JP2001112487A - Ｍｌ−２３６ｂ生合成関連ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤ＭＬ−２３６Ｂ
生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴と
するＤＮＡ、該ＤＮＡとハイブリダイズする核酸分子、
該ＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡベクター、該組換え
ＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、ＭＬ−２３
６Ｂの製造法、該ＤＮＡ上の塩基配列に基いて設計され
たＰＣＲ用プライマー等の提供。 【解決手段】ペニシリウム・シトリウム（Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）由来の特定な塩基配列
を含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入さ
れることにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善する
ことを特徴とするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還
元酵素阻害剤ＭＬ−２３６Ｂ生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生
産能を改善することを特徴とするＤＮＡ、該ＤＮＡとハ
イブリダイズする核酸分子、該ＤＮＡを組み込んだ組換
えＤＮＡベクター、該組換えＤＮＡベクターで形質転換
された宿主細胞、ＭＬ−２３６Ｂの製造法、該ＤＮＡ上
の塩基配列に基いて設計されたＰＣＲ用プライマー等に
関する。

【０００２】

【従来の技術】高脂血症改善薬として臨床において使用
されているＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤プラバスタチ
ンは、ペニシリウム・シトリナムが生産するＭＬ−２３
６Ｂをストレプトミセス・カルボフィラス（Streptomyc
es carbophilus）により微生物変換することにより得ら
れる（Endo,A.,et al.,J.Antibiot.,29,1346(1976)：Ma
tsuoka,S.,et al.,Eur.J.Biochem.,184,707(1989)記
載）。

【０００３】プラバスタチンの前駆体ＭＬ−２３６Ｂ、
及び、プラバスタチンと部分構造を共有するＨＭＧ−Ｃ
ｏＡ阻害剤ロバスタチンは、ともにポリケチドを経て生
合成されることが示されている（Moore,R.N.,et al.,J.
Am.Chem.Soc.,107,3694(1985) ：Shiao,M.and Don,H.
S.,Proc.Natl.Sci.Counc.ROC.,11,223(1987)記載）。

【０００４】ポリケチドとは、酢酸、プロピオン酸、酪
酸などの低分子カルボン酸残基の連続的な縮合反応から
生じるβ―ケト炭素鎖から導かれる化合物の総称であ
り、各β―ケトカルボニル基の縮合・還元様式により、
多様な構造が導かれる（Hopwood, D.A. and Sherman,
D.H., Annu.Rev.Genet., 24, 37-66(1990)：Hutchinso
n,C.R. and Fujii, I., Annu.Rev.Genet., 49, 201-238
(1995)記載）。

【０００５】ポリケチドの合成を担うポリケチド・シン
ターゼ（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ：以
下、「ＰＫＳ」という。）は糸状菌や細菌の有する酵素
であることが知られており、糸状菌では該酵素の分子生
物学的研究がなされている（Feng,G.H.and Leonard,T.
J.,J.Bacteriol.,177,6246(1995)：Takano,Y.,et al.Mo
l.Gen.Genet.249,162(1995)記載）。ロバスタチン生産
菌であるアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terr
eus）については、トリオールＰＫＳ遺伝子の解析がな
されている（特表平９−５０４４３６号公報記載）。

【０００６】ところで、糸状菌の二次代謝産物の生合成
関連遺伝子は、ゲノム上でクラスターを形成しているこ
とが少なくない。ポリケチドの生合成系にて、該系に関
与する遺伝子クラスターの存在が知られている。アスペ
ルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペ
ルギルス・パラシティカス（Aspergillus parasiticu
s）の生産するポリケチドであるアフラトキシンの生合
成では、ＰＫＳその他ポリケチドの生合成に関与する酵
素蛋白質をコードする遺伝子がクラスター構造を形成し
ていることが知られており、両菌のアフラトキシン生合
成関連遺伝子のゲノム比較解析が行なわれている（Yu,
J.,et al,Appl.Environ.Microbiol.,61,2365(1995)記
載）。アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus ni
dulans）の生産するステリグマトシスチンの生合成にお
いては、生合成関連遺伝子が、ゲノム上の連続する約６
０ｋｂの領域においてクラスター構造を形成しているこ
とが報告されている（Brown,D.W.,et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,93,1418(1996)記載）。

【０００７】ＭＬ−２３６Ｂ生合成に関する分子生物学
的研究は、現在まで十分にはなされていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ペニシ
リウム・シトリナムのＭＬ−２３６Ｂ生合成を担う酵素
の遺伝子又は遺伝子クラスターを、ＭＬ−２３６Ｂ生産
菌のゲノムＤＮＡライブラリーよりクローニングし、得
られた組換えＤＮＡベクターを用いて該生産菌を形質転
換することにより、該生産菌においてＭＬ−２３６Ｂの
生産性が改善されることを見出し、本発明を完成した。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）配列表
の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３で示
される塩基配列を含むことからなり、ＭＬ−２３６Ｂ生
産菌内に導入されることにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生
産能を改善することを特徴とするＤＮＡ、（２）形質転
換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１
９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０）より得ることがで
きる、（１）記載のＤＮＡ、（３）（１）又は（２）記
載のＤＮＡとハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌
内に導入されることにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能
を改善することを特徴とするＤＮＡ、（４）（１）又は
（２）記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されるこ
とにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを
特徴とするＤＮＡ、（５）（１）乃至（４）のいずれか
一つに記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡベクター、
（６）形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ Ｓ
ＡＮＫ７１１９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０）に保
持される、（５）記載の組換えＤＮＡベクター、（７）
（５）又は（６）記載の組換えＤＮＡベクターで形質転
換された宿主細胞、（８）ＭＬ−２３６Ｂ生産菌である
ことを特徴とする（７）記載の宿主細胞、（９）ペニシ
リウム・シトリナム（Penicillium citrinum）であるこ
とを特徴とする、請求項８記載の宿主細胞、（１０）
（８）又は（９）記載の宿主細胞を培養し、次いで該培
養物からＭＬ−２３６Ｂを回収することを特徴とする、
ＭＬ−２３６Ｂの製造法、（１１）大腸菌であることを
特徴とする、（７）記載の宿主細胞、（１２）形質転換
大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９
９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０）である、（１１）記載
の宿主細胞、（１３）配列表の配列番号２において、ヌ
クレオチド番号２３０４５のアデニン又はそれより５’
−側の塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩
基からなる配列を有するＰＣＲ用プライマーＡ１、（１
４）（１３）記載のＰＣＲ用プライマーＡ１の塩基配列
と７０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基
からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＡ２（但し、該
ＰＣＲ用プライマーＡ２は、配列表の配列番号２のヌク
レオチド番号２３０４５乃至２３０４７によりコードさ
れるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得
る）、（１５）（１３）記載のＰＣＲ用プライマーＡ１
の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも１
０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＡ３
（但し、該ＰＣＲ用プライマーＡ３は、配列表の配列番
号２のヌクレオチド番号２３０４５乃至２３０４７によ
りコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに
用いられ得る）、（１６）（１３）記載のＰＣＲ用プラ
イマーＡ１の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少
なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プラ
イマーＡ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＡ４は、配列
表の配列番号２のヌクレオチド番号２３０４５乃至２３
０４７によりコードされるメチオニン残基をＮ末端とす
るポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるため
のＰＣＲに用いられ得る）、（１７）配列表の配列番号
１において、ヌクレオチド番号１４７９のシトシン又は
それより５’−側の塩基を５’−末端とする、少なくと
も１０個の塩基からなる配列を有するＰＣＲ用プライマ
ーＢ１、（１８）（１７）記載のＰＣＲ用プライマーＢ
１の塩基配列と７０％以上の相同性を有する、少なくと
も１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマー
Ｂ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＢ２は、配列表の配
列番号２のヌクレオチド番号３２７２０乃至３２７２２
によりコードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
に用いられ得る）、（１９）（１７）記載のＰＣＲ用プ
ライマーＢ１の塩基配列と８０％以上の相同性を有す
る、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ
用プライマーＢ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＢ３
は、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号３２７２０
乃至３２７２２によりコードされるアラニン残基をＣ末
端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させ
るためのＰＣＲに用いられ得る）、（２０）（１７）記
載のＰＣＲ用プライマーＢ１の塩基配列と９０％以上の
相同性を有する、少なくとも１０個の塩基からなる配列
を含むＰＣＲ用プライマーＢ４（但し、該ＰＣＲ用プラ
イマーＢ４は、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号
３２７２０乃至３２７２２によりコードされるアラニン
残基をＣ末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
を増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、（２１）
配列表の配列番号２において、ヌクレオチド番号１１７
４８のアデニン又はそれより５’−側の塩基を５’−末
端とする、少なくとも１０個の塩基からなる配列を有す
るＰＣＲ用プライマーＣ１、（２２）（２１）記載のＰ
ＣＲ用プライマーＣ１の塩基配列と７０％以上の相同性
を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰ
ＣＲ用プライマーＣ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＣ
２が、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１１７４
８乃至１１７５０によりコードされるメチオニン残基を
Ｎ末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅
させるためのＰＣＲに用いられ得る）、（２３）（２
１）記載のＰＣＲ用プライマーＣ１の塩基配列と８０％
以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる
配列を含むＰＣＲ用プライマーＣ３（但し、該ＰＣＲ用
プライマーＣ３が、配列表の配列番号２のヌクレオチド
番号１１７４８乃至１１７５０によりコードされるメチ
オニン残基をＮ末端とするポリペプチドをコードするｃ
ＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、
（２４）（２１）記載のＰＣＲ用プライマーＣ１の塩基
配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の
塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＣ４（但
し、該ＰＣＲ用プライマーＣ４が、配列表の配列番号２
のヌクレオチド番号１１７４８乃至１１７５０によりコ
ードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチド
をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
られ得る）、（２５）配列表の配列番号１において、ヌ
クレオチド番号１４３６２のチミン又はそれより５’−
側の塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基
からなる配列を有するＰＣＲ用プライマーＤ１、（２
６）（２５）記載のＰＣＲ用プライマーＤ１の塩基配列
と７０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基
からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＤ２（但し、該
ＰＣＲ用プライマーＤ２は、配列表の配列番号２のヌク
レオチド番号１９８３７乃至１９８３９によりコードさ
れるセリン残基をＣ末端とするポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得
る）、（２７）（２５）記載のＰＣＲ用プライマーＤ１
の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも１
０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＤ３
（但し、該ＰＣＲ用プライマーＤ３は、配列表の配列番
号２のヌクレオチド番号１９８３７乃至１９８３９によ
りコードされるセリン残基をＣ末端とするポリペプチド
をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
られ得る）、（２８）（２５）記載のＰＣＲ用プライマ
ーＤ１の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なく
とも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマ
ーＤ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＤ４は、配列表の
配列番号２のヌクレオチド番号１９８３７乃至１９８３
９によりコードされるセリン残基をＣ末端とするポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
に用いられ得る）、（２９）配列表の配列番号１におい
て、ヌクレオチド番号１１７９６のアデニン又はそれよ
り５’−側の塩基を５’−末端とする、少なくとも１０
個の塩基からなる配列を有するＰＣＲ用プライマーＥ
１、（３０）（２９）記載のＰＣＲ用プライマーＥ１の
塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも１０
個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＥ２
（但し、該ＰＣＲ用プライマーＥ２が、配列表の配列番
号１のヌクレオチド番号１１７９６乃至１１７９８によ
りコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに
用いられ得る）、（３１）（２９）記載のＰＣＲ用プラ
イマーＥ１の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少
なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プラ
イマーＥ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＥ３が、配列
表の配列番号１のヌクレオチド番号１１７９６乃至１１
７９８によりコードされるメチオニン残基をＮ末端とす
るポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるため
のＰＣＲに用いられ得る）、（３２）（２９）記載のＰ
ＣＲ用プライマーＥ１の塩基配列と９０％以上の相同性
を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰ
ＣＲ用プライマーＥ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＥ
４が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１１７９
６乃至１１７９８によりコードされるメチオニン残基を
Ｎ末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅
させるためのＰＣＲに用いられ得る）、（３３）配列表
の配列番号２において、ヌクレオチド番号２０７２３の
チミン又はそれより５’−側の塩基を５’−末端とす
る、少なくとも１０個の塩基からなる配列を有するＰＣ
Ｒ用プライマーＦ１、（３４）（３３）記載のＰＣＲ用
プライマーＦ１の塩基配列と７０％以上の相同性を有
し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ
用プライマーＦ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＦ２
が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１３４７６
乃至１３４７８によりコードされるシステイン残基をＣ
末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅さ
せるためのＰＣＲに用いられ得る）、（３５）（３３）
記載のＰＣＲ用プライマーＦ１の塩基配列と８０％以上
の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列
を含むＰＣＲ用プライマーＦ３（但し、該ＰＣＲ用プラ
イマーＦ３が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
１３４７６乃至１３４７８によりコードされるシステイ
ン残基をＣ末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、（３
６）（３３）記載のＰＣＲ用プライマーＦ１の塩基配列
と９０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基
からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＦ４（但し、該
ＰＣＲ用プライマーＦ４が、配列表の配列番号１のヌク
レオチド番号１３４７６乃至１３４７８によりコードさ
れるシステイン残基をＣ末端とするポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得
る）、（３７）配列表の配列番号１において、ヌクレオ
チド番号２４３２１のアデニン又はそれより５’−側の
塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基から
なる配列を有するＰＣＲ用プライマーＧ１、（３８）
（３７）記載のＰＣＲ用プライマーＧ１の塩基配列と７
０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基から
なる配列を含むＰＣＲ用プライマーＧ２（但し、該ＰＣ
Ｒ用プライマーＧ２が、配列表の配列番号１のヌクレオ
チド番号２４３２１乃至２４３２３でコードされるメチ
オニン残基をＮ末端とするポリペプチドをコードするｃ
ＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、
（３９）（３７）記載のＰＣＲ用プライマーＧ１の塩基
配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の
塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＧ３（但
し、該ＰＣＲ用プライマーＧ３が、配列表の配列番号１
のヌクレオチド番号２４３２１乃至２４３２３でコード
されるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドをコ
ードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ
得る）、（４０）（３７）記載のＰＣＲ用プライマーＧ
１の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＧ
４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＧ４が、配列表の配列
番号１のヌクレオチド番号２４３２１乃至２４３２３で
コードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
いられ得る）、（４１）配列表の配列番号２において、
ヌクレオチド番号６３１２のチミン又はそれより５’−
側の塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基
からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ１、（４２）
（４１）記載のＰＣＲ用プライマーＨ１の塩基配列と７
０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基から
なる配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ２（但し、該ＰＣ
Ｒ用プライマーＨ２は、配列表の配列番号１のヌクレオ
チド番号２７８８７乃至２７８８９でコードされるアル
ギニン残基をＣ末端とするポリペプチドをコードするｃ
ＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、
（４３）（４１）記載のＰＣＲ用プライマーＨ１の塩基
配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の
塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ３（但
し、該ＰＣＲ用プライマーＨ３は、配列表の配列番号１
のヌクレオチド番号２７８８７乃至２７８８９でコード
されるアルギニン残基をＣ末端とするポリペプチドをコ
ードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ
得る）、（４４）（４１）記載のＰＣＲ用プライマーＨ
１の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ
４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＨ４は、配列表の配列
番号１のヌクレオチド番号２７８８７乃至２７８８９で
コードされるアルギニン残基をＣ末端とするポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
いられ得る）、（４５）配列表の配列番号２において、
ヌクレオチド番号３５４５のアデニン又はそれより５’
−側の塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩
基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ１、（４
６）（４５）記載のＰＣＲ用プライマーＩ１の塩基配列
と７０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基
からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ２（但し、該
ＰＣＲ用プライマーＩ２が、配列表の配列番号２のヌク
レオチド番号３５４５乃至３５４７でコードされるメチ
オニン残基をＮ末端とするポリペプチドをコードするｃ
ＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、
（４７）（４５）記載のＰＣＲ用プライマーＩ１の塩基
配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の
塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ３（但
し、該ＰＣＲ用プライマーＩ３が、配列表の配列番号２
のヌクレオチド番号３５４５乃至３５４７でコードされ
るメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドをコード
するｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得
る）、（４８）（４５）記載のＰＣＲ用プライマーＩ１
の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも１
０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ４
（但し、該ＰＣＲ用プライマーＩ４が、配列表の配列番
号２のヌクレオチド番号３５４５乃至３５４７でコード
されるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドをコ
ードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ
得る）、（４９）配列表の配列番号１において、ヌクレ
オチド番号２８４７２のチミン又はそれより５’−側の
塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基から
なる配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ１、（５０）（４
９）記載のＰＣＲ用プライマーＪ１の塩基配列と７０％
以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる
配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ２（但し、該ＰＣＲ用
プライマーＪ２は、配列表の配列番号２のヌクレオチド
番号５７２７乃至５７２９によりコードされるアラニン
残基をＣ末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
を増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、（５１）
（４９）記載のＰＣＲ用プライマーＪ１の塩基配列と８
０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基から
なる配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ３（但し、該ＰＣ
Ｒ用プライマーＪ３は、配列表の配列番号２のヌクレオ
チド番号５７２７乃至５７２９によりコードされるアラ
ニン残基をＣ末端とするポリペプチドをコードするｃＤ
ＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、（５
２）（４９）記載のＰＣＲ用プライマーＪ１の塩基配列
と９０％以上の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基
からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ４（但し、該
ＰＣＲ用プライマーＪ４は、配列表の配列番号２のヌク
レオチド番号５７２７乃至５７２９によりコードされる
アラニン残基をＣ末端とするポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、
（５３）配列表の配列番号２において、ヌクレオチド番
号４００のアデニン又はそれより５’−側の塩基を５’
−末端とする、少なくとも１０個の塩基からなる配列を
含むＰＣＲ用プライマーＫ１、（５４）（５３）記載の
ＰＣＲ用プライマーＫ１の塩基配列と７０％以上の相同
性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含む
ＰＣＲ用プライマーＫ２（但し、該ＰＣＲ用プライマー
Ｋ２が、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号４００
乃至４０２によりコードされるメチオニン残基をＮ末端
とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させる
ためのＰＣＲに用いられ得る）、（５５）（５３）記載
のＰＣＲ用プライマーＫ１の塩基配列と８０％以上の相
同性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含
むＰＣＲ用プライマーＫ３（但し、該ＰＣＲ用プライマ
ーＫ３が、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号４０
０乃至４０２によりコードされるメチオニン残基をＮ末
端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させ
るためのＰＣＲに用いられ得る）、（５６）（５３）記
載のＰＣＲ用プライマーＫ１の塩基配列と９０％以上の
相同性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を
含むＰＣＲ用プライマーＫ４（但し、該ＰＣＲ用プライ
マーＫ４が、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号４
００乃至４０２によりコードされるメチオニン残基をＮ
末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅さ
せるためのＰＣＲに用いられ得る）、（５７）配列表の
配列番号１において、ヌクレオチド番号３２２８７のシ
トシン又はそれより５’−側の塩基を５’−末端とす
る、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ
用プライマーＬ１、（５８）（５７）記載のＰＣＲ用プ
ライマーＬ１の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、
少なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プ
ライマーＬ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＬ２は、配
列表の配列番号２のヌクレオチド番号１９１２乃至１９
１４によりコードされるアラニン残基をＣ末端とするポ
リペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰ
ＣＲに用いられ得る）、（５９）（５７）記載のＰＣＲ
用プライマーＬ１の塩基配列と８０％以上の相同性を有
し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ
用プライマーＬ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＬ３
は、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１９１２乃
至１９１４によりコードされるアラニン残基をＣ末端と
するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるた
めのＰＣＲに用いられ得る）、及び、（６０）（５７）
記載のＰＣＲ用プライマーＬ１の塩基配列と９０％以上
の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列
を含むＰＣＲ用プライマーＬ４（但し、該ＰＣＲ用プラ
イマーＬ４は、配列表の配列番号２のヌクレオチド番号
１９１２乃至１９１４によりコードされるアラニン残基
をＣ末端とするポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増
幅させるためのＰＣＲに用いられ得る）、に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明をより詳細に説明す
る。

【００１１】本発明は、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入
されることにより該生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改
善することを特徴とする、該生産菌のゲノムに由来する
ＤＮＡ（以下、「ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ＤＮＡ」と
いう。）等に関する。

【００１２】本発明において、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌と
は、ＭＬ−２３６Ｂ生産能を先天的に有する微生物をい
う。ＭＬ−２３６Ｂ生産菌としては、例えば、ペニシリ
ウム（Penicillium）属に属するＭＬ−２３６Ｂ生産菌
が挙げられ、ペニシリウム・シトリナム、ペニシリウム
・ブレビコンパクタム（Penicilium brevicompactum：B
rown,A.G.,et al.,J.Chem.Soc.Perkin-1.,1165(1976)記
載）、ペニシリウム・シクロピウム（Penicillium cyc
lopium：Doss,S.L.,et al.,J.Natl.Prod.,49,357(1986)
記載）等が例示される。さらに、これら以外に、ユーペ
ニシリウム・エスピー Ｍ６６０３（ Eupenicillium s
p.M6603：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609
(1986)記載）、ペシロミセス・ビリディス ＦＥＲＭ
Ｐ−６２３６（Paecilomyces viridis FERM P-6236：特
開昭５８−９８０９２号公報記載）、ペシロミセス・エ
スピー Ｍ２０１６（Paecilomyces sp.M2016：Endo,
A.,et al.,J.Antibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、
トリコデルマ・ロンギブラチアタム Ｍ６７３５（Tric
hoderma longibrachiatum M6735：Endo,A.,et al.,J.An
tibiot.-Tokyo,39,1609(1986)記載）、ヒポミセス・ク
リソスペルムス ＩＦＯ ７７９８（Hypomyces chryso
spermus IFO 7798：Endo,A.,et al.,J.Antibiot.-Toky
o,39,1609(1986)記載）、グリオクラディウム・エスピ
ー ＹＪ−９５１５（Gliocladium sp. YJ-9515：ＷＯ
９８０６８６７号公報記載）、トリコデルマ・ビリデ
ＩＦＯ ５８３６（Trichoderma viride IFO 5836：特
公昭６２−１９１５号公報記載）、ユーペニシリウム・
レチクリスポルム ＩＦＯ ９０２２（Eupenicillium
reticulisporum IFO 9022：特公昭６２−１９１５９号
公報記載）等が挙げられる。これらのＭＬ−２３６Ｂ生
産菌のうち、好適にはペニシリウム・シトリナムであ
り、より好適にはペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ
１３３８０株である。ペニシリウム・シトリナム ＳＡ
ＮＫ１３３８０株は、平成４年（１９９２年）１２月２
２日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に国際寄
託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４１２９を付され
た。

【００１３】ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ＤＮＡは、ＭＬ
−２３６Ｂ生産菌のゲノムＤＮＡライブラリーに対し
て、類似の機能を有するものと推測される糸状菌由来の
ＤＮＡの塩基配列に基いて設計されるプローブを用いて
スクリーニングを行なうことにより得られる。

【００１４】ゲノムＤＮＡライブラリーの作成法として
は、通常真核生物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製す
るための方法であれば特に限定されないが、例えば、マ
ニアティスらの方法（Maniatis,T.,et al.,Molecular c
loning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Har
bor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）
等が挙げられる。

【００１５】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌のゲノムＤＮＡは、
該生産菌培養物から菌体を回収して物理的に破砕した
後、核内ＤＮＡを抽出、精製することにより得られる。

【００１６】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌の培養は、各ＭＬ−
２３６Ｂ生産菌に適した条件下で行なうことができる。
好適なＭＬ−２３６Ｂ生産菌であるペニシリウム・シト
リナムの培養は、該菌体を培養したスラントから、ＭＢ
Ｇ３−８培地（組成；７％(w/v)グリセリン、３％(w/v)
グルコース、１％(w/v)大豆粉、１％(w/v)ペプトン（極
東製薬工業（株）製）、１％(w/v)コーンスチープリカ
ー（ホーネンコーポレーション（株）製）、０．５％(w
/v)硝酸ナトリウム 、０．１％(w/v)硫酸マグネシウム
七水和物、ｐＨ６．５）へ該菌体を接種し、２２乃至２
８℃、３乃至７日間、振盪しつつ保温することにより行
なうことができる。該スラントは、溶解させたＰＧＡ寒
天培地（組成；２００ｇ/Ｌ馬鈴薯抽出液、１５％(w/v)
グリセリン、２％(w/v)寒天）を試験管に注ぎ、傾斜さ
せつつ固化させたものに、白金耳を用いてペニシリウム
・シトリナムを接種し、２２乃至２８℃、７乃至１５日
保温することにより作製する。該スラントを０乃至４℃
で保存することにより、該スラント上で該菌を継続的に
生存させることができる。

【００１７】液体培地で培養したＭＬ−２３６Ｂ生産菌
の菌体は、遠心分離により、固体培地で培養した該菌の
菌体は、セル・スクレーパー等でかきとることにより、
それぞれ回収することができる。

【００１８】菌体の物理的破砕は、菌体を液体窒素等で
凍結しつつ乳鉢と乳棒ですり潰すことにより行なうこと
ができる。破砕された菌体の核内ＤＮＡの抽出は、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓ
ｕｌｐｈａｔｅ：以下、「ＳＤＳ」という。）等の界面
活性剤を用いて行なうことができる。抽出されたゲノム
ＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出を行なうこと
により除タンパクされ、エタノール沈澱を行なうことに
より沈澱として回収することができる。

【００１９】得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で
限定分解させ、断片化する。限定分解に使用される制限
酵素としては、通常入手可能な制限酵素であれば特に限
定されないが、例えば、Ｓａｕ３ＡＩ等を挙げることが
できる。断片化されたＤＮＡをゲル電気泳動に供し、適
当なサイズのゲノムＤＮＡを含むゲルからＤＮＡを回収
する。ＤＮＡ断片のサイズには特に限定はないが、好適
には２０ｋｂ以上である。

【００２０】ゲノムＤＮＡライブラリー作製用のＤＮＡ
ベクターとしては、該ＤＮＡベクターで形質転換された
宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有するも
のであれば特に限定されないが、例えば、プラスミドベ
クター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣ
ベクター等が挙げられ、好適にはコスミドベクターであ
る。また、これらＤＮＡベクターは発現ベクターであっ
てもよい。さらに、該ＤＮＡベクターは、該ＤＮＡベク
ターで形質転換された宿主細胞に表現形質（表現型；Ｐ
ｈｅｎｏｔｙｐｅ）の選択性を付与する塩基配列を有し
ていることが好ましい。

【００２１】該ＤＮＡベクターは、クローニング及び機
能発現の双方に適用できるものであることが好ましい。
該ＤＮＡベクターとしては、複数の微生物群に形質転換
可能なシャトルベクターを用いることが好ましい。該シ
ャトルベクターは、少なくとも一方の微生物群の宿主細
胞において複製されるのに必要な塩基配列を有する。ま
た、シャトルベクターは複数の微生物群の宿主にそれぞ
れ表現形質の選択性を付与する塩基配列を有しているこ
とが好ましい。

【００２２】該シャトルベクターにより形質転換される
微生物群の組合わせとしては、一方の微生物群がクロー
ニングに適用でき且つ他方がＭＬ−２３６Ｂ生産能を有
していれば特に限定されないが、例えば、細菌及び糸状
菌の組合わせ、酵母及び糸状菌の組合わせ等が挙げら
れ、好適には細菌及び糸状菌の組合わせである。細菌と
しては、通常遺伝子工学に使用されるものであれば特に
限定されないが、例えば、大腸菌、枯草菌等を挙げるこ
とができ、好適には大腸菌であり、より好適には大腸菌
ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株である。酵母としては、通常遺
伝子工学に用いられるものであれば特に限定されない
が、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）等を挙げることができる。糸状菌とし
ては、上述のＭＬ−２３６Ｂ生産菌等が挙げられる。な
お、本発明において微生物群は、細菌、糸状菌及び酵母
から選択される。

【００２３】このようなシャトルベクターとしては、例
えば、適当な表現型選択マーカー遺伝子及びコス（ｃｏ
ｓ）部位を有するコスミドベクター等を挙げることがで
き、好適には大腸菌ハイグロマイシンＢホスフォトラン
スフェラーゼ遺伝子配列を有するプラスミドｐＳＡＫ３
３３（特開平３−２６２４８６号公報記載）にコスミド
ベクターｐＷＥ１５（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）の有
するコス（ｃｏｓ）部位を挿入して作製されたｐＳＡＫ
ｃｏｓ１が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＳ
ＡＫｃｏｓ１の構築手順については図１に記載されてい
る。

【００２４】上述のＭＬ−２３６Ｂ生産菌ゲノムＤＮＡ
断片をライゲーションしたシャトルベクターを宿主細胞
に導入することにより、所望のゲノムＤＮＡライブラリ
ーが完成する。宿主細胞には、好適には大腸菌、より好
適には大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ株がそれぞれ使用さ
れる。宿主細胞が大腸菌の場合、該導入はｉｎ ｖｉｔ
ｒｏパッケージングにより行なう。本発明において、形
質転換とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングによる外
来ＤＮＡの導入も意味し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージ
ングにより外来ＤＮＡを導入された細胞も形質転換細胞
の意味に包含される。

【００２５】所望のクローンのスクリーニングには、抗
体又は核酸プローブを用い、好適には、核酸プローブを
用いる。該核酸プローブは、糸状菌のポリケチド生合成
関連遺伝子の塩基配列に基づいて作製することができ
る。このような遺伝子としては、ポリケチドの生合成へ
の関与が確認され且つ塩基配列が公知のものであれば特
に限定されないが、例えば、アスペルギルス・フラヴァ
ス（Aspergillus flavus）及びアスペルギルス・パラシ
ティカス（Aspergillus parasiticus）のアフラトキシ
ンＰＫＳ遺伝子、アスペルギルス・ニデュランス（Aspe
rgillus nidulans）のストリグマトシスチンＰＫＳ遺伝
子等を挙げることができる。

【００２６】該核酸プローブは、上述の公知の塩基配列
に基づいて、ゲノムＤＮＡの部分塩基配列からなるオリ
ゴヌクレオチドプローブの合成により、またオリゴヌク
レオチドプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡを鋳型とし
たポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈ
ａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、「ＰＣＲ」とい
う。：Saiki,R.K.,et al.,Science,239,487(1988)記
載）を行なうことにより、又は、ｍＲＮＡを鋳型とし
て、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ）でｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲを行なう方
法（逆転写ＰＣＲ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔａｔｉｏｎ−ＰＣＲ：以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」とい
う。）等により、取得することができる。

【００２７】核酸プローブのＭＬ−２３６Ｂ生産菌から
のＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲによる取得方法は、以下の通
りである。ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマ
ー（以下、「ＰＣＲ用プライマー」という。）の設計
は、塩基配列が公知であるところのポリケチド生合成関
連遺伝子の塩基配列に基づいて、好適にはアスペルギル
ス・フラヴァス（Aspergillus flavus）、アスペルギル
ス・パラシティカス（Aspergillus parasiticus）のア
フラトキシンＰＫＳ遺伝子又はアスペルギルス・ニデュ
ランス（Aspergillus nidulans）のストリグマトシスチ
ンＰＫＳ遺伝子の塩基配列に基づいて設計することがで
きる。これらのうちいずれか一つのＰＫＳのアミノ酸配
列上で種間保存性の高いアミノ酸配列を塩基配列に還元
することにより、ＰＣＲ用プライマーを設計することが
できる。アミノ酸配列から塩基配列に還元する方法とし
ては、宿主のコドン使用頻度を考慮して単一の配列を導
く方法又は多重コドンを使用して混合配列（以下、「ミ
ックス・プライマー」という。）を導く方法の二通りが
使用できる。後者の場合、塩基配列にヒポキサンチンを
含有させることにより多重度を下げることができる。

【００２８】また、ＰＣＲ用プライマーには、鋳型鎖と
アニーリングするための塩基配列に加え、該プライマー
の５’−末端に適宜塩基配列を付加させることが可能で
ある。そのような塩基配列としては、該プライマーがＰ
ＣＲに使用可能であれば特に限定されないが、例えば、
ＰＣＲ産物についてその後のクローニング操作を行なう
のに便利な塩基配列等が挙げられ、このような塩基配列
として、制限酵素認識配列及び該制限酵素認識配列を含
む塩基配列が挙げられる。

【００２９】さらに、ＰＣＲ用プライマーの設計におい
ては、グアニン塩基の数とシトシン塩基の数の和が総塩
基数の４０乃至６０％であることが好ましい。また、自
己アニーリングし難いことが好ましい。一組のＰＣＲ用
プライマーにおいては、双方のＰＣＲ用プライマー同士
がアニーリングし難いことが好ましい。

【００３０】また、ＰＣＲ用プライマーの塩基数は、Ｐ
ＣＲに適用できれば特に限定されないが、その範囲の下
限は１０乃至１４、上限は４０乃至６０であり、好適な
範囲は１４乃至４０である。

【００３１】さらに、ＰＣＲ用プライマーは、好適には
ＤＮＡである。該プライマーを構成するヌクレオシドと
しては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオ
キシチミジン、デオキシグアノシン、アデノシン、シチ
ジン、ウリジン及びグアノシンに加え、デオキシイノシ
ン、イノシン等が挙げられる。また、ＰＣＲ用プライマ
ーの５’−末端に位置するヌクレオシドの５’−位は、
水酸基であるか、又は、該水酸基に一リン酸がエステル
結合した状態である。

【００３２】さらに、ＰＣＲ用プライマーの合成は、通
常核酸の合成に使用される方法、例えば、ホスフォロア
ミダイト法により行なうことができ、このような方法に
は、ＤＮＡ自動合成機が好適に使用される。

【００３３】ＰＣＲの鋳型としては、ＭＬ−２３６Ｂ生
産菌のゲノムＤＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては、
ＭＬ−２３６Ｂ生産菌のｍＲＮＡが、それぞれ使用でき
る。なお、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては、ｍＲＮＡの代
わりに全ＲＮＡを使用することも可能である。

【００３４】ＰＣＲ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物をこのも
のに適したＤＮＡベクターに組込むことにより、該ＰＣ
Ｒ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることが
できる。該クローニングに用いるＤＮＡベクターとして
は、通常ＤＮＡ断片をクローニングするのに使用される
ＤＮＡベクターであれば特に限定されない。また、ＰＣ
Ｒ産物又はＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングを簡便に行
なうキットが市販されており、このようなキットとし
て、例えば、Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製：ＤＮＡベクターと
してｐＣＲ２．１を使用している。）が好適に使用され
る。

【００３５】クローニングしたＰＣＲ産物の取得は、所
望のＰＣＲ産物を含んでいることを確認した形質転換宿
主細胞を培養し、該細胞からプラスミドを抽出、精製
し、得られたプラスミドから挿入ＤＮＡ断片を回収する
ことにより行なうことができる。

【００３６】形質転換宿主細胞の培養は、各宿主細胞に
適した条件下で行なうことができる。好適な宿主細胞で
ある大腸菌の形質転換体の培養は、ＬＢ培地（１％(w/
v)トリプトン、０．５％(w/v)イーストエキストラク
ト、０．５％(w/v)塩化ナトリウム）で、３０乃至３７
℃、１８時間乃至２日間、振盪しつつ保温することによ
り行なうことができる。

【００３７】形質転換宿主細胞の培養物からのプラスミ
ドの調製は、該宿主細胞の菌体を回収し、ゲノムＤＮＡ
やタンパク質を除去することによりなされる。好適な宿
主細胞である大腸菌の形質転換体の培養物からのプラス
ミドの調製は、マニアティスらのアルカリ法（Maniati
s,T.,et al.,Molecular cloning,a laboratory manual,
2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,N.Y.(1989)記載）により行なうことができる。
また、より純度の高いプラスミドを得るためのキットが
市販されており、このようなキットとして、例えば、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
が好適に使用される。さらに、プラスミドの大量調製を
行うキットが市販されており、このようなキットとし
て、例えば、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩ
ＡＧＥＮ社製）が好適に使用される。

【００３８】得られたプラスミドのＤＮＡ濃度は、ＤＮ
Ａ試料を適宜希釈して波長２６０ｎｍにおける吸光度を
測定し、吸光度１＝ＤＮＡ５０μｇ／ｍｌとして算出す
ることができる。ＤＮＡの純度は、波長２８０及び２６
０ｎｍの吸光度の比率から算出することができる。

【００３９】核酸プローブの標識は、放射性標識及び非
放射性標識に大別される。放射性標識に使用される放射
性核種としては、通常使用されるものであれば特に限定
されないが、例えば、³²Ｐ，³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ等を挙げること
ができ、好適には^３２Ｐである。非放射性標識に用いる
試薬としては、通常核酸の標識に用いられるものであれ
ば特に限定されないが、例えば、ジゴキシゲニン、ビオ
チン等が挙げられ、好適にはジゴキシゲニンである。核
酸プローブを標識する方法としては、通常使用される方
法であれば特に限定されないが、例えば、標識基質を用
いたＰＣＲにより該産物中に取り込ませる方法、ニック
・トランスレーション法、ランダム・プライマー法、末
端標識法、標識基質を用いてオリゴヌクレオチドＤＮＡ
を合成する方法等を挙げることができ、核酸プローブの
種類等によりこれらの方法から適宜選択できる。

【００４０】核酸プローブの塩基配列がＭＬ−２３６Ｂ
生産菌のゲノム中に存在することは、該生産菌のゲノム
ＤＮＡを用いたサザンブロット・ハイブリダイゼーショ
ンにより確認することができる。

【００４１】サザンブロット・ハイブリダイゼーション
は、マニアティスらの方法（Maniatis,T.,et al.,Molec
ular cloning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spri
ng Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)
記載）により行なうことができる。

【００４２】上述の通り作製された標識核酸プローブを
用い、ゲノムＤＮＡライブラリーから目的クローンをス
クリーニングすることができる。該スクリーニング法と
しては、通常遺伝子クローニングに使用される方法であ
れば特に限定されないが、好適にはコロニー・ハイブリ
ダイゼーション法（Maniatis,T.,et al.,Molecular clo
ning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbo
r Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）を
使用することができる。

【００４３】コロニー・ハイブリダイゼーションに用い
るコロニーの培養は、各宿主細胞に適した条件下で行な
うことができ、好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換
体の培養は、ＬＢ寒天培地（１％(w/v)トリプトン、
０．５％(w/v)イーストエキストラクト、０．５％(w/v)
塩化ナトリウム、１．５％(w/v)アガロース）上で、３
０乃至３７℃、１８時間乃至２日間保温することにより
行なうことができる。

【００４４】コロニー・ハイブリダイゼーションにより
得られる陽性クローンからの組換えＤＮＡベクターの調
製は、該陽性クローンの培養物からプラスミドを抽出及
び精製することによりなされる。本発明において得られ
た陽性クローンである形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉｐ
ＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１９９株は、平成１１年（１９
９９年）７月７日付けで通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３）
に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０を
付された。Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮＫ７１１
９９株が保持する組換えＤＮＡベクターはｐＭＬ４８と
命名された。

【００４５】陽性クローンの保有する組換えＤＮＡベク
ターが所望のＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ＤＮＡを含んで
いることは、該組換えＤＮＡベクターの挿入塩基配列の
決定、サザンブロット・ハイブリダイゼーション又は機
能発現により確認できる。

【００４６】ＤＮＡの塩基配列は、マキサム−ギルバー
トの化学修飾法 （Maxiam,A.M.M. and Gilbert,W.,Meth
ods in Enzymology,65,499(1980)記載）又はジデオキシ
ヌクレオチド鎖終結法 （Messing,J. and Vieira,J.,Ge
ne,19,269(1982)記載）等により決定できる。なお、塩
基配列決定に供するプラスミドＤＮＡとしては、より純
度の高い標品が好ましい。

【００４７】ｐＭＬ４８の挿入塩基配列は配列表の配列
番号１に示される。配列表の配列番号２に示される塩基
配列は、配列番号２に示される塩基配列に対して完全に
相補的である。通常ゲノムＤＮＡの塩基配列は同種内に
おいて遺伝的多型（ポリモルフィズム：ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｙｓｍ）を有している。また、ＤＮＡクローニング
の過程及び塩基配列決定の過程において、ヌクレオチド
の置換等が一定の確率で生じ得る。従って、本発明は、
配列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３
４２０３に示される塩基配列を有するＤＮＡにハイブリ
ダイズするＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ＤＮＡ、及び配列
表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４２
０３に示される塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＭＬ−２３６Ｂ生合
成関連ＤＮＡをも包合する。これらＤＮＡとしては、配
列表の配列番号１又は２のヌクレオチド番号１乃至３４
２０３に示される塩基配列に１つ以上のヌクレオチドの
置換、欠失及び／又は付加が生じたもの、並びにペニシ
リウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株以外のＭＬ
−２３６Ｂ生産菌に由来するものであり、ＭＬ−２３６
Ｂ生産菌内に導入されることにより該菌のＭＬ−２３６
Ｂ生産能を改善する機能を有するものをも包合する。な
お、本発明において、ハイブリダイズとは、２本の一本
鎖核酸同士が互いに相補的な領域又は相補性の高い領域
において二本鎖を形成することをいい、ストリンジェン
トな条件とは、ハイブリダイゼーション液の組成が６×
ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭＮａＣｌ、１
５ｍＭクエン酸三ナトリウム。）であり且つハイブリダ
イゼーションを行なう際の保温温度が５５℃の場合をい
う。

【００４８】ＭＬ−２３６Ｂ生合成関連ＤＮＡの解析法
は次の１）乃至３）に従う。 １）遺伝子解析ソフトによる解析 ゲノムＤＮＡ配列中の遺伝子領域の推定は、既存の遺伝
子解析プログラム（Ｇｅｎｅ Ｆｉｎｄｉｎｇプログラ
ム（以下、「ＧＲＡＩＬ」という。）、及び配列の相同
性検索プログラム（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ）に
より行うことができる。

【００４９】ＧＲＡＩＬはゲノム配列の「遺伝子配列ら
しさ」を評価する７つのパラメータに分割し、それらの
結果をニューラルネット法を用いて統合することによ
り、ゲノムＤＮＡ上の構造遺伝子を検索するプログラム
（Uberbacher,E.C.& Mural,R.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA.,88,11261(1991)記載）であり、ＡｐｏＣｏｍ ＧＲ
ＡＩＬ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＡＰＯＣＯＭ社製）が好適に
使用される。

【００５０】ＢＬＡＳＴは核酸配列及びアミノ酸配列の
相同性検索を行なうアルゴリズム（Altechul,S.F.,Madd
en,T.L.,et al.,Nucl.Acids Res.,25,3389(1997)記載）
を用いたプログラムである。

【００５１】ゲノムＤＮＡ配列を適当な長さに分割し、
ＢＬＡＳＴＮを用いて遺伝子データベースに対し相同性
検索することにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の
位置及び方向を推定することができる。また、分割され
たゲノムＤＮＡ配列を６つの翻訳フレーム（センス配列
及びアンチセンス配列に各々３つずつ）に従ってアミノ
酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列のペプチド・データベ
ースに対する相同性検索をＢＬＡＳＴＸを用いて行なう
ことにより、被検ＤＮＡ配列上の構造遺伝子の位置及び
方向の推定を行なうこともできる。さらに、真核生物に
おいては、ゲノムＤＮＡ配列中に含まれる構造遺伝子の
コード領域がイントロン配列により分断されている場合
があり、このようなギャップを有する構造遺伝子の解析
にはギャップ含有配列用のＢＬＡＳＴがより有効であ
り、Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２：ＷＩＳ
ＣＯＮＳＩＮ ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒ． １
０．０に搭載）が好適に使用される。 ２）ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法によ
る解析 ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法により、
１）記載の解析法により推定される構造遺伝子の発現を
調べることができる。

【００５２】ノーザンブロットに供するＭＬ−２３６Ｂ
生産菌の全ＲＮＡは、該菌の培養物より得ることができ
る。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産菌であるペニシリウム・
シトリナムの培養は、該菌のスラントからＭＧＢ３−８
培地に該菌を接種し、２２乃至２８℃、１乃至４日間、
振盪しつつ保温することにより行うことができる。

【００５３】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌からのＲＮＡの抽出
は、通常全ＲＮＡを調製するのに使用される方法であれ
ば特に限定されないが、例えば、グアニジン・チオシア
ネート・ホットフェノール法、グアニジン・チオシアネ
ート−グアニジン・塩酸法等が挙げられる。また、より
純度の高い全ＲＮＡを調製するための市販キットとして
は、例えば、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋ
ｉｔ（キアゲン社製）等が挙げられる。さらに、ｍＲＮ
Ａは、全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）カラムに添加し、該カ
ラムに吸着した画分を回収することにより得ることがで
きる。

【００５４】ＲＮＡのメンブレンへのトランスファー、
プローブの調製、ハイブリダイゼーション及びシグナル
の検出は、上述のサザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンと同様に行なうことができる。 ３）５’−末端及び３’−末端の解析 各構造遺伝子の５’−末端及び３’−末端の解析は、Ｒ
ＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法により行なうことができる。
ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡを鋳型とし、塩基配列が決定され
ている領域から塩基配列が決定されていない５’−末端
又は３’−末端領域までを含むｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣ
Ｒの応用により取得する方法である（Frohman.M.A.,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,8998(1988)記
載）。

【００５５】５’ＲＡＣＥは以下の方法に従う。ｍＲＮ
Ａを鋳型とし、塩基配列中の公知の部分に基いて設計さ
れたアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）
をプライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一
鎖を合成した後、ターミナルデオキシヌクレオチヂルト
ランスフェラーゼにより該ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端
にホモポリメリックな（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ：
単一塩基からなる）ヌクレオチド鎖を付加させる。該ｃ
ＤＮＡ第一鎖を鋳型とし且つ該ホモポリメリックな塩基
配列に相補的な塩基配列を含むセンス側のオリゴヌクレ
オチドＤＮＡ、及び、アンチセンス側に存在し且つオリ
ゴヌクレオチドＤＮＡ（１）より３’−側に存在するオ
リゴヌクレオチドＤＮＡ（２）をプライマーとしたＰＣ
Ｒによって、５’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅さ
せる方法である（Frohman,M.A.,Methods in Enzymol.,2
18,340(1993)記載）。５’ＲＡＣＥ用のキットが市販さ
れており、このようなキットとして、例えば、５’ＲＡ
ＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ，Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ社製）等が好適に使用さ
れる。

【００５６】３’ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡの３’−末端に
存在するポリＡ領域を利用する方法である。すなわち、
ｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄ（Ｔ）アダプターをプ
ライマーとした逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ第一鎖を
合成した後、該ｃＤＮＡ第一鎖を鋳型として、塩基配列
中の公知の部分に基いて設計されたセンス側のオリゴヌ
クレオチドＤＮＡ（３）、及び、アンチセンス側のオリ
ゴｄ（Ｔ）アダプターをプライマーとしたＰＣＲによっ
て、３’−末端領域の二本鎖ｃＤＮＡを増幅させる方法
である。３’ＲＡＣＥ用のキットが市販されており、こ
のようなキットとして、例えば、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇ
ｏ Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋ
ｉｔ（Ｐｈｒａｍａｃｉａ社製）が好適に使用される。

【００５７】ＲＡＣＥにおける塩基配列中の公知の部分
に基いたプライマーの設計には、上記１）及び２）の解
析結果が好適に利用できる。

【００５８】以上、１）乃至３）に記載した解析法によ
り、ゲノムＤＮＡ配列上の構造遺伝子の方向、並びに、
構造遺伝子中の転写開始点の位置、翻訳開始コドンの位
置、翻訳終止コドン及びその位置を推定することができ
る。これらの情報に基づいて、各構造遺伝子及びそのｃ
ＤＮＡを取得することが可能である。

【００５９】本発明において得られた組換えＤＮＡベク
ター ｐＭＬ４８挿入配列上には、６つの構造遺伝子の
存在が推定され、それぞれをｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌ
ｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲと命名した。こ
のうち、ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲは
配列表の配列番号２に示される塩基配列上にコード領域
を有し、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤは配列表の配列番号１に
示される塩基配列上にコード領域を有しているものと推
定された。ｃＤＮＡの取得法としては、上述の情報に基
づいて設計され得るプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲに
よるクローニング、かかる情報に基いて得られるＤＮＡ
プローブを用いたｃＤＮＡライブラリーからのクローニ
ング等が挙げられる。

【００６０】これらの方法で取得できるｃＤＮＡを機能
発現させるためには、完全長のｃＤＮＡを得る必要があ
る。また、ＲＴ−ＰＣＲにより機能発現し得るｃＤＮＡ
を取得するためには、該ＲＴ−ＰＣＲ産物が本来の位置
に翻訳開始コドンを含み且つ該翻訳開始コドンより開始
される翻訳フレーム中には本来の位置以外に翻訳終止コ
ドンを含まないようにプライマーを設計することが必須
である。

【００６１】ＰＣＲ用プライマーＸ１（ＸはＡ、Ｃ、
Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫのいずれかより選択され、Ａ１は（１
３）、Ｃ１は（２１）、Ｅ１は（２９）、Ｇ１は（３
７）、Ｉ１は（４５）、Ｋ１は（５３）に記載されてい
る。）又はＰＣＲ用プライマーＹ１（ＹはＢ，Ｄ，Ｆ、
Ｈ、Ｊ又はＬのいずれかより選択され、Ｂ１は（１
７）、Ｄ１は（２５）、Ｆ１は（３３）、Ｈ１は（４
１）、Ｊ１は（４９）、Ｌ１は（５７）に記載されてい
る。）は配列表の配列番号１又は配列番号２に示される
塩基配列中の少なくとも１０個の塩基からなる塩基配列
を有する。ＰＣＲ用プライマーの有する塩基配列は、鋳
型鎖と選択的にアニーリングし且つＰＣＲ又はＲＴ−Ｐ
ＣＲのプライマーとして機能し得る限りにおいては、該
鋳型鎖の一部と完全に相補的でなくてもよい。

【００６２】ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４（Ｘは
Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫのいずれかより選択され、Ａ
２は（１４）、Ａ３は（１５）、Ａ４は（１６）、Ｃ２
は（２２）、Ｃ３は（２３）、Ｃ４は（２４）、Ｅ２は
（３０）、Ｅ３は（３１）、Ｅ４（３２）、Ｇ２は（３
８）、Ｇ３は（３９）、Ｇ４は（４０）、Ｉ２は（４
６）、Ｉ３は（４７）、Ｉ４は（４８）、Ｋ２は（５
４）、Ｋ３は（５５）、Ｋ４は（５６）に記載されてい
る。）はＰＣＲ用プライマーＸ１（Ｘ１及びＸ２乃至Ｘ
４のＸは同じアルファベットのグループを表わす；Ａ１
にはＡ２乃至Ａ４、Ｃ１にはＣ２乃至Ｃ４、Ｅ１にはＥ
２乃至Ｅ４、Ｇ１にはＧ２乃至Ｇ４、Ｉ１にはＩ２乃至
Ｉ４、Ｋ１にはＫ２乃至Ｋ４が、それぞれ対応する。）
の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、好適には８０
％以上の相同性を有し、より好適には９０％以上の相同
性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列を含
む。

【００６３】ＰＣＲ用プライマーＹ２乃至Ｙ４（Ｙは
Ｂ，Ｄ，Ｆ、Ｈ、Ｊ又はＬのいずれかより選択され、Ｂ
２は（１８）、Ｂ３は（１９）、Ｂ４は（２０）、Ｄ２
は（２６）、Ｄ３は（２７）、Ｄ４は（２８）、Ｆ２は
（３４）、Ｆ３は（３５）、Ｆ４は（３６）、Ｈ２は
（４２）、Ｈ３は（４３）、Ｈ４は（４４）、Ｊ２は
（５０）、Ｊ３は（５１）、Ｊ４は（５２）、Ｌ２は
（５８）、Ｌ３は（５９）、Ｌ４は（６０）に記載され
ている。）はＰＣＲ用プライマーＹ１（Ｙ１及びＹ２乃
至Ｙ４のＹは同じアルファベットのグループを表わす；
Ｂ１にはＢ２乃至Ｂ４、Ｄ１にはＤ２乃至Ｄ４、Ｆ１に
はＦ２乃至Ｆ４、Ｈ１にはＨ２乃至Ｈ４、Ｊ１にはＪ２
乃至Ｊ４、Ｌ１にはＬ２乃至Ｌ４が、それぞれ対応す
る。）の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、好適に
は８０％以上の相同性を有し、より好適には９０％以上
の相同性を有し、少なくとも１０個の塩基からなる配列
を含む。

【００６４】ＰＣＲ用プライマーＸ１乃至Ｘ４（Ｘは
Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫのいずれかより選択され
る。）のいずれか一つ及びＰＣＲ用プライマーＹ１乃至
Ｙ４（ＹはＢ，Ｄ，Ｆ、Ｈ、Ｊ又はＬのいずれかより選
択される。）のいずれか一つをプライマーとしてＰＣＲ
又はＲＴ−ＰＣＲを行なうことができる。

【００６５】上述の通り、本発明において得られた組換
えＤＮＡベクター ｐＭＬ４８挿入配列上には、６つの
構造遺伝子（ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃ
Ｄ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲ）の存在が推定された。これ
らの６つの構造遺伝子のｃＤＮＡは、逆転写反応並びに
該ＰＣＲ用プライマーＸ１乃至Ｘ４のいずれか一つ及び
ＰＣＲ用プライマーＹ１乃至Ｙ４のいずれか一つによる
ＰＣＲを組み合せたＲＴ−ＰＣＲにより取得することが
できる。また、各構造遺伝子は、ＰＣＲ用プライマーＸ
１乃至Ｘ４のいずれか一つ及びＰＣＲ用プライマーＹ１
乃至Ｙ４のいずれか一つをプライマーとし、ＭＬ−２３
６Ｂ生産菌のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取
得することができる。

【００６６】完全長であり且つ適当な宿主細胞において
発現し得るｃＤＮＡを取得するためのＰＣＲ用プライマ
ーとしては、次のにおいて述べる、ＰＣＲ用プライマ
ーＸ１乃至Ｘ４のいずれか一つ及びＰＣＲ用プライマー
Ｙ１乃至Ｙ４のいずれか一つの組み合わせが好適に使用
される。 ｍｌｃＡのｃＤＮＡの取得には、ＰＣＲ用プライマー
Ａ１乃至Ａ４のいずれか一つ、及びＰＣＲ用プライマー
Ｂ１乃至Ｂ４のいずれか一つの組み合わせが好適に使用
される。

【００６７】ｍｌｃＢのｃＤＮＡの取得には、ＰＣＲ用
プライマーＣ１乃至Ｃ４のいずれか一つ、及びＰＣＲ用
プライマーＤ１乃至Ｄ４のいずれか一つの組み合わせが
好適に使用される。

【００６８】ｍｌｃＣのｃＤＮＡの取得には、ＰＣＲ用
プライマーＥ１乃至Ｅ４のいずれか一つ、及びＰＣＲ用
プライマーＦ１乃至Ｆ４のいずれか一つの組み合わせが
好適に使用される。

【００６９】ｍｌｃＤのｃＤＮＡの取得には、ＰＣＲ用
プライマーＧ１乃至Ｇ４のいずれか一つ、及びＰＣＲ用
プライマーＨ１乃至Ｈ４のいずれか一つの組み合わせが
好適に使用される。

【００７０】ｍｌｃＥのｃＤＮＡの取得には、ＰＣＲ用
プライマーＩ１乃至Ｉ４のいずれか一つ、及びＰＣＲ用
プライマーＪ１乃至Ｊ４のいずれか一つの組み合わせが
好適に使用される。

【００７１】ｍｌｃＲのｃＤＮＡの取得には、ＰＣＲ用
プライマーＫ１乃至Ｋ４のいずれか一つ、及びＰＣＲ用
プライマーＬ１乃至Ｌ４のいずれか一つの組み合わせが
好適に使用される。

【００７２】さらに、ＰＣＲ用プライマーＸ１乃至Ｘ４
には以下のの要件が伴う。 ＰＣＲ用プライマーＸ１乃至Ｘ４は、該ＰＣＲ用プラ
イマーＸ１乃至Ｘ４のいずれか一つ及びＰＣＲ用プライ
マーＹ１乃至Ｙ４のいずれか一つをプライマーとしたＰ
ＣＲ産物が本来の位置に翻訳開始コドンａｔｇを含み且
つ該翻訳開始コドンより開始される翻訳フレーム中には
本来の位置以外に翻訳終止コドンを含まないように設計
される（なお、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
１乃至３４２０３に示される塩基配列及び配列表の配列
番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示される
塩基配列における、本発明において推定された各構造遺
伝子の翻訳開始コドンの位置は、表４に記載されてい
る）。

【００７３】ＰＣＲ用プライマーＸ１はｃＤＮＡの翻訳
開始コドンａｔｇ中のａ又はそれより５’−側の塩基を
５’−末端とする。

【００７４】ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４は配列表
の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に示
される塩基配列上又は配列表の配列番号２のヌクレオチ
ド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上の特定の
領域と選択的にアニーリングする（配列表の配列番号２
の全塩基配列は、配列表の配列番号１の全塩基配列に対
して完全に相補的である。）。

【００７５】ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４が翻訳開
始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列を含む場合、翻
訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列上に開始コ
ドンａｔｇから始まる翻訳フレーム中に終始コドンとな
るような塩基配列（ｔａａ、ｔａｇ又はｔｇａ）は含ま
れない。なお、開始コドンａｔｇから始まる翻訳フレー
ムとは、翻訳開始コドンａｔｇより３’−側の塩基配列
を翻訳開始コドンａｔｇから３塩基単位に分割したとき
に生じる３塩基からなる配列をいう。

【００７６】ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４が、翻訳
開始コドンのａ、ａｔ又はａｔｇ（「塩基又は塩基配列
ｍ」という。）にその位置で対応する塩基又は塩基配列
（「塩基又は塩基配列ｍ’」という。）を含む場合、塩
基又は塩基配列ｍがａのとき、塩基又は塩基配列ｍ’は
ａであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａは、該ＰＣ
Ｒ用プライマーＸ２乃至Ｘ４の３’−末端に位置する。
塩基又は塩基配列ｍがａｔのとき、塩基又は塩基配列
ｍ’はａｔであり、且つ、塩基又は塩基配列ｍ’のａｔ
は、該ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４の３’−末端に
位置する。塩基又は塩基配列ｍがａｔｇのとき、塩基又
は塩基配列ｍ’はａｔｇであり、且つ、塩基又は塩基配
列ｍ’のａｔｇ中のａを１番目として３’−方向に数え
て３×ｎ＋１（ｎは１以上の整数）番目のヌクレオチド
を５’−末端とするトリヌクレオチドが該ＰＣＲ用プラ
イマーＸ２乃至Ｘ４に存在する場合、該トリヌクレオチ
ドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかで
あることはない。

【００７７】ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４の３’−
末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａを１番目として
３’−方向に数えて３×ｎ＋１（ｎは１以上の整数）番
目のヌクレオチドであるとき、該ＰＣＲ用プライマーＸ
２乃至Ｘ４を一方のプライマーとし、ＭＬ−２３６Ｂ生
産菌のＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣ
Ｒ産物又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡを鋳型とする
ＰＣＲ産物において、３×ｎ＋１番目のヌクレオチド及
びその３’−側に隣接するジヌクレオチドからなるトリ
ヌクレオチドの塩基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａの
いずれかであることはない。

【００７８】ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４のいずれ
か一つの３’−末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａを
１番目として３’−方向に数えて３×ｎ＋２（ｎは１以
上の整数）番目のヌクレオチドであるとき、該ＰＣＲ用
プライマーＸ２乃至Ｘ４を一方のプライマーとし、ＭＬ
−２３６Ｂ生産菌のＲＮＡ若しくはｍＲＮＡを鋳型とす
るＲＴ−ＰＣＲ産物又はゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ
を鋳型とするＰＣＲ産物において、３×ｎ＋２番目のヌ
クレオチド及びその３’−側並びに５’−側に隣接する
２つのモノヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩
基配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであるこ
とはない。

【００７９】ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４の３’−
末端が、翻訳開始コドンａｔｇ中のａを１番目として
３’−方向に数えて３×ｎ＋３（ｎは１以上の整数）番
目のヌクレオチドであるとき、３×ｎ＋１乃至３×ｎ＋
３番目のヌクレオチドからなるトリヌクレオチドの塩基
配列がｔａａ、ｔａｇ及びｔｇａのいずれかであること
はない。

【００８０】以上がの要件である。

【００８１】また、ＰＣＲ用プライマーＹ１乃至Ｙ４に
は以下のの要件が伴う。 ＰＣＲ用プライマーＹ１乃至Ｙ４は、ＰＣＲ用プライ
マーＸ１乃至Ｘ４のいずれか一つ及び該Ｙ１乃至Ｙ４の
いずれか一つをプライマーとするＰＣＲにより、各構造
遺伝子（ｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍ
ｌｃＥ及びｍｌｃＲ）にコードされるペプチドのＮ末端
からＣ末端までをコードしたｃＤＮＡを増幅できるよう
に設計される。

【００８２】ＰＣＲ用プライマーＹ１は、ｃＤＮＡ上の
翻訳終止領域附近の塩基配列に対して相補的な塩基配列
を有するＰＣＲ用プライマーであれば特に限定されない
が、好適には翻訳終止コドンの３’−末端の塩基に対し
て相補的な塩基又はそれより５’−側の塩基を５’−末
端とする塩基配列を有し、より好適には翻訳終止コドン
に対して相補的な３塩基の配列を有する（なお、本発明
において推定された各構造遺伝子の翻訳終止コドン、該
翻訳終止コドンの相補配列、各構造遺伝子にコードされ
るペプチドのＣ末端のアミノ酸残基、該アミノ酸残基を
コードした塩基配列、並びに、配列表の配列番号１のヌ
クレオチド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列及
び配列表の配列番号２のヌクレオチド番号１乃至３４２
０３に示される塩基配列におけるそれらの位置は、表８
乃至１０に記載されている）。

【００８３】ＰＣＲ用プライマーＹ２乃至Ｙ４は、配列
表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至３４２０３に
示される塩基配列上又は配列表の配列番号２のヌクレオ
チド番号１乃至３４２０３に示される塩基配列上の特定
の領域と選択的にアニーリングする。

【００８４】以上がの要件である。

【００８５】さらに、ＰＣＲ用プライマーＸ２乃至Ｘ４
及びＰＣＲ用プライマーＹ２乃至Ｙ４は、上述の定義及
び及び記載の要件を満たす限りにおいて、それぞれ
の５’−末端に適宜塩基配列を付加させることが可能で
ある。そのような塩基配列としては、該プライマーがＰ
ＣＲに使用可能であれば特に限定されないが、例えば、
ＰＣＲ産物についてその後のクローニング操作を行なう
のに便利な塩基配列等が挙げられ、このような塩基配列
として、制限酵素認識配列及び該制限酵素認識配列を含
む塩基配列が挙げられる。

【００８６】また、ＰＣＲ用プライマーＸ１乃至Ｘ４及
びＰＣＲ用プライマーＹ１乃至Ｙ４の設計は、前述のＰ
ＣＲ用プライマーの設計に関する記述に従って行なう。

【００８７】陽性クローンの保有する組換えＤＮＡベク
ターの機能発現は、該組換えＤＮＡベクターで細胞を形
質転換し、該形質転換細胞のＭＬ−２３６Ｂ生産能を測
定することにより行なうことができる。機能発現を行な
う細胞としては、上述のＭＬ−２３６Ｂ生産菌又はＭＬ
−２３６Ｂ非生産菌を用いることができる。ＭＬ−２３
６Ｂ非生産菌としては、該ＤＮＡベクターで形質転換さ
れる細胞であれば特に限定されないが、例えば、上述の
ＭＬ−２３６Ｂ生産菌の非生産変異株等が挙げられる。
該変異株に形質転換することによりＭＬ−２３６Ｂの生
産が回復すれば、該組換えＤＮＡベクターが所望の機能
を有すると推定することができる。

【００８８】機能発現のための形質転換法は、宿主細胞
に依存して適宜選択される。好適なＭＬ−２３６Ｂ生産
菌でるペニシリウム・シトリナムの形質転換は、ペニシ
リウム・シトリナムの胞子からプロトプラストを調製
し、該プロトプラストに組換えＤＮＡベクターを導入す
ることにより行なうことができる（Nara,F.,et al.,Cur
r.Genet.23,28(1993)記載）。

【００８９】プロトプラストの調製は以下の方法によ
る。

【００９０】ペニシリウム・シトリナムを培養したスラ
ントからＰＧＡ寒天培地のプレートへ該菌を接種し、２
２乃至２８℃、１０乃至１４日間保温し、該プレートか
ら胞子を回収し、該胞子１×１０⁷乃至１×１０⁹個を５
０乃至１００ｍｌのＹＰＬ−２０培地（組成；０．１％
(w/v)イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、
０．５％(w/v)ポリペプトン（日本製薬（株）製）、２
０％(w/v)ラクトース、ｐＨ５．０）に接種し、２２乃
至２８℃、１８時間乃至２日間保温する。該培養物から
発芽胞子を回収し、細胞壁分解酵素で処理し、プロトプ
ラストを得る。細胞壁分解酵素としては、ペニシリウム
・シトリナムの細胞壁を分解するものであり且つ該菌に
有害な作用を及ぼさないものであれば特に限定されない
が、例えば、ザイモリアーゼ、キチナーゼ等が挙げられ
る。

【００９１】形質転換されたＭＬ−２３６Ｂ生産菌の培
養は、各宿主細胞に適した条件下で行なうことができる
が、好適なＭＬ−２３６Ｂ生産菌であるペニシリウム・
シトリナムの形質転換体の場合は、ＭＬ−２３６Ｂを生
産させる前に、形質転換された該菌のプロトプラストを
適当な条件下で培養することにより予め細胞壁を再生さ
せておく。

【００９２】該細胞壁の再生は、形質転換したペニシリ
ウム・シトリナムのプロトプラストを封入したＶＧＳ中
層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/v)グ
ルコース、１Ｍグルシトール、２％(w/v)寒天）をＶＧ
Ｓ下層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培地、２％(w/
v)グルコース、１Ｍグルシトール、２．７％(w/v)寒
天）及びＶＧＳ上層寒天培地（組成；Ｖｏｇｅｌ最小培
地、２％(w/v)グルコース、１Ｍグルシトール、１．５
％(w/v)寒天）で挟み、２２乃至２８℃、７乃至１５日
間保温することにより行なうことができる。得られた菌
株はＰＧＡ培地上で、２２乃至２８℃で保温しつつ継代
培養する。該菌株をＰＧＡ培地で作製したスラントに白
金耳を用いて接種し、２２乃至２８℃、１０乃至１４日
間保温し、０乃至４℃で保存する。

【００９３】上述の通り細胞壁を再生させたペニシリウ
ム・シトリナムの形質転換体を培養したスラントから、
ＭＢＧ３−８培地へ該形質転換体を接種し、２２乃至２
８℃、７乃至１２日間、振盪しつつ保温することによ
り、ＭＬ−２３６Ｂを効率よく生産することができる。
なお、宿主細胞のペニシリウム・シトリナムについて
も、全く同様の液体培養によりＭＬ−２３６Ｂを生産さ
せることができる。

【００９４】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌の培養物からのＭＬ
−２３６Ｂの精製は、通常天然物の精製に使用される諸
技法を組み合わせることによりなされる。該諸技法とし
ては、特に限定されないが、例えば、遠心分離、濾過に
よる固液分離、アルカリ又は酸処理、有機溶媒による抽
出、転溶、吸着及び分配等の各種クロマトグラフィー、
結晶化等が挙げられる。ＭＬ−２３６Ｂは、ヒドロキシ
酸体とラクトン体の両方の形をとり、相互に変換し、更
に、ヒドロキシ酸体は安定な塩を形成する。このような
物理化学的特質を利用して、ＭＬ−２３６Ｂのヒドロキ
シ酸体（以下、「遊離型ヒドロキシ酸」という。）、Ｍ
Ｌ−２３６Ｂのヒドロキシ酸塩（以下、「ヒドロキシ酸
塩」という。）、又はＭＬ−２３６Ｂのラクトン体（以
下、「ラクトン」という。）を得ることができる。

【００９５】該培養物を、加熱下又は常温下でアルカリ
加水分解することにより開環し、ヒドロキシ酸塩に変換
し、該反応溶液を酸性にした後濾過し、濾液を水と混和
しない有機溶媒で抽出することにより、目的化合物を遊
離型ヒドロキシ酸として得ることができる。水と混和し
ない有機溶媒としては、特に限定されるものではない
が、例えば、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素
類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、メチレ
ンクロリド、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、
ジエチルエーテル等のエーテル類、蟻酸エチル、酢酸エ
チル等のエステル類、それら２種以上の混合溶媒等が挙
げられる。

【００９６】また、この遊離型ヒドロキシ酸を、水酸化
ナトリウム等のアルカリ金属塩類の水溶液に転溶するこ
とにより、目的化合物をヒドロキシ酸塩として得ること
ができる。

【００９７】さらに、この遊離型ヒドロキシ酸を、有機
溶媒中で加熱して脱水するか、又は他の方法により閉環
することにより、目的化合物をラクトンとして得ること
ができる。

【００９８】このようにして得ることができる遊離型ヒ
ドロキシ酸、ヒドロキシ酸塩及びラクトンは、カラムク
ロマトグラフィー等により精製、単離することが可能で
ある。カラムクロマトグラフィーの担体としては、特に
限定されるものではないが、例えば、セファデックス
ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ダイヤイオン
ＨＰ−２０（三菱化学（株）製）、シリカゲル、逆相
系担体等が挙げられ、好適にはＣ１８系の担体である。

【００９９】ＭＬ−２３６Ｂの定量法としては、通常有
機化合物の定量に用いられる方法であれば特に限定され
ないが、例えば、逆相高性能クロマトグラフィー（ｒｅ
ｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａ
ｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ：以下、「逆相ＨＰＬＣ」という。）法等が挙げられ
る。逆相ＨＰＬＣ法による定量は、ＭＬ−２３６Ｂ生産
菌の培養物をアルカリ加水分解し、可溶性画分をＣ１８
カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに供し、紫外吸収を測定
し、該吸収を定量化することにより行なうことがきる。
Ｃ１８カラムとしては、通常の逆相ＨＰＬＣに使用され
るＣ１８カラムであれば特に限定されないが、例えば、
ＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２（直径６ｍｍ、長さ１００ｍ
ｍ：センシュー科学（株）製）等が挙げられる。移動相
としては、通常逆相ＨＰＬＣに使用される溶媒であれば
特に限定されないが、例えば、７５％(v/v)メタノール
−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸
等が挙げられる。移動相に流速２ｍｌ／分の７５％(v/
v)メタノール−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．
１％(v/v)酢酸を用いてＳＳＣ−ＯＤＳ−２６２カラム
にＭＬ−２３６Ｂを室温で添加すると、４．０分後に溶
出される。ＭＬ−２３６Ｂの検出は、ＨＰＬＣ用ＵＶ検
出器を用いて行なうことができ、ＵＶ検出器の吸収波長
は、２２０乃至２８０ｎｍであり、好適には２２０乃至
２６０ｎｍ、より好適には２３６ｎｍである。

【０１００】機能発現が確認された遺伝子を有する所望
の組換えＤＮＡベクターは、ＭＬ−２３６Ｂの生産性の
改善に有用である。

【０１０１】なお、本明細書においては、アデニンを
「ａ」、グアニンを「ｇ」、チミンを「ｔ」、シトシン
を「ｃ」とそれぞれ記載する。配列表の各配列番号に示
される塩基配列は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン（特許庁刊行、平
成１０年６月）」に従って記載した。

【０１０２】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【０１０３】実施例１．ｐＳＡＫｃｏｓ１ベクターの作
製 １）大腸菌由来のハイグロマイシンＢホスフォトランス
フェラーゼ遺伝子をもつプラスミドｐＳＡＫ３３３（特
開平３−２６２４８６号公報記載）を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造（株）製）で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ（宝酒造（株）製）で末端を平滑化した。 ２）ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２
（宝酒造（株）製）を用いて上記ＤＮＡ断片を自己環状
化し、大腸菌のコンピーテント・セルＪＭ１０９株（宝
酒造（株）製）を形質転換した。形質転換大腸菌からＢ
ａｍＨＩ部位を欠失したプラスミドを保有する株を選抜
し、この株が保有するプラスミドをｐＳＡＫ３６０と命
名した。 ３）ｐＳＡＫ３６０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した
後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、５’末端の
脱リン酸化を行なった。コスミドベクターｐＷＥ１５
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）からコス（ｃｏｓ）部位
を含む［ＳａｌＩ−ＳｃａＩ］断片（約３ｋｂ）を取得
し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより末端を平滑化した
後、ｐＳＡＫ３６０のＰｖｕＩＩ部位に連結し、ＪＭ１
０９株を形質転換した。該形質転換大腸菌から［Ｓａｌ
Ｉ−ＳｃａＩ］断片（約３ｋｂ）をＰｖｕＩＩ部位に挿
入したプラスミドを保有する株を選抜し、この株が保有
するプラスミドをｐＳＡＫｃｏｓ１と命名した。ｐＳＡ
Ｋｃｏｓ１は、ｐＷＥ１５由来のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ及びＮｏｔＩの各制限酵素認識部位を１つずつ有す
る。また、ｐＳＡＫｃｏｓ１は選択マーカーとして、ア
ンピシリン耐性遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子
を有している。以下の実施例において、大腸菌を宿主と
する場合、ｐＳＡＫｃｏｓ１又は外来ＤＮＡを挿入した
ｐＳＡＫｃｏｓ１による形質転換体の選択は、４０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを培地に添加して行なった。ペニ
シリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０を宿主とす
る場合、ｐＳＡＫｃｏ１又は外来ＤＮＡを挿入したｐＳ
ＡＫｃｏｓ１による形質転換体の選択は、２００μｇ／
ｍｌのハイグロマシシンＢ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
Ｂ）を培地に添加して行なった。

【０１０４】ｐＳＡＫｃｏｓ１の構築手順を図１に記載
した。 実施例２．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３
８０株のゲノムＤＮＡの調製 １）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株
の培養 ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の種
菌の培養はＰＧＡ寒天培地を用いたスラントにて行なっ
た。すなわち、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１
３３８０株を白金耳により接種し、２６℃にて１４日間
保温した。このスラントは４℃で保存した。

【０１０５】本培養は、液体通気培養にて行なった。上
述のスラント５ｍｍ角の菌体を５０ｍｌのＭＢＧ３−８
培地を入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２
６℃、２１０ｒｐｍの条件下で５日間振盪培養した。 ２）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株
の培養物からのゲノムＤＮＡの調製 １）の培養物を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分
間遠心分離し、菌体を回収した。湿重量３ｇの菌体を、
ドライアイスで冷却した乳鉢上で粉末になるまで破砕し
た。菌体破砕物を２０ｍｌの６２．５ｍＭ ＥＤＴＡ・
２Ｎａ（和光純薬（株）製）−５％(w/v)ＳＤＳ−５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ（和光純薬（株）製）−塩酸（和光純薬
（株）製）緩衝液（ｐＨ８．０）で満たした遠心管に入
れ、穏やかに混合した後、０℃にて１時間静置した。１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ-塩酸−０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ（ｐＨ８．０：以下「ＴＥ」という。）で飽和した１
０ｍｌのフェノールを添加し、５０℃にて１時間穏やか
に攪拌した。室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間
遠心分離した後、１５ｍｌの上層（水相）を別の遠心管
にとり、０．５倍容のＴＥ飽和フェノール及び０．５倍
容のクロロホルム溶液を加え、２分間穏やかに攪拌した
後、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離
した（以下、「フェノール・クロロホルム抽出」とい
う。）。１０ｍｌの上層（水相）に１０ｍｌの８Ｍ 酢
酸アンモニウム（ｐＨ７．５）及び２５ｍｌの２−プロ
パノール（和光純薬（株）製）を添加し、−８０℃にて
１５分間冷却した後、４℃、１００００×Ｇの条件下で
１０分間遠心分離した。沈澱を５ｍｌのＴＥに溶解させ
た後、２０μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ
（Ｓｉｇｍａ社製）及び２５０単位のリボヌクレアーゼ
Ｔ１（ＧＩＢＣＯ社製）を添加し、３７℃にて２０分間
保温した。これに２０ｍｌの２−プロパノールを添加
し、穏やかに混合した後、糸状のゲノムＤＮＡをパスツ
ールピペットの先端に巻きつけ、１ｍｌのＴＥに溶解さ
せた。このＤＮＡ溶液に０．１倍容の３Ｍ 酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．５）及び２．５倍容のエタノールを加
え、−８０℃にて１５分冷却した後、４℃、１００００
×Ｇの条件下で５分間遠心分離した（以下、「エタノー
ル沈澱」という。）。得られた沈澱を２００μｌのＴＥ
に溶解し、ゲノムＤＮＡ画分とした。 実施例３．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３
８０株のゲノムＤＮＡライブラリーの作製 １）ゲノムＤＮＡ断片の調製 実施例２において得られたペニシリウム・シトリナム
ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（５０μｇ）を含
む１００μｌの水溶液に、０．２５単位のＳａｕ３ＡＩ
（宝酒造（株）製）を添加した後、１０、３０、６０、
９０及び１２０秒経過後に２０μｌずつサンプリング
し、各サンプルに２０μｌずつの０．５ＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）を加えて制限酵素反応を停止した。アガロー
スゲル電気泳動により、得られた部分消化ＤＮＡ断片を
分離し、３０ｋｂ以上の大きさをもつＤＮＡ断片を含む
アガロースゲルを回収した。

【０１０６】回収したゲルを細かく砕き、ウルトラフリ
ーＣ３遠心式ろ過ユニット（日本ミリポア（株）製）に
入れた。−８０℃にて１５分間冷却し、ゲルを凍結した
後、３７℃にて１０分間保温してゲルを融解した。５０
００×Ｇ、５分間遠心分離し、ＤＮＡ抽出液を得た。こ
のＤＮＡ抽出液について、フェノール・クロロホルム抽
出及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量の
ＴＥに溶解した。 ２）ＤＮＡベクター ｐＳＡＫｃｏｓ１の前処理 ｐＳＡＫｃｏｓ１を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造（株）
社製）により消化した後、６５℃にて３０分間アルカリ
フォスファターゼ（宝酒造（株）製）反応を行った。反
応終了液について、フェノール・クロロホルム抽出及び
エタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴＥに
溶解した。 ３）ライゲーション及びｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージン
グ 上記１）記載のゲノムＤＮＡ断片（２μｇ）及び上記
２）記載の前処理済みｐＳＡＫｃｏｓ１（１μｇ）を混
合し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２
（宝酒造（株）製）を用い、１６℃にて１６時間ライゲ
ーション反応を行なった。反応終了液について、フェノ
ール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、
得られた沈澱を５μｌのＴＥに溶解させた。ライゲーシ
ョン生成物溶液を、ＧＩＧＡＰＡＫ ＩＩ Ｇｏｌｄ
（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）キットを用いたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏパッケージングに供し、組換えＤＮＡベクター
を含む形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌のコロニ
ーを形成させたプレートに３ｍｌのＬＢ培地を注ぎ、セ
ルスクレーパーを用いてプレート上のコロニーを回収し
た（回収液１という）。さらに３ｍｌのＬＢ培地でプレ
ートを洗浄、回収した（回収液２という。）。回収液１
及び２の混合液にグリセリンを終濃度１８％となるよう
加えたものを大腸菌菌体液と称し、ペニシリウム・シト
リナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡライブラ
リーとして、−８０℃にて保存した。 実施例４．ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３
８０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによるＰＫＳ
遺伝子断片の増幅 １）ＰＣＲ用プライマーの設計及び合成 アスペルギルス・フラヴァス（Aspergillus flavus）の
ＰＫＳ遺伝子のアミノ酸配列（Brown,D.W.,et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,93,1418(1996)記載）に基づき、
配列表の配列番号３及び４に示されるミックス・プライ
マーを設計した。

【０１０７】配列表の配列番号３：gayacngcntgyasttc 配列表の配列番号４：tcnccnknrcwgtgncc なお、配列表の配列番号３及び４に示される塩基配列に
おいて、nはイノシンの塩基（ヒポキサンチン）を、yは
t又はcを、sはg又はcを、kはg又はtを、rはg又はaを、w
はa又はtを、それぞれ表わす。 ２）ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅 上記２）記載のＰＣＲ用プライマー（各１００ｐｍｏ
ｌ）、実施例２で得られたペニシリウム・シトリナム
ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）、
０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２
ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、５０ｍＭ 塩
化カリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウム及び１．２５単
位のＥｘ．Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）
製）を含む５０μｌの反応液を、９４℃にて１分間、５
８℃にて２分間、７０℃にて３分間、の連続する３工程
からなるサイクル反応に供した。このサイクルを３０回
繰り返すことによりＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、
ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ
ＭＰ ＴＰ３０００（宝酒造（株）製）を使用して行
なった。

【０１０８】増幅されたＤＮＡ断片を、アガロースゲル
電気泳動に供した後、約１．０乃至２．０ｋｂの大きさ
をもつＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを回収した。ゲ
ルからＤＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出
及びエタノール沈澱を行ない、得られた沈澱を少量のＴ
Ｅに溶解した。 ３）ライゲーション及び形質転換 ２）で得られたＤＮＡ断片、及び、ＴＡクローニング・
システムｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を
用いて、このキットに含まれるプラスミドｐＣＲ２．１
にライゲーションし、形質転換株を得た。

【０１０９】得られたクローンを数個選び、マニアティ
スら（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a labor
atory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）の方法に従っ
て培養した。すなわち、２ｍｌのＬＢ培地を含む２４ｍ
ｌ容の試験管に各コロニーを接種し、３７℃にて１８時
間、振盪培養した。

【０１１０】この培養物からの組換えＤＮＡベクターの
調製は、アルカリ法（Maniatis,T.,et al.,Molecular c
loning,a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Har
borLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）
に従った。すなわち、１．５ｍｌの培養液を、室温、１
００００×Ｇの条件下で２分間遠心分離し、沈澱より菌
体を回収した。菌体に１００μｌの５０ｍＭ グルコー
ス−２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-塩酸−１０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０） を加えて懸濁し、２００μｌの０．２
規定水酸化ナトリウム−１％(w/v)ＳＤＳを加えて穏や
かに攪拌し、溶菌させた。これに１５０μｌの３Ｍ 酢
酸カリウム−１１．５％(w/v)氷酢酸を加えてタンパク
質を変成させ、室温、１００００×Ｇの条件下で１０分
間遠心分離し、上清を回収した。上清について、フェノ
ール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ない、
得られた沈澱を４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ
（Ｓｉｇｍａ社製）を含有する５０μｌのＴＥに溶解さ
せた。

【０１１１】各組換えＤＮＡベクターを制限酵素消化し
て電気泳動に供し、電気泳動パターンの異なる組換えＤ
ＮＡベクター中の挿入塩基配列を、ＤＮＡシークエンサ
ー（モデル３７７：パーキンエルマー・ジャパン社製）
を用いて決定した。

【０１１２】その結果、ＰＫＳ遺伝子断片を含む組換え
ＤＮＡベクターを保有する株の存在が確認された。

【０１１３】実施例５．ペニシリウム・シトリナム Ｓ
ＡＮＫ１３３８０株のゲノミック・サザンブロットハイ
ブリダイゼーション １）電気泳動及びメンブレンへのトランスファー 実施例２において得られたのペニシリウム・シトリナム
ＳＡＮＫ１３３８０株のゲノムＤＮＡ（１０μｇ）
を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ又
はＳａｃＩ（いずれも宝造（株）製）を用いて消化し、
アガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲルの調
製には、Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ０３「ＴＡＫＡＲＡ」（宝
酒造（株）製）を用いた。泳動後、ゲルを０．２５規定
塩酸（和光純薬（株）製）に浸し、室温にて１０分間穏
やかに振盪した。このゲルを０．４規定水酸化ナトリウ
ム（和光純薬（株）製）中に移し、室温にて３０分間穏
やかに振盪した。マニアティスらのアルカリトランスフ
ァー法（Maniatis,T.,et al.,Molecular cloning,a lab
oratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laborato
ry,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)記載）により、ゲル
中のＤＮＡをナイロン・メンブレンＨｙｂｏｎｄ^TM−Ｎ
＋（アマシャム社製）にトランスファーし、固定した。
メンブレンを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）で
洗浄した後風乾した。 ２）ハイブリダイゼーション及びシグナルの検出 １）で得られたメンブレンに対し、実施例４で得られた
ＰＫＳ遺伝子断片をプローブとして用いたハイブリダイ
ゼーションを行なった。

【０１１４】プローブには、実施例４において得られた
ＰＫＳ遺伝子断片ＤＮＡ（１μｇ）をＤＩＧ ＤＮＡ
Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイ
ム社製）で標識し、使用直前に１０分間煮沸後急冷した
ものを用いた。

【０１１５】ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージ
ーハイブ：ベーリンガー・マンハイム社製）に１）記載
のメンブレンを浸し、２０ｒｐｍで振盪しつつ、４２℃
にて２時間プレハイブリダイゼーションを行なった後、
上述の標識プローブをハイブリダイゼーション液に添加
し、マルチシェーカー・オーブンＨＢ（ＴＡＩＴＥＣ社
製）を用い、２０ｒｐｍで振盪しつつ４２℃にて１８時
間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼ
ーションを行なったメンブレンについて、２×ＳＳＣを
用いた室温、２０分間の洗浄を３回、０．１×ＳＳＣを
用いた５５℃、３０分間の洗浄を２回、それぞれ行なっ
た。

【０１１６】洗浄したメンブランをＤＩＧ Ｌｕｍｉｎ
ｅｓｃｅｎｔ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ ｆｏｒ Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ベーリンガー・マンハイム
社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミフィルム：ベーリ
ンガー・マンハイム社製）に露光した。感光は富士メデ
ィカルフィルムプロセサーＦＰＭ８００Ａ（Ｆｕｊｉ
Ｆｉｌｍ社製）を用いて行なった。

【０１１７】その結果、実施例４において得られたＰＫ
Ｓ遺伝子断片はペニシリウム・シトリナムのゲノム上に
存在することが確認された。

【０１１８】実施例６．ＰＫＳ遺伝子断片をプローブと
したペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株
のゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング ＰＫＳ遺伝子を含むゲノムＤＮＡのクローニングは、コ
ロニーハイブリダイゼーション法により行なった。 １）メンブレンの調製 ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株のゲ
ノムＤＮＡライブラリーとして保存した大腸菌菌体液
（実施例３記載）を、ＬＢ寒天培地のプレートに、プレ
ート１枚あたり５０００乃至１００００個のコロニーが
生育するよう希釈して撒いた。このプレートを２６℃に
て１８時間保温した後、４℃にて１時間冷却した。Ｈｙ
ｂｏｎｄ^TM−Ｎ＋（アマシャム社製）をプレートにの
せ、１分間接触させた。コロニーを付着させたメンブレ
ンをプレートから注意深く離し、コロニー接触面を上に
して、２００ｍｌの１．５Ｍ 塩化ナトリウム−０．５
規定水酸化ナトリウムに７分、２００ｍｌの１．５Ｍ
塩化ナトリウム−０．５ＭＴｒｉｓ-塩酸−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．５）に３分ずつ２回浸した後、４００
ｍｌの２×ＳＳＣで洗浄した。洗浄したメンブレンを３
０分風乾した。 ２）ハイブリダイゼーション プローブには、実施例４において得られたＰＫＳ遺伝子
断片ＤＮＡ（１μｇ）をＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）で標識
し、使用直前に１０分間煮沸後急冷したものを用いた。

【０１１９】ハイブリダイゼーション液（ＤＩＧイージ
ーハイブ：ベーリンガー・マンハイム社製）に１）記載
のメンブレンを浸し、２０ｒｐｍで振盪しつつ、４２℃
にて２時間プレハイブリダイゼーションを行なった後、
上述の標識プローブをハイブリダイゼーション液に加
え、マルチシェーカー・オーブンＨＢ（ＴＡＩＴＥＣ社
製）を用い、２０ｒｐｍで振盪しつつ４２℃にて１８時
間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼ
ーションを行なったメンブレンについて、２×ＳＳＣを
用いた室温、２０分間の洗浄を３回、０．１×ＳＳＣを
用いた６８℃、３０分間の洗浄を２回、それぞれ行なっ
た。

【０１２０】洗浄したメンブランをＤＩＧ Ｌｕｍｉｎ
ｅｓｃｅｎｔ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ ｆｏｒ Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ベーリンガー・マンハイム
社製）で処理し、Ｘ線フィルム（ルミフィルム：ベーリ
ンガー・マンハイム社製）に露光した。感光は富士メデ
ィカルフィルムプロセサーＦＰＭ８００Ａ：Ｆｕｊｉ
Ｆｉｌｍ社製）を用いて行なった。

【０１２１】以上、１）及び２）記載の操作をスクリー
ニングという。

【０１２２】一回目のスクリーニングで陽性シグナルが
検出されたクローンのコロニー周辺をかきとってＬＢ培
地に懸濁した後、適宜希釈してプレートに撒いて培養
し、同様に二回目のスクリーニングを行ない、陽性クロ
ーンを純化した。

【０１２３】なお、本実施例で得られた陽性クローン、
すなわち形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８
ＳＡＮＫ７１１９９は、平成１１年（１９９９年）７月
７日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（日本国茨城県つくば市東町１丁目１番３号）に国際
寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０を付され
た。

【０１２４】実施例７．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４
８の挿入配列の解析（１） 実施例６で得られたＥ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４８ ＳＡＮ
Ｋ７１１９９株の培養及び該培養物からの組換えＤＮＡ
ベクターの調製は、実施例４記載の方法に準じて行なっ
た。

【０１２５】得られた組換えＤＮＡベクターをｐＭＬ４
８と命名した。ｐＭＬ４８挿入配列を各種制限酵素消化
し、ｐＵＣ１１９（宝酒造（株）製）に組込むことによ
り、サブクローニングした。得られたサブクローンをプ
ローブとして、実施例５記載の方法に準じてサザンブロ
ット・ハイブリダイゼーションを行なった。すなわち、
ｐＭＬ４８の各種制限酵素消化物を電気泳動に供し、Ｄ
ＮＡをメンブレンへトランスファーしたものに対して、
ハイブリダイゼーションを行なった。

【０１２６】その結果、ｐＭＬ４８挿入配列の制限酵素
地図が作成された。

【０１２７】また、上述の各サブクローンの挿入配列の
塩基配列を、ＤＮＡシークエンサーモデル３７７（パー
キンエルマー・ジャパン社製）を用いて決定し、ｐＭＬ
４８の全塩基配列を決定した。

【０１２８】ｐＭＬ４８の挿入配列は全３４２０３塩基
であった。

【０１２９】ｐＭＬ４８の挿入配列の塩基配列は、配列
表の配列番号１及び２に記載されている。配列表の配列
番号１及び２に示される塩基配列は、互いに、完全に相
補的である。

【０１３０】該挿入配列上の構造遺伝子の存在につい
て、遺伝子検索プログラムＧＲＡＩＬ（ＡｐｏＣｏｍ
ＧＲＡＩＬ Ｔｏｏｌｋｉｔ：ＡＰＯＣＯＭ社製）及び
相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬ
ＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２）：ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＣＧ
ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒ．１０．０に搭載）を用いて
解析した。

【０１３１】その結果、ｐＭＬ４８の挿入塩基配列中に
は、６種類の異なる構造遺伝子の存在が推定され、それ
ぞれをｍｌｃＡ、ｍｌｃＢ、ｍｌｃＣ、ｍｌｃＤ、ｍｌ
ｃＥ及びｍｌｃＲと命名した。また、ｍｌｃＡ、ｍｌｃ
Ｂ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲは配列表の配列番号２記載の
塩基配列中に、ｍｌｃＣ及びｍｌｃＤは配列表の配列番
号１に示される塩基配列中に、それぞれコード領域を有
していることが推定された。さらに、該挿入配列におけ
る各推定構造遺伝子の相対的位置及び大きさが推定され
た。

【０１３２】本実施例の結果を図２に記載した。 実施例８．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４８の挿入配列
の解析（２） ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション法及びＲＡ
ＣＥにより、実施例７において存在が示唆された構造遺
伝子の発現解析、及び５’−末端並びに３’−末端領域
の解析を行なった。 １）ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０の
全ＲＮＡの調製 ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培
養したスラント（実施例２記載）より５ｍｍ角の菌体を
１０ｍｌのＭＧＢ３−８培地を入れた１００ｍｌ容の三
角フラスコに接種し、２６℃にて３日間、振盪培養し
た。

【０１３３】培養物からの全ＲＮＡの調製は、グアニジ
ン・イソチオシアネート法を利用したＲＮｅａｓｙ Ｐ
ｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて
行った。すなわち、培養物を、室温、５０００×Ｇの条
件下で１０分間遠心分離して菌体を回収し、湿重量２ｇ
の菌体を液体窒素により凍結した後、乳鉢上で粉末にな
るまで破砕した。この破砕物をグアニジン・イソチオシ
アネートを含む４ｍｌの菌体溶解バッファー（このキッ
トに含まれる。）に懸濁した。懸濁液をこのキットに含
まれるＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム１０本に４
５０μｌずつ分注し、室温、１０００×Ｇ、１０分間遠
心分離した後、溶出液をそれぞれ回収した。各溶出液に
２２５μずつのエタノールを加えた後、このキットに含
まれるＲＮＡミニスピンカラムに添加した。このカラム
をこのキットに含まれる洗浄用緩衝液で洗浄した後、５
０μｌずつのリボヌクレアーゼ・フリー蒸留水で吸着物
を溶出させ、溶出液を全ＲＮＡ画分とした。 ２）ノーザンブロット・ハイブリダイゼーション ２０μｇのペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３
８０の全ＲＮＡを含む２．２５μｌの水溶液に、１μｌ
の１０×ＭＯＰＳ（組成；２００ｍＭ ３−モルフォリ
ノプロパンスルホン酸、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ７．０：１２１℃にて
２０分間オートクレーブ滅菌してから使用した。：同仁
化学研究所（株）製）、１．７５μｌのホルムアルデヒ
ド及び５μｌのホルムアミドを添加して混合し、ＲＮＡ
サンプルとした。このＲＮＡサンプルを、６５℃にて１
０分間保温した後、氷水中で急冷し、アガロースゲル電
気泳動に供した。電気泳動のゲルは、１０ｍｌの１０×
ＭＯＰＳ及び１ｇの Ａｇａｒｏｓｅ Ｌ０３「ＴＡＫ
ＡＲＡ」（宝酒造（株）製）を７２ｍｌのピロカルボニ
ック・アシッド・ジエチルエステル（Ｓｉｇｍａ社製）
処理水に混合し、加熱してアガロースを溶解させた後冷
却させ、１８ｍｌのホルムアルデヒドを添加することに
より作製した。サンプルバッファーは、１×ＭＯＰＳ
（１０×ＭＯＰＳを水で１０倍希釈したもの。）を使用
した。ゲル中のＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中でＨｙｂｏｎ
ｄ^TM−Ｎ＋（アマシャム社）へトランスファーした。

【０１３４】プローブには、ｐＭＬ４８挿入配列を下記
表１記載の制限酵素１及び２で消化することにより得ら
れるＤＮＡ断片（a、b、c、d及びe）を用いた。

【０１３５】

【表１】

【０１３６】プローブの標識、ハイブリダイゼーション
及びシグナルの検出は、実施例５のサザンブロット・ハ
イブリダイゼーションに従って行なった。

【０１３７】本実施例の結果を図３に記載した。

【０１３８】各シグナルは各プローブの塩基配列と相同
な転写産物の存在を示す。

【０１３９】本実施例でｐＭＬ４８挿入配列上に存在が
推定された６つの構造遺伝子のうち、ｍｌｃＢ、ｍｌｃ
Ｄ、ｍｌｃＥ及びｍｌｃＲはペニシリウム・シトリナム
ＳＡＮＫ１３３８０株内で転写されていることが確認
され、ｍｌｃＡ及びｍｌｃＣについても該細胞内で転写
されていることが示唆された。

【０１４０】各シグナルの位置は、転写産物の相対的な
サイズを示すものではない。 ３）５’ＲＡＣＥによる５’−末端配列の決定 各構造遺伝子の５’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得
は、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡＥｎｄ
ｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ社製）を用い
て行なった。

【０１４１】実施例７及び本実施例の２）の結果より推
定されたｐＭＬ４８の挿入配列上の各構造遺伝子におい
て、コード領域であり且つ該遺伝子の５’−末端近傍に
位置すると考えられる塩基配列に基いて設計されたアン
チセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡを２種類作製し
た。

【０１４２】表２に、各構造遺伝子の、より３’−側に
位置する塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側の
オリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）の塩基配列を、表３
に、より５’−側に位置する塩基配列に基いて設計され
たアンチセンス側のオリゴヌクレオチドＤＮＡ（２）の
塩基配列を、それぞれ記載した。

【０１４３】

【表２】

【０１４４】

【表３】

【０１４５】オリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）をプライ
マーとし、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３
８０株の全ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によりｃＤＮ
Ａ第一鎖を合成した。すなわち、１μｇの全ＲＮＡ、
２．５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ（１）、１
μｌのＳＵＰＥＲ ＳＣＲＩＰＴＴＭ ＩＩ ｒｅｖｅ
ｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（このキットに含
まれる。）を含む２４μｌの反応液を、１６℃にて１時
間保温した後、生成物をこのキットに含まれるＧＬＡＳ
ＳＭＡＸスピンカートリッジに添加してｃＤＮＡ第一鎖
を精製した。

【０１４６】ｃＤＮＡ第一鎖の３’−末端に、このキッ
トに含まれるｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅにより
ポリＣ鎖を付加させた。

【０１４７】３’−末端にポリＣ鎖の付加したｃＤＮＡ
第一鎖、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＤＮＡ
（２）及び４０ｐｍｏｌのＡｂｒｉｇｅｄ Ａｎｃｈｏ
ｒ Ｐｒｉｍｅｒ（このキットに含まれる）を含む５０
μｌの反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９
４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、及び、７２℃にて
２分間を１サイクルとする反応を３５回行なった後、７
２℃にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた
産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤ
ＮＡを回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタ
ノール沈澱により産物を精製し、実施例４記載の方法に
準じてｐＣＲ２．１を用いてクローニングした。

【０１４８】以上の操作を５’ＲＡＣＥという。

【０１４９】５’−末端を含むｃＤＮＡ断片の塩基配列
を決定し、転写開始点及び翻訳開始コドンの位置を推定
した。

【０１５０】５’ＲＡＣＥにより得られた各構造遺伝子
に対応する５’−末端ｃＤＮＡ断片の塩基配列を記載し
た配列表の配列番号を表４に表示した。また、表５に、
各構造遺伝子の転写開始点及び翻訳開始の存在する配列
番号、転写開始点の位置及び翻訳開始点の位置を記載し
た。

【０１５１】

【表４】

【０１５２】

【表５】

【０１５３】４）３’ＲＡＣＥによる３’−末端配列の
決定 各構造遺伝子の３’−末端領域を含むｃＤＮＡの取得
は、Ｒｅａｄｙ ＴｏＧｏ：Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒ
ｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用
いて行なった。

【０１５４】実施例７及び本実施例の２）の結果より推
定されたｐＭＬ４８の挿入塩基配列上の各構造遺伝子に
おいて、コード領域であり、構造遺伝子の３’−末端近
傍に位置すると考えられるセンス側のオリゴヌクレオチ
ドＤＮＡ（３）を１種類ずつを作製した。

【０１５５】表６に各構造遺伝子について作製したオリ
ゴヌクレオチドＤＮＡ（３）の塩基配列を表示した。

【０１５６】

【表６】

【０１５７】オリゴヌクレオチドＤＮＡ（３）をプライ
マーとし、ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３
８０株の全ＲＮＡ（１μｇ）を鋳型とした逆転写反応に
よりｃＤＮＡ第一鎖を合成した。

【０１５８】ｃＤＮＡ第一鎖、４０ｐｍｏｌのオリゴヌ
クレオチドＤＮＡ（３）及びＮｏｔＩ−ｄ（Ｔ）１８プ
ライマー（このキットに含まれる。）を含む１００μｌ
の反応液を、９４℃にて２分間保温し、続いて、９４℃
にて３０秒、５５℃にて３０秒、及び、７２℃にて２分
間を１サイクルとする反応を３５回行なった後、７２℃
にて５分間、４℃にて１８時間保温した。得られた産物
をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルからＤＮＡ
を回収し、フェノール・クロロホルム抽出及びエタノー
ル沈澱により産物を精製し、実施例４記載の方法に準じ
てｐＣＲ２．１を用いてクローニングした。

【０１５９】以上の操作を３’ＲＡＣＥという。

【０１６０】得られたｃＤＮＡの３’−側断片の塩基配
列を決定し、翻訳終止コドンの位置を推定した。

【０１６１】３’ＲＡＣＥにより得られた各構造遺伝子
に対応する３’−末端ｃＤＮＡ断片の塩基配列を記載し
た配列表の配列番号を表７にまとめた。また、表８に、
各構造遺伝子の翻訳終止コドン及び該コドンの位置を配
列表の配列番号１又は２に基いて記載した。

【０１６２】

【表７】

【０１６３】

【表８】

【０１６４】さらに、各構造遺伝子がコードすると推定
されるポリペプチドのＣ末端のアミノ酸残基、そのアミ
ノ酸残基をコードするトリヌクレオチドの塩基配列及び
そのトリヌクレオチドの位置を表９に記載した。

【０１６５】

【表９】

【０１６６】さらに、表８記載の翻訳終止コドンに対す
る相補配列、該相補配列の存在する配列番号、及び、該
相補配列の位置を表１０にまとめた。

【０１６７】

【表１０】

【０１６８】以上の通り、各構造遺伝子の存在、その方
向及びその位置が明らかとなった。これらの情報に基い
て、各構造遺伝子の転写産物及び翻訳産物を取得するこ
とが可能である。 実施例９．組換えＤＮＡベクターｐＭＬ４８を用いたペ
ニシリウム・シトリナムの形質転換 ペニシリウム・シトリナムの形質転換は、ナラらの方法
（Nara,F.,et al.,Curr.Genet.23,28(1993)記載）に従
った。 １）プロトプラストの調製 ペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培
養したスラントより、白金耳を用いてＰＧＡ寒天培地に
接種し、２６℃にて１４日間保温した。該培養物よりペ
ニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株の胞子
を回収し、１×１０⁸個の胞子を８０ｍｌのＹＰＬ−２
０培地に接種し、２６℃にて１日間保温した。胞子の発
芽を顕微鏡観察により確認した後、発芽胞子を、室温、
５０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離して胞子を沈
澱として回収した。胞子を滅菌水で３回洗浄した後、プ
ロトプラスト化を行なった。すなわち、２００ｍｇのザ
イモリアーゼ２０Ｔ（生化学工業（株）製）及び１００
ｍｇのキチナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍｌの０．
５５Ｍ 塩化マグネシウムに溶解し、室温、５０００×
Ｇの条件下で１０分間遠心分離して得られた上清を酵素
液とし、２０ｍｌの酵素液及び湿重量０．５ｇの発芽胞
子を１００ｍｌ容三角フラスコに入れ、３０℃にて６０
分間穏やかに振盪し、発芽胞子がプロトプラスト化した
ことを顕微鏡観察により確認した後、反応液を３Ｇ−２
ガラスフィルター（ＨＡＲＩＯ社製）で濾過した。該濾
液を、室温、１０００×Ｇの条件下で１０分間遠心分離
し、プロトプラストを沈澱として回収した。 ２）形質転換 １）で得られたプロトプラストを３０ｍｌの０．５５Ｍ
塩化マグネシウム溶液で２回、３０ｍｌの０．５５Ｍ
塩化マグネシウム−５０ｍＭ 塩化カルシウム−１０
ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホン酸（ｐＨ６．
３：以下、「ＭＣＭ溶液」という。）で１回それぞれ洗
浄し、１００μｌの４％(w/v)ポリエチレングリコール
８０００−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロパンスルホ
ン酸−０．００２５％(w/v)ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社
製）−５０ｍＭ 塩化マグネシウム（ｐＨ６．３：以
下、「形質転換用溶液」という。）に懸濁した。約５×
１０^７個のプロトプラストを含む９６μｌの形質転換溶
液及び１２０μｇのｐＭＬ４８ＤＮＡを含む１０μｌの
ＴＥを混合し、氷上で３０分間静置した。これに１．２
ｍｌの２０％(w/v)ポリエチレングリコール−５０ｍＭ
塩化マグネシウム−１０ｍＭ ３−モルフォリノプロ
パンスルホン酸（ｐＨ６．３）を加えて穏やかにピペッ
ティングし、室温、２０分間静置した。これに１０ｍｌ
のＭＣＭ溶液を加えて穏やかに混合し、室温、１０００
×Ｇの条件下で１０分間遠心分離した。沈澱より形質転
換プロトプラストを回収した。 ３）形質転換プロトプラストにおける細胞壁の再生 ２）で得られた形質転換プロトプラストを５ｍｌの液状
のＶＧＳ中層寒天培地に懸濁し、固化した１０ｍｌのＶ
ＧＳ下層寒天培地プレートに重層した。該プレートを、
２６℃にて１日間培養した後、プレート１枚につき５ｍ
ｇのハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ：
Ｓｉｇｍａ社製）を含む１０ｍｌの液状のＶＧＳ上層寒
天培地を重層した（ハイグロマイシンＢの終濃度は２０
０μｇ／ｍｌ）。２６℃にて１４日間保温して得られた
菌株を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有
するＰＧＡ寒天培地上で継代培養した後、ＰＧＡ寒天培
地で作製したスラントに植え継ぎ、２６℃にて１４日間
保温した。

【０１６９】これを形質転換株という。

【０１７０】該スラントは４℃で保存した。 試験例１．形質転換株及び親株の有するＭＬ−２３６Ｂ
生産能の比較 実施例９において得られた形質転換株及び親株ペニシリ
ウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３８０株を培養し、該
培養物中のＭＬ−２３６Ｂ量を測定した。

【０１７１】形質転換株を培養したスラント（実施例９
記載）又はペニシリウム・シトリナム ＳＡＮＫ１３３
８０株を培養したスラント（実施例２記載）より５ｍｍ
角の菌体を、１０ｍｌのＭＢＧ３−８培地を入れた１０
０ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２６℃にて２日間、
振盪培養した後、３．５ｍｌの５０％(w/v)グリセリン
溶液を添加し、さらに２６℃にて１０日間、振盪培養し
た。

【０１７２】該培養物１０ｍｌに５０ｍｌの０．２規定
水酸化ナトリウムを加え、２６℃にて１時間、振盪しつ
つ保温した後、室温、３０００×Ｇの条件下で２分間遠
心分離し、１ｍｌの上清を回収し、９ｍｌの５０％メタ
ノールと混合してＨＰＬＣに供した。

【０１７３】ＨＰＬＣのカラムには、ＳＳＣ−ＯＤＳ−
２６２（直径６ｍｍ、長さ１００ｍｍ：センシュー科学
（株）製）を用い、移動相には７５％(v/v)メタノール
−０．１％(v/v)トリエチルアミン−０．１％(v/v)酢酸
を用い、室温にて２ｍｌ／分の流速で溶出した。これら
条件下において、ＭＬ−２３６Ｂはカラム添加後４．０
分に溶出された。検出はＵＶ検出器の吸収波長を２３６
ｎｍに設定して行なった。

【０１７４】形質転換株のうちＭＬ２３６Ｂ生産能の改
善された株が５つ得られ、これらの生産能は親株より平
均１２％高かった。

【０１７５】この５株のＭＬ−２３６Ｂ生産能は、モノ
スポア処理等の継代を行なった後も安定に維持された。

【０１７６】

【発明の効果】本発明においてＭＬ−２３６Ｂ生産菌よ
り得られたＤＮＡは、、該生産菌内に導入されることに
より該生産菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善する。

【０１７７】また、該ＤＮＡ上に６つの構造遺伝子の存
在、その方向及びその位置が明らかとなった。６つの構
造遺伝子はそれぞれＭＬ−２３６Ｂの生産へ関与してお
り、本発明により、それぞれの構造遺伝子に対応するｃ
ＤＮＡを取得することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】大腸菌及び糸状菌に導入させることができ且つ
長いＤＮＡを挿入することができるＤＮＡベクターｐＳ
ＡＫｃｏｓ１の構築図。

【図２】ｐＭＬ４８挿入配列の構造遺伝子解析。

【図３】ｐＭＬ４８挿入配列のノーザンブロット・ハイ
ブリダイゼーション。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sankyo Company, Limited <120> DNAs related to the biosynthesis of ML-236B <130> 2000103SW <140> <141> <150> JP HEI 11-227696 <151> 1999-8-11 <160> 34 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 34203 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 1 gatcaatact acgtcgttgt tatttccttg tcagtaatga ctaacaaatt ccccagaaca 60 gacgaagtca cagctcacac cacaagagaa aatgagtcca gcgaggatta cagatttctc 120 gccaggcaaa ccgagaaaag ctctcttatg catccacggt gccgggtgct cagcagccat 180 attccgcgtc cagatctcta aactgcgcgt ggcgttgaaa aacgagtttg aattcgtata 240 tgcgaccgcg ccgtttagct ccagccccgg acccggcgtg cttcctgtct tccaaggcat 300 gggtccatac tacacctggt tccaaaagca tcatgacgcc gttacaaaca cgacaacccc 360 cacggtgggc gatagagtag cggctgtgat cgggcctgtg caaaagaccg tccaagattg 420 gtctataact aacccacagg cacccattgt cggcatagtg gccttctctg agggcgcatt 480 ggtcgccact ttgctgctcc atcaacagca aatgggaaaa ctgccatggt ttccgaaaat 540 gagcattgct gttttgattt gctgtttcta tagcgatgaa gccagagatt acatgagagc 600 cgaggcgcaa gacgacgacg acaagctaat 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ttcgtcgcga 31380 gaggttgtcc cttggccagg agtattcctg gaggcagcaa caaatggtaa aagatcatac 31440 catcttcaac aacactattg gcatgttcat gaagggtacc attgacctcg accggttgag 31500 gcgggctctg aaagcctcat tgcgccgtca cgagatcttc cgtacgtgct ttgttactgg 31560 cgatgactat agcagcgatt taaatggtcc cgtccaagtg gttctcaaga acccggagaa 31620 cagagtgcac tttgttcagg tgaacaacgc tgcggaggca gaggaagagt accggaaact 31680 cgagaagaca aactatagca tctccacagg tgacactctc agactcgttg atttctactg 31740 gggcacagat gaccacctgt tggtaatcgg ctaccacaga ttagttggtg atggctcaac 31800 aacagaaaac ctgttcaatg agatcgggca gatttacagc ggggtgaaaa tgcagcgacc 31860 atcgacccaa ttctctgatc tagccgtcca acagcgggaa aacctggaaa atgggcgaat 31920 gggggacgat atcgcgttct ggaagtccat gcatagcaaa gtctcgtcat ctgcgccaac 31980 cgtgcttccc atcatgaatc tgatcaatga ccctgctgcc aattcagagc agcagcaaat 32040 acagccattc acgtggcagc agtatgaagc aattgctcgt ttagatccca tggtcgcctt 32100 ccgaatcaaa gagcggagcc gcaagcacaa ggcaaccccc atgcagttct acctggccgc 32160 ctaccacgtt ttgttggcgc gtcttaccgg cagcaaagac ataaccatcg gcctcgccga 32220 aaccaaccga tccaccatgg aagaaatttc ggcgatgggc tttttcgcta acgtgcttcc 32280 cctgcgcttt gatgagttcg tcggcagcaa gacattcggc gagcaccttg tagccaccaa 32340 ggacagtgtg cgtgaggcca tgcaacacgc gcgggtgccg tatggcgtca tcctcgactg 32400 tctaggcctg aatctcccta cctcaggcga ggaacccaag actcagacac acgccccctt 32460 gttccaggct gtctttgatt acaagcaggg tcaagcggag agtggctcaa ttggcaatgc 32520 caaaatgacg agtgttctcg cttcccgtga gcgcactcct tatgacatcg ttctcgagat 32580 gtgggatgac cctaccaagg acccactcat tcatgtcaaa cttcagagct cgctgtatgg 32640 ccctgagcac gctcaggcct ttgtagacca cttttcttca atcctcacta tgttctcgat 32700 gaacccggct ctgaagttgg cctagatcgt tcagcgccgt gaattcagat gtgtggtttg 32760 agtgttgttc atgataaaga tggattagaa attggcaata gagcagatgg caaatctatc 32820 ctgaattcgg cgtcaattga cacacgcata ttcatctaca aatagcgaat tcgtcttgta 32880 tctttgtcaa aattacttct accttcgttg ctcttcttta ttgcagcaat cgtaacatca 32940 agttagatag cgcggttcag agtaccgtaa cggtgataaa tatacctcgg tagcgcgttt 33000 cgaaagactc tgtgaggaag gtgaaacctc caaggcttgg aattgatttc aatccatcct 33060 gtatataaat tcgacgccat tgcaaatagt tccatagtta ctggtttagt gccttgttgt 33120 ggtgatcgag tggttttaga tgtctgtcat gcctgttcag aacgagcctt ccatgatcta 33180 tccaaaatat gttcacgaaa tatttatgag atggtcgcga ccactataac taaatcaccc 33240 ttggaaggtg agcattcaaa ccgtgtaaga ttagaactat tcaaatttgt tcagtaaaaa 33300 tgtggtatgg actaggcatg agagccagag ccttgctata taccctgttg tctcacctag 33360 acaaatgaac ctgacatctt gaccttttga tatagctgtt ggaagcgctt gaccgtctcc 33420 tggacatcac tcggtctgtt gggaaaatta tgctttccct gaaactcgag tacatctgca 33480 ttctgaggca ggtaatgtgt ttcaaccatc tgtctcgacc cttggagagc aaaatcttga 33540 cgaccgtgaa gatgcagtgt cggcacgttg attattagct tgtcgtcgtc gtcttgcgcc 33600 tcggctctca tgtaatctct ggcttcatcg ctatagaaac agcaaatcaa aacagcaatg 33660 ctcattttcg gaaaccatgg cagttttccc atttgctgtt gatggagcag caaagtggcg 33720 accaatgcgc cctcagagaa ggccactatg ccgacaatgg gtgcctgtgg gttagttata 33780 gaccaatctt ggacggtctt ttgcacaggc ccgatcacag ccgctactct atcgcccacc 33840 gtgggggttg tcgtgtttgt aacggcgtca tgatgctttt ggaaccaggt gtagtatgga 33900 cccatgcctt ggaagacagg aagcacgccg ggtccggggc tggagctaaa cggcgcggtc 33960 gcatatacga attcaaactc gtttttcaac gccacgcgca gtttagagat ctggacgcgg 34020 aatatggctg ctgagcaccc ggcaccgtgg atgcataaga gagcttttct cggtttgcct 34080 ggcgagaaat ctgtaatcct cgctggactc attttctctt gtggtgtgag ctgtgacttc 34140 gtctgttctg gggaatttgt tagtcattac tgacaaggaa ataacaacga cgtagtattg 34200 atc 34203 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A mixed primer which has a DNA sequence decuced from the amino acid sequence of PKS of Aspergillus flavus. <220> <221> modified base <222> (6) <223> i <220> <221> modified base <222> (9) <223> i <400> 3 gayacngcnt gyasttc 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A mixed primer which has a DNA sequence deduced from the amino acid sequence of PKS of Aspergillus flavus. <220> <221> modified base <222> (3) <223> i <220> <221> modified base <222> (6) <223> i <220> <221> modified base <222> (8) <223> i <220> <221> modified base <222> (15) <223> i <400> 4 tcnccnknrc wgtgncc 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 5 gcatgttcaa tttgctctc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 6 ctggatcaga cttttctgc 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 7 gtcgcagtag catgggcc 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 8 gtcagagtga tgctcttctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 9 gttgagagga ttgtgagggc 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 10 ttgcttgtgt tggattgtc 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 11 catggtactc tcgcccgttc 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 12 ctccccagta cgtaagctc 19 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 13 ccataatgag tgtgactgtt c 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 14 gaacatctgc atccccgtc 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 15 ggaaggcaaa gaaagtgtac 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 16 agattcattg ctgttggcat c 21 <210> 17 <211> 722 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 17 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg gggggggggg gcttgttcgc tcagagattc 60 aactctgcga ttctgtttaa tcccaatcct atcgcccaaa aacaggatca gcagttatgg 120 atcaagccaa ctatccaaac gagccaattg tggtagtggg aagcggttgt cggtttccag 180 gtggtgtcaa cacaccatca aaactttggg agctgctcaa agagccccgg gatgtacaga 240 ccaagatccc taaggagaga tttgacgtcg atacatttta cagccccgat ggcactcacc 300 ccgggcgcac gaacgcaccc tttgcatact tgctgcagga ggatctacgc ggttttgatg 360 cctctttctt caacatccaa gctggagagg ccgaaacgat tgacccacag caaaggctgc 420 tgctggagac ggtctatgaa gctgtatcca acgcaggcct acggatccaa ggccttcaag 480 gatcctctac tgctgtgtac gtcggtatga tgacgcatga ctatgagact atcgtgacgc 540 gtgaattgga tagtattcct acatactctg ccacgggggt agctgtcagt gtggcctcca 600 accgtgtatc atacttcttc gactggcatg ggccgagtat gacgatcgac acagcctgta 660 gttcatcctt agctgccgtg catctggccg tccaacagct tagaacgggc gagagtacca 720 tg 722 <210> 18 <211> 760 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 18 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg gggggggggg gactatcaac ggttttatca 60 ccagggcgac tgatatatca gtcaatgaaa caacgttgga atgaacaata cccccgccgt 120 aaccgcaacc gcaaccgcaa ccgcaaccgc aaccgcaatg gcaggctcgg cttgctctaa 180 cacatccacg cccattgcca tagttggaat gggatgtcga tttgctggag atgcaacgag 240 tccacagaag ctttgggaaa tggttgaaag aggaggcagt gcctggtcta aggtcccctc 300 ctcgcgattc aatgtgagag gagtatacca cccgaatggc gaaagggtcg ggtccaccca 360 cgtaaagggt ggacacttca tcgacgagga tcctgcttta tttgacgccg cgttcttcaa 420 catgaccaca gaggtcgcca gctgcatgga tccgcagtat cggcttatgc ttgaggtggt 480 ctacgaatcg ctggagagtg ccggtatcac catcgatggt atggcaggct ctaatacgtc 540 ggtgtttggg ggtgtcatgt accacgacta tcaggattcg ctcaatcgtg accccgagac 600 agttccgcgt tatttcataa ctggcaactc aggaacaatg ctttcgaacc ggatatcaca 660 cttctacgac ttacgtggtc ccagcgtgac ggttgacacg gcctgttcga cgacattgac 720 cgcactgcac ttggcgtgcc agagcttacg tactggggag 760 <210> 19 <211> 773 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 19 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg ggtttttttt ttttcaaggt tgactggaag 60 agtgctctcg gccacaaaat cccagaagca ttagtgctgt tattcgatta taaaccgtcg 120 cagcgctctc attcttcgct ctttcttctt ttccactggt gtgcataggt cctatctgtc 180 tcacgcaatg ctcggccagg ttcttctgac cgtcgaatcg taccaatggg tatcgacccc 240 tcaagccctt gtggcggtcg cagtgcttct tagtctcatc gcctaccgtt tgcgggggcg 300 ccagtccgaa ctgcaagtct ataatcccaa aaaatggtgg gagttgacga ccatgagggc 360 taggcaggac ttcgatacgt atggtccgag ctggatcgaa gcttggttct cgaaaaacga 420 caagcccctg cgcttcattg ttgattccgg ctattgcacc atcctcccat cgtccatggc 480 cgacgagttt cggaaaatca aagatatgtg catgtacaag tttttggcgg atgactttca 540 ctctcatctc cctggattcg acgggttcaa ggaaatctgc caggatgcac atcttgtcaa 600 caaagttgtt ttgaaccagt tacaaaccca agcccccaag tacacaaagc cattggctac 660 cttggccgac gctactattg ccaagttgtt cggtaaaagc gaggagtggc aaaccgcacc 720 tgtctattcc aatggattgg accttgtcac acgaacagtc acactcatta tgg 773 <210> 20 <211> 527 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 20 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg gtacctagga actgttcagt tgtccctccc 60 aaccccttgg gccgaacaac cttcctccaa tctacgacgg cagattatac ctaggcgcct 120 aaccgattag gttgctcatt cgattttgga gagactacct agctataggt accactccaa 180 gctgtagcac agacctttca gcatggtcgc ttcgttgcta ccctctcgct ttcgcggtag 240 ggaatcaatg aatcagcagc accctctacg ctcgggaaat cgggcattga cctccacact 300 ccaatttcta tccaaaacgg cgtgtctaca cccgatccat accgtttgca ccatagctat 360 tctagctagt accacatacg ttggactact caaagacagc ttcttccatg gccccgcaaa 420 cgttgataaa gcagaatggg gctctttggt cgaaggaagt cgaagcttga tcaccggccc 480 acagaatggc tggaagtggc agagcttcga cggggatgca gatgttc 527 <210> 21 <211> 522 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 21 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg gggggggggg ggatccatca atctgacttc 60 aggctagcgg accttaacga aacaacgaga gcgagatcat tcatacacca aaacacaggt 120 actatagaag cgccgcgcag tagagattca caccgcccct tgaagcaaaa gtcggaagga 180 attgcgcgat gtcagaacct ctacccccta aagaagggga accaaggcca cagaaggaag 240 aaagtcaaaa tgacacgctc gaagcgactg agtccaagtc ccagcacatc acaggcctca 300 agctcgggct ggtggttgct tcagttactt tcgtagcatt tttgatgctc cttgatatgt 360 ccattatcgt cacggcaatc ccacatatca caagcgagtt ccactctctg aacgatgtag 420 ggtggtacgg cagtgcttat cttctggcta actgtgctct ccagcccctg gccggtaaat 480 tgtatacact cttgggcttg aagtacactt tctttgcctt cc 522 <210> 22 <211> 541 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 22 ggccacgcgt cgactagtac gggggggggg ggctcacctc acattatttg atcttaatcc 60 aataattatg tccctgccgc atgcaacgat tccgacgaac ctacgccgtc gcgcgtttcg 120 acgctcatgt gaccggtgtc atgcacaaaa gctcaaatgt accggtagca atgccaattt 180 agtccgtgct cagtgtcaac gttgtcagca agccggatta aggtgtgtgt acagcgaaag 240 gctacccaag cgcaatttac ataaagaagc cgcagctgga actacaagag ccacagaaac 300 ctcacaaccg atgaccgcga catcttctac ggtcttctca tcattggcag agactcctcc 360 accttactgc tcaccaccta cgcatattgg cacctcggca ctcaaggaaa cattatcaga 420 accatcagcg gcaaccctgc aattctatga tacatcaatc aactttgatg atcccgagtc 480 gtttcccggc ggctggcctc agccaaatac atttcgcgac gatgccaaca gcaatgaatc 540 t 541 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 23 atcataccat cttcaacaac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 24 gctagaatag gttacaagcc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 25 acattgccag gcacccagac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 26 caacgcccaa gctgccaatc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 27 gtcttttcct actatctacc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 28 ctttcccagc tgctactatc 20 <210> 29 <211> 1524 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 29 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttttcaa cgaaggtaga 60 agtaattttg acaaagatac aagacgaatt cgctatttgt agatgaatat gcgtgtgtca 120 attgaagccg aattcaggat agatttgcca tctgctctat tgccaatttc taatccatct 180 ttatcatgaa caacactcaa accacacatc tgaattcacg gcgctgaacg atctaggcca 240 acttcagagc cgggttcatc gagaacatag tgaggattga agaaaagtgg tctacaaagg 300 cctgagcgtg ctcagggcca tacagcgagc tctgaagttt gacatgaatg agtgggtcct 360 tggtagggtc atcccacatc tcgagaacga tgtcataagg agtgcgctca cgggaagcga 420 gaacactcgt cattttggca ttgccaattg agccactctc cgcttgaccc tgcttgtaat 480 caaagacagc ctggaacaag ggggcgtgtg tctgagtctt gggttcctcg cctgaggtag 540 ggagattcag gcctagacag tcgaggatga cgccatacgg cacccgcgcg tgttgcatgg 600 cctcacgcac actgtccttg gtggctacaa ggtgctcgcc gaatgtcttg ctgccgacga 660 actcatcaaa gcgcagggga agcacgttag cgaaaaagcc catcgccgaa atttcttcca 720 tggtggatcg gttggtttcg gcgaggccga tggttatgtc tttgctgccg gtaagacgcg 780 ccaacaaaac gtggtaggcg gccaggtaga actgcatggg ggttgccttg tgcttgcggc 840 tccgctcttt gattcggaag gcgaccatgg gatctaaacg agcaattgct tcatactgct 900 gccacgtgaa tggctgtatt tgctgctgct ctgaattggc agcagggtca ttgatcagat 960 tcatgatggg aagcacggtt ggcgcagatg acgagacttt gctatgcatg gacttccaga 1020 acgcgatatc gtcccccatt cgcccatttt ccaggttttc ccgctgttgg acggctagat 1080 cagagaattg ggtcgatggt cgctgcattt tcaccccgct gtaaatctgc ccgatctcat 1140 tgaacaggtt ttctgttgtt gagccatcac caactaatct gtggtagccg attaccaaca 1200 ggtggtcatc tgtgccccag tagaaatcaa cgagtctgag agtgtcacct gtggagatgc 1260 tatagtttgt cttctcgagt ttccggtact cttcctctgc ctccgcagcg ttgttcacct 1320 gaacaaagtg cactctgttc tccgggttct tgagaaccac ttggacggga ccatttaaat 1380 cgctgctata gtcatcgcca gtaacaaagc acgtacggaa gatctcgtga cggcgcaatg 1440 aggctttcag agcccgcctc aaccggtcga ggtcaatggt acccttcatg aacatgccaa 1500 tagtgttgtt gaagatggta tgat 1524 <210> 30 <211> 784 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 30 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttttttc tttgttgctt 60 ctcagggcca ctgtaatggt atttcaggta tctctattta ctgctatcca gaagtcaggc 120 attaaatagt caggctcagc ccaggctcga ttcagattgg attcaggctt cagaccatgg 180 ccgctatgct ccttcgtact atacctccgt cgagctatac ccgcttggcc agacaaaagg 240 cttcactgaa cccttcaact taactgcatt tcgccacaac taactcgacg aggccggcga 300 tggtgttacc attcatgagc tcaaagatcg acacatcaac atggatttca gatgtgatcc 360 agtttcgaag ttcaatggcg acgagtgagt ctacgccgac acctgccagg tttttggacg 420 aggacatgtc gtcttctgcc agaccaaaca ttcgcatcag cttttccgtc attgctttga 480 ggacgataga aatggcctcg tcgtgagagg tgaccctgct tagttgggcc cgcacgccat 540 ctggtccttt tttatgcgaa gagacaaagg attggtctgc atgaaggact tggcggtatt 600 taagtcccac aaaccgctgt tcctgtatcc agtttgcctc ggtccagtga gcacccgggg 660 atgtgttgat tcctgtaacc acagctgcgg gaggtgatgg aaattgaggg gaagaacaca 720 ggattgcctt ctccaacaca tccatgacgt ccttttcatg cataggcttg taacctattc 780 tagc 784 <210> 31 <211> 764 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 31 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttttttc gaataaaatg 60 cgttttattt tactaaccta ctcgactaat acagcaccta gtttctctgg gacggaaacc 120 attggaataa gcctggggac ggatgcatat ttgttttagt ttgcgtgtta tatcttagca 180 ccggtcatga gggagcggga tgtcctcgtt gcgccggcgt accatgagct ttgtggttgg 240 atgcatacga acgctaaaag cgtgacggta gtatttgtca tcgtctcctg gtacaggctt 300 cacatcatac tgaatcagta tatgagcgag gagaatcttg atttccttcg aggcgaagaa 360 ccgcccggga caagcgcgtg ggttccagcc gaagccgatg tgatcaccgt tggtattctc 420 caattgagcg gtgaaggcct tgtctggatc ctcgcgcatg cgcataaatc ggtagggatc 480 ataattttcg gggttttccc acacatcagg gttgttcatg cggtctgcag ccacagcggc 540 caactcgccc ttgggaatga agaggccatt ggatagagtg atgtctctga gagcggtact 600 gcgcatagtg gcgcactcga ccggcttgat tcgctgcgtc tctttcatgc agctgtcgag 660 gagcttcagc ttgaacagag aggcaggcgt ccagccccct tctccgatta cagtgcggat 720 ctcttggcgg agaggctgaa taaggtctgg gtgcctggca atgt 764 <210> 32 <211> 765 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 32 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttttctgg aaaaggacca 60 tctctttata tattcttctt ccctactact tgcatcgtaa atttcaacaa catataaaca 120 tgagataccc tttctggccg ttcactctac cacctgcctg tctcattgca ttgtgctttt 180 gaaaattatg acaataacaa ccaatgagaa aaaatatgat cctcctgcaa tgaatccact 240 ggagggggta cggagcttgg aatgctccta agattccgac ctaatcagcg tcgagcccga 300 tcagtagctg cagcactcgg cctcagtgca ttgttaggaa cagggactgt cctggttccg 360 cctgacgggg agacacttcg agaaggggct gaagatgccg gggcagaacg gttgtgcgcc 420 atgtgcgcct tgaccaggtg accggcggct agggcagcac atagcgagag ctccccagcc 480 aaaacagcgc ttccgatgat gcgcgcaagt tgacgtgcat tctcaccggg agtggtcggg 540 tgtgatccgc ggacaccaag catgtcaagc attgcgccct ggggctccag aatcgtacca 600 ccgcccaacg ttccaacctc aatagacggc atggagacag agatttgaag cgatccgcga 660 agattgttca tgagagtgat gcagttagcg ctctccacaa cttgcgccgg atcctgacct 720 gtggcaatga aaatggctgc cgcaagattg gcagcttggg cgttg 765 <210> 33 <211> 802 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 33 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt tttttataga atctttgaaa 60 tcