JP3972068B2 - 遺伝子クラスター上の構造遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養し、次いで該培養物からＭＬ−２３６Ｂを回収することを特徴とするＭＬ−２３６Ｂの製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プラバスタチンナトリウムは、高脂血症改善薬として臨床において使用されている、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である。プラバスタチンは、ペニシリウム・シトリナムが生産するＭＬ−２３６Ｂをストレプトミセス・カルボフィラス（Streptomyces carbophilus）により微生物変換することにより得られる（Endo,A.,et al.,J.Antibiot.,29,1346(1976)：Matsuoka,S.,et al.,Eur.J.Biochem.,184,707(1989)記載：特開昭５７−２２４０号公報記載）。
【０００３】
プラバスタチンの前駆体ＭＬ−２３６Ｂ、及び、プラバスタチンと部分構造を共有するＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤ロバスタチンは、ともにポリケチドを経て生合成されることが示されている（Moore,R.N.,et al.,J.Am.Chem.Soc.,107, 3694(1985)：Shiao,M.and Don,H.S.,Proc.Natl.Sci.Counc.Repub.China B,11,223(1987)記載）。
【０００４】
ポリケチドとは、酢酸、プロピオン酸、酪酸などの低分子カルボン酸残基の連続的な縮合反応から生じるβ―ケト炭素鎖から導かれる化合物の総称であり、各β―ケトカルボニル基の縮合・還元様式により、多様な構造が導かれる（Hopwood, D.A. and Sherman, D.H., Annu.Rev.Genet., 24, 37-66(1990)：Hutchinson, C.R. and Fujii, I., Annu.Rev.Microbiol., 49, 201-238(1995)記載）。
【０００５】
ポリケチドの合成を担うポリケチド・シンターゼ（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ：以下、「ＰＫＳ」という。）は糸状菌や細菌の有する酵素であることが知られており、糸状菌では該酵素の分子生物学的研究がなされている（Feng,G.H.and Leonard,T.J.,J.Bacteriol.,177,6246(1995)：Takano,Y.,et al.Mol.Gen.Genet.249,162(1995)記載）。ロバスタチン生産菌であるアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）については、ロバスタチン生合成に関連したＰＫＳ遺伝子の解析がなされている（特表平９−５０４４３６号公報記載）。
【０００６】
ところで、糸状菌の二次代謝産物の生合成関連遺伝子は、ゲノム上でクラスターを形成していることが少なくない。ポリケチドの生合成系にて、該系に関与する遺伝子クラスターの存在が知られている。アスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticus）の生産するポリケチドであるアフラトキシンの生合成では、ＰＫＳその他ポリケチドの生合成に関与する酵素蛋白質をコードする遺伝子がクラスター構造を形成していることが知られており、両菌のアフラトキシン生合成関連遺伝子のゲノム比較解析が行なわれている（Yu,J.,et al,Appl.Environ.Microbiol.,61,2365(1995)記載）。アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）の生産するステリグマトシスチン（sterigmatocystin）の生合成関連遺伝子は、ゲノム上の連続する約６０ｋｂの領域においてクラスター構造を形成していることが報告されている（Brown,D.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,1418(1996)記載）。
【０００７】
しかし、ＭＬ−２３６Ｂ生合成に関する分子生物学的研究は、現在まで十分にはなされていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ペニシリウム・シトリナムのＭＬ−２３６Ｂ生合成に関連するゲノムＤＮＡ（以下、「ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ」という。）を、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡライブラリーよりクローニングし、該ゲノムＤＮＡを解析して該ゲノムＤＮＡ上に構造遺伝子を見出し、ペニシリウム・シトリナムの（全ＲＮＡに含まれる）ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription - polymerase chain reaction：以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）により該構造遺伝子に対応するｃＤＮＡを得、該ｃＤＮＡを含有する組換えＤＮＡベクターを用いて該生産微生物を形質転換することにより、該生産微生物においてＭＬ−２３６Ｂの生合成が促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）
以下の群から選択されるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号３７のヌクレオチド番号１乃至１６６２で示される塩基配列を１つ又は複数含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ：
（ｂ）（ａ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ、
（２）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５）より得ることができる、（１）記載のＤＮＡ、
（３）
以下の群から選択されるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号４１のヌクレオチド番号１乃至１３８０で示される塩基配列を１つ又は複数含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ：
（ｂ）（ａ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ、
（４）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）より得ることができる、（３）記載のＤＮＡ、
（５）
（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、
（６）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５）株より得ることができる、（５）記載の組換えＤＮＡベクター、
（７）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）株より得ることができる、（５）記載の組換えＤＮＡベクター、
（８）
（５）乃至（７）のいずれか一つに記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、
（９）
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であることを特徴とする、（８）記載の宿主細胞、（１０）
ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）であることを特徴とする、（９）記載の宿主細胞、
（１１）
（９）又は（１０）記載の宿主細胞を培養し、次いで該培養物からＭＬ−２３６Ｂを回収することを特徴とする、ＭＬ−２３６Ｂの製造法、
（１２）
大腸菌であることを特徴とする、（８）記載の宿主細胞、
（１３）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５）株である、（１２）記載の宿主細胞、
（１４）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）株である、（１２）記載の宿主細胞、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進し得るｃＤＮＡ（以下、「ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡ」という。）等に関する。
【００１２】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成ｃＤＮＡのような、本発明のポリヌクレオチドは、次の群より選択される；
（Ｉ）ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノム遺伝子中のＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ上に存在する構造遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを含む全ＲＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡ。
（ＩＩ）（Ｉ）記載のＤＮＡ、及び、（Ｉ）記載のＤＮＡを第一鎖として合成された第二鎖ＤＮＡが会合して生じる二本鎖ＤＮＡ。
（ＩＩ）（ＩＩ）記載の二本鎖ＤＮＡをクローニング等の手法により複製又はは増幅することによって得られる二本鎖ＤＮＡ。
（ＩＶ）（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のいずれか一つに記載のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ＩＶ）のＤＮＡとしては、配列表の配列番号３７のヌクレオチド番号１乃至１６６２で示される塩基配列に１つ若しくは２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入が生じたものであり、且つ、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該微生物のＭＬ−２３６Ｂの生合成を促進するものを挙げることができる。
【００１３】
また、（ＩＶ）のＤＮＡとしては、配列表の配列番号４１のヌクレオチド番号１乃至１３８０で示される塩基配列に１つ若しくは２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入が生じたものであり、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該微生物のＭＬ−２３６Ｂの生合成を促進するものを挙げることができる。
【００１４】
本発明において、ハイブリダイズとは、２本の一本鎖核酸同士が互いに相補的な領域又は相補性の高い領域において二本鎖を形成することをいい、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション液の組成が６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム。）であり且つハイブリダイゼーションを行なう際の保温温度が５５℃の場合をいう。
【００１５】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡは、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｃＤＮＡライブリーから所望のｃＤＮＡを含むクローンを単離する方法、又はＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡの塩基配列に基いて作製される一組のプライマー及びＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｍＲＮＡ若しくは全ＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲにより得ることができる。
【００１６】
本発明において、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物とは、ＭＬ−２３６Ｂ生産能を先天的に有する微生物をいう。ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物としては、例えば、ペニシリウム（Penicillium）属に属するＭＬ−２３６Ｂ生産糸状菌が挙げられ、より具体的には、ペニシリウム・シトリナム、ペニシリウム・ブレビコンパクタム（Penicilium brevicompactum：Brown,A.G.,et al.,J.Chem.Soc.Perkin-1.,1165(1976)記載）、ペニシリウム・シクロピウム（Penicillium cyclopium：Doss,S.L.,et al.,J.Natl.Prod.,49,357(1986)記載）等が例示される。また、これら以外に、ユーペニシリウム・エスピー Ｍ６６０３（ Eupenicillium sp.M6603：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、ペシロミセス・ビリディス ＦＥＲＭ Ｐ−６２３６（Paecilomyces viridis FERM P-6236：特開昭５８−９８０９２号公報記載）、ペシロミセス・エスピー Ｍ２０１６（Paecilomyces sp.M2016：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、トリコデルマ・ロンギブラチアタム Ｍ６７３５（Trichoderma longibrachiatum M6735：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、ヒポミセス・クリソスペルムス ＩＦＯ ７７９８（Hypomyces chrysospermus IFO 7798：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、グリオクラディウム・エスピー ＹＪ−９５１５（Gliocladium sp. YJ-9515：ＷＯ９８０６８６７号公報記載）、トリコデルマ・ビリデ ＩＦＯ ５８３６（Trichoderma viride IFO 5836：特公昭６２−１９１５９号公報記載）、ユーペニシリウム・レチクリスポルム ＩＦＯ ９０２２（Eupenicillium reticulisporum IFO 9022：特公昭６２−１９１５９号公報記載）等を例示することができる。
【００１７】
これらのＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のうち、好適にはペニシリウム・シトリナムであり、より好適にはペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株である。ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株は、平成４年（１９９２年）１２月２２日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４１２９を付与された。これらのＭＬ−２３６Ｂ生産微生物には、自然界から単離された株、自然に生じた変異株及び人工的に生じさせた変異株が包含される。
【００１８】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡは、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡライブラリーに対して、類似の機能を有するものと推測される糸状菌由来のＤＮＡの塩基配列に基いて設計されるプローブを用いてスクリーニングを行なうことにより得ることができる。
【００１９】
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製法としては、通常真核生物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製するための方法であれば特に限定されないが、例えば、マニアティスらの方法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）等が挙げられる。
【００２０】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡは、該微生物培養物から該微生物を回収して物理的に破砕した後、核内ＤＮＡを抽出、精製することにより得られる。
【００２１】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の培養は、各ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物に適した条件下で行なうことができる。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であるペニシリウム・シトリナムの培養は、該微生物を培養したスラントから、ＭＢＧ３−８培地（組成；７％(w/v)グリセリン、３％(w/v)グルコース、１％(w/v)大豆粉、１％(w/v)ペプトン（極東製薬工業（株）製）、１％(w/v)コーンスチープリカー（ホーネンコーポレーション（株）製）、０．５％(w/v)硝酸ナトリウム 、０．１％(w/v)硫酸マグネシウム七水和物、ｐＨ６．５）へ該微生物を接種し、２２乃至２８℃、３乃至７日間、振盪しつつ保温することにより行なうことができる。該スラントは、溶解させたＰＧＡ寒天培地（組成；２００ｇ/Ｌ馬鈴薯抽出液、１５％(w/v)グリセリン、２％(w/v)寒天）を試験管に注ぎ、傾斜させつつ固化させたものに、白金耳を用いてペニシリウム・シトリナムを接種し、２２乃至２８℃、７乃至１５日保温することにより作製する。該スラントを０乃至４℃で保存することにより、該スラント上でＭＬ−２３６Ｂ生産微生物を継続的に生存させることができる。
【００２２】
液体培地で培養したＭＬ−２３６Ｂ生産微生物は、遠心分離により、固体培地で培養した該微生物は、セル・スクレーパー等でかきとることにより、それぞれ回収することができる。
【００２３】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の物理的破砕は、該微生物を液体窒素等で凍結しつつ乳鉢と乳棒ですり潰すことにより行なうことができる。破砕された微生物の核内ＤＮＡの抽出は、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ：以下、「ＳＤＳ」という。）等の界面活性剤を用いて行なうことができる。抽出されたゲノムＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出を行なうことにより除タンパクされ、エタノール沈澱を行なうことにより沈澱として回収することができる。
【００２４】
得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で限定分解させ、断片化する。限定分解に使用される制限酵素としては、通常入手可能な制限酵素であれば特に限定されないが、例えば、Ｓａｕ３ＡＩ等を挙げることができる。断片化されたＤＮＡをゲル電気泳動に供し、適当なサイズのゲノムＤＮＡを含むゲルからＤＮＡを回収する。ＤＮＡ断片のサイズには特に限定はないが、好適には２０ｋｂ以上である。
【００２５】
ゲノムＤＮＡライブラリー作製用のＤＮＡベクターとしては、該ＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等が挙げられ、好適にはコスミドベクターである。また、これらＤＮＡベクターは発現ベクターであってもよい。さらに、該ＤＮＡベクターは、該ＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞に表現形質（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の選択性を付与する塩基配列を有していることが好ましい。
【００２６】
該ＤＮＡベクターは、クローニング及び機能発現の双方に適用できるものであることが好ましい。該ＤＮＡベクターとしては、複数の微生物群に形質転換可能なＤＮＡベクター、すなわちシャトルベクターを用いることが好ましい。該シャトルベクターは、少なくとも一方の微生物群の宿主細胞において複製されるのに必要な塩基配列を有する。また、シャトルベクターは複数の微生物群の宿主にそれぞれ表現形質の選択性を付与する塩基配列を有していることが好ましい。
【００２７】
このようなシャトルベクターにより形質転換される微生物群の組合わせとしては、一方の微生物群がクローニングに適用でき且つ他方がＭＬ−２３６Ｂ生産能を有していれば特に限定されないが、例えば、細菌及び糸状菌の組合わせ、酵母及び糸状菌の組合わせ等が挙げられ、好適には細菌及び糸状菌の組合わせである。細菌としては、通常遺伝子工学に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌、枯草菌等を挙げることができ、好適には大腸菌であり、より好適には大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株である。酵母としては、通常遺伝子工学に用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等を挙げることができる。糸状菌としては、上述のＭＬ−２３６Ｂ生産微生物等が挙げられる。なお、本発明において微生物群は、細菌、糸状菌及び酵母から選択される。
【００２８】
このようなシャトルベクターとしては、例えば、適当な表現形質選択マーカー遺伝子及びコス（ｃｏｓ）部位を有するコスミドベクター等を挙げることができ、好適には大腸菌ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子配列を有するプラスミドｐＳＡＫ３３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）にコスミドベクターｐＷＥ１５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の有するコス（ｃｏｓ）部位を挿入して作製されたｐＳＡＫｃｏｓ１が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＳＡＫｃｏｓ１の構築手順については図１に記載されている。
【００２９】
上述のＭＬ−２３６Ｂ生産微生物ゲノムＤＮＡ断片をライゲーションしたシャトルベクターを宿主細胞に導入することにより、所望のゲノムＤＮＡライブラリーが完成する。宿主細胞には、好適には大腸菌、より好適には大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株がそれぞれ使用される。宿主細胞が大腸菌の場合、該導入はｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングにより行なう。本発明において、形質転換とは、ｉｎｖｉｔｒｏパッケージングによる外来ＤＮＡの導入も意味し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングにより外来ＤＮＡを導入された細胞も形質転換細胞の意味に包含される。
【００３０】
所望のクローンのスクリーニングには、抗体又は核酸プローブを用い、好適には、核酸プローブを用いる。該核酸プローブは、糸状菌のポリケチド生合成関連遺伝子の塩基配列に基づいて作製することができる。このような遺伝子としては、ポリケチドの生合成への関与が確認され且つ塩基配列が公知のものであれば特に限定されないが、例えば、アスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticus）のアフラトキシンＰＫＳ遺伝子、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のストリグマトシスチンＰＫＳ遺伝子等を挙げることができる。
【００３１】
該核酸プローブは、上述の公知の塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブの合成により、またオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、「ＰＣＲ」という。：Saiki,R.K.,et al.,Science,239,487(1988)記載）を行なうことにより、又は、ｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ等により、取得することができる。
【００３２】
核酸プローブのＭＬ−２３６Ｂ生産微生物からのＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲによる取得方法は、以下に述べる通りである。
【００３３】
ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマー（以下、「ＰＣＲ用プライマー」という。）の設計は、塩基配列が公知であるところのポリケチド生合成関連遺伝子の塩基配列に基づいて、好適にはアスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticus）のアフラトキシンＰＫＳ遺伝子又はアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のストリグマトシスチンＰＫＳ遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。これらのうちいずれか一つのＰＫＳのアミノ酸配列上で種間保存性の高いアミノ酸配列を塩基配列に還元することにより、ＰＣＲ用プライマーを設計することができる。アミノ酸配列から塩基配列に還元する方法としては、宿主のコドン使用頻度を考慮して単一の配列を導く方法又は多重コドンを使用して混合配列（以下、「ミックス・プライマー」という。）を導く方法の二通りが使用できる。後者の場合、塩基配列にヒポキサンチンを含有させることにより多重度を下げることができる。
【００３４】
また、ＰＣＲ用プライマーには、鋳型鎖とアニーリングするための塩基配列に加え、該プライマーの５’−末端に適宜塩基配列を付加させることが可能である。そのような塩基配列としては、該プライマーがＰＣＲに使用可能であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ産物についてその後のクローニング操作を行なうのに便利な塩基配列等が挙げられ、このような塩基配列としては、制限酵素認識配列を含有するか又は該認識配列からなる塩基配列を例示することができる。
【００３５】
さらに、ＰＣＲ用プライマーの設計においては、グアニン塩基の数とシトシン塩基の数の和が総塩基数の４０乃至６０％であることが好ましい。また、自己アニーリングし難いことが好ましい。一組のＰＣＲ用プライマーにおいては、双方のＰＣＲ用プライマー同士がアニーリングし難いことが好ましい。
【００３６】
また、ＰＣＲ用プライマーの塩基数は、ＰＣＲに適用できれば特に限定されないが、その範囲の下限は１０乃至１４、上限は４０乃至６０であり、好適な範囲は１４乃至４０である。
【００３７】
さらに、ＰＣＲ用プライマーは、好適にはＤＮＡである。該プライマーを構成するヌクレオシドとしては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシチミジン及びデオキシグアノシンに加え、デオキシイノシンが挙げられる。
また、ＰＣＲ用プライマーの５’−末端に位置するヌクレオシドの５’−位は、水酸基であるか、又は、該水酸基に一リン酸がエステル結合した状態である。
【００３８】
さらに、ＰＣＲ用プライマーの合成は、通常核酸の合成に使用される方法、例えば、ホスフォロアミダイト法により行なうことができ、このような方法には、ＤＮＡ自動合成機が好適に使用される。
【００３９】
ＰＣＲの鋳型としては、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｍＲＮＡが、それぞれ使用できる。なお、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては、ｍＲＮＡの代わりに全ＲＮＡを使用することも可能である。
【００４０】
ＰＣＲ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物をこのものに適したＤＮＡベクターに組込むことにより、該ＰＣＲ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることができる。該クローニングに用いるＤＮＡベクターとしては、通常ＤＮＡ断片をクローニングするのに使用されるＤＮＡベクターであれば特に限定されない。また、ＰＣＲ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングを簡便に行なうキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製：ＤＮＡベクターとしてｐＣＲ２．１を使用している。）が好適に使用される。
【００４１】
クローニングしたＰＣＲ産物の取得は、所望のＰＣＲ産物を含んでいることを確認した形質転換宿主細胞を培養し、該細胞からプラスミドを抽出、精製し、得られたプラスミドから挿入ＤＮＡ断片を回収することにより行なうことができる。
【００４２】
形質転換宿主細胞の培養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができる。好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の培養は、ＬＢ培地（１％(w/v)トリプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラクト、０．５％(w/v)塩化ナトリウム）で、３０乃至３７℃、１８時間乃至２日間、振盪しつつ保温することにより行なうことができる。
【００４３】
形質転換宿主細胞の培養物からのプラスミドの調製は、該宿主細胞体を回収し、ゲノムＤＮＡやタンパク質を除去することによりなされる。好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の培養物からのプラスミドの調製は、マニアティスらのアルカリ法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）により行なうことができる。また、より純度の高いプラスミドを得るためのキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）が好適に使用される。さらに、プラスミドの大量調製を行うキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）が好適に使用される。
【００４４】
得られたプラスミドのＤＮＡ濃度は、ＤＮＡ試料を適宜希釈して波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、５０μｇ／ｍｌ濃度のＤＮＡ水溶液の波長２６０ｎｍにおける吸光度を１として算出することができる。ＤＮＡの純度は、波長２８０及び２６０ｎｍの吸光度の比率から算出することができる（いずれもManiatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）。
【００４５】
核酸プローブの標識は、放射性標識及び非放射性標識に大別される。放射性標識に使用される放射性核種としては、通常使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、32Ｐ，35Ｓ、14Ｃ等を挙げることができ、好適には32Ｐである。非放射性標識に用いる試薬としては、通常核酸の標識に用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン等が挙げられ、好適にはジゴキシゲニンである。核酸プローブを標識する方法としては、通常使用される方法であれば特に限定されないが、例えば、標識基質を用いたＰＣＲにより該産物中に取り込ませる方法、ニック・トランスレーション法、ランダム・プライマー法、末端標識法、標識基質を用いてオリゴヌクレオチドＤＮＡを合成する方法等を挙げることができ、核酸プローブの種類等によりこれらの方法から適宜選択できる。
【００４６】
核酸プローブの塩基配列と同一の塩基配列がＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノム中に存在することは、該微生物のゲノムＤＮＡに対するサザンブロット・ハイブリダイゼーションにより確認することができる。
【００４７】
サザンブロット・ハイブリダイゼーションは、マニアティスらの方法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）により行なうことができる。
【００４８】
上述の通り作製された標識核酸プローブを用い、ゲノムＤＮＡライブラリーから目的クローンをスクリーニングすることができる。該スクリーニング法としては、通常遺伝子クローニングに使用される方法であれば特に限定されないが、好適にはコロニー・ハイブリダイゼーション法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）を使用することができる。
【００４９】
コロニー・ハイブリダイゼーションに用いるコロニーの培養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができ、好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の培養は、ＬＢ寒天培地（１％(w/v)トリプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラクト、０．５％(w/v)塩化ナトリウム、１．５％(w/v)アガロース）上で、３０乃至３７℃、１８時間乃至２日間保温することにより行なうことができる。
【００５０】
コロニー・ハイブリダイゼーションにより得られる陽性クローンからの組換えＤＮＡベクターの調製は、該陽性クローンの培養物からプラスミドを抽出及び精製することによりなされる。
【００５１】
本発明において得られた陽性クローンである形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９株は、平成１１年（１９９９年）７月７日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０を付された。
【００５２】
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９株が保持する組換えＤＮＡベクターはｐＭＬ４８と命名された。
【００５３】
陽性クローンの保持する組換えＤＮＡベクターが所望のＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡを含んでいることは、該組換えＤＮＡベクターの挿入塩基配列の決定、サザンブロット・ハイブリダイゼーション又は機能発現により確認できる。
【００５４】
ＤＮＡの塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾法 （Maxiam,A.M.M. and Gilbert,W.,Methods in Enzymology,65,499(1980)記載）又はジデオキシヌクレオチド鎖終結法 （Messing,J. and Vieira,J.,Gene,19,269(1982)記載）等により決定できる。なお、塩基配列決定に供するプラスミドＤＮＡとしては、より純度の高い標品が好ましい。
【００５５】
ｐＭＬ４８の挿入塩基配列は配列表の配列番号１で示される。配列表の配列番号２で示される塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列に対して完全に相補的である。通常ゲノムＤＮＡの塩基配列は同種内において遺伝的多型（ポリモルフィズム：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）を有している。また、ＤＮＡクローニングの過程及び塩基配列決定の過程において、ヌクレオチドの置換等が一定の確率で生じ得る。従って、本発明のＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡは、配列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ、及び配列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノムＤＮＡをも包合する。これらゲノムＤＮＡとしては、配列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３で示される塩基配列に１つ又は２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入が生じたもの、並びに、ＭＬ−２３６Ｂ又はその誘導体を生産する、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株以外の微生物に由来し、且つ該微生物によるＭＬ−２３６又はその誘導体の生合成に関連するものが包合される。
【００５６】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡの解析法は次の１）乃至３）に従う。１）遺伝子解析ソフトによる解析
ゲノムＤＮＡ配列中の遺伝子領域の推定は、既存の遺伝子解析プログラム（Ｇｅｎｅ Ｆｉｎｄｉｎｇプログラム（以下、「ＧＲＡＩＬ」という。）、及び配列の相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ）により行うことができる。
【００５７】
ＧＲＡＩＬはゲノム配列の「遺伝子配列らしさ」を評価する７つのパラメータに分割し、それらの結果をニューラルネット法を用いて統合することにより、ゲノムＤＮＡ上の構造遺伝子を検索するプログラム（Uberbacher,E.C.& Mural,R.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88,11261(1991)記載）であり、ＡｐｏＣｏｍ ＧＲＡＩＬ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＡＰＯＣＯＭ社製）が好適に使用される。
【００５８】
ＢＬＡＳＴは核酸配列及びアミノ酸配列の相同性検索を行なうアルゴリズム（Altechul,S.F.,Madden,T.L.,et al.,Nucl.Acids Res.,25,3389(1997)記載）を用いたプログラムである。
【００５９】
ゲノムＤＮＡ配列を適当な長さに分割し、ＢＬＡＳＴＮを用いて遺伝子データベースに対し相同性検索することにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の位置及び方向を推定することができる。また、分割されたゲノムＤＮＡ配列を６つの翻訳フレーム（センス配列及びアンチセンス配列に各々３つずつ）に従ってアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列のペプチド・データベースに対する相同性検索をＢＬＡＳＴＸを用いて行なうことにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の位置及び方向の推定を行なうこともできる。さらに、真核生物においては、ゲノムＤＮＡ配列中に含まれる構造遺伝子のコード領域がイントロン配列により分断されている場合があり、このようなギャップを有する構造遺伝子の解析にはギャップ含有配列用のＢＬＡＳＴがより有効であり、Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２：ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒ． １０．０に搭載）が好適に使用される。
２）ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法による解析
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法により、１）記載の解析法により推定される構造遺伝子の発現を調べることができる。
【００６０】
ノーザンブロットに供するＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の全ＲＮＡは、該微生物の培養物より得ることができる。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であるペニシリウム・シトリナムの培養は、該菌のスラントからＭＧＢ３−８培地に該菌を接種し、２２乃至２８℃、１乃至４日間、振盪しつつ保温することにより行うことができる。
【００６１】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物からのＲＮＡの抽出は、通常全ＲＮＡを調製するのに使用される方法であれば特に限定されないが、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホットフェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられる。また、より純度の高い全ＲＮＡを調製するための市販キットとしては、例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）等が挙げられる。さらに、ｍＲＮＡは、全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）カラムに添加し、該カラムに吸着した画分を回収することにより得ることができる。
【００６２】
ＲＮＡのメンブレンへのトランスファー、プローブの調製、ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出は、上述のサザンブロット・ハイブリダイゼーションと同様に行なうことができる。
３）５’−末端及び３’−末端の解析
各構造遺伝子の５’−末端及び３’−末端の解析は、ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法により行なうことができる。ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡを鋳型とし、塩基配列が決定されている領域から塩基配列が決定されていない５’−末端又は３’−末端領域までを含むｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの応用により取得する方法である（Frohman,M.A.,Methods in Enzymol.,218,340(1993)記載）。
【００６３】
５’ＲＡＣＥは以下の方法に従う。ｍＲＮＡを鋳型とし、塩基配列中の公知の部分に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）をプライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した後、ターミナルデオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼにより該ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端にホモポリメリックな（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ：単一塩基からなる）ヌクレオチド鎖を付加させる。該ｃＤＮＡ第一鎖を鋳型とし且つ該ホモポリメリックな塩基配列に相補的な塩基配列を含むセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ、及び、アンチセンス側に存在し且つオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）より３’−側に存在するオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）をプライマーとしたＰＣＲによって、５’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅させる方法である（Frohman,M.A.,Methods in Enzymol.,218,340(1993)記載）。５’ＲＡＣＥ用のキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ社製）等が好適に使用される。
【００６４】
３’ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの３’−末端に存在するポリＡ領域を利用する方法である。すなわち、ｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄ（Ｔ）アダプターをプライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した後、該ｃＤＮＡ第一鎖を鋳型として、塩基配列中の公知の部分に基いて設計されたセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）、及び、アンチセンス側のオリゴｄ（Ｔ）アダプターをプライマーとしたＰＣＲによって、３’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅させる方法である。３’ＲＡＣＥ用のキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ｐｈｒａｍａｃｉａ社製）が好適に使用される。
【００６５】
ＲＡＣＥにおける塩基配列中の公知の部分に基いたプライマーの設計には、上記１）及び２）の解析結果が好適に利用できる。
【００６６】
以上、１）乃至３）に記載した解析法により、ゲノムＤＮＡ配列上の構造遺伝子の方向、並びに、構造遺伝子中の転写開始点の位置、転写終始点の位置、翻訳開始コドンの位置、翻訳終止コドン及びその位置を推定することができる。これらの情報に基づいて、各構造遺伝子及びそれに対応するｃＤＮＡ、すなわちＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを取得し、その塩基配列を決定することが可能である。また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた転写産物の塩基配列解析に基づき、各構造遺伝子に対応する完全長のｃＤＮＡを取得せずに、コード領域及び対応するｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００６７】
本発明において得られた組換えＤＮＡベクター ｐＭＬ４８の挿入配列上には、６つの構造遺伝子の存在が推定され、それぞれｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲと命名された。このうちｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲは配列表の配列番号２に示される塩基配列上にコード領域を有し、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤは配列表の配列番号１に示される塩基配列上にコード領域を有しているものと推定された。各構造遺伝子の転写レベルでの発現解析には、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法が好適に使用され得る。
【００６８】
上述の６つの構造遺伝子に対応するＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを取得する方法としては、各構造遺伝子の塩基配列に基づいて設計され得るプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによるクローニング、該塩基配列に基いて得られるＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡライブラリーからのクローニング等が挙げられる。また、これらの方法で取得されるｃＤＮＡを機能発現させるためには、完全長のｃＤＮＡを得ることが好ましい。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲによるＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡの取得について述べる。
【００７０】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを取得するための一組のＲＴ−ＰＣＲ用プライマーは、各鋳型鎖と選択的にアニーリングし且つｃＤＮＡを取得するべく設計されなければならないが、この条件を満たす限りにおいて、一組のＲＴ−ＰＣＲの一方又は双方は各鋳型鎖の一部と完全に相補的でなくてもよい。アンチセンス鎖にアニーリングするＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（以下、「センスプライマー」という。）としては、アンチセンス鎖の一部と完全に相補的なセンスプライマー（以下、「無置換センスプライマー」という）又はアンチセンス鎖の一部と完全には相補的でないセンスプライマー（以下、「一部置換センスプライマー」という。）を使用することができる。センス鎖にアニーリングするＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（以下、「アンチセンスプライマー」という。）としては、センス鎖の一部と完全に相補的なアンチセンスプライマー（以下、「無置換アンチセンスプライマー」という）又はセンス鎖の一部と完全には相補的でないアンチセンスプライマー（以下、「一部置換アンチセンスプライマー」という。）を使用することができる。
【００７１】
センスプライマーは、それを一方のプライマーとするＲＴ−ＰＣＲ産物が本来の位置に翻訳開始コドンａｔｇを含み且つ該翻訳開始コドンより開始される翻訳フレーム中には本来の位置以外に翻訳終止コドンを含まないように設計される（なお、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列及び配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列における、本発明において推定された各構造遺伝子の翻訳開始コドンの位置は、表４に記載されている）。
【００７２】
無置換センスプライマーは、ｃＤＮＡの翻訳開始コドンａｔｇ中のａ又はそれより５’−側の塩基を５’−末端とする。
【００７３】
一部置換センスプライマーは、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列又は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上の特定の領域と選択的にアニーリングする（配列表の配列番号２の全塩基配列は、配列表の配列番号１の全塩基配列に対して完全に相補的である）。
【００７４】
また、一部置換センスプライマーが翻訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列を含む場合、翻訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列上に開始コドンａｔｇから始まる翻訳フレーム中に終始コドンとなるような塩基配列（ｔａａ、ｔａｇ又はｔｇａ）は含まれない。なお、開始コドンａｔｇから始まる翻訳フレームとは、翻訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列を翻訳開始コドンａｔｇから３塩基単位に分割したときに生じる３塩基からなる配列をいう。
【００７５】
さらに、一部置換センスプライマーが、翻訳開始コドンのａ、ａｔ又はａｔｇ（「塩基又は塩基配列ｍ」という。）にその位置で対応する塩基又は塩基配列（「塩基又は塩基配列ｍ’」という。）を含む場合、塩基又は塩基配列ｍがａのとき、塩基又は塩基配列ｍ’はａであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａは、その一部置換センスプライマーの３’−末端に位置する。塩基又は塩基配列ｍがａｔのとき、塩基又は塩基配列ｍ’はａｔであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａｔは、その一部置換センスプライマーの３’−末端に位置する。塩基又は塩基配列ｍがａｔｇのとき、塩基又は塩基配列ｍ’はａｔｇであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋１（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドを５’−末端とするトリヌクレオチドがその一部置換センスプライマーに存在する場合、該トリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７６】
また、一部置換センスプライマーの３’−末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋１（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドであるとき、その一部置換センスプライマーを一方のプライマーとし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ産物又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物において、３×ｎ＋１番目のヌクレオチド及びその３’−側に隣接するジヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７７】
さらに、一部置換センスプライマーのいずれか一つの３’−末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋２（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドであるとき、その一部置換センスプライマーを一方のプライマーとし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ産物又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物において、３×ｎ＋２番目のヌクレオチド及びその３’−側並びに５’−側に隣接する２つのモノヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７８】
また、一部置換センスプライマーの３’−末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋３（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドであるとき、３×ｎ＋１乃至３×ｎ＋３番目のヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７９】
以上がセンスプライマーの要件である。
【００８０】
アンチセンスプライマーは、それ自体及び上述のセンスプライマーを一組のプライマーとして使用するＲＴ−ＰＣＲにより、各構造遺伝子（ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲ）にコードされるペプチドのＮ末端からＣ末端までをコードしたｃＤＮＡを増幅できるように設計される。
【００８１】
無置換アンチセンスプライマーは、ｃＤＮＡ上の翻訳終止領域附近の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するアンチセンスプライマーであれば特に限定されないが、好適には翻訳終止コドンの３’−末端の塩基に対して相補的な塩基又はそれより５’−側の塩基を５’−末端とする塩基配列を有し、より好適には翻訳終止コドンに対して相補的な３塩基の配列を有する（なお、本発明において推定された各構造遺伝子の翻訳終止コドン、該翻訳終止コドンの相補配列、各構造遺伝子にコードされるペプチドのＣ末端のアミノ酸残基、該アミノ酸残基をコードした塩基配列、並びに、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列及び配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列におけるそれらの位置は、表８乃至１０に記載されている）。
【００８２】
一部置換アンチセンスプライマーは、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上又は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上の特定の領域と選択的にアニーリングする。
【００８３】
以上がアンチセンスプライマーの要件である。
【００８４】
また、一部置換センスプライマー及び一部置換アンチセンスプライマーは、上述の要件を満たす限りにおいて、それぞれの５’−末端に適宜塩基配列を付加させることが可能である。そのような塩基配列としては、該プライマーがＰＣＲに使用可能であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ産物についてその後のクローニング操作を行なうのに便利な塩基配列等が挙げられ、このような塩基配列として、制限酵素認識配列を含有するか又は該認識配列からなる塩基配列が挙げられる。
【００８５】
さらに、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの設計は、前述のＰＣＲ用プライマーの設計に関する記述に従って行なう。
【００８６】
上述の通り、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型には、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｍＲＮＡ又は全ＲＮＡを使用する。例えば、ｐＭＬ４８挿入配列中に存在する構造遺伝子ｍｌｃＥのコード領域全域を増幅できるような一組のプライマー（それぞれの塩基配列は、配列表の配列番号３５及び３６参照）を設計及び合成し、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株等の全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型してＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、構造遺伝子ｍｌｃＥに対応するＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡが得られる。同様に、ｐＭＬ４８挿入配列中に存在する構造遺伝子ｍｌｃＲのコード領域全域を増幅できるような一組のプライマー（それぞれの塩基配列は、配列表の配列番号３９及び４０参照）を設計及び合成し、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株等の全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型してＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡが得られる。
【００８７】
また、上述の通り、ＲＴ−ＰＣＲ産物を適当なＤＮＡベクターに組込むことにより、該ＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることができる。そのようなクローニングに用いるＤＮＡベクターとしては、通常ＤＮＡ断片をクローニングするのに使用されるＤＮＡベクターであれば特に限定されない。ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングを簡便に行なうキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製：ＤＮＡベクターとしてｐＣＲ２．１を使用している。）が好適に使用される。
【００８８】
このようにして取得されるＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡがＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内で機能発現し得ることは、該ｃＤＮＡをＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内での機能発現に適したＤＮＡベクターに組換え、その組換えＤＮＡベクターで細胞を形質転換し、該形質転換細胞及び宿主細胞のＭＬ−２３６Ｂ生合成能を比較することにより確認できる。すなわち、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡが形質転換細胞内で機能発現していれば、該形質転換細胞のＭＬ−２３６Ｂ生合成能が宿主細胞のそれよりも改善されている。
【００８９】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内での機能発現に適したＤＮＡベクター（以下、「発現ベクター」という。）としては、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物を形質転換することができ、且つＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内で機能発現させることができ、且つ宿主細胞内で安定に保持され、且つ宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有しているものであれば、特に限定されない。
【００９０】
また、発現ベクターは、宿主細胞に表現形質の選択性を付与する塩基配列を有していること、及びシャトルベクターであることが、それぞれ好ましい。
【００９１】
さらに、宿主細胞に付与され得る表現形質の選択性としては、薬剤耐性等が挙げられ、好適には抗生物質耐性、より好適にはアンピシリン耐性、ハイグロマイシンＢ耐性である。
【００９２】
また、発現ベクターがシャトルベクターである場合、一方の微生物群の宿主細胞において複製されるのに必要な塩基配列を有し、且つ他方の宿主細胞において挿入配列にコードされたポリペプチドを機能発現させるのに必要な塩基配列を有していなければならない。また、形質転換される複数の微生物群の宿主にそれぞれ異なった表現形質の選択性を付与する塩基配列を有していることが好ましい。複数の微生物群の組み合わせは、本明細書中に記載されたＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡのクローニング及び機能発現に使用されるシャトルベクターの要件に準ずる。本発明においては、このようなシャトルベクターとして、ＤＮＡベクターｐＳＡＫ３３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）に、該ＤＮＡベクター上に存在するアスペルギルス・ニデュランス由来の３−ホスホグリセレートキナーゼ（3-phosphoglycerate kinase：以下、「ｐｇｋ」という。）遺伝子プロモータ、外来遺伝子挿入用のアダプター、及び該ＤＮＡ上に存在するｐｇｋターミネータを、この順で組込むことにより作製されたＤＮＡベクターｐＳＡＫ７００ （図４参照）が好適に使用される。
【００９３】
上述のような発現ベクターに本発明のＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを挿入して得られる組換えＤＮＡベクター（組換え発現ベクター）をＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内に導入することにより、該ｃＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを機能発現させることができる。
【００９４】
本発明の組換え発現ベクターは、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ若しくはｍｌｃＲ又はそれに対応するｃＤＮＡを１つ又は２つ以上含有してもよく、好適には、構造遺伝子ｍｌｃＥ若しくはｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡを１つ又は２つ以上含有する。
【００９５】
構造遺伝子ｍｌｃＥ、ｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡをｐＳＡＫ７００のアダプター部位にそれぞれ挿入することにより、組換え発現ベクターｐＳＡＫｅｘｐＥ及びｐＳＡＫｅｘｐＲが得られた。ｐＳＡＫｅｘｐＥの挿入配列は配列表の配列番号３７に、ｐＳＡＫｅｘｐＲの挿入配列は配列表の配列番号４１に、それぞれ記載されている。
【００９６】
ｐＳＡＫｅｘｐＥで形質転換された大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥＳＡＮＫ ７２４９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５を付された。
【００９７】
ｐＳＡＫｅｘｐＲで形質転換された大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲＳＡＮＫ ７２５９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６を付された。
【００９８】
また、本発明の組換え発現ベクターは、単独で又は組合せによりＭＬ−２３６Ｂ生産微生物によるＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進し得るＤＮＡを１種又は２種以上、それぞれ１つ又は２つ以上含有してもよい。そのようなＤＮＡとしては、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ若しくはｍｌｃＲ又はそれに対応するｃＤＮＡ、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡの発現調節因子をコードしたＤＮＡ等が例示できる。
【００９９】
本発明のＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡ、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ又はそれらのいずれかの断片を機能発現させるための形質転換法は、宿主細胞により適宜選択される。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物でるペニシリウム・シトリナムの形質転換は、ペニシリウム・シトリナムの胞子からプロトプラストを調製し、該プロトプラストに組換えＤＮＡベクターを導入することにより行なうことができる（Nara,F.,et al.,Curr.Genet.23,28(1993)記載）。
【０１００】
ペニシリウム・シトリナムを培養したスラントからＰＧＡ寒天培地のプレートへ該菌を接種し、２２乃至２８℃、１０乃至１４日間保温し、該プレートから胞子を回収し、該胞子１×１０7乃至１×１０9個を５０乃至１００ｍｌのＹＰＬ−２０培地（組成；０．１％(w/v)イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％(w/v)ポリペプトン（日本製薬（株）製）、２０％(w/v)ラクトース、ｐＨ５．０）に接種し、２２乃至２８℃、１８時間乃至２日間保温する。該培養物から発芽胞子を回収し、細胞壁分解酵素で処理し、プロトプラストを得る。細胞壁分解酵素としては、ペニシリウム・シトリナムの細胞壁を分解するものであり且つ該菌に有害な作用を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、ザイモリアーゼ、キチナーゼ等が挙げられる。
【０１０１】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物又はそのプロトプラストに、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを挿入した組換え発現ベクターを接触させると、該組換え発現ベクターがプロトプラストの中に取り込まれ、形質転換体が得られる。
【０１０２】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の形質転換体の培養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができるが、好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であるペニシリウム・シトリナムの形質転換体の場合は、予め形質転換させたプロトプラストを適当な条件下で培養することにより細胞壁を再生させ、その後培養する。すなわち、形質転換されたペニシリウム・シトリナムのプロトプラストを封入したＶＧＳ中層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、２％(w/v)寒天）をＶＧＳ下層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、２．７％(w/v)寒天）及びＶＧＳ上層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、１．５％(w/v)寒天、８００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂ）で挟み、２２乃至２８℃、７乃至１５日間保温することにより行なうことができる。得られた菌株はＰＧＡ培地上で、２２乃至２８℃で保温しつつ継代培養する。該菌株をＰＧＡ培地で作製したスラントに白金耳を用いて接種し、２２乃至２８℃、１０乃至１４日間保温し、０乃至４℃で保存する。
【０１０３】
上述の通り細胞壁を再生させたペニシリウム・シトリナムの形質転換体を培養したスラントから、ＭＢＧ３−８培地へ該形質転換体を接種し、２２乃至２８℃、７乃至１２日間、振盪しつつ保温することにより、ＭＬ−２３６Ｂを効率よく生産することができる。なお、宿主細胞のペニシリウム・シトリナムについても、全く同様の液体培養によりＭＬ−２３６Ｂを生産させることができる。
【０１０４】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の形質転換体の培養物からのＭＬ−２３６Ｂの精製は、通常天然物の精製に使用される諸技法を組み合わせることによりなされる。該諸技法としては、特に限定されないが、例えば、遠心分離、濾過による固液分離、アルカリ又は酸処理、有機溶媒による抽出、転溶、吸着及び分配等の各種クロマトグラフィー、結晶化等が挙げられる。ＭＬ−２３６Ｂは、ヒドロキシ酸体とラクトン体の両方の形をとり、相互に変換し、更に、ヒドロキシ酸体は安定な塩を形成する。このような物理化学的特質を利用して、ＭＬ−２３６Ｂのヒドロキシ酸体（以下、「遊離型ヒドロキシ酸」という。）、ＭＬ−２３６Ｂのヒドロキシ酸塩（以下、「ヒドロキシ酸塩」という。）、又はＭＬ−２３６Ｂのラクトン体（以下、「ラクトン」という。）を得ることができる。
【０１０５】
該培養物を、加熱下又は常温下でアルカリ加水分解することにより開環し、ヒドロキシ酸塩に変換し、該反応溶液を酸性にした後濾過し、濾液を水と混和しない有機溶媒で抽出することにより、目的化合物を遊離型ヒドロキシ酸として得ることができる。水と混和しない有機溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、メチレンクロリド、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、蟻酸エチル、酢酸エチル等のエステル類、それら２種以上の混合溶媒等が挙げられる。
【０１０６】
また、この遊離型ヒドロキシ酸を、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属塩類の水溶液に転溶することにより、目的化合物をヒドロキシ酸塩として得ることができる。
【０１０７】
さらに、この遊離型ヒドロキシ酸を、有機溶媒中で加熱して脱水するか、又は他の方法により閉環することにより、目的化合物をラクトンとして得ることができる。
【０１０８】
このようにして得ることができる遊離型ヒドロキシ酸、ヒドロキシ酸塩及びラクトンは、カラムクロマトグラフィー等により精製、単離することが可能である。カラムクロマトグラフィーの担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、セファデックス ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ダイヤイオン ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）、シリカゲル、逆相系担体等が挙げられ、好適にはＣ１８系の担体である。
【０１０９】
ＭＬ−２３６Ｂの定量法としては、通常有機化合物の定量に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば、逆相高性能クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下、「逆相ＨＰＬＣ」という。）法等が挙げられる。逆相ＨＰＬＣ法による定量は、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の培養物をアルカリ加水分解し、可溶性画分をＣ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに供し、紫外吸収を測定し、該吸収を定量化することにより行なうことがきる。Ｃ１８カラムラムとしては、通常の逆相ＨＰＬＣに使用されるＣ１８カラムであれば特に限定されないが、例えば、ＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２（直径６ｍｍ、長さ１００ｍｍ：センシュー科学（株）製）等が挙げられる。移動相としては、通常逆相ＨＰＬＣに使用される溶媒であれば特に限定されないが、例えば、７５％(v/v)メタノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸等が挙げられる。移動相に流速２ｍｌ／分の７５％(v/v)メタノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸を用いてＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２カラムにＭＬ−２３６Ｂを室温で添加すると、４．０分後に溶出される。ＭＬ−２３６Ｂの検出は、ＨＰＬＣ用ＵＶ検出器を用いて行なうことができ、ＵＶ検出器の吸収波長は、２２０乃至２８０ｎｍであり、好適には２２０乃至２６０ｎｍ、より好適には２３６ｎｍである。
【０１１０】
なお、本明細書においては、アデニンを「ａ」、グアニンを「ｇ」、チミンを「ｔ」、シトシンを「ｃ」とそれぞれ記載する。配列表の各配列番号に示される塩基配列は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（特許庁公表、平成１０年６月）」に従って記載した。
【０１１１】
【実施例】
以下に実施例及び試験例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１２】
実施例１．ｐＳＡＫｃｏｓ１ベクターの作製
１）大腸菌由来のハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（hygromycin B phosphotransferase gene：以下、「ＨＰＴ」という。）を含有するプラスミドｐＳＡＫ３３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）で末端を平滑化した。
２）ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて上記ＤＮＡ断片を自己環状化し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。形質転換大腸菌からＢａｍＨＩ部位を欠失したプラスミドを保有する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫ３６０と命名した。
３）ｐＳＡＫ３６０を制限酵素Ｐｖｕ２で消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、５’末端の脱リン酸化を行なった。コスミドベクターｐＷＥ１５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）からコス（ｃｏｓ）部位を含む［Ｓａｌ１−Ｓｃａ１］断片（約３ｋｂ）を取得し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより末端を平滑化した後、ｐＳＡＫ３６０のＰｖｕ２部位に連結し、ＪＭ１０９株を形質転換した。該形質転換大腸菌から［Ｓａｌ１−Ｓｃａ１］断片（約３ｋｂ）をＰｖｕ２部位に挿入したプラスミドを保有する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫｃｏｓ１と命名した。ｐＳＡＫｃｏｓ１は、ｐＷＥ１５由来のＢａｍＨ１、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１の各制限酵素認識部位を１つずつ有する。また、ｐＳＡＫｃｏｓ１は選択マーカーとして、アンピシリン耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有している。以下の実施例において、大腸菌を宿主とする場合、ｐＳＡＫｃｏｓ１又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫｃｏｓ１による形質転換体の選択は、４０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ：Ｓｉｇｍａ社製）を培地に添加して行なった。ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０を宿主とする場合、ｐＳＡＫｃｏｓ１又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫｃｏｓ１による形質転換体の選択は、２００μｇ／ｍｌのハイグロマシシンＢ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ：Ｓｉｇｍａ社製）を培地に添加して行なった。
【０１１３】
ｐＳＡＫｃｏｓ１の構築手順を図１に記載した。
実施例２．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡの調製
１）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の培養
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の種菌の培養はＰＧＡ寒天培地を用いたスラントにて行なった。すなわち、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を白金耳により接種し、２６℃にて１４日間保温した。このスラントは４℃で保存した。
【０１１４】
本培養は、液体通気培養にて行なった。上述のスラント５ｍｍ角の菌体を５０ｍｌのＭＢＧ３−８培地を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２６℃、２１０ｒｐｍの条件下で５日間振盪培養した。
２）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の培養物からのゲノムＤＮＡの調製
１）の培養物を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離し、菌体を回収した。湿重量３ｇの菌体を、ドライアイスで冷却した乳鉢上で粉末になるまで破砕した。菌体破砕物を２０ｍｌの６２．５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光純薬（株）製）−５％(w/v)ＳＤＳ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（和光純薬（株）製）−塩酸（和光純薬（株）製）緩衝液（ｐＨ８．０）で満たした遠心管に入れ、穏やかに混合した後、０℃にて１時間静置した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-塩酸−０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐＨ８．０：以下「ＴＥ」という。）で飽和した１０ｍｌのフェノールを添加し、５０℃にて１時間穏やかに攪拌した。室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した後、１５ｍｌの上層（水相）を別の遠心管に分注した。
【０１１５】
この上層（水相）に０．５倍容のＴＥ飽和フェノール及び０．５倍容のクロロホルム溶液を加え、２分間穏やかに攪拌した後、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した（以下、「フェノール・クロロホルム抽出」という。）。
【０１１６】
１０ｍｌの上層（水相）に１０ｍｌの８Ｍ 酢酸アンモニウム（ｐＨ７．５）及び２５ｍｌの２−プロパノール（和光純薬（株）製）を添加し、−８０℃にて１５分間冷却した後、４℃、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌのＴＥに溶解させた後、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ社製）及び２５０単位のリボヌクレアーゼＴ１（ＧＩＢＣＯ社製）を添加し、３７℃にて２０分間保温した。これに２０ｍｌの２−プロパノールを添加し、穏やかに混合した後、糸状のゲノムＤＮＡをパスツールピペットの先端に巻きつけ、１ｍｌのＴＥに溶解させた。
【０１１７】
このＤＮＡ溶液に０．１倍容の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び２．５倍容のエタノールを加え、−８０℃にて１５分冷却した後、４℃、１００００×Ｇの条件下で５分間遠心分離した（以下、「エタノール沈澱」という。）。
【０１１８】
得られた沈澱を２００μｌのＴＥに溶解し、ゲノムＤＮＡ画分とした。
実施例３．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーの作製
１）ゲノムＤＮＡ断片の調製
実施例２において得られたペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（５０μｇ）を含む１００μｌの水溶液に、０．２５単位のＳａｕ３Ａ１（宝酒造（株）製）を添加した後、１０、３０、６０、９０及び１２０秒経過後に２０μｌずつサンプリングし、各サンプルに２０μｌずつの０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えて制限酵素反応を停止した。アガロースゲル電気泳動により、得られた部分消化ＤＮＡ断片を分離し、３０ｋｂ以上の大きさをもつＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを回収した。
【０１１９】
回収したゲルを細かく砕き、ウルトラフリーＣ３遠心式ろ過ユニット（日本ミリポア（株）製）に入れた。−８０℃にて１５分間冷却し、ゲルを凍結した後、３７℃にて１０分間保温してゲルを融解した。５０００×Ｇ、５分間遠心分離し、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに溶解した。
２）ＤＮＡベクター ｐＳＡＫｃｏｓ１の前処理
ｐＳＡＫｃｏｓ１を制限酵素ＢａｍＨ１（宝酒造（株）社製）により消化した後、６５℃にて３０分間アルカリフォスファターゼ（宝酒造（株）製）反応を行った。反応終了液について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに溶解した。
３）ライゲーション及びｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング
上記１）記載のゲノムＤＮＡ断片（２μｇ）及び上記２）記載の前処理済みｐＳＡＫｃｏｓ１（１μｇ）を混合し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用い、１６℃にて１６時間ライゲーション反応を行なった。反応終了液について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を５μｌのＴＥに溶解させた。ライゲーション生成物溶液を、ＧＩＧＡＰＡＫ ＩＩ Ｇｏｌｄ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）キットを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングに供し、組換えＤＮＡベクターを含む形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌のコロニーを形成させたプレートに３ｍｌのＬＢ培地を注ぎ、セルスクレーパーを用いてプレート上のコロニーを回収した（回収液１という）。さらに３ｍｌのＬＢ培地でプレートを洗浄、回収した（回収液２という。）。回収液１及び２の混合液にグリセリンを終濃度１８％となるよう加えたものを大腸菌菌体液と称し、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーとして、−８０℃にて保存した。
実施例４．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによるＰＫＳ遺伝子断片の増幅
１）ＰＣＲ用プライマーの設計及び合成
アスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）のＰＫＳ遺伝子のアミノ酸配列（Brown,D.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,1418(1996)記載）に基づき、配列表の配列番号３及び４に示されるミックス・プライマーを設計及び合成した。該合成はホスフォロアミダイト法により行った。
【０１２０】
配列表の配列番号３：gayacngcntgyasttc
配列表の配列番号４：tcnccnknrcwgtgncc
なお、配列表の配列番号３及び４に示される塩基配列において、nはイノシンの塩基（ヒポキサンチン）を、yはt又はcを、sはg又はcを、kはg又はtを、rはg又はaを、wはa又はtを、それぞれ表わす。
２）ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅
上記２）記載のＰＣＲ用プライマー（各１００ｐｍｏｌ）、実施例２で得られたペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、５０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウム及び１．２５単位のＥｘ．Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）を含む５０μｌの反応液を、９４℃にて１分間、５８℃にて２分間、７０℃にて３分間、の連続する３工程からなるサイクル反応に供した。このサイクルを３０回繰り返すことによりＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ ＴＰ３０００（宝酒造（株）製）を使用して行なった。
【０１２１】
増幅されたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動に供した後、約１．０乃至２．０ｋｂの大きさをもつＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを回収した。ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに溶解した。
３）ライゲーション及び形質転換
２）で得られたＤＮＡ断片、及び、ＴＡクローニング・システムｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、このキットに含まれるプラスミドｐＣＲ２．１にライゲーションし、形質転換株を得た。
【０１２２】
得られたクローンを数個選び、マニアティスら（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）の方法に従って培養した。すなわち、２ｍｌのＬＢ培地を含む２４ｍｌ容の試験管に各コロニーを接種し、３７℃にて１８時間、振盪培養した。
【０１２３】
この培養物からの組換えＤＮＡベクターの調製は、アルカリ法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）に従った。すなわち、１．５ｍｌの培養液を、室温、１００００×Ｇの条件下で２分間遠心分離し、沈澱より菌体を回収した。菌体に１００μｌの５０ｍＭ グルコース−２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-塩酸−１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） を加えて懸濁し、２００μｌの０．２規定水酸化ナトリウム−１％(w/v)ＳＤＳを加えて穏やかに攪拌し、溶菌させた。これに１５０μｌの３Ｍ 酢酸カリウム−１１．５％(w/v)氷酢酸を加えてタンパク質を変成させ、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離し、上清を回収した。上清について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含有する５０μｌのＴＥに溶解させた。
【０１２４】
各組換えＤＮＡベクターを制限酵素消化して電気泳動に供し、電気泳動パターンの異なる組換えＤＮＡベクター中の挿入塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７７：パーキンエルマー・ジャパン社製）を用いて決定した。
【０１２５】
その結果、ＰＫＳ遺伝子断片を含む組換えＤＮＡベクターを保有する株の存在が確認された。
【０１２６】
実施例５．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノミック・サザンブロットハイブリダイゼーション
１）電気泳動及びメンブレンへのトランスファー
実施例２において得られたのペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、Ｈｉｎｄ３又はＳａｃ１（いずれも宝酒造（株）製）を用いて消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲルの調製には、Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ０３「ＴＡＫＡＲＡ」（宝酒造（株）製）を用いた。泳動後、ゲルを０．２５規定塩酸（和光純薬（株）製）に浸し、室温にて１０分間穏やかに振盪した。このゲルを０．４規定水酸化ナトリウム（和光純薬（株）製）中に移し、室温にて３０分間穏やかに振盪した。マニアティスらのアルカリトランスファー法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）により、ゲル中のＤＮＡをナイロン・メンブレンＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ+（アマシャム社製）にトランスファーし、固定した。メンブレンを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）で洗浄した後風乾した。
２）ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出
１）で得られたメンブレンに対し、実施例４で得られたＰＫＳ遺伝子断片をプローブとして用いたハイブリダイゼーションを行なった。
【０１２７】
プローブには、実施例４において得られたＰＫＳ遺伝子断片ＤＮＡ（１μｇ）をＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）で標識し、使用直前に１０分間煮沸後急冷したものを用いた。
【０１２８】
ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージーハイブ：ベーリンガー・マンハイム社製）に１）記載のメンブレンを浸し、２０ｒｐｍで振盪しつつ、４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行なった後、上述の標識プローブをハイブリダイゼーション液に添加し、マルチシェーカー・オーブンＨＢ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用い、２０ｒｐｍで振盪しつつ４２℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションを行なったメンブレンについて、２×ＳＳＣを用いた室温、２０分間の洗浄を３回、０．１×ＳＳＣを用いた５５℃、３０分間の洗浄を２回、それぞれ行なった。
【０１２９】
洗浄したメンブランをＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ベーリンガー・マンハイム社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミフィルム：ベーリンガー・マンハイム社製）に露光した。感光は富士メディカルフィルムプロセサーＦＰＭ８００Ａ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて行なった。
【０１３０】
その結果、実施例４において得られたＰＫＳ遺伝子断片はペニシリウム・シトリナムのゲノム上に存在することが確認された。
【０１３１】
実施例６．ＰＫＳ遺伝子断片をプローブとしたペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＰＫＳ遺伝子を含むゲノムＤＮＡのクローニングは、コロニーハイブリダイゼーション法により行なった。
１）メンブレンの調製
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーとして保存した大腸菌菌体液（実施例３記載）を、ＬＢ寒天培地のプレートに、プレート１枚あたり５０００乃至１００００個のコロニーが生育するよう希釈して撒いた。このプレートを２６℃にて１８時間保温した後、４℃にて１時間冷却した。ＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ＋（アマシャム社製）をプレートにのせ、１分間接触させた。コロニーを付着させたメンブレンをプレートから注意深く離し、コロニー接触面を上にして、２００ｍｌの１．５Ｍ 塩化ナトリウム−０．５規定 水酸化ナトリウムに７分、２００ｍｌの１．５Ｍ 塩化ナトリウム−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ-塩酸−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に３分ずつ２回浸した後、４００ｍｌの２×ＳＳＣで洗浄した。洗浄したメンブレンを３０分風乾した。
２）ハイブリダイゼーション
プローブには、実施例４において得られたＰＫＳ遺伝子断片ＤＮＡ（１μｇ）をＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）で標識し、使用直前に１０分間煮沸後急冷したものを用いた。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージーハイブ：ベーリンガー・マンハイム社製）に１）記載のメンブレンを浸し、２０ｒｐｍで振盪しつつ、４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行なった後、上述の標識プローブをハイブリダイゼーション液に加え、マルチシェーカー・オーブンＨＢ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用い、２０ｒｐｍで振盪しつつ４２℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションを行なったメンブレンについて、２×ＳＳＣを用いた室温、２０分間の洗浄を３回、０．１×ＳＳＣを用いた６８℃、３０分間の洗浄を２回、それぞれ行なった。
【０１３３】
洗浄したメンブランをＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ベーリンガー・マンハイム社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミフィルム：ベーリンガー・マンハイム社製）に露光した。感光は富士メディカルフィルムプロセサーＦＰＭ８００Ａ：Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて行なった。
【０１３４】
以上、１）及び２）記載の操作をスクリーニングという。
【０１３５】
一回目のスクリーニングで陽性シグナルが検出されたクローンのコロニー周辺をかきとってＬＢ培地に懸濁した後、適宜希釈してプレートに撒いて培養し、同様に二回目のスクリーニングを行ない、陽性クローンを純化した。
【０１３６】
なお、本実施例で得られた陽性クローン、すなわち形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９は、平成１１年（１９９９年）７月７日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０を付された。
【０１３７】
実施例７．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４８の挿入配列の解析（１）
実施例６で得られたＥ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９株の培養及び該培養物からの組換えＤＮＡベクターの調製は、実施例４記載の方法に準じて行なった。
【０１３８】
得られた組換えＤＮＡベクターをｐＭＬ４８と命名した。ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡである、ｐＭＬ４８挿入配列を、各種制限酵素消化し、ｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）に組込むことにより、サブクローニングした。得られたサブクローンをプローブとして、実施例５記載の方法に準じてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行なった。すなわち、ｐＭＬ４８の各種制限酵素消化物を電気泳動に供し、ＤＮＡをメンブレンへトランスファーしたものに対して、ハイブリダイゼーションを行なった。
【０１３９】
その結果、ｐＭＬ４８挿入配列の制限酵素地図が作成された。
【０１４０】
また、上述の各サブクローンの挿入配列の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーモデル３７７（パーキンエルマー・ジャパン社製）を用いて決定し、ｐＭＬ４８の全塩基配列を決定した。
【０１４１】
ｐＭＬ４８の挿入配列は全３４２０３塩基であった。
【０１４２】
ｐＭＬ４８の挿入配列の塩基配列は、配列表の配列番号１及び２に記載されている。配列表の配列番号１及び２に示される塩基配列は、互いに、完全に相補的である。
【０１４３】
該挿入配列上の構造遺伝子の存在について、遺伝子検索プログラムＧＲＡＩＬ（ＡｐｏＣｏｍ ＧＲＡＩＬ Ｔｏｏｌｋｉｔ：ＡＰＯＣＯＭ社製）及び相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２）：ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒ．１０．０に搭載）を用いて解析した。
【０１４４】
その結果、ｐＭＬ４８の挿入塩基配列中には、６種類の異なる構造遺伝子の存在が推定され、それぞれをｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲと命名した。また、ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲは配列表の配列番号２記載の塩基配列中に、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤは配列表の配列番号１に示される塩基配列中に、それぞれコード領域を有していることが推定された。さらに、該挿入配列における各推定構造遺伝子の相対的位置及び大きさが推定された。
【０１４５】
本実施例の結果を図２に記載した。
実施例８．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４８の挿入配列の解析（２）
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法及びＲＡＣＥにより、実施例７において存在が示唆された構造遺伝子の発現解析、及び５’−末端並びに３’−末端領域の解析を行なった。
１）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０の全ＲＮＡの調製
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養したスラント（実施例２記載）より５ｍｍ角の菌体を１０ｍｌのＭＧＢ３−８培地を入れた１００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２６℃にて３日間、振盪培養した。
【０１４６】
培養物からの全ＲＮＡの調製は、グアニジン・イソチオシアネート法を利用したＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて行った。すなわち、培養物を、室温、５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して菌体を回収し、湿重量２ｇの菌体を液体窒素により凍結した後、乳鉢上で粉末になるまで破砕した。この破砕物をグアニジン・イソチオシアネートを含む４ｍｌの菌体溶解バッファー（このキットに含まれる。）に懸濁した。懸濁液をこのキットに含まれるＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム１０本に４５０μｌずつ分注し、室温、１０００×Ｇ、１０分間遠心分離した後、溶出液をそれぞれ回収した：各溶出液に２２５μずつのエタノールを加えた後、このキットに含まれるＲＮＡミニスピンカラムに添加した。このカラムをこのキットに含まれる洗浄用緩衝液で洗浄した後、５０μｌずつのリボヌクレアーゼ・フリー蒸留水で吸着物を溶出させ、溶出液を全ＲＮＡ画分とした。
２）ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション
２０μｇのペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０の全ＲＮＡを含む２．２５μｌの水溶液に、１μｌの１０×ＭＯＰＳ（組成；２００ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．０：１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌してから使用した。：同仁化学研究所（株）製）、１．７５μｌのホルムアルデヒド及び５μｌのホルムアミドを添加して混合し、ＲＮＡサンプルとした。このＲＮＡサンプルを、６５℃にて１０分間保温した後、氷水中で急冷し、アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動のゲルは、１０ｍｌの１０×ＭＯＰＳ及び１ｇの Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ０３「ＴＡＫＡＲＡ」（宝酒造（株）製）を７２ｍｌのピロカルボニック・アシッド・ジエチルエステル（Ｓｉｇｍａ社製）処理水に混合し、加熱してアガロースを溶解させた後冷却させ、１８ｍｌのホルムアルデヒドを添加することにより作製した。サンプルバッファーは、１×ＭＯＰＳ（１０×ＭＯＰＳを水で１０倍希釈したもの。）を使用した。ゲル中のＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中でＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ+（アマシャム社）へトランスファーした。
【０１４７】
プローブには、ｐＭＬ４８挿入配列を下記表１記載の制限酵素１及び２で消化することにより得られるＤＮＡ断片（a、b、c、d及びe）を用いた。
【０１４８】
【表１】
【０１４９】
プローブの標識、ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出は、実施例５のサザンブロット・ハイブリダイゼーションに従って行なった。
【０１５０】
本実施例の結果を図３に記載した。
【０１５１】
各シグナルは各プローブの塩基配列と相同な転写産物の存在を示す。
【０１５２】
本実施例でｐＭＬ４８挿入配列上に存在が推定された６つの構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲはペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株内で転写されていることが確認された。
【０１５３】
各シグナルの位置は、転写産物の相対的なサイズを示すものではない。
３）５’ＲＡＣＥによる５’−末端配列の決定
各構造遺伝子の５’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得は、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて行なった。
【０１５４】
実施例７及び本実施例の２）の結果より推定されたｐＭＬ４８の挿入配列上の各構造遺伝子において、コード領域であり且つ該遺伝子の５’−末端近傍に位置すると考えられる塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡを２種類作製した。
【０１５５】
表２に、各構造遺伝子の、より３’−側に位置する塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）の塩基配列を、表３に、より５’−側に位置する塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）の塩基配列を、それぞれ記載した。
【０１５６】
【表２】
【０１５７】
【表３】
【０１５８】
オリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）をプライマーとし、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した。すなわち、１μｇの全ＲＮＡ、２．５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）、１μｌのＳＵＰＥＲ ＳＣＲＩＰＴＴＭ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（このキットに含まれる。）を含む２４μｌの反応液を、１６℃にて１時間保温した後、生成物をこのキットに含まれるＧＬＡＳＳＭＡＸスピンカートリッジに添加してｃＤＮＡ第一鎖を精製した。
【０１５９】
ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端に、このキットに含まれるｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによりポリＣ鎖を付加させた。
【０１６０】
３’−末端にポリＣ鎖の付加したｃＤＮＡ第一鎖、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）及び４０ｐｍｏｌのＡｂｒｉｇｅｄ Ａｎｃｈｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ（このキットに含まれる）を含む５０μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３５回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製し、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いてクローニングした。
【０１６１】
以上の操作を５’ＲＡＣＥという。
【０１６２】
５’−末端を含むｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、転写開始点及び翻訳開始コドンの位置を推定した。
【０１６３】
５’ＲＡＣＥにより得られた各構造遺伝子に対応する５’−末端ｃＤＮＡ断片の塩基配列を記載した配列表の配列番号を表４に表示した。また、表５に、各構造遺伝子の転写開始点及び翻訳開始の存在する配列番号、転写開始点の位置及び翻訳開始点の位置を記載した。
【０１６４】
【表４】
【０１６５】
【表５】
【０１６６】
４）３’ＲＡＣＥによる３’−末端配列の決定
各構造遺伝子の３’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得は、Ｒｅａｄｙ Ｔｏ Ｇｏ：Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いて行なった。
【０１６７】
実施例７及び本実施例の２）の結果より推定されたｐＭＬ４８の挿入塩基配列上の各構造遺伝子において、コード領域であり、構造遺伝子の３’−末端近傍に位置すると考えられるセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）を１種類ずつを作製した。
【０１６８】
表６に各構造遺伝子について作製したオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）の塩基配列を表示した。
【０１６９】
【表６】
【０１７０】
オリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）をプライマーとし、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の全ＲＮＡ（１μｇ）を鋳型とした逆転写反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した。
【０１７１】
ｃＤＮＡ第一鎖、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）及びＮｏｔＩ−ｄ（Ｔ）１８プライマー（このキットに含まれる。）を含む１００μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３５回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製し、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いてクローニングした。
【０１７２】
以上の操作を３’ＲＡＣＥという。
【０１７３】
得られたｃＤＮＡの３’−側断片の塩基配列を決定し、翻訳終止コドンの位置を推定した。
【０１７４】
３’ＲＡＣＥにより得られた各構造遺伝子に対応する３’−末端ｃＤＮＡ断片の塩基配列を記載した配列表の配列番号を表７にまとめた。また、表８に、各構造遺伝子の翻訳終止コドン及び該コドンの位置を配列表の配列番号１又は２に基いて記載した。
【０１７５】
【表７】
【０１７６】
【表８】
【０１７７】
さらに、各構造遺伝子がコードすると推定されるポリペプチドのＣ末端のアミノ酸残基、そのアミノ酸残基をコードするトリヌクレオチドの塩基配列及びそのトリヌクレオチドの位置を表９に記載した。
【０１７８】
【表９】
【０１７９】
さらに、表８記載の翻訳終止コドンに対する相補配列、該相補配列の存在する配列番号、及び、該相補配列の位置を表１０にまとめた。
【０１８０】
【表１０】
【０１８１】
以上の通り、各構造遺伝子の存在、その方向及びその位置が明らかとなった。これらの情報に基いて、各構造遺伝子の転写産物及び翻訳産物を取得することが可能である。
実施例９．構造遺伝子ｍｌｃＥに対応するｃＤＮＡの取得
１）全ＲＮＡの調製
ペニシリウム・シトリナムの全ＲＮＡは実施例８の方法に従って調製した。
２）プライマーの設計
実施例８により決定された構造遺伝子ｍｌｃＥに対応する完全長のｃＤＮＡを取得するために、ｍｌｃＥの５’−上流域のヌクレオチド配列よりセンス・プライマー（5'-gttaacatgtcagaacctctaccccc-3'：配列表の配列番号３５番参照）を、３’−下流域のヌクレオチド配列よりアンチセンス・プライマー（5'-aatatttcaagcatcagtctcaggcac-3'：配列表の配列番号３６番参照）を、それぞれ設計及び合成した。該合成はホスフォロアミダイト法により行った。
３）ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｌｃＥの遺伝子産物をコードする完全長のｃＤＮＡを取得するために、Ｔａｋａｒａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１を用いた。
【０１８２】
１μｇの全ＲＮＡ、キットに添付のＲａｎｄｏｍ ９ｍｅｒｓプライマーを２．５ｐｍｏｌ、１μｌの逆転写酵素（キットに含まれる。）を含む２０μｌの反応液を４２℃にて３０分保温し、ｃＤＮＡ第１鎖を合成した後、９９℃にて５分間加熱して逆転写酵素を失活させた。
【０１８３】
ｃＤＮＡ第１鎖反応溶液全量、４０ｐｍｏｌのセンス・プライマー及び４０ｐｍｏｌのアンチセンス・プライマーを含む総容１００μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３０回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製した。つづいて、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いて、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換し、形質転換大腸菌から該ＤＮＡ断片を所有したプラスミドを保持する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＣＲｅｘｐＥと命名した。
【０１８４】
得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＥ中の挿入ＤＮＡの塩基配列を決定したところ、該挿入ＤＮＡは構造遺伝子ｍｌｃＥに対応する完全長のｃＤＮＡを含んでいた。その塩基配列及びその塩基配列によりコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列は、配列表の配列番号３７及び／又は３８に記載されている。
実施例１０．構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡの取得
１）全ＲＮＡの調製
ペニシリウム・シトリナムの全ＲＮＡは実施例８の方法に従って調製した。
２）プライマーの設計
実施例８により決定された構造遺伝子ｍｌｃＲに対応する完全長のｃＤＮＡを取得するために、ｍｌｃＲの５’−上流域のヌクレオチド配列よりセンス・プライマー（5'-ggatccatgtccctgccgcatgcaacgattc-3'：配列表の配列番号３９参照）を、３’−下流域のヌクレオチド配列よりアンチセンス・プライマー（5'-ggatccctaagcaatattgtgtttcttcgc-3'：配列表の配列番号４０参照）を、それぞれ設計及び合成した。該合成はホスフォロアミダイト法により行った。
３）ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｌｃＲの遺伝子産物をコードする完全長のｃＤＮＡを取得するために、Ｔａｋａｒａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１を用いた。
【０１８５】
１μｇの全ＲＮＡ、キットに添付のＲａｎｄｏｍ ９ｍｅｒｓプライマーを２．５ｐｍｏｌ、１μｌの逆転写酵素（キットに含まれる。）を含む２０μｌの反応液を４２℃にて３０分保温し、ｃＤＮＡ第１鎖を合成した後、９９℃にて５分間加熱して逆転写酵素を失活させた。
【０１８６】
ｃＤＮＡ第１鎖反応溶液全量、４０ｐｍｏｌのセンス・プライマー及び４０ｐｍｏｌのアンチセンス・プライマーを含む総容１００μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３０回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製した。つづいて、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いて、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換し、形質転換大腸菌から該ＤＮＡ断片を所有したプラスミドを保持する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＣＲｅｘｐＲと命名した。
【０１８７】
得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＲ中の挿入ＤＮＡの塩基配列を決定したところ、該挿入ＤＮＡは構造遺伝子ｍｌｃＲに対応する完全長のｃＤＮＡを含んでいた。その塩基配列及びその塩基配列によりコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列は、配列表の配列番号４１及び／又は４２に記載されている。
実施例１１．発現ベクターｐＳＡＫ７００の構築
実施例１記載のベクターｐＳＡＫ３３３及びｐＳＡＫ３６０を用いて、ｃＤＮＡ発現ベクターｐＳＡＫ７００の構築を行なった。
１）ｐＳＡＫ３３３を制限酵素ＢａｍＨ１とＨｉｎｄ３（宝酒造（株）製）で二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、４．１ｋｂ断片をゲルより回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）で該ＤＮＡ断片の末端を平滑化した。
２）ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて上記ＤＮＡ断片に、ＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１−ＢａｍＨ１アダプター（宝酒造（株）製）を連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。形質転換大腸菌からアダプターを所有したプラスミドを保有する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫ４１０と命名した。
３）ｐＳＡＫ３６０を制限酵素Ｐｖｕ２及びＳｓｐ１で二重消化した後、電気泳動を行ない、アスペルギルス・ニデュランス由来の３−ホスホグリセレートキナーゼ（3-phosphoglycerate kinase：以下、「ｐｇｋ」という。）遺伝子のプロモーター及びターミネーター、大腸菌由来のＨＰＴを含有するＤＮＡ断片（約２．９ｋｂ）をゲルより回収した。
４）回収した上記ＤＮＡ断片を、ｐＳＡＫ４１０のＰｖｕ２部位に、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。形質転換大腸菌から該ＤＮＡ断片を所有したプラスミドを保持する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫ７００と命名した。
【０１８８】
ｐＳＡＫ７００の構築手順を図４に記載する。
【０１８９】
ｐＳＡＫ７００は、アダプター由来のＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの各制限酵素認識部位を１つずつ有する。また、ｐＳＡＫ７００は選択マーカーとして、アンピシリン耐性遺伝子（Ampicillin resistant gene：以下、「Ａｍｐr」という。）及びハイグロマイシン耐性遺伝子であるＨＴＰを有している。以下の実施例において、大腸菌を宿主とする場合、ｐＳＡＫ７００又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫ７００による形質転換体の選択は、４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを培地に添加して行なった。ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０を宿主とする場合、ｐＳＡＫ７００又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫ７００による形質転換体の選択は、２００μｇ／ｍｌのハイグロマシシンＢを培地に添加して行なった。
実施例１２．組換え発現ベクターｐＳＡＫｅｘｐＥの構築
１）実施例９で得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＥを制限酵素ＨｐａＩ及びＳｓｐＩ（ともに，宝酒造（株）製）の存在下で３７℃にて２時間反応させ、該反応物をアガロースゲル電気泳動に供し、ｍｌｃＥの完全長ｃＤＮＡを含む１．７ｋｂ付近のバンドをゲルより回収した。
２）ｐＳＡＫ７００を制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造（株）製）で３７℃１時間反応させた後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）と３７℃５分間反応させることにより末端を平滑化し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。得られた沈殿を少量のＴＥに溶解させ、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）製）を添加し、６５℃３０分間反応させた。このように平滑末端化したｐＳＡＫ７００のＮｏｔ１消化物と、１）で得られた１．７ｋｂのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。その結果、組換え発現ベクターで形質転換された大腸菌株が得られた。
【０１９０】
本実施例で得られた形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５を付与された。
実施例１３．組換え発現ベクターｐＳＡＫｅｘｐＲの構築
１）実施例１０で得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＲを制限酵素ＢａｍＨ１（宝酒造（株）製）の存在下で３７℃にて２時間反応させ、該反応物をアガロースゲル電気泳動に供し、ｍｌｃＲの完全長ｃＤＮＡを含む１．４ｋｂ付近のバンドをゲルより回収した。
２）ｐＳＡＫ７００を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）で３７℃１時間反応させた後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造（株）製）を添加して６５℃にて３０分間反応させた。このようにＢａｍＨ１消化されたｐＳＡＫ７００と、１）で得られた１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。その結果、組換え発現ベクターで形質転換された大腸菌株が得られた。
【０１９１】
本実施例で得られた形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６を付与された。
実施例１４．ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の形質転換
１）プロトプラストの調製
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養したスラントより、白金耳を用いてＰＧＡ寒天培地に接種し、２６℃にて１４日間保温した。該培養物よりペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の胞子を回収し、１×１０8個の胞子を８０ｍｌのＹＰＬ−２０培地に接種し、２６℃にて１日間保温した。胞子の発芽を顕微鏡観察により確認した後、発芽胞子を、室温、５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して胞子を沈澱として回収した。胞子を滅菌水で３回洗浄した後、プロトプラスト化を行なった。すなわち、２００ｍｇのザイモリアーゼ２０Ｔ（生化学工業（株）製）及び１００ｍｇのキチナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍｌの０．５５Ｍ 塩化マグネシウムに溶解し、室温、５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して得られた上清を酵素液とし、２０ｍｌの酵素液及び湿重量０．５ｇの発芽胞子を１００ｍｌ容三角フラスコに入れ、３０℃にて６０分間穏やかに振盪し、発芽胞子がプロトプラスト化したことを顕微鏡観察により確認した後、反応液を３Ｇ−２ガラスフィルター（ＨＡＲＩＯ社製）で濾過した。該濾液を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離し、プロトプラストを沈澱として回収した。
２）形質転換
１）で得られたプロトプラストを３０ｍｌの０．５５Ｍ 塩化マグネシウム溶液で２回、３０ｍｌの０．５５Ｍ 塩化マグネシウム−５０ｍＭ 塩化カルシウム−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ｐＨ６．３：以下、「ＭＣＭ溶液」という。）で１回それぞれ洗浄し、１００μｌの４％(w/v)ポリエチレングリコール８０００−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸−０．００２５％(w/v)ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社製）−５０ｍＭ 塩化マグネシウム（ｐＨ６．３：以下、「形質転換用溶液」という。）に懸濁した。約５×１０7個のプロトプラストを含む９６μｌの形質転換溶液及び１２０μｇのｐＳＡＫｅｘｐＥ（実施例１２記載）又はｐＳＡＫｅｘｐＲ（実施例１３記載）を含む１０μｌのＴＥを混合し、氷上で３０分間静置した。これに１．２ｍｌの２０％(w/v)ポリエチレングリコール−５０ｍＭ 塩化マグネシウム−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ｐＨ６．３）を加えて穏やかにピペッティングし、室温、２０分間静置した。これに１０ｍｌのＭＣＭ溶液を加えて穏やかに混合し、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した。沈澱より形質転換プロトプラストを回収した。
３）形質転換プロトプラストにおける細胞壁の再生
２）で得られた形質転換プロトプラストを５ｍｌの液状のＶＧＳ中層寒天培地に懸濁し、固化した１０ｍｌのＶＧＳ下層寒天培地プレートに重層した。該プレートを、２６℃にて１日間培養した後、プレート１枚につき５ｍｇのハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ：Ｓｉｇｍａ社製）を含む１０ｍｌの液状のＶＧＳ上層寒天培地を重層した（ハイグロマイシンＢの終濃度は２００μｇ／ｍｌ）。２６℃にて１４日間保温して得られた菌株を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有するＰＧＡ寒天培地上で継代培養した後、ＰＧＡ寒天培地で作製したスラントに植え継ぎ、２６℃にて１４日間保温した。
【０１９２】
該スラントは４℃で保存した。
実施例１５．構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤに対応する各ｃＤＮＡ配列の決定
１）構造遺伝子ｍｌｃＡに対応するｃＤＮＡ配列の決定
ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ ｖｅｒ１．１（宝酒造（株）製）を用いてｃＤＮＡ第１鎖を合成した。
【０１９３】
所望のｃＤＮＡの全長又はその部分領域を増幅するために多種のプライマーを設計し、該ｃＤＮＡ第１鎖を鋳型として以下の条件によるＰＣＲを行った；Ｔｈｅ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ／Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ及びＫｉｔとＴｈｅ ＡＢ１ Ｐｒｉｓｍ ３７７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ともに、ＰＥアプライド・バイオシステムズ社製）を用い、９４℃にて３０秒、６２℃にて３０秒、７２℃にて５分からなる反応サイクルを３０回反復した。
【０１９４】
ＰＣＲ産物をそれぞれプラスミドｐＣＲ２．１へ挿入した。
【０１９５】
組換プラスミドでそれぞれ大腸菌を形質転換した。
【０１９６】
形質転換大腸菌から得られた組換プラスミドの各挿入配列のヌクレオチド配列と構造遺伝子ｍｌｃＡのヌクレオチド配列とを比較することにより、エキソンとイントロンの構造を決定した。
【０１９７】
このようにして、構造遺伝子ｍｌｃＡに対応するｃＤＮＡの配列が決定され（配列表の配列番号４３）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号４４）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０１９８】
構造遺伝子ｍｌｃＡによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するＬＮＫＳ（ｌｏｖＥ）であり、６０％同一であった。
２）構造遺伝子ｍｌｃＢに対応するｃＤＮＡ配列の決定
１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＢに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号４５）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号４６）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０１９９】
構造遺伝子ｍｌｃＢによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するＬＤＫＳ（ｌｏｖＦ）であり、６１％同一であった。
３）構造遺伝子ｍｌｃＣに対応するｃＤＮＡ配列の決定
１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＣに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号４７）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号４８）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０２００】
構造遺伝子ｍｌｃＣによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するｌｏｖＡであり、７２％同一であった。
４）構造遺伝子ｍｌｃＤに対応するｃＤＮＡ配列の決定
１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＤに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号４９）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号５０）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０２０１】
構造遺伝子ｍｌｃＤによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するＯＲＦ８であり、６３％同一であった。
５）構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤの各エキソンの、ｐＭＬ４８挿入配列上の位置は、表１３に示す通りである。
【０２０２】
【表１１】
【０２０３】
また、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲの転写終結点の、ｐＭＬ４８挿入配列上の位置は、表１２に示す通りである。
【０２０４】
【表１２】
【０２０５】
実施例１６．構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ又はｍｌｃＤの破壊
ＤＮＡの相同組換（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）手法を用いた部位特異的変異（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ又はｍｌｃＤを破壊した。
１）構造遺伝子ｍｌｃＡ破壊株の取得とその解析
ｐＳＡＫ３３３を用い、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＡを破壊するための組換プラスミドを作製した。
【０２０６】
ｐＭＬ４８挿入配列を制限酵素Ｋｐｎ１で消化し、構造遺伝子ｍｌｃＡ中の４．１断片を回収、精製した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、制限酵素Ｐｖｕ２で消化したｐＳＡＫ３３３に連結した。得られたプラスミドをｐｄｉｓｍｌｃＡと命名した。
【０２０７】
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ １３３８０株をｐｄｉｓｍｌｃＡで形質転換した。
【０２０８】
ｐｄｉｓｍｌｃＡ形質転換株のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行い、構造遺伝子ｍｌｃＡの破壊を確認した。
【０２０９】
得られた構造遺伝子ｍｌｃＡ破壊株は、ＭＬ−２３６Ｂ及びその前駆体を全く生産しなかった。
２）構造遺伝子ｍｌｃＢ破壊株の取得とその解析
ｐＳＡＫ３３３を用い、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＢを破壊するための組換プラスミドを作製した。
【０２１０】
ｐＭＬ４８挿入配列を制限酵素Ｐｓｔ１及びＢａｍＨ１で消化し、構造遺伝子ｍｌｃＢ中の１．４ｋｂ断片を回収、精製した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、制限酵素Ｐｖｕ２で消化したｐＳＡＫ３３３に連結した。得られたプラスミドをｐｄｉｓｍｌｃＢと命名した。
【０２１１】
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ １３３８０株をｐｄｉｓｍｌｃＢで形質転換した。
【０２１２】
ｐｄｉｓｍｌｃＢ形質転換株のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行い、構造遺伝子ｍｌｃＢの破壊を確認した。
【０２１３】
得られた構造遺伝子ｍｌｃＢ破壊株は、ＭＬ−２３６Ｂを生産せず、ＭＬ−２３６Ｂの前駆体であるＭＬ−２３６Ａを生産した。
３）構造遺伝子ｍｌｃＤ破壊株の取得とその解析
ｐＳＡＫ３３３を用い、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＤを破壊するための組換プラスミドを作製した。
【０２１４】
ｐＭＬ４８挿入配列を制限酵素Ｋｐｎ１及びＢａｍＨ１で消化し、構造遺伝子ｍｌｃＤ中の１．４ｋｂ断片を回収、精製した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、制限酵素Ｐｖｕ２で消化したｐＳＡＫ３３３に連結した。得られたプラスミドをｐｄｉｓｍｌｃＤと命名した。
【０２１５】
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ １３３８０株をｐｄｉｓｍｌｃＤで形質転換した。
【０２１６】
ｐｄｉｓｍｌｃＤ形質転換株のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行い、構造遺伝子ｍｌｃＤの破壊を確認した。
【０２１７】
得られた構造遺伝子ｍｌｃＤ破壊株のＭＬ−２３６Ｂ生産量は、対照のｍｌｃＤ非破壊株の３０％であった。
実施例１７．ｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株における構造遺伝子ｍｌｃＲの機能解析
実施例１３において得られた２つのｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株（ＴＲ１及びＴＲ２）及び対照の非形質転換株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）を、それぞれＭＢＧ３−８培地に接種し、実施例８記載の方法により培養した。
【０２１８】
培養終了後、実施例８記載の方法により、全ＲＮＡを抽出した。
【０２１９】
全ＲＮＡを鋳型とし、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ又はｍｌｃＲのヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド（表１３参照）をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２２０】
【表１３】
【０２２１】
ＴＲ１、ＴＲ２及びペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株に関するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図５に示す。
【０２２２】
形質転換株（ＴＲ１及びＴＲ２）において、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ並びにｍｌｃＲは、培養１日目、２日目及び３日目のいずれにおいても発現していた。
【０２２３】
これに対し、非形質転換対照株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）において、これらの構造遺伝子は、培養３日目においてのみ発現していた。
【０２２４】
構造遺伝子ｍｌｃＥの発現は、形質転換株と非形質転換対照株とで、差が見られなかった。
【０２２５】
これらの結果は、構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ上に位置する他の構造遺伝子（ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ等）のいくつかの転写を誘導することを示唆するものである。
実施例１８．ｐＳＡＫｅｘｐＥ形質転換株における構造遺伝子ｍｌｃＥの機能解析
実施例１３において得られたｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株（ＴＥ１）及び対照の非形質転換株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）を、それぞれＭＢＧ３−８培地に接種し、実施例８記載の方法により培養した。
【０２２６】
培養終了後、実施例８記載の方法により、全ＲＮＡを抽出した。
【０２２７】
全ＲＮＡを鋳型とし、実施例１７の表１３に記載オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２２８】
ＴＥ１及びペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株に関する、構造遺伝子ｍｌｃＥのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図６に示す。
【０２２９】
形質転換株（ＴＥ１）において、構造遺伝子ｍｌｃＥは、培養１日目、２日目及び３日目のいずれにおいても発現していた。
【０２３０】
これに対し、非形質転換対照株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）において、構造遺伝子ｍｌｃＥは、培養３日目においてのみ発現していた。
【０２３１】
一方、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ及びｍｌｃＲの発現は、形質転換株と非形質転換対照株とで、差が見られなかった。
【０２３２】
これらの結果は、構造遺伝子ｍｌｃＥに対応するｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ上に位置する他の構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ及びｍｌｃＲの転写誘導を伴わずに、ＭＬ−２３６Ｂの生合成を促進し得ることを示唆するものである。
試験例１．形質転換株及び親株の有するＭＬ−２３６Ｂ生合成能の比較
実施例１４において得られた形質転換株及び対照の非形質転換株であるペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養し、該培養物中のＭＬ−２３６Ｂ量を測定した。
【０２３３】
形質転換株を培養した実施例１４記載のスラント又はペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養した実施例２記載のスラントより、５ｍｍ角の菌体を、１０ｍｌのＭＢＧ３−８培地を入れた１００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２４℃にて２日間、振盪培養した後、３．５ｍｌの５０％(w/v)グリセリン溶液を添加し、さらに２４℃にて１０日間、振盪培養した。
【０２３４】
該培養物１０ｍｌに５０ｍｌの０．２規定水酸化ナトリウムを加え、２６℃にて１時間、振盪しつつ保温した後、室温、３０００×Ｇの条件下で２分間遠心分離し、１ｍｌの上清を回収し、９ｍｌの５０％メタノールと混合してＨＰＬＣに供した。
【０２３５】
ＨＰＬＣのカラムには、ＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２（直径６ｍｍ、長さ１００ｍｍ：センシュー科学（株）製）を用い、移動相には７５％(v/v)メタノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸を用い、室温にて２ｍｌ／分の流速で溶出した。これら条件下において、ＭＬ−２３６Ｂはカラム添加後４．０分に溶出された。検出はＵＶ検出器の吸収波長を２３６ｎｍに設定して行なった。
【０２３６】
ｐＳＡＫｅｘｐＥ形質転換株のうち、ＭＬ−２３６Ｂ生合成能の上昇した株３つが得られた。これらのＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、対照の非形質転換株より平均１０％高かった。これら３株のＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、モノスポア処理等の継代を行なった後も安定に維持された。
【０２３７】
ｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株のうち、ＭＬ−２３６Ｂ生合成能の上昇した株５つが得られた。これらのＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、対照の非形質転換株より平均１５％高かった。これら５株のＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、モノスポア処理等の継代を行なった後も安定に維持された。
【０２３８】
これらの結果より、ｐＳＡＫｅｘｐＥ又はｐＳＡＫｅｘｐＲの挿入配列は、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡであることが示された。
【０２３９】
【発明の効果】
本発明においてＭＬ−２３６Ｂ生産微生物より得られたＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡは、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進する。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌及び糸状菌に導入させることができ且つ長いＤＮＡを挿入することができるＤＮＡベクターｐＳＡＫｃｏｓ１の構築図。
【図２】ｐＭＬ４８挿入配列の構造遺伝子解析。
【図３】ｐＭＬ４８挿入配列のノーザンブロット・ハイブリダイゼーション。
【図４】大腸菌及び糸状菌に導入させることができる発現ベクターｐＳＡＫ７００の構築図。
【図５】ｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株及び非形質転換対照株における、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲの、ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現解析。
【図６】ｐＳＡＫｅｘｐＥ形質転換株及び非形質転換対照株における、構造遺伝子ｍｌｃＥの、ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現解析。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養し、次いで該培養物からＭＬ−２３６Ｂを回収することを特徴とするＭＬ−２３６Ｂの製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プラバスタチンナトリウムは、高脂血症改善薬として臨床において使用されている、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である。プラバスタチンは、ペニシリウム・シトリナムが生産するＭＬ−２３６Ｂをストレプトミセス・カルボフィラス（Streptomyces carbophilus）により微生物変換することにより得られる（Endo,A.,et al.,J.Antibiot.,29,1346(1976)：Matsuoka,S.,et al.,Eur.J.Biochem.,184,707(1989)記載：特開昭５７−２２４０号公報記載）。
【０００３】
プラバスタチンの前駆体ＭＬ−２３６Ｂ、及び、プラバスタチンと部分構造を共有するＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤ロバスタチンは、ともにポリケチドを経て生合成されることが示されている（Moore,R.N.,et al.,J.Am.Chem.Soc.,107, 3694(1985)：Shiao,M.and Don,H.S.,Proc.Natl.Sci.Counc.Repub.China B,11,223(1987)記載）。
【０００４】
ポリケチドとは、酢酸、プロピオン酸、酪酸などの低分子カルボン酸残基の連続的な縮合反応から生じるβ―ケト炭素鎖から導かれる化合物の総称であり、各β―ケトカルボニル基の縮合・還元様式により、多様な構造が導かれる（Hopwood, D.A. and Sherman, D.H., Annu.Rev.Genet., 24, 37-66(1990)：Hutchinson, C.R. and Fujii, I., Annu.Rev.Microbiol., 49, 201-238(1995)記載）。
【０００５】
ポリケチドの合成を担うポリケチド・シンターゼ（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ：以下、「ＰＫＳ」という。）は糸状菌や細菌の有する酵素であることが知られており、糸状菌では該酵素の分子生物学的研究がなされている（Feng,G.H.and Leonard,T.J.,J.Bacteriol.,177,6246(1995)：Takano,Y.,et al.Mol.Gen.Genet.249,162(1995)記載）。ロバスタチン生産菌であるアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）については、ロバスタチン生合成に関連したＰＫＳ遺伝子の解析がなされている（特表平９−５０４４３６号公報記載）。
【０００６】
ところで、糸状菌の二次代謝産物の生合成関連遺伝子は、ゲノム上でクラスターを形成していることが少なくない。ポリケチドの生合成系にて、該系に関与する遺伝子クラスターの存在が知られている。アスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticus）の生産するポリケチドであるアフラトキシンの生合成では、ＰＫＳその他ポリケチドの生合成に関与する酵素蛋白質をコードする遺伝子がクラスター構造を形成していることが知られており、両菌のアフラトキシン生合成関連遺伝子のゲノム比較解析が行なわれている（Yu,J.,et al,Appl.Environ.Microbiol.,61,2365(1995)記載）。アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）の生産するステリグマトシスチン（sterigmatocystin）の生合成関連遺伝子は、ゲノム上の連続する約６０ｋｂの領域においてクラスター構造を形成していることが報告されている（Brown,D.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,1418(1996)記載）。
【０００７】
しかし、ＭＬ−２３６Ｂ生合成に関する分子生物学的研究は、現在まで十分にはなされていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ペニシリウム・シトリナムのＭＬ−２３６Ｂ生合成に関連するゲノムＤＮＡ（以下、「ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ」という。）を、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡライブラリーよりクローニングし、該ゲノムＤＮＡを解析して該ゲノムＤＮＡ上に構造遺伝子を見出し、ペニシリウム・シトリナムの（全ＲＮＡに含まれる）ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription - polymerase chain reaction：以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という。）により該構造遺伝子に対応するｃＤＮＡを得、該ｃＤＮＡを含有する組換えＤＮＡベクターを用いて該生産微生物を形質転換することにより、該生産微生物においてＭＬ−２３６Ｂの生合成が促進されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）
以下の群から選択されるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号３７のヌクレオチド番号１乃至１６６２で示される塩基配列を１つ又は複数含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ：
（ｂ）（ａ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ、
（２）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５）より得ることができる、（１）記載のＤＮＡ、
（３）
以下の群から選択されるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号４１のヌクレオチド番号１乃至１３８０で示される塩基配列を１つ又は複数含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ：
（ｂ）（ａ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ、
（４）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）より得ることができる、（３）記載のＤＮＡ、
（５）
（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、
（６）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５）株より得ることができる、（５）記載の組換えＤＮＡベクター、
（７）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）株より得ることができる、（５）記載の組換えＤＮＡベクター、
（８）
（５）乃至（７）のいずれか一つに記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、
（９）
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であることを特徴とする、（８）記載の宿主細胞、（１０）
ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）であることを特徴とする、（９）記載の宿主細胞、
（１１）
（９）又は（１０）記載の宿主細胞を培養し、次いで該培養物からＭＬ−２３６Ｂを回収することを特徴とする、ＭＬ−２３６Ｂの製造法、
（１２）
大腸菌であることを特徴とする、（８）記載の宿主細胞、
（１３）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５）株である、（１２）記載の宿主細胞、
（１４）
形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）株である、（１２）記載の宿主細胞、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進し得るｃＤＮＡ（以下、「ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡ」という。）等に関する。
【００１２】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成ｃＤＮＡのような、本発明のポリヌクレオチドは、次の群より選択される；
（Ｉ）ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノム遺伝子中のＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ上に存在する構造遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡを含む全ＲＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡ。
（ＩＩ）（Ｉ）記載のＤＮＡ、及び、（Ｉ）記載のＤＮＡを第一鎖として合成された第二鎖ＤＮＡが会合して生じる二本鎖ＤＮＡ。
（ＩＩ）（ＩＩ）記載の二本鎖ＤＮＡをクローニング等の手法により複製又はは増幅することによって得られる二本鎖ＤＮＡ。
（ＩＶ）（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のいずれか一つに記載のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ＩＶ）のＤＮＡとしては、配列表の配列番号３７のヌクレオチド番号１乃至１６６２で示される塩基配列に１つ若しくは２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入が生じたものであり、且つ、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該微生物のＭＬ−２３６Ｂの生合成を促進するものを挙げることができる。
【００１３】
また、（ＩＶ）のＤＮＡとしては、配列表の配列番号４１のヌクレオチド番号１乃至１３８０で示される塩基配列に１つ若しくは２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入が生じたものであり、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該微生物のＭＬ−２３６Ｂの生合成を促進するものを挙げることができる。
【００１４】
本発明において、ハイブリダイズとは、２本の一本鎖核酸同士が互いに相補的な領域又は相補性の高い領域において二本鎖を形成することをいい、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション液の組成が６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム。）であり且つハイブリダイゼーションを行なう際の保温温度が５５℃の場合をいう。
【００１５】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡは、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｃＤＮＡライブリーから所望のｃＤＮＡを含むクローンを単離する方法、又はＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡの塩基配列に基いて作製される一組のプライマー及びＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｍＲＮＡ若しくは全ＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲにより得ることができる。
【００１６】
本発明において、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物とは、ＭＬ−２３６Ｂ生産能を先天的に有する微生物をいう。ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物としては、例えば、ペニシリウム（Penicillium）属に属するＭＬ−２３６Ｂ生産糸状菌が挙げられ、より具体的には、ペニシリウム・シトリナム、ペニシリウム・ブレビコンパクタム（Penicilium brevicompactum：Brown,A.G.,et al.,J.Chem.Soc.Perkin-1.,1165(1976)記載）、ペニシリウム・シクロピウム（Penicillium cyclopium：Doss,S.L.,et al.,J.Natl.Prod.,49,357(1986)記載）等が例示される。また、これら以外に、ユーペニシリウム・エスピー Ｍ６６０３（ Eupenicillium sp.M6603：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、ペシロミセス・ビリディス ＦＥＲＭ Ｐ−６２３６（Paecilomyces viridis FERM P-6236：特開昭５８−９８０９２号公報記載）、ペシロミセス・エスピー Ｍ２０１６（Paecilomyces sp.M2016：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、トリコデルマ・ロンギブラチアタム Ｍ６７３５（Trichoderma longibrachiatum M6735：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、ヒポミセス・クリソスペルムス ＩＦＯ ７７９８（Hypomyces chrysospermus IFO 7798：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、グリオクラディウム・エスピー ＹＪ−９５１５（Gliocladium sp. YJ-9515：ＷＯ９８０６８６７号公報記載）、トリコデルマ・ビリデ ＩＦＯ ５８３６（Trichoderma viride IFO 5836：特公昭６２−１９１５９号公報記載）、ユーペニシリウム・レチクリスポルム ＩＦＯ ９０２２（Eupenicillium reticulisporum IFO 9022：特公昭６２−１９１５９号公報記載）等を例示することができる。
【００１７】
これらのＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のうち、好適にはペニシリウム・シトリナムであり、より好適にはペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株である。ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株は、平成４年（１９９２年）１２月２２日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４１２９を付与された。これらのＭＬ−２３６Ｂ生産微生物には、自然界から単離された株、自然に生じた変異株及び人工的に生じさせた変異株が包含される。
【００１８】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡは、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡライブラリーに対して、類似の機能を有するものと推測される糸状菌由来のＤＮＡの塩基配列に基いて設計されるプローブを用いてスクリーニングを行なうことにより得ることができる。
【００１９】
ゲノムＤＮＡライブラリーの作製法としては、通常真核生物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製するための方法であれば特に限定されないが、例えば、マニアティスらの方法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）等が挙げられる。
【００２０】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡは、該微生物培養物から該微生物を回収して物理的に破砕した後、核内ＤＮＡを抽出、精製することにより得られる。
【００２１】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の培養は、各ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物に適した条件下で行なうことができる。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であるペニシリウム・シトリナムの培養は、該微生物を培養したスラントから、ＭＢＧ３−８培地（組成；７％(w/v)グリセリン、３％(w/v)グルコース、１％(w/v)大豆粉、１％(w/v)ペプトン（極東製薬工業（株）製）、１％(w/v)コーンスチープリカー（ホーネンコーポレーション（株）製）、０．５％(w/v)硝酸ナトリウム 、０．１％(w/v)硫酸マグネシウム七水和物、ｐＨ６．５）へ該微生物を接種し、２２乃至２８℃、３乃至７日間、振盪しつつ保温することにより行なうことができる。該スラントは、溶解させたＰＧＡ寒天培地（組成；２００ｇ/Ｌ馬鈴薯抽出液、１５％(w/v)グリセリン、２％(w/v)寒天）を試験管に注ぎ、傾斜させつつ固化させたものに、白金耳を用いてペニシリウム・シトリナムを接種し、２２乃至２８℃、７乃至１５日保温することにより作製する。該スラントを０乃至４℃で保存することにより、該スラント上でＭＬ−２３６Ｂ生産微生物を継続的に生存させることができる。
【００２２】
液体培地で培養したＭＬ−２３６Ｂ生産微生物は、遠心分離により、固体培地で培養した該微生物は、セル・スクレーパー等でかきとることにより、それぞれ回収することができる。
【００２３】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の物理的破砕は、該微生物を液体窒素等で凍結しつつ乳鉢と乳棒ですり潰すことにより行なうことができる。破砕された微生物の核内ＤＮＡの抽出は、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ：以下、「ＳＤＳ」という。）等の界面活性剤を用いて行なうことができる。抽出されたゲノムＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出を行なうことにより除タンパクされ、エタノール沈澱を行なうことにより沈澱として回収することができる。
【００２４】
得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で限定分解させ、断片化する。限定分解に使用される制限酵素としては、通常入手可能な制限酵素であれば特に限定されないが、例えば、Ｓａｕ３ＡＩ等を挙げることができる。断片化されたＤＮＡをゲル電気泳動に供し、適当なサイズのゲノムＤＮＡを含むゲルからＤＮＡを回収する。ＤＮＡ断片のサイズには特に限定はないが、好適には２０ｋｂ以上である。
【００２５】
ゲノムＤＮＡライブラリー作製用のＤＮＡベクターとしては、該ＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等が挙げられ、好適にはコスミドベクターである。また、これらＤＮＡベクターは発現ベクターであってもよい。さらに、該ＤＮＡベクターは、該ＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞に表現形質（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の選択性を付与する塩基配列を有していることが好ましい。
【００２６】
該ＤＮＡベクターは、クローニング及び機能発現の双方に適用できるものであることが好ましい。該ＤＮＡベクターとしては、複数の微生物群に形質転換可能なＤＮＡベクター、すなわちシャトルベクターを用いることが好ましい。該シャトルベクターは、少なくとも一方の微生物群の宿主細胞において複製されるのに必要な塩基配列を有する。また、シャトルベクターは複数の微生物群の宿主にそれぞれ表現形質の選択性を付与する塩基配列を有していることが好ましい。
【００２７】
このようなシャトルベクターにより形質転換される微生物群の組合わせとしては、一方の微生物群がクローニングに適用でき且つ他方がＭＬ−２３６Ｂ生産能を有していれば特に限定されないが、例えば、細菌及び糸状菌の組合わせ、酵母及び糸状菌の組合わせ等が挙げられ、好適には細菌及び糸状菌の組合わせである。細菌としては、通常遺伝子工学に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌、枯草菌等を挙げることができ、好適には大腸菌であり、より好適には大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株である。酵母としては、通常遺伝子工学に用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等を挙げることができる。糸状菌としては、上述のＭＬ−２３６Ｂ生産微生物等が挙げられる。なお、本発明において微生物群は、細菌、糸状菌及び酵母から選択される。
【００２８】
このようなシャトルベクターとしては、例えば、適当な表現形質選択マーカー遺伝子及びコス（ｃｏｓ）部位を有するコスミドベクター等を挙げることができ、好適には大腸菌ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子配列を有するプラスミドｐＳＡＫ３３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）にコスミドベクターｐＷＥ１５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の有するコス（ｃｏｓ）部位を挿入して作製されたｐＳＡＫｃｏｓ１が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＳＡＫｃｏｓ１の構築手順については図１に記載されている。
【００２９】
上述のＭＬ−２３６Ｂ生産微生物ゲノムＤＮＡ断片をライゲーションしたシャトルベクターを宿主細胞に導入することにより、所望のゲノムＤＮＡライブラリーが完成する。宿主細胞には、好適には大腸菌、より好適には大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株がそれぞれ使用される。宿主細胞が大腸菌の場合、該導入はｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングにより行なう。本発明において、形質転換とは、ｉｎｖｉｔｒｏパッケージングによる外来ＤＮＡの導入も意味し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングにより外来ＤＮＡを導入された細胞も形質転換細胞の意味に包含される。
【００３０】
所望のクローンのスクリーニングには、抗体又は核酸プローブを用い、好適には、核酸プローブを用いる。該核酸プローブは、糸状菌のポリケチド生合成関連遺伝子の塩基配列に基づいて作製することができる。このような遺伝子としては、ポリケチドの生合成への関与が確認され且つ塩基配列が公知のものであれば特に限定されないが、例えば、アスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticus）のアフラトキシンＰＫＳ遺伝子、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のストリグマトシスチンＰＫＳ遺伝子等を挙げることができる。
【００３１】
該核酸プローブは、上述の公知の塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡの部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブの合成により、またオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、「ＰＣＲ」という。：Saiki,R.K.,et al.,Science,239,487(1988)記載）を行なうことにより、又は、ｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ等により、取得することができる。
【００３２】
核酸プローブのＭＬ−２３６Ｂ生産微生物からのＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲによる取得方法は、以下に述べる通りである。
【００３３】
ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマー（以下、「ＰＣＲ用プライマー」という。）の設計は、塩基配列が公知であるところのポリケチド生合成関連遺伝子の塩基配列に基づいて、好適にはアスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticus）のアフラトキシンＰＫＳ遺伝子又はアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）のストリグマトシスチンＰＫＳ遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。これらのうちいずれか一つのＰＫＳのアミノ酸配列上で種間保存性の高いアミノ酸配列を塩基配列に還元することにより、ＰＣＲ用プライマーを設計することができる。アミノ酸配列から塩基配列に還元する方法としては、宿主のコドン使用頻度を考慮して単一の配列を導く方法又は多重コドンを使用して混合配列（以下、「ミックス・プライマー」という。）を導く方法の二通りが使用できる。後者の場合、塩基配列にヒポキサンチンを含有させることにより多重度を下げることができる。
【００３４】
また、ＰＣＲ用プライマーには、鋳型鎖とアニーリングするための塩基配列に加え、該プライマーの５’−末端に適宜塩基配列を付加させることが可能である。そのような塩基配列としては、該プライマーがＰＣＲに使用可能であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ産物についてその後のクローニング操作を行なうのに便利な塩基配列等が挙げられ、このような塩基配列としては、制限酵素認識配列を含有するか又は該認識配列からなる塩基配列を例示することができる。
【００３５】
さらに、ＰＣＲ用プライマーの設計においては、グアニン塩基の数とシトシン塩基の数の和が総塩基数の４０乃至６０％であることが好ましい。また、自己アニーリングし難いことが好ましい。一組のＰＣＲ用プライマーにおいては、双方のＰＣＲ用プライマー同士がアニーリングし難いことが好ましい。
【００３６】
また、ＰＣＲ用プライマーの塩基数は、ＰＣＲに適用できれば特に限定されないが、その範囲の下限は１０乃至１４、上限は４０乃至６０であり、好適な範囲は１４乃至４０である。
【００３７】
さらに、ＰＣＲ用プライマーは、好適にはＤＮＡである。該プライマーを構成するヌクレオシドとしては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシチミジン及びデオキシグアノシンに加え、デオキシイノシンが挙げられる。
また、ＰＣＲ用プライマーの５’−末端に位置するヌクレオシドの５’−位は、水酸基であるか、又は、該水酸基に一リン酸がエステル結合した状態である。
【００３８】
さらに、ＰＣＲ用プライマーの合成は、通常核酸の合成に使用される方法、例えば、ホスフォロアミダイト法により行なうことができ、このような方法には、ＤＮＡ自動合成機が好適に使用される。
【００３９】
ＰＣＲの鋳型としては、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノムＤＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｍＲＮＡが、それぞれ使用できる。なお、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては、ｍＲＮＡの代わりに全ＲＮＡを使用することも可能である。
【００４０】
ＰＣＲ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物をこのものに適したＤＮＡベクターに組込むことにより、該ＰＣＲ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることができる。該クローニングに用いるＤＮＡベクターとしては、通常ＤＮＡ断片をクローニングするのに使用されるＤＮＡベクターであれば特に限定されない。また、ＰＣＲ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングを簡便に行なうキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製：ＤＮＡベクターとしてｐＣＲ２．１を使用している。）が好適に使用される。
【００４１】
クローニングしたＰＣＲ産物の取得は、所望のＰＣＲ産物を含んでいることを確認した形質転換宿主細胞を培養し、該細胞からプラスミドを抽出、精製し、得られたプラスミドから挿入ＤＮＡ断片を回収することにより行なうことができる。
【００４２】
形質転換宿主細胞の培養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができる。好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の培養は、ＬＢ培地（１％(w/v)トリプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラクト、０．５％(w/v)塩化ナトリウム）で、３０乃至３７℃、１８時間乃至２日間、振盪しつつ保温することにより行なうことができる。
【００４３】
形質転換宿主細胞の培養物からのプラスミドの調製は、該宿主細胞体を回収し、ゲノムＤＮＡやタンパク質を除去することによりなされる。好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の培養物からのプラスミドの調製は、マニアティスらのアルカリ法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）により行なうことができる。また、より純度の高いプラスミドを得るためのキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）が好適に使用される。さらに、プラスミドの大量調製を行うキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）が好適に使用される。
【００４４】
得られたプラスミドのＤＮＡ濃度は、ＤＮＡ試料を適宜希釈して波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、５０μｇ／ｍｌ濃度のＤＮＡ水溶液の波長２６０ｎｍにおける吸光度を１として算出することができる。ＤＮＡの純度は、波長２８０及び２６０ｎｍの吸光度の比率から算出することができる（いずれもManiatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）。
【００４５】
核酸プローブの標識は、放射性標識及び非放射性標識に大別される。放射性標識に使用される放射性核種としては、通常使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、32Ｐ，35Ｓ、14Ｃ等を挙げることができ、好適には32Ｐである。非放射性標識に用いる試薬としては、通常核酸の標識に用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン等が挙げられ、好適にはジゴキシゲニンである。核酸プローブを標識する方法としては、通常使用される方法であれば特に限定されないが、例えば、標識基質を用いたＰＣＲにより該産物中に取り込ませる方法、ニック・トランスレーション法、ランダム・プライマー法、末端標識法、標識基質を用いてオリゴヌクレオチドＤＮＡを合成する方法等を挙げることができ、核酸プローブの種類等によりこれらの方法から適宜選択できる。
【００４６】
核酸プローブの塩基配列と同一の塩基配列がＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のゲノム中に存在することは、該微生物のゲノムＤＮＡに対するサザンブロット・ハイブリダイゼーションにより確認することができる。
【００４７】
サザンブロット・ハイブリダイゼーションは、マニアティスらの方法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）により行なうことができる。
【００４８】
上述の通り作製された標識核酸プローブを用い、ゲノムＤＮＡライブラリーから目的クローンをスクリーニングすることができる。該スクリーニング法としては、通常遺伝子クローニングに使用される方法であれば特に限定されないが、好適にはコロニー・ハイブリダイゼーション法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）を使用することができる。
【００４９】
コロニー・ハイブリダイゼーションに用いるコロニーの培養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができ、好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の培養は、ＬＢ寒天培地（１％(w/v)トリプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラクト、０．５％(w/v)塩化ナトリウム、１．５％(w/v)アガロース）上で、３０乃至３７℃、１８時間乃至２日間保温することにより行なうことができる。
【００５０】
コロニー・ハイブリダイゼーションにより得られる陽性クローンからの組換えＤＮＡベクターの調製は、該陽性クローンの培養物からプラスミドを抽出及び精製することによりなされる。
【００５１】
本発明において得られた陽性クローンである形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９株は、平成１１年（１９９９年）７月７日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０を付された。
【００５２】
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９株が保持する組換えＤＮＡベクターはｐＭＬ４８と命名された。
【００５３】
陽性クローンの保持する組換えＤＮＡベクターが所望のＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡを含んでいることは、該組換えＤＮＡベクターの挿入塩基配列の決定、サザンブロット・ハイブリダイゼーション又は機能発現により確認できる。
【００５４】
ＤＮＡの塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾法 （Maxiam,A.M.M. and Gilbert,W.,Methods in Enzymology,65,499(1980)記載）又はジデオキシヌクレオチド鎖終結法 （Messing,J. and Vieira,J.,Gene,19,269(1982)記載）等により決定できる。なお、塩基配列決定に供するプラスミドＤＮＡとしては、より純度の高い標品が好ましい。
【００５５】
ｐＭＬ４８の挿入塩基配列は配列表の配列番号１で示される。配列表の配列番号２で示される塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列に対して完全に相補的である。通常ゲノムＤＮＡの塩基配列は同種内において遺伝的多型（ポリモルフィズム：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）を有している。また、ＤＮＡクローニングの過程及び塩基配列決定の過程において、ヌクレオチドの置換等が一定の確率で生じ得る。従って、本発明のＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡは、配列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ、及び配列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノムＤＮＡをも包合する。これらゲノムＤＮＡとしては、配列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３で示される塩基配列に１つ又は２つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加及び／又は挿入が生じたもの、並びに、ＭＬ−２３６Ｂ又はその誘導体を生産する、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株以外の微生物に由来し、且つ該微生物によるＭＬ−２３６又はその誘導体の生合成に関連するものが包合される。
【００５６】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡの解析法は次の１）乃至３）に従う。１）遺伝子解析ソフトによる解析
ゲノムＤＮＡ配列中の遺伝子領域の推定は、既存の遺伝子解析プログラム（Ｇｅｎｅ Ｆｉｎｄｉｎｇプログラム（以下、「ＧＲＡＩＬ」という。）、及び配列の相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ）により行うことができる。
【００５７】
ＧＲＡＩＬはゲノム配列の「遺伝子配列らしさ」を評価する７つのパラメータに分割し、それらの結果をニューラルネット法を用いて統合することにより、ゲノムＤＮＡ上の構造遺伝子を検索するプログラム（Uberbacher,E.C.& Mural,R.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,88,11261(1991)記載）であり、ＡｐｏＣｏｍ ＧＲＡＩＬ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＡＰＯＣＯＭ社製）が好適に使用される。
【００５８】
ＢＬＡＳＴは核酸配列及びアミノ酸配列の相同性検索を行なうアルゴリズム（Altechul,S.F.,Madden,T.L.,et al.,Nucl.Acids Res.,25,3389(1997)記載）を用いたプログラムである。
【００５９】
ゲノムＤＮＡ配列を適当な長さに分割し、ＢＬＡＳＴＮを用いて遺伝子データベースに対し相同性検索することにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の位置及び方向を推定することができる。また、分割されたゲノムＤＮＡ配列を６つの翻訳フレーム（センス配列及びアンチセンス配列に各々３つずつ）に従ってアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列のペプチド・データベースに対する相同性検索をＢＬＡＳＴＸを用いて行なうことにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の位置及び方向の推定を行なうこともできる。さらに、真核生物においては、ゲノムＤＮＡ配列中に含まれる構造遺伝子のコード領域がイントロン配列により分断されている場合があり、このようなギャップを有する構造遺伝子の解析にはギャップ含有配列用のＢＬＡＳＴがより有効であり、Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２：ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒ． １０．０に搭載）が好適に使用される。
２）ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法による解析
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法により、１）記載の解析法により推定される構造遺伝子の発現を調べることができる。
【００６０】
ノーザンブロットに供するＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の全ＲＮＡは、該微生物の培養物より得ることができる。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であるペニシリウム・シトリナムの培養は、該菌のスラントからＭＧＢ３−８培地に該菌を接種し、２２乃至２８℃、１乃至４日間、振盪しつつ保温することにより行うことができる。
【００６１】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物からのＲＮＡの抽出は、通常全ＲＮＡを調製するのに使用される方法であれば特に限定されないが、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホットフェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられる。また、より純度の高い全ＲＮＡを調製するための市販キットとしては、例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）等が挙げられる。さらに、ｍＲＮＡは、全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）カラムに添加し、該カラムに吸着した画分を回収することにより得ることができる。
【００６２】
ＲＮＡのメンブレンへのトランスファー、プローブの調製、ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出は、上述のサザンブロット・ハイブリダイゼーションと同様に行なうことができる。
３）５’−末端及び３’−末端の解析
各構造遺伝子の５’−末端及び３’−末端の解析は、ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法により行なうことができる。ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡを鋳型とし、塩基配列が決定されている領域から塩基配列が決定されていない５’−末端又は３’−末端領域までを含むｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの応用により取得する方法である（Frohman,M.A.,Methods in Enzymol.,218,340(1993)記載）。
【００６３】
５’ＲＡＣＥは以下の方法に従う。ｍＲＮＡを鋳型とし、塩基配列中の公知の部分に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）をプライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した後、ターミナルデオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼにより該ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端にホモポリメリックな（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ：単一塩基からなる）ヌクレオチド鎖を付加させる。該ｃＤＮＡ第一鎖を鋳型とし且つ該ホモポリメリックな塩基配列に相補的な塩基配列を含むセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ、及び、アンチセンス側に存在し且つオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）より３’−側に存在するオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）をプライマーとしたＰＣＲによって、５’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅させる方法である（Frohman,M.A.,Methods in Enzymol.,218,340(1993)記載）。５’ＲＡＣＥ用のキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ社製）等が好適に使用される。
【００６４】
３’ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの３’−末端に存在するポリＡ領域を利用する方法である。すなわち、ｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄ（Ｔ）アダプターをプライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した後、該ｃＤＮＡ第一鎖を鋳型として、塩基配列中の公知の部分に基いて設計されたセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）、及び、アンチセンス側のオリゴｄ（Ｔ）アダプターをプライマーとしたＰＣＲによって、３’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅させる方法である。３’ＲＡＣＥ用のキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ｐｈｒａｍａｃｉａ社製）が好適に使用される。
【００６５】
ＲＡＣＥにおける塩基配列中の公知の部分に基いたプライマーの設計には、上記１）及び２）の解析結果が好適に利用できる。
【００６６】
以上、１）乃至３）に記載した解析法により、ゲノムＤＮＡ配列上の構造遺伝子の方向、並びに、構造遺伝子中の転写開始点の位置、転写終始点の位置、翻訳開始コドンの位置、翻訳終止コドン及びその位置を推定することができる。これらの情報に基づいて、各構造遺伝子及びそれに対応するｃＤＮＡ、すなわちＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを取得し、その塩基配列を決定することが可能である。また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた転写産物の塩基配列解析に基づき、各構造遺伝子に対応する完全長のｃＤＮＡを取得せずに、コード領域及び対応するｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００６７】
本発明において得られた組換えＤＮＡベクター ｐＭＬ４８の挿入配列上には、６つの構造遺伝子の存在が推定され、それぞれｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲと命名された。このうちｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲは配列表の配列番号２に示される塩基配列上にコード領域を有し、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤは配列表の配列番号１に示される塩基配列上にコード領域を有しているものと推定された。各構造遺伝子の転写レベルでの発現解析には、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法が好適に使用され得る。
【００６８】
上述の６つの構造遺伝子に対応するＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを取得する方法としては、各構造遺伝子の塩基配列に基づいて設計され得るプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによるクローニング、該塩基配列に基いて得られるＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡライブラリーからのクローニング等が挙げられる。また、これらの方法で取得されるｃＤＮＡを機能発現させるためには、完全長のｃＤＮＡを得ることが好ましい。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲによるＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡの取得について述べる。
【００７０】
ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを取得するための一組のＲＴ−ＰＣＲ用プライマーは、各鋳型鎖と選択的にアニーリングし且つｃＤＮＡを取得するべく設計されなければならないが、この条件を満たす限りにおいて、一組のＲＴ−ＰＣＲの一方又は双方は各鋳型鎖の一部と完全に相補的でなくてもよい。アンチセンス鎖にアニーリングするＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（以下、「センスプライマー」という。）としては、アンチセンス鎖の一部と完全に相補的なセンスプライマー（以下、「無置換センスプライマー」という）又はアンチセンス鎖の一部と完全には相補的でないセンスプライマー（以下、「一部置換センスプライマー」という。）を使用することができる。センス鎖にアニーリングするＲＴ−ＰＣＲ用プライマー（以下、「アンチセンスプライマー」という。）としては、センス鎖の一部と完全に相補的なアンチセンスプライマー（以下、「無置換アンチセンスプライマー」という）又はセンス鎖の一部と完全には相補的でないアンチセンスプライマー（以下、「一部置換アンチセンスプライマー」という。）を使用することができる。
【００７１】
センスプライマーは、それを一方のプライマーとするＲＴ−ＰＣＲ産物が本来の位置に翻訳開始コドンａｔｇを含み且つ該翻訳開始コドンより開始される翻訳フレーム中には本来の位置以外に翻訳終止コドンを含まないように設計される（なお、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列及び配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列における、本発明において推定された各構造遺伝子の翻訳開始コドンの位置は、表４に記載されている）。
【００７２】
無置換センスプライマーは、ｃＤＮＡの翻訳開始コドンａｔｇ中のａ又はそれより５’−側の塩基を５’−末端とする。
【００７３】
一部置換センスプライマーは、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列又は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上の特定の領域と選択的にアニーリングする（配列表の配列番号２の全塩基配列は、配列表の配列番号１の全塩基配列に対して完全に相補的である）。
【００７４】
また、一部置換センスプライマーが翻訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列を含む場合、翻訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列上に開始コドンａｔｇから始まる翻訳フレーム中に終始コドンとなるような塩基配列（ｔａａ、ｔａｇ又はｔｇａ）は含まれない。なお、開始コドンａｔｇから始まる翻訳フレームとは、翻訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列を翻訳開始コドンａｔｇから３塩基単位に分割したときに生じる３塩基からなる配列をいう。
【００７５】
さらに、一部置換センスプライマーが、翻訳開始コドンのａ、ａｔ又はａｔｇ（「塩基又は塩基配列ｍ」という。）にその位置で対応する塩基又は塩基配列（「塩基又は塩基配列ｍ’」という。）を含む場合、塩基又は塩基配列ｍがａのとき、塩基又は塩基配列ｍ’はａであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａは、その一部置換センスプライマーの３’−末端に位置する。塩基又は塩基配列ｍがａｔのとき、塩基又は塩基配列ｍ’はａｔであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａｔは、その一部置換センスプライマーの３’−末端に位置する。塩基又は塩基配列ｍがａｔｇのとき、塩基又は塩基配列ｍ’はａｔｇであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋１（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドを５’−末端とするトリヌクレオチドがその一部置換センスプライマーに存在する場合、該トリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７６】
また、一部置換センスプライマーの３’−末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋１（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドであるとき、その一部置換センスプライマーを一方のプライマーとし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ産物又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物において、３×ｎ＋１番目のヌクレオチド及びその３’−側に隣接するジヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７７】
さらに、一部置換センスプライマーのいずれか一つの３’−末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋２（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドであるとき、その一部置換センスプライマーを一方のプライマーとし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ産物又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物において、３×ｎ＋２番目のヌクレオチド及びその３’−側並びに５’−側に隣接する２つのモノヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７８】
また、一部置換センスプライマーの３’−末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａから３’−方向に数えて３×ｎ＋３（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチドであるとき、３×ｎ＋１乃至３×ｎ＋３番目のヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであることはない。
【００７９】
以上がセンスプライマーの要件である。
【００８０】
アンチセンスプライマーは、それ自体及び上述のセンスプライマーを一組のプライマーとして使用するＲＴ−ＰＣＲにより、各構造遺伝子（ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲ）にコードされるペプチドのＮ末端からＣ末端までをコードしたｃＤＮＡを増幅できるように設計される。
【００８１】
無置換アンチセンスプライマーは、ｃＤＮＡ上の翻訳終止領域附近の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するアンチセンスプライマーであれば特に限定されないが、好適には翻訳終止コドンの３’−末端の塩基に対して相補的な塩基又はそれより５’−側の塩基を５’−末端とする塩基配列を有し、より好適には翻訳終止コドンに対して相補的な３塩基の配列を有する（なお、本発明において推定された各構造遺伝子の翻訳終止コドン、該翻訳終止コドンの相補配列、各構造遺伝子にコードされるペプチドのＣ末端のアミノ酸残基、該アミノ酸残基をコードした塩基配列、並びに、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列及び配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列におけるそれらの位置は、表８乃至１０に記載されている）。
【００８２】
一部置換アンチセンスプライマーは、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上又は配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上の特定の領域と選択的にアニーリングする。
【００８３】
以上がアンチセンスプライマーの要件である。
【００８４】
また、一部置換センスプライマー及び一部置換アンチセンスプライマーは、上述の要件を満たす限りにおいて、それぞれの５’−末端に適宜塩基配列を付加させることが可能である。そのような塩基配列としては、該プライマーがＰＣＲに使用可能であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ産物についてその後のクローニング操作を行なうのに便利な塩基配列等が挙げられ、このような塩基配列として、制限酵素認識配列を含有するか又は該認識配列からなる塩基配列が挙げられる。
【００８５】
さらに、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの設計は、前述のＰＣＲ用プライマーの設計に関する記述に従って行なう。
【００８６】
上述の通り、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型には、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物のｍＲＮＡ又は全ＲＮＡを使用する。例えば、ｐＭＬ４８挿入配列中に存在する構造遺伝子ｍｌｃＥのコード領域全域を増幅できるような一組のプライマー（それぞれの塩基配列は、配列表の配列番号３５及び３６参照）を設計及び合成し、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株等の全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型してＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、構造遺伝子ｍｌｃＥに対応するＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡが得られる。同様に、ｐＭＬ４８挿入配列中に存在する構造遺伝子ｍｌｃＲのコード領域全域を増幅できるような一組のプライマー（それぞれの塩基配列は、配列表の配列番号３９及び４０参照）を設計及び合成し、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株等の全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型してＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡが得られる。
【００８７】
また、上述の通り、ＲＴ−ＰＣＲ産物を適当なＤＮＡベクターに組込むことにより、該ＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることができる。そのようなクローニングに用いるＤＮＡベクターとしては、通常ＤＮＡ断片をクローニングするのに使用されるＤＮＡベクターであれば特に限定されない。ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングを簡便に行なうキットが市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製：ＤＮＡベクターとしてｐＣＲ２．１を使用している。）が好適に使用される。
【００８８】
このようにして取得されるＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡがＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内で機能発現し得ることは、該ｃＤＮＡをＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内での機能発現に適したＤＮＡベクターに組換え、その組換えＤＮＡベクターで細胞を形質転換し、該形質転換細胞及び宿主細胞のＭＬ−２３６Ｂ生合成能を比較することにより確認できる。すなわち、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡが形質転換細胞内で機能発現していれば、該形質転換細胞のＭＬ−２３６Ｂ生合成能が宿主細胞のそれよりも改善されている。
【００８９】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内での機能発現に適したＤＮＡベクター（以下、「発現ベクター」という。）としては、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物を形質転換することができ、且つＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内で機能発現させることができ、且つ宿主細胞内で安定に保持され、且つ宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有しているものであれば、特に限定されない。
【００９０】
また、発現ベクターは、宿主細胞に表現形質の選択性を付与する塩基配列を有していること、及びシャトルベクターであることが、それぞれ好ましい。
【００９１】
さらに、宿主細胞に付与され得る表現形質の選択性としては、薬剤耐性等が挙げられ、好適には抗生物質耐性、より好適にはアンピシリン耐性、ハイグロマイシンＢ耐性である。
【００９２】
また、発現ベクターがシャトルベクターである場合、一方の微生物群の宿主細胞において複製されるのに必要な塩基配列を有し、且つ他方の宿主細胞において挿入配列にコードされたポリペプチドを機能発現させるのに必要な塩基配列を有していなければならない。また、形質転換される複数の微生物群の宿主にそれぞれ異なった表現形質の選択性を付与する塩基配列を有していることが好ましい。複数の微生物群の組み合わせは、本明細書中に記載されたＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡのクローニング及び機能発現に使用されるシャトルベクターの要件に準ずる。本発明においては、このようなシャトルベクターとして、ＤＮＡベクターｐＳＡＫ３３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）に、該ＤＮＡベクター上に存在するアスペルギルス・ニデュランス由来の３−ホスホグリセレートキナーゼ（3-phosphoglycerate kinase：以下、「ｐｇｋ」という。）遺伝子プロモータ、外来遺伝子挿入用のアダプター、及び該ＤＮＡ上に存在するｐｇｋターミネータを、この順で組込むことにより作製されたＤＮＡベクターｐＳＡＫ７００ （図４参照）が好適に使用される。
【００９３】
上述のような発現ベクターに本発明のＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを挿入して得られる組換えＤＮＡベクター（組換え発現ベクター）をＭＬ−２３６Ｂ生産微生物体内に導入することにより、該ｃＤＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドを機能発現させることができる。
【００９４】
本発明の組換え発現ベクターは、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ若しくはｍｌｃＲ又はそれに対応するｃＤＮＡを１つ又は２つ以上含有してもよく、好適には、構造遺伝子ｍｌｃＥ若しくはｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡを１つ又は２つ以上含有する。
【００９５】
構造遺伝子ｍｌｃＥ、ｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡをｐＳＡＫ７００のアダプター部位にそれぞれ挿入することにより、組換え発現ベクターｐＳＡＫｅｘｐＥ及びｐＳＡＫｅｘｐＲが得られた。ｐＳＡＫｅｘｐＥの挿入配列は配列表の配列番号３７に、ｐＳＡＫｅｘｐＲの挿入配列は配列表の配列番号４１に、それぞれ記載されている。
【００９６】
ｐＳＡＫｅｘｐＥで形質転換された大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥＳＡＮＫ ７２４９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５を付された。
【００９７】
ｐＳＡＫｅｘｐＲで形質転換された大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲＳＡＮＫ ７２５９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６を付された。
【００９８】
また、本発明の組換え発現ベクターは、単独で又は組合せによりＭＬ−２３６Ｂ生産微生物によるＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進し得るＤＮＡを１種又は２種以上、それぞれ１つ又は２つ以上含有してもよい。そのようなＤＮＡとしては、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ若しくはｍｌｃＲ又はそれに対応するｃＤＮＡ、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡの発現調節因子をコードしたＤＮＡ等が例示できる。
【００９９】
本発明のＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡ、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ又はそれらのいずれかの断片を機能発現させるための形質転換法は、宿主細胞により適宜選択される。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物でるペニシリウム・シトリナムの形質転換は、ペニシリウム・シトリナムの胞子からプロトプラストを調製し、該プロトプラストに組換えＤＮＡベクターを導入することにより行なうことができる（Nara,F.,et al.,Curr.Genet.23,28(1993)記載）。
【０１００】
ペニシリウム・シトリナムを培養したスラントからＰＧＡ寒天培地のプレートへ該菌を接種し、２２乃至２８℃、１０乃至１４日間保温し、該プレートから胞子を回収し、該胞子１×１０7乃至１×１０9個を５０乃至１００ｍｌのＹＰＬ−２０培地（組成；０．１％(w/v)イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％(w/v)ポリペプトン（日本製薬（株）製）、２０％(w/v)ラクトース、ｐＨ５．０）に接種し、２２乃至２８℃、１８時間乃至２日間保温する。該培養物から発芽胞子を回収し、細胞壁分解酵素で処理し、プロトプラストを得る。細胞壁分解酵素としては、ペニシリウム・シトリナムの細胞壁を分解するものであり且つ該菌に有害な作用を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、ザイモリアーゼ、キチナーゼ等が挙げられる。
【０１０１】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物又はそのプロトプラストに、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡを挿入した組換え発現ベクターを接触させると、該組換え発現ベクターがプロトプラストの中に取り込まれ、形質転換体が得られる。
【０１０２】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の形質転換体の培養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができるが、好適なＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であるペニシリウム・シトリナムの形質転換体の場合は、予め形質転換させたプロトプラストを適当な条件下で培養することにより細胞壁を再生させ、その後培養する。すなわち、形質転換されたペニシリウム・シトリナムのプロトプラストを封入したＶＧＳ中層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、２％(w/v)寒天）をＶＧＳ下層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、２．７％(w/v)寒天）及びＶＧＳ上層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、１．５％(w/v)寒天、８００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂ）で挟み、２２乃至２８℃、７乃至１５日間保温することにより行なうことができる。得られた菌株はＰＧＡ培地上で、２２乃至２８℃で保温しつつ継代培養する。該菌株をＰＧＡ培地で作製したスラントに白金耳を用いて接種し、２２乃至２８℃、１０乃至１４日間保温し、０乃至４℃で保存する。
【０１０３】
上述の通り細胞壁を再生させたペニシリウム・シトリナムの形質転換体を培養したスラントから、ＭＢＧ３−８培地へ該形質転換体を接種し、２２乃至２８℃、７乃至１２日間、振盪しつつ保温することにより、ＭＬ−２３６Ｂを効率よく生産することができる。なお、宿主細胞のペニシリウム・シトリナムについても、全く同様の液体培養によりＭＬ−２３６Ｂを生産させることができる。
【０１０４】
ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の形質転換体の培養物からのＭＬ−２３６Ｂの精製は、通常天然物の精製に使用される諸技法を組み合わせることによりなされる。該諸技法としては、特に限定されないが、例えば、遠心分離、濾過による固液分離、アルカリ又は酸処理、有機溶媒による抽出、転溶、吸着及び分配等の各種クロマトグラフィー、結晶化等が挙げられる。ＭＬ−２３６Ｂは、ヒドロキシ酸体とラクトン体の両方の形をとり、相互に変換し、更に、ヒドロキシ酸体は安定な塩を形成する。このような物理化学的特質を利用して、ＭＬ−２３６Ｂのヒドロキシ酸体（以下、「遊離型ヒドロキシ酸」という。）、ＭＬ−２３６Ｂのヒドロキシ酸塩（以下、「ヒドロキシ酸塩」という。）、又はＭＬ−２３６Ｂのラクトン体（以下、「ラクトン」という。）を得ることができる。
【０１０５】
該培養物を、加熱下又は常温下でアルカリ加水分解することにより開環し、ヒドロキシ酸塩に変換し、該反応溶液を酸性にした後濾過し、濾液を水と混和しない有機溶媒で抽出することにより、目的化合物を遊離型ヒドロキシ酸として得ることができる。水と混和しない有機溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、メチレンクロリド、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、蟻酸エチル、酢酸エチル等のエステル類、それら２種以上の混合溶媒等が挙げられる。
【０１０６】
また、この遊離型ヒドロキシ酸を、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属塩類の水溶液に転溶することにより、目的化合物をヒドロキシ酸塩として得ることができる。
【０１０７】
さらに、この遊離型ヒドロキシ酸を、有機溶媒中で加熱して脱水するか、又は他の方法により閉環することにより、目的化合物をラクトンとして得ることができる。
【０１０８】
このようにして得ることができる遊離型ヒドロキシ酸、ヒドロキシ酸塩及びラクトンは、カラムクロマトグラフィー等により精製、単離することが可能である。カラムクロマトグラフィーの担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、セファデックス ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ダイヤイオン ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）、シリカゲル、逆相系担体等が挙げられ、好適にはＣ１８系の担体である。
【０１０９】
ＭＬ−２３６Ｂの定量法としては、通常有機化合物の定量に用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば、逆相高性能クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：以下、「逆相ＨＰＬＣ」という。）法等が挙げられる。逆相ＨＰＬＣ法による定量は、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の培養物をアルカリ加水分解し、可溶性画分をＣ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに供し、紫外吸収を測定し、該吸収を定量化することにより行なうことがきる。Ｃ１８カラムラムとしては、通常の逆相ＨＰＬＣに使用されるＣ１８カラムであれば特に限定されないが、例えば、ＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２（直径６ｍｍ、長さ１００ｍｍ：センシュー科学（株）製）等が挙げられる。移動相としては、通常逆相ＨＰＬＣに使用される溶媒であれば特に限定されないが、例えば、７５％(v/v)メタノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸等が挙げられる。移動相に流速２ｍｌ／分の７５％(v/v)メタノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸を用いてＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２カラムにＭＬ−２３６Ｂを室温で添加すると、４．０分後に溶出される。ＭＬ−２３６Ｂの検出は、ＨＰＬＣ用ＵＶ検出器を用いて行なうことができ、ＵＶ検出器の吸収波長は、２２０乃至２８０ｎｍであり、好適には２２０乃至２６０ｎｍ、より好適には２３６ｎｍである。
【０１１０】
なお、本明細書においては、アデニンを「ａ」、グアニンを「ｇ」、チミンを「ｔ」、シトシンを「ｃ」とそれぞれ記載する。配列表の各配列番号に示される塩基配列は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（特許庁公表、平成１０年６月）」に従って記載した。
【０１１１】
【実施例】
以下に実施例及び試験例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１２】
実施例１．ｐＳＡＫｃｏｓ１ベクターの作製
１）大腸菌由来のハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（hygromycin B phosphotransferase gene：以下、「ＨＰＴ」という。）を含有するプラスミドｐＳＡＫ３３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）で末端を平滑化した。
２）ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて上記ＤＮＡ断片を自己環状化し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。形質転換大腸菌からＢａｍＨＩ部位を欠失したプラスミドを保有する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫ３６０と命名した。
３）ｐＳＡＫ３６０を制限酵素Ｐｖｕ２で消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、５’末端の脱リン酸化を行なった。コスミドベクターｐＷＥ１５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）からコス（ｃｏｓ）部位を含む［Ｓａｌ１−Ｓｃａ１］断片（約３ｋｂ）を取得し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより末端を平滑化した後、ｐＳＡＫ３６０のＰｖｕ２部位に連結し、ＪＭ１０９株を形質転換した。該形質転換大腸菌から［Ｓａｌ１−Ｓｃａ１］断片（約３ｋｂ）をＰｖｕ２部位に挿入したプラスミドを保有する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫｃｏｓ１と命名した。ｐＳＡＫｃｏｓ１は、ｐＷＥ１５由来のＢａｍＨ１、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１の各制限酵素認識部位を１つずつ有する。また、ｐＳＡＫｃｏｓ１は選択マーカーとして、アンピシリン耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有している。以下の実施例において、大腸菌を宿主とする場合、ｐＳＡＫｃｏｓ１又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫｃｏｓ１による形質転換体の選択は、４０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ：Ｓｉｇｍａ社製）を培地に添加して行なった。ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０を宿主とする場合、ｐＳＡＫｃｏｓ１又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫｃｏｓ１による形質転換体の選択は、２００μｇ／ｍｌのハイグロマシシンＢ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ：Ｓｉｇｍａ社製）を培地に添加して行なった。
【０１１３】
ｐＳＡＫｃｏｓ１の構築手順を図１に記載した。
実施例２．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡの調製
１）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の培養
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の種菌の培養はＰＧＡ寒天培地を用いたスラントにて行なった。すなわち、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を白金耳により接種し、２６℃にて１４日間保温した。このスラントは４℃で保存した。
【０１１４】
本培養は、液体通気培養にて行なった。上述のスラント５ｍｍ角の菌体を５０ｍｌのＭＢＧ３−８培地を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２６℃、２１０ｒｐｍの条件下で５日間振盪培養した。
２）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の培養物からのゲノムＤＮＡの調製
１）の培養物を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離し、菌体を回収した。湿重量３ｇの菌体を、ドライアイスで冷却した乳鉢上で粉末になるまで破砕した。菌体破砕物を２０ｍｌの６２．５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光純薬（株）製）−５％(w/v)ＳＤＳ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（和光純薬（株）製）−塩酸（和光純薬（株）製）緩衝液（ｐＨ８．０）で満たした遠心管に入れ、穏やかに混合した後、０℃にて１時間静置した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-塩酸−０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐＨ８．０：以下「ＴＥ」という。）で飽和した１０ｍｌのフェノールを添加し、５０℃にて１時間穏やかに攪拌した。室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した後、１５ｍｌの上層（水相）を別の遠心管に分注した。
【０１１５】
この上層（水相）に０．５倍容のＴＥ飽和フェノール及び０．５倍容のクロロホルム溶液を加え、２分間穏やかに攪拌した後、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した（以下、「フェノール・クロロホルム抽出」という。）。
【０１１６】
１０ｍｌの上層（水相）に１０ｍｌの８Ｍ 酢酸アンモニウム（ｐＨ７．５）及び２５ｍｌの２−プロパノール（和光純薬（株）製）を添加し、−８０℃にて１５分間冷却した後、４℃、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌのＴＥに溶解させた後、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ社製）及び２５０単位のリボヌクレアーゼＴ１（ＧＩＢＣＯ社製）を添加し、３７℃にて２０分間保温した。これに２０ｍｌの２−プロパノールを添加し、穏やかに混合した後、糸状のゲノムＤＮＡをパスツールピペットの先端に巻きつけ、１ｍｌのＴＥに溶解させた。
【０１１７】
このＤＮＡ溶液に０．１倍容の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び２．５倍容のエタノールを加え、−８０℃にて１５分冷却した後、４℃、１００００×Ｇの条件下で５分間遠心分離した（以下、「エタノール沈澱」という。）。
【０１１８】
得られた沈澱を２００μｌのＴＥに溶解し、ゲノムＤＮＡ画分とした。
実施例３．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーの作製
１）ゲノムＤＮＡ断片の調製
実施例２において得られたペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（５０μｇ）を含む１００μｌの水溶液に、０．２５単位のＳａｕ３Ａ１（宝酒造（株）製）を添加した後、１０、３０、６０、９０及び１２０秒経過後に２０μｌずつサンプリングし、各サンプルに２０μｌずつの０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えて制限酵素反応を停止した。アガロースゲル電気泳動により、得られた部分消化ＤＮＡ断片を分離し、３０ｋｂ以上の大きさをもつＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを回収した。
【０１１９】
回収したゲルを細かく砕き、ウルトラフリーＣ３遠心式ろ過ユニット（日本ミリポア（株）製）に入れた。−８０℃にて１５分間冷却し、ゲルを凍結した後、３７℃にて１０分間保温してゲルを融解した。５０００×Ｇ、５分間遠心分離し、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに溶解した。
２）ＤＮＡベクター ｐＳＡＫｃｏｓ１の前処理
ｐＳＡＫｃｏｓ１を制限酵素ＢａｍＨ１（宝酒造（株）社製）により消化した後、６５℃にて３０分間アルカリフォスファターゼ（宝酒造（株）製）反応を行った。反応終了液について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに溶解した。
３）ライゲーション及びｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング
上記１）記載のゲノムＤＮＡ断片（２μｇ）及び上記２）記載の前処理済みｐＳＡＫｃｏｓ１（１μｇ）を混合し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用い、１６℃にて１６時間ライゲーション反応を行なった。反応終了液について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を５μｌのＴＥに溶解させた。ライゲーション生成物溶液を、ＧＩＧＡＰＡＫ ＩＩ Ｇｏｌｄ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）キットを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングに供し、組換えＤＮＡベクターを含む形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌のコロニーを形成させたプレートに３ｍｌのＬＢ培地を注ぎ、セルスクレーパーを用いてプレート上のコロニーを回収した（回収液１という）。さらに３ｍｌのＬＢ培地でプレートを洗浄、回収した（回収液２という。）。回収液１及び２の混合液にグリセリンを終濃度１８％となるよう加えたものを大腸菌菌体液と称し、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーとして、−８０℃にて保存した。
実施例４．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによるＰＫＳ遺伝子断片の増幅
１）ＰＣＲ用プライマーの設計及び合成
アスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）のＰＫＳ遺伝子のアミノ酸配列（Brown,D.W.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,1418(1996)記載）に基づき、配列表の配列番号３及び４に示されるミックス・プライマーを設計及び合成した。該合成はホスフォロアミダイト法により行った。
【０１２０】
配列表の配列番号３：gayacngcntgyasttc
配列表の配列番号４：tcnccnknrcwgtgncc
なお、配列表の配列番号３及び４に示される塩基配列において、nはイノシンの塩基（ヒポキサンチン）を、yはt又はcを、sはg又はcを、kはg又はtを、rはg又はaを、wはa又はtを、それぞれ表わす。
２）ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅
上記２）記載のＰＣＲ用プライマー（各１００ｐｍｏｌ）、実施例２で得られたペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、５０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウム及び１．２５単位のＥｘ．Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）を含む５０μｌの反応液を、９４℃にて１分間、５８℃にて２分間、７０℃にて３分間、の連続する３工程からなるサイクル反応に供した。このサイクルを３０回繰り返すことによりＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ ＴＰ３０００（宝酒造（株）製）を使用して行なった。
【０１２１】
増幅されたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動に供した後、約１．０乃至２．０ｋｂの大きさをもつＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを回収した。ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに溶解した。
３）ライゲーション及び形質転換
２）で得られたＤＮＡ断片、及び、ＴＡクローニング・システムｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、このキットに含まれるプラスミドｐＣＲ２．１にライゲーションし、形質転換株を得た。
【０１２２】
得られたクローンを数個選び、マニアティスら（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）の方法に従って培養した。すなわち、２ｍｌのＬＢ培地を含む２４ｍｌ容の試験管に各コロニーを接種し、３７℃にて１８時間、振盪培養した。
【０１２３】
この培養物からの組換えＤＮＡベクターの調製は、アルカリ法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）に従った。すなわち、１．５ｍｌの培養液を、室温、１００００×Ｇの条件下で２分間遠心分離し、沈澱より菌体を回収した。菌体に１００μｌの５０ｍＭ グルコース−２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-塩酸−１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） を加えて懸濁し、２００μｌの０．２規定水酸化ナトリウム−１％(w/v)ＳＤＳを加えて穏やかに攪拌し、溶菌させた。これに１５０μｌの３Ｍ 酢酸カリウム−１１．５％(w/v)氷酢酸を加えてタンパク質を変成させ、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離し、上清を回収した。上清について、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を含有する５０μｌのＴＥに溶解させた。
【０１２４】
各組換えＤＮＡベクターを制限酵素消化して電気泳動に供し、電気泳動パターンの異なる組換えＤＮＡベクター中の挿入塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（モデル３７７：パーキンエルマー・ジャパン社製）を用いて決定した。
【０１２５】
その結果、ＰＫＳ遺伝子断片を含む組換えＤＮＡベクターを保有する株の存在が確認された。
【０１２６】
実施例５．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノミック・サザンブロットハイブリダイゼーション
１）電気泳動及びメンブレンへのトランスファー
実施例２において得られたのペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、Ｈｉｎｄ３又はＳａｃ１（いずれも宝酒造（株）製）を用いて消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲルの調製には、Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ０３「ＴＡＫＡＲＡ」（宝酒造（株）製）を用いた。泳動後、ゲルを０．２５規定塩酸（和光純薬（株）製）に浸し、室温にて１０分間穏やかに振盪した。このゲルを０．４規定水酸化ナトリウム（和光純薬（株）製）中に移し、室温にて３０分間穏やかに振盪した。マニアティスらのアルカリトランスファー法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）により、ゲル中のＤＮＡをナイロン・メンブレンＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ+（アマシャム社製）にトランスファーし、固定した。メンブレンを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）で洗浄した後風乾した。
２）ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出
１）で得られたメンブレンに対し、実施例４で得られたＰＫＳ遺伝子断片をプローブとして用いたハイブリダイゼーションを行なった。
【０１２７】
プローブには、実施例４において得られたＰＫＳ遺伝子断片ＤＮＡ（１μｇ）をＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）で標識し、使用直前に１０分間煮沸後急冷したものを用いた。
【０１２８】
ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージーハイブ：ベーリンガー・マンハイム社製）に１）記載のメンブレンを浸し、２０ｒｐｍで振盪しつつ、４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行なった後、上述の標識プローブをハイブリダイゼーション液に添加し、マルチシェーカー・オーブンＨＢ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用い、２０ｒｐｍで振盪しつつ４２℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションを行なったメンブレンについて、２×ＳＳＣを用いた室温、２０分間の洗浄を３回、０．１×ＳＳＣを用いた５５℃、３０分間の洗浄を２回、それぞれ行なった。
【０１２９】
洗浄したメンブランをＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ベーリンガー・マンハイム社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミフィルム：ベーリンガー・マンハイム社製）に露光した。感光は富士メディカルフィルムプロセサーＦＰＭ８００Ａ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて行なった。
【０１３０】
その結果、実施例４において得られたＰＫＳ遺伝子断片はペニシリウム・シトリナムのゲノム上に存在することが確認された。
【０１３１】
実施例６．ＰＫＳ遺伝子断片をプローブとしたペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＰＫＳ遺伝子を含むゲノムＤＮＡのクローニングは、コロニーハイブリダイゼーション法により行なった。
１）メンブレンの調製
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラリーとして保存した大腸菌菌体液（実施例３記載）を、ＬＢ寒天培地のプレートに、プレート１枚あたり５０００乃至１００００個のコロニーが生育するよう希釈して撒いた。このプレートを２６℃にて１８時間保温した後、４℃にて１時間冷却した。ＨｙｂｏｎｄTM−Ｎ＋（アマシャム社製）をプレートにのせ、１分間接触させた。コロニーを付着させたメンブレンをプレートから注意深く離し、コロニー接触面を上にして、２００ｍｌの１．５Ｍ 塩化ナトリウム−０．５規定 水酸化ナトリウムに７分、２００ｍｌの１．５Ｍ 塩化ナトリウム−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ-塩酸−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に３分ずつ２回浸した後、４００ｍｌの２×ＳＳＣで洗浄した。洗浄したメンブレンを３０分風乾した。
２）ハイブリダイゼーション
プローブには、実施例４において得られたＰＫＳ遺伝子断片ＤＮＡ（１μｇ）をＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）で標識し、使用直前に１０分間煮沸後急冷したものを用いた。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージーハイブ：ベーリンガー・マンハイム社製）に１）記載のメンブレンを浸し、２０ｒｐｍで振盪しつつ、４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行なった後、上述の標識プローブをハイブリダイゼーション液に加え、マルチシェーカー・オーブンＨＢ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用い、２０ｒｐｍで振盪しつつ４２℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションを行なったメンブレンについて、２×ＳＳＣを用いた室温、２０分間の洗浄を３回、０．１×ＳＳＣを用いた６８℃、３０分間の洗浄を２回、それぞれ行なった。
【０１３３】
洗浄したメンブランをＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ベーリンガー・マンハイム社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミフィルム：ベーリンガー・マンハイム社製）に露光した。感光は富士メディカルフィルムプロセサーＦＰＭ８００Ａ：Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ社製）を用いて行なった。
【０１３４】
以上、１）及び２）記載の操作をスクリーニングという。
【０１３５】
一回目のスクリーニングで陽性シグナルが検出されたクローンのコロニー周辺をかきとってＬＢ培地に懸濁した後、適宜希釈してプレートに撒いて培養し、同様に二回目のスクリーニングを行ない、陽性クローンを純化した。
【０１３６】
なお、本実施例で得られた陽性クローン、すなわち形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９は、平成１１年（１９９９年）７月７日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０を付された。
【０１３７】
実施例７．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４８の挿入配列の解析（１）
実施例６で得られたＥ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９株の培養及び該培養物からの組換えＤＮＡベクターの調製は、実施例４記載の方法に準じて行なった。
【０１３８】
得られた組換えＤＮＡベクターをｐＭＬ４８と命名した。ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡである、ｐＭＬ４８挿入配列を、各種制限酵素消化し、ｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）に組込むことにより、サブクローニングした。得られたサブクローンをプローブとして、実施例５記載の方法に準じてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行なった。すなわち、ｐＭＬ４８の各種制限酵素消化物を電気泳動に供し、ＤＮＡをメンブレンへトランスファーしたものに対して、ハイブリダイゼーションを行なった。
【０１３９】
その結果、ｐＭＬ４８挿入配列の制限酵素地図が作成された。
【０１４０】
また、上述の各サブクローンの挿入配列の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーモデル３７７（パーキンエルマー・ジャパン社製）を用いて決定し、ｐＭＬ４８の全塩基配列を決定した。
【０１４１】
ｐＭＬ４８の挿入配列は全３４２０３塩基であった。
【０１４２】
ｐＭＬ４８の挿入配列の塩基配列は、配列表の配列番号１及び２に記載されている。配列表の配列番号１及び２に示される塩基配列は、互いに、完全に相補的である。
【０１４３】
該挿入配列上の構造遺伝子の存在について、遺伝子検索プログラムＧＲＡＩＬ（ＡｐｏＣｏｍ ＧＲＡＩＬ Ｔｏｏｌｋｉｔ：ＡＰＯＣＯＭ社製）及び相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２）：ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒ．１０．０に搭載）を用いて解析した。
【０１４４】
その結果、ｐＭＬ４８の挿入塩基配列中には、６種類の異なる構造遺伝子の存在が推定され、それぞれをｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲと命名した。また、ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲは配列表の配列番号２記載の塩基配列中に、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤは配列表の配列番号１に示される塩基配列中に、それぞれコード領域を有していることが推定された。さらに、該挿入配列における各推定構造遺伝子の相対的位置及び大きさが推定された。
【０１４５】
本実施例の結果を図２に記載した。
実施例８．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４８の挿入配列の解析（２）
ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法及びＲＡＣＥにより、実施例７において存在が示唆された構造遺伝子の発現解析、及び５’−末端並びに３’−末端領域の解析を行なった。
１）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０の全ＲＮＡの調製
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養したスラント（実施例２記載）より５ｍｍ角の菌体を１０ｍｌのＭＧＢ３−８培地を入れた１００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２６℃にて３日間、振盪培養した。
【０１４６】
培養物からの全ＲＮＡの調製は、グアニジン・イソチオシアネート法を利用したＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて行った。すなわち、培養物を、室温、５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して菌体を回収し、湿重量２ｇの菌体を液体窒素により凍結した後、乳鉢上で粉末になるまで破砕した。この破砕物をグアニジン・イソチオシアネートを含む４ｍｌの菌体溶解バッファー（このキットに含まれる。）に懸濁した。懸濁液をこのキットに含まれるＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム１０本に４５０μｌずつ分注し、室温、１０００×Ｇ、１０分間遠心分離した後、溶出液をそれぞれ回収した：各溶出液に２２５μずつのエタノールを加えた後、このキットに含まれるＲＮＡミニスピンカラムに添加した。このカラムをこのキットに含まれる洗浄用緩衝液で洗浄した後、５０μｌずつのリボヌクレアーゼ・フリー蒸留水で吸着物を溶出させ、溶出液を全ＲＮＡ画分とした。
２）ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション
２０μｇのペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０の全ＲＮＡを含む２．２５μｌの水溶液に、１μｌの１０×ＭＯＰＳ（組成；２００ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．０：１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌してから使用した。：同仁化学研究所（株）製）、１．７５μｌのホルムアルデヒド及び５μｌのホルムアミドを添加して混合し、ＲＮＡサンプルとした。このＲＮＡサンプルを、６５℃にて１０分間保温した後、氷水中で急冷し、アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動のゲルは、１０ｍｌの１０×ＭＯＰＳ及び１ｇの Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ０３「ＴＡＫＡＲＡ」（宝酒造（株）製）を７２ｍｌのピロカルボニック・アシッド・ジエチルエステル（Ｓｉｇｍａ社製）処理水に混合し、加熱してアガロースを溶解させた後冷却させ、１８ｍｌのホルムアルデヒドを添加することにより作製した。サンプルバッファーは、１×ＭＯＰＳ（１０×ＭＯＰＳを水で１０倍希釈したもの。）を使用した。ゲル中のＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中でＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ+（アマシャム社）へトランスファーした。
【０１４７】
プローブには、ｐＭＬ４８挿入配列を下記表１記載の制限酵素１及び２で消化することにより得られるＤＮＡ断片（a、b、c、d及びe）を用いた。
【０１４８】
【表１】
プローブの標識、ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出は、実施例５のサザンブロット・ハイブリダイゼーションに従って行なった。
【０１５０】
本実施例の結果を図３に記載した。
【０１５１】
各シグナルは各プローブの塩基配列と相同な転写産物の存在を示す。
【０１５２】
本実施例でｐＭＬ４８挿入配列上に存在が推定された６つの構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲはペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株内で転写されていることが確認された。
【０１５３】
各シグナルの位置は、転写産物の相対的なサイズを示すものではない。
３）５’ＲＡＣＥによる５’−末端配列の決定
各構造遺伝子の５’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得は、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて行なった。
【０１５４】
実施例７及び本実施例の２）の結果より推定されたｐＭＬ４８の挿入配列上の各構造遺伝子において、コード領域であり且つ該遺伝子の５’−末端近傍に位置すると考えられる塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡを２種類作製した。
【０１５５】
表２に、各構造遺伝子の、より３’−側に位置する塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）の塩基配列を、表３に、より５’−側に位置する塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）の塩基配列を、それぞれ記載した。
【０１５６】
【表２】
【表３】
オリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）をプライマーとし、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した。すなわち、１μｇの全ＲＮＡ、２．５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）、１μｌのＳＵＰＥＲ ＳＣＲＩＰＴＴＭ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（このキットに含まれる。）を含む２４μｌの反応液を、１６℃にて１時間保温した後、生成物をこのキットに含まれるＧＬＡＳＳＭＡＸスピンカートリッジに添加してｃＤＮＡ第一鎖を精製した。
【０１５９】
ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端に、このキットに含まれるｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによりポリＣ鎖を付加させた。
【０１６０】
３’−末端にポリＣ鎖の付加したｃＤＮＡ第一鎖、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）及び４０ｐｍｏｌのＡｂｒｉｇｅｄ Ａｎｃｈｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ（このキットに含まれる）を含む５０μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３５回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製し、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いてクローニングした。
【０１６１】
以上の操作を５’ＲＡＣＥという。
【０１６２】
５’−末端を含むｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、転写開始点及び翻訳開始コドンの位置を推定した。
【０１６３】
５’ＲＡＣＥにより得られた各構造遺伝子に対応する５’−末端ｃＤＮＡ断片の塩基配列を記載した配列表の配列番号を表４に表示した。また、表５に、各構造遺伝子の転写開始点及び翻訳開始の存在する配列番号、転写開始点の位置及び翻訳開始点の位置を記載した。
【０１６４】
【表４】
【表５】
４）３’ＲＡＣＥによる３’−末端配列の決定
各構造遺伝子の３’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得は、Ｒｅａｄｙ Ｔｏ Ｇｏ：Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いて行なった。
【０１６７】
実施例７及び本実施例の２）の結果より推定されたｐＭＬ４８の挿入塩基配列上の各構造遺伝子において、コード領域であり、構造遺伝子の３’−末端近傍に位置すると考えられるセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）を１種類ずつを作製した。
【０１６８】
表６に各構造遺伝子について作製したオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）の塩基配列を表示した。
【０１６９】
【表６】
オリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）をプライマーとし、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の全ＲＮＡ（１μｇ）を鋳型とした逆転写反応によりｃＤＮＡ第一鎖を合成した。
【０１７１】
ｃＤＮＡ第一鎖、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）及びＮｏｔＩ−ｄ（Ｔ）１８プライマー（このキットに含まれる。）を含む１００μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３５回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製し、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いてクローニングした。
【０１７２】
以上の操作を３’ＲＡＣＥという。
【０１７３】
得られたｃＤＮＡの３’−側断片の塩基配列を決定し、翻訳終止コドンの位置を推定した。
【０１７４】
３’ＲＡＣＥにより得られた各構造遺伝子に対応する３’−末端ｃＤＮＡ断片の塩基配列を記載した配列表の配列番号を表７にまとめた。また、表８に、各構造遺伝子の翻訳終止コドン及び該コドンの位置を配列表の配列番号１又は２に基いて記載した。
【０１７５】
【表７】
【表８】
さらに、各構造遺伝子がコードすると推定されるポリペプチドのＣ末端のアミノ酸残基、そのアミノ酸残基をコードするトリヌクレオチドの塩基配列及びそのトリヌクレオチドの位置を表９に記載した。
【０１７８】
【表９】
さらに、表８記載の翻訳終止コドンに対する相補配列、該相補配列の存在する配列番号、及び、該相補配列の位置を表１０にまとめた。
【０１８０】
【表１０】
以上の通り、各構造遺伝子の存在、その方向及びその位置が明らかとなった。これらの情報に基いて、各構造遺伝子の転写産物及び翻訳産物を取得することが可能である。
実施例９．構造遺伝子ｍｌｃＥに対応するｃＤＮＡの取得
１）全ＲＮＡの調製
ペニシリウム・シトリナムの全ＲＮＡは実施例８の方法に従って調製した。
２）プライマーの設計
実施例８により決定された構造遺伝子ｍｌｃＥに対応する完全長のｃＤＮＡを取得するために、ｍｌｃＥの５’−上流域のヌクレオチド配列よりセンス・プライマー（5'-gttaacatgtcagaacctctaccccc-3'：配列表の配列番号３５番参照）を、３’−下流域のヌクレオチド配列よりアンチセンス・プライマー（5'-aatatttcaagcatcagtctcaggcac-3'：配列表の配列番号３６番参照）を、それぞれ設計及び合成した。該合成はホスフォロアミダイト法により行った。
３）ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｌｃＥの遺伝子産物をコードする完全長のｃＤＮＡを取得するために、Ｔａｋａｒａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１を用いた。
【０１８２】
１μｇの全ＲＮＡ、キットに添付のＲａｎｄｏｍ ９ｍｅｒｓプライマーを２．５ｐｍｏｌ、１μｌの逆転写酵素（キットに含まれる。）を含む２０μｌの反応液を４２℃にて３０分保温し、ｃＤＮＡ第１鎖を合成した後、９９℃にて５分間加熱して逆転写酵素を失活させた。
【０１８３】
ｃＤＮＡ第１鎖反応溶液全量、４０ｐｍｏｌのセンス・プライマー及び４０ｐｍｏｌのアンチセンス・プライマーを含む総容１００μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３０回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製した。つづいて、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いて、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換し、形質転換大腸菌から該ＤＮＡ断片を所有したプラスミドを保持する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＣＲｅｘｐＥと命名した。
【０１８４】
得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＥ中の挿入ＤＮＡの塩基配列を決定したところ、該挿入ＤＮＡは構造遺伝子ｍｌｃＥに対応する完全長のｃＤＮＡを含んでいた。その塩基配列及びその塩基配列によりコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列は、配列表の配列番号３７及び／又は３８に記載されている。
実施例１０．構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡの取得
１）全ＲＮＡの調製
ペニシリウム・シトリナムの全ＲＮＡは実施例８の方法に従って調製した。
２）プライマーの設計
実施例８により決定された構造遺伝子ｍｌｃＲに対応する完全長のｃＤＮＡを取得するために、ｍｌｃＲの５’−上流域のヌクレオチド配列よりセンス・プライマー（5'-ggatccatgtccctgccgcatgcaacgattc-3'：配列表の配列番号３９参照）を、３’−下流域のヌクレオチド配列よりアンチセンス・プライマー（5'-ggatccctaagcaatattgtgtttcttcgc-3'：配列表の配列番号４０参照）を、それぞれ設計及び合成した。該合成はホスフォロアミダイト法により行った。
３）ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｌｃＲの遺伝子産物をコードする完全長のｃＤＮＡを取得するために、Ｔａｋａｒａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１を用いた。
【０１８５】
１μｇの全ＲＮＡ、キットに添付のＲａｎｄｏｍ ９ｍｅｒｓプライマーを２．５ｐｍｏｌ、１μｌの逆転写酵素（キットに含まれる。）を含む２０μｌの反応液を４２℃にて３０分保温し、ｃＤＮＡ第１鎖を合成した後、９９℃にて５分間加熱して逆転写酵素を失活させた。
【０１８６】
ｃＤＮＡ第１鎖反応溶液全量、４０ｐｍｏｌのセンス・プライマー及び４０ｐｍｏｌのアンチセンス・プライマーを含む総容１００μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分間を１サイクルとする反応を３０回行なった後、７２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱により産物を精製した。つづいて、実施例４記載の方法に準じてｐＣＲ２．１を用いて、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換し、形質転換大腸菌から該ＤＮＡ断片を所有したプラスミドを保持する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＣＲｅｘｐＲと命名した。
【０１８７】
得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＲ中の挿入ＤＮＡの塩基配列を決定したところ、該挿入ＤＮＡは構造遺伝子ｍｌｃＲに対応する完全長のｃＤＮＡを含んでいた。その塩基配列及びその塩基配列によりコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列は、配列表の配列番号４１及び／又は４２に記載されている。
実施例１１．発現ベクターｐＳＡＫ７００の構築
実施例１記載のベクターｐＳＡＫ３３３及びｐＳＡＫ３６０を用いて、ｃＤＮＡ発現ベクターｐＳＡＫ７００の構築を行なった。
１）ｐＳＡＫ３３３を制限酵素ＢａｍＨ１とＨｉｎｄ３（宝酒造（株）製）で二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、４．１ｋｂ断片をゲルより回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）で該ＤＮＡ断片の末端を平滑化した。
２）ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて上記ＤＮＡ断片に、ＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１−ＢａｍＨ１アダプター（宝酒造（株）製）を連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。形質転換大腸菌からアダプターを所有したプラスミドを保有する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫ４１０と命名した。
３）ｐＳＡＫ３６０を制限酵素Ｐｖｕ２及びＳｓｐ１で二重消化した後、電気泳動を行ない、アスペルギルス・ニデュランス由来の３−ホスホグリセレートキナーゼ（3-phosphoglycerate kinase：以下、「ｐｇｋ」という。）遺伝子のプロモーター及びターミネーター、大腸菌由来のＨＰＴを含有するＤＮＡ断片（約２．９ｋｂ）をゲルより回収した。
４）回収した上記ＤＮＡ断片を、ｐＳＡＫ４１０のＰｖｕ２部位に、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。形質転換大腸菌から該ＤＮＡ断片を所有したプラスミドを保持する株を選抜し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫ７００と命名した。
【０１８８】
ｐＳＡＫ７００の構築手順を図４に記載する。
【０１８９】
ｐＳＡＫ７００は、アダプター由来のＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの各制限酵素認識部位を１つずつ有する。また、ｐＳＡＫ７００は選択マーカーとして、アンピシリン耐性遺伝子（Ampicillin resistant gene：以下、「Ａｍｐr」という。）及びハイグロマイシン耐性遺伝子であるＨＴＰを有している。以下の実施例において、大腸菌を宿主とする場合、ｐＳＡＫ７００又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫ７００による形質転換体の選択は、４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを培地に添加して行なった。ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０を宿主とする場合、ｐＳＡＫ７００又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳＡＫ７００による形質転換体の選択は、２００μｇ／ｍｌのハイグロマシシンＢを培地に添加して行なった。
実施例１２．組換え発現ベクターｐＳＡＫｅｘｐＥの構築
１）実施例９で得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＥを制限酵素ＨｐａＩ及びＳｓｐＩ（ともに，宝酒造（株）製）の存在下で３７℃にて２時間反応させ、該反応物をアガロースゲル電気泳動に供し、ｍｌｃＥの完全長ｃＤＮＡを含む１．７ｋｂ付近のバンドをゲルより回収した。
２）ｐＳＡＫ７００を制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造（株）製）で３７℃１時間反応させた後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）と３７℃５分間反応させることにより末端を平滑化し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。得られた沈殿を少量のＴＥに溶解させ、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）製）を添加し、６５℃３０分間反応させた。このように平滑末端化したｐＳＡＫ７００のＮｏｔ１消化物と、１）で得られた１．７ｋｂのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。その結果、組換え発現ベクターで形質転換された大腸菌株が得られた。
【０１９０】
本実施例で得られた形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＥ ＳＡＮＫ ７２４９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００５を付与された。
実施例１３．組換え発現ベクターｐＳＡＫｅｘｐＲの構築
１）実施例１０で得られた組換えＤＮＡベクターｐＣＲｅｘｐＲを制限酵素ＢａｍＨ１（宝酒造（株）製）の存在下で３７℃にて２時間反応させ、該反応物をアガロースゲル電気泳動に供し、ｍｌｃＲの完全長ｃＤＮＡを含む１．４ｋｂ付近のバンドをゲルより回収した。
２）ｐＳＡＫ７００を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）製）で３７℃１時間反応させた後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造（株）製）を添加して６５℃にて３０分間反応させた。このようにＢａｍＨ１消化されたｐＳＡＫ７００と、１）で得られた１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造（株）製）を用いて連結し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）を形質転換した。その結果、組換え発現ベクターで形質転換された大腸菌株が得られた。
【０１９１】
本実施例で得られた形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９株は、平成１２年（２０００年）１月２５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６を付与された。
実施例１４．ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物の形質転換
１）プロトプラストの調製
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養したスラントより、白金耳を用いてＰＧＡ寒天培地に接種し、２６℃にて１４日間保温した。該培養物よりペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の胞子を回収し、１×１０8個の胞子を８０ｍｌのＹＰＬ−２０培地に接種し、２６℃にて１日間保温した。胞子の発芽を顕微鏡観察により確認した後、発芽胞子を、室温、５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して胞子を沈澱として回収した。胞子を滅菌水で３回洗浄した後、プロトプラスト化を行なった。すなわち、２００ｍｇのザイモリアーゼ２０Ｔ（生化学工業（株）製）及び１００ｍｇのキチナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍｌの０．５５Ｍ 塩化マグネシウムに溶解し、室温、５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して得られた上清を酵素液とし、２０ｍｌの酵素液及び湿重量０．５ｇの発芽胞子を１００ｍｌ容三角フラスコに入れ、３０℃にて６０分間穏やかに振盪し、発芽胞子がプロトプラスト化したことを顕微鏡観察により確認した後、反応液を３Ｇ−２ガラスフィルター（ＨＡＲＩＯ社製）で濾過した。該濾液を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離し、プロトプラストを沈澱として回収した。
２）形質転換
１）で得られたプロトプラストを３０ｍｌの０．５５Ｍ 塩化マグネシウム溶液で２回、３０ｍｌの０．５５Ｍ 塩化マグネシウム−５０ｍＭ 塩化カルシウム−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ｐＨ６．３：以下、「ＭＣＭ溶液」という。）で１回それぞれ洗浄し、１００μｌの４％(w/v)ポリエチレングリコール８０００−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸−０．００２５％(w/v)ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社製）−５０ｍＭ 塩化マグネシウム（ｐＨ６．３：以下、「形質転換用溶液」という。）に懸濁した。約５×１０7個のプロトプラストを含む９６μｌの形質転換溶液及び１２０μｇのｐＳＡＫｅｘｐＥ（実施例１２記載）又はｐＳＡＫｅｘｐＲ（実施例１３記載）を含む１０μｌのＴＥを混合し、氷上で３０分間静置した。これに１．２ｍｌの２０％(w/v)ポリエチレングリコール−５０ｍＭ 塩化マグネシウム−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ｐＨ６．３）を加えて穏やかにピペッティングし、室温、２０分間静置した。これに１０ｍｌのＭＣＭ溶液を加えて穏やかに混合し、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した。沈澱より形質転換プロトプラストを回収した。
３）形質転換プロトプラストにおける細胞壁の再生
２）で得られた形質転換プロトプラストを５ｍｌの液状のＶＧＳ中層寒天培地に懸濁し、固化した１０ｍｌのＶＧＳ下層寒天培地プレートに重層した。該プレートを、２６℃にて１日間培養した後、プレート１枚につき５ｍｇのハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ：Ｓｉｇｍａ社製）を含む１０ｍｌの液状のＶＧＳ上層寒天培地を重層した（ハイグロマイシンＢの終濃度は２００μｇ／ｍｌ）。２６℃にて１４日間保温して得られた菌株を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有するＰＧＡ寒天培地上で継代培養した後、ＰＧＡ寒天培地で作製したスラントに植え継ぎ、２６℃にて１４日間保温した。
【０１９２】
該スラントは４℃で保存した。
実施例１５．構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤに対応する各ｃＤＮＡ配列の決定
１）構造遺伝子ｍｌｃＡに対応するｃＤＮＡ配列の決定
ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ ｖｅｒ１．１（宝酒造（株）製）を用いてｃＤＮＡ第１鎖を合成した。
【０１９３】
所望のｃＤＮＡの全長又はその部分領域を増幅するために多種のプライマーを設計し、該ｃＤＮＡ第１鎖を鋳型として以下の条件によるＰＣＲを行った；Ｔｈｅ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ／Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ及びＫｉｔとＴｈｅ ＡＢ１ Ｐｒｉｓｍ ３７７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ともに、ＰＥアプライド・バイオシステムズ社製）を用い、９４℃にて３０秒、６２℃にて３０秒、７２℃にて５分からなる反応サイクルを３０回反復した。
【０１９４】
ＰＣＲ産物をそれぞれプラスミドｐＣＲ２．１へ挿入した。
【０１９５】
組換プラスミドでそれぞれ大腸菌を形質転換した。
【０１９６】
形質転換大腸菌から得られた組換プラスミドの各挿入配列のヌクレオチド配列と構造遺伝子ｍｌｃＡのヌクレオチド配列とを比較することにより、エキソンとイントロンの構造を決定した。
【０１９７】
このようにして、構造遺伝子ｍｌｃＡに対応するｃＤＮＡの配列が決定され（配列表の配列番号４３）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号４４）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０１９８】
構造遺伝子ｍｌｃＡによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するＬＮＫＳ（ｌｏｖＥ）であり、６０％同一であった。
２）構造遺伝子ｍｌｃＢに対応するｃＤＮＡ配列の決定
１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＢに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号４５）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号４６）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０１９９】
構造遺伝子ｍｌｃＢによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するＬＤＫＳ（ｌｏｖＦ）であり、６１％同一であった。
３）構造遺伝子ｍｌｃＣに対応するｃＤＮＡ配列の決定
１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＣに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号４７）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号４８）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０２００】
構造遺伝子ｍｌｃＣによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するｌｏｖＡであり、７２％同一であった。
４）構造遺伝子ｍｌｃＤに対応するｃＤＮＡ配列の決定
１）と同様に、構造遺伝子ｍｌｃＤに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定され（配列表の配列番号４９）、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が推定された（配列表の配列番号５０）。また、該ポリペプチドの機能が、アミノ酸配列の相同性検索により推定された。
【０２０１】
構造遺伝子ｍｌｃＤによりコードされるポリペプチドと最も高い相同性を示すアミノ酸配列を有する公知物質はロバスタチン生合成遺伝子クラスター上に存在するＯＲＦ８であり、６３％同一であった。
５）構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤの各エキソンの、ｐＭＬ４８挿入配列上の位置は、表１３に示す通りである。
【０２０２】
【表１１】
また、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲの転写終結点の、ｐＭＬ４８挿入配列上の位置は、表１２に示す通りである。
【０２０４】
【表１２】
実施例１６．構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ又はｍｌｃＤの破壊
ＤＮＡの相同組換（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）手法を用いた部位特異的変異（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ又はｍｌｃＤを破壊した。
１）構造遺伝子ｍｌｃＡ破壊株の取得とその解析
ｐＳＡＫ３３３を用い、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＡを破壊するための組換プラスミドを作製した。
【０２０６】
ｐＭＬ４８挿入配列を制限酵素Ｋｐｎ１で消化し、構造遺伝子ｍｌｃＡ中の４．１断片を回収、精製した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、制限酵素Ｐｖｕ２で消化したｐＳＡＫ３３３に連結した。得られたプラスミドをｐｄｉｓｍｌｃＡと命名した。
【０２０７】
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ １３３８０株をｐｄｉｓｍｌｃＡで形質転換した。
【０２０８】
ｐｄｉｓｍｌｃＡ形質転換株のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行い、構造遺伝子ｍｌｃＡの破壊を確認した。
【０２０９】
得られた構造遺伝子ｍｌｃＡ破壊株は、ＭＬ−２３６Ｂ及びその前駆体を全く生産しなかった。
２）構造遺伝子ｍｌｃＢ破壊株の取得とその解析
ｐＳＡＫ３３３を用い、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＢを破壊するための組換プラスミドを作製した。
【０２１０】
ｐＭＬ４８挿入配列を制限酵素Ｐｓｔ１及びＢａｍＨ１で消化し、構造遺伝子ｍｌｃＢ中の１．４ｋｂ断片を回収、精製した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、制限酵素Ｐｖｕ２で消化したｐＳＡＫ３３３に連結した。得られたプラスミドをｐｄｉｓｍｌｃＢと命名した。
【０２１１】
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ １３３８０株をｐｄｉｓｍｌｃＢで形質転換した。
【０２１２】
ｐｄｉｓｍｌｃＢ形質転換株のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行い、構造遺伝子ｍｌｃＢの破壊を確認した。
【０２１３】
得られた構造遺伝子ｍｌｃＢ破壊株は、ＭＬ−２３６Ｂを生産せず、ＭＬ−２３６Ｂの前駆体であるＭＬ−２３６Ａを生産した。
３）構造遺伝子ｍｌｃＤ破壊株の取得とその解析
ｐＳＡＫ３３３を用い、ペニシリウム・シトリナムの構造遺伝子ｍｌｃＤを破壊するための組換プラスミドを作製した。
【０２１４】
ｐＭＬ４８挿入配列を制限酵素Ｋｐｎ１及びＢａｍＨ１で消化し、構造遺伝子ｍｌｃＤ中の１．４ｋｂ断片を回収、精製した後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、制限酵素Ｐｖｕ２で消化したｐＳＡＫ３３３に連結した。得られたプラスミドをｐｄｉｓｍｌｃＤと命名した。
【０２１５】
ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ １３３８０株をｐｄｉｓｍｌｃＤで形質転換した。
【０２１６】
ｐｄｉｓｍｌｃＤ形質転換株のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行い、構造遺伝子ｍｌｃＤの破壊を確認した。
【０２１７】
得られた構造遺伝子ｍｌｃＤ破壊株のＭＬ−２３６Ｂ生産量は、対照のｍｌｃＤ非破壊株の３０％であった。
実施例１７．ｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株における構造遺伝子ｍｌｃＲの機能解析
実施例１３において得られた２つのｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株（ＴＲ１及びＴＲ２）及び対照の非形質転換株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）を、それぞれＭＢＧ３−８培地に接種し、実施例８記載の方法により培養した。
【０２１８】
培養終了後、実施例８記載の方法により、全ＲＮＡを抽出した。
【０２１９】
全ＲＮＡを鋳型とし、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ又はｍｌｃＲのヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド（表１３参照）をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２２０】
【表１３】
ＴＲ１、ＴＲ２及びペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株に関するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図５に示す。
【０２２２】
形質転換株（ＴＲ１及びＴＲ２）において、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ並びにｍｌｃＲは、培養１日目、２日目及び３日目のいずれにおいても発現していた。
【０２２３】
これに対し、非形質転換対照株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）において、これらの構造遺伝子は、培養３日目においてのみ発現していた。
【０２２４】
構造遺伝子ｍｌｃＥの発現は、形質転換株と非形質転換対照株とで、差が見られなかった。
【０２２５】
これらの結果は、構造遺伝子ｍｌｃＲに対応するｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ上に位置する他の構造遺伝子（ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ等）のいくつかの転写を誘導することを示唆するものである。
実施例１８．ｐＳＡＫｅｘｐＥ形質転換株における構造遺伝子ｍｌｃＥの機能解析
実施例１３において得られたｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株（ＴＥ１）及び対照の非形質転換株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）を、それぞれＭＢＧ３−８培地に接種し、実施例８記載の方法により培養した。
【０２２６】
培養終了後、実施例８記載の方法により、全ＲＮＡを抽出した。
【０２２７】
全ＲＮＡを鋳型とし、実施例１７の表１３に記載オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０２２８】
ＴＥ１及びペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株に関する、構造遺伝子ｍｌｃＥのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図６に示す。
【０２２９】
形質転換株（ＴＥ１）において、構造遺伝子ｍｌｃＥは、培養１日目、２日目及び３日目のいずれにおいても発現していた。
【０２３０】
これに対し、非形質転換対照株（ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株）において、構造遺伝子ｍｌｃＥは、培養３日目においてのみ発現していた。
【０２３１】
一方、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ及びｍｌｃＲの発現は、形質転換株と非形質転換対照株とで、差が見られなかった。
【０２３２】
これらの結果は、構造遺伝子ｍｌｃＥに対応するｃＤＮＡによりコードされるタンパク質が、ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ゲノムＤＮＡ上に位置する他の構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ及びｍｌｃＲの転写誘導を伴わずに、ＭＬ−２３６Ｂの生合成を促進し得ることを示唆するものである。
試験例１．形質転換株及び親株の有するＭＬ−２３６Ｂ生合成能の比較
実施例１４において得られた形質転換株及び対照の非形質転換株であるペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養し、該培養物中のＭＬ−２３６Ｂ量を測定した。
【０２３３】
形質転換株を培養した実施例１４記載のスラント又はペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養した実施例２記載のスラントより、５ｍｍ角の菌体を、１０ｍｌのＭＢＧ３−８培地を入れた１００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２４℃にて２日間、振盪培養した後、３．５ｍｌの５０％(w/v)グリセリン溶液を添加し、さらに２４℃にて１０日間、振盪培養した。
【０２３４】
該培養物１０ｍｌに５０ｍｌの０．２規定水酸化ナトリウムを加え、２６℃にて１時間、振盪しつつ保温した後、室温、３０００×Ｇの条件下で２分間遠心分離し、１ｍｌの上清を回収し、９ｍｌの５０％メタノールと混合してＨＰＬＣに供した。
【０２３５】
ＨＰＬＣのカラムには、ＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２（直径６ｍｍ、長さ１００ｍｍ：センシュー科学（株）製）を用い、移動相には７５％(v/v)メタノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸を用い、室温にて２ｍｌ／分の流速で溶出した。これら条件下において、ＭＬ−２３６Ｂはカラム添加後４．０分に溶出された。検出はＵＶ検出器の吸収波長を２３６ｎｍに設定して行なった。
【０２３６】
ｐＳＡＫｅｘｐＥ形質転換株のうち、ＭＬ−２３６Ｂ生合成能の上昇した株３つが得られた。これらのＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、対照の非形質転換株より平均１０％高かった。これら３株のＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、モノスポア処理等の継代を行なった後も安定に維持された。
【０２３７】
ｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株のうち、ＭＬ−２３６Ｂ生合成能の上昇した株５つが得られた。これらのＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、対照の非形質転換株より平均１５％高かった。これら５株のＭＬ−２３６Ｂ生合成能は、モノスポア処理等の継代を行なった後も安定に維持された。
【０２３８】
これらの結果より、ｐＳＡＫｅｘｐＥ又はｐＳＡＫｅｘｐＲの挿入配列は、ＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡであることが示された。
【０２３９】
【発明の効果】
本発明においてＭＬ−２３６Ｂ生産微生物より得られたＭＬ−２３６Ｂ生合成促進ｃＤＮＡは、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進する。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌及び糸状菌に導入させることができ且つ長いＤＮＡを挿入することができるＤＮＡベクターｐＳＡＫｃｏｓ１の構築図。
【図２】ｐＭＬ４８挿入配列の構造遺伝子解析。
【図３】ｐＭＬ４８挿入配列のノーザンブロット・ハイブリダイゼーション。
【図４】大腸菌及び糸状菌に導入させることができる発現ベクターｐＳＡＫ７００の構築図。
【図５】ｐＳＡＫｅｘｐＲ形質転換株及び非形質転換対照株における、構造遺伝子ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲの、ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現解析。
【図６】ｐＳＡＫｅｘｐＥ形質転換株及び非形質転換対照株における、構造遺伝子ｍｌｃＥの、ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現解析。
【配列表】
Claims (10)
- 以下の群から選択されるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４１のヌクレオチド番号１乃至１３８０で示される塩基配列を１つ又は複数含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ：
（ｂ）（ａ）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物内に導入されることにより該生産微生物のＭＬ−２３６Ｂ生合成を促進することを特徴とするＤＮＡ。 - 形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）より得ることができる、請求項１記載のＤＮＡ。
- 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター。
- 形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）株より得ることができる、請求項３記載の組換えＤＮＡベクター。
- 請求項３又は４に記載の組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞。
- ＭＬ−２３６Ｂ生産微生物であることを特徴とする請求項５記載の宿主細胞。
- ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）であることを特徴とする、請求項６記載の宿主細胞。
- 請求項７記載の宿主細胞を培養し、次いで該培養物からＭＬ−２３６Ｂを回収することを特徴とする、ＭＬ−２３６Ｂの製造法。
- 大腸菌であることを特徴とする、請求項５記載の宿主細胞。
- 形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＳＡＫｅｘｐＲ ＳＡＮＫ ７２５９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−７００６）株である、請求項９記載の宿主細胞。
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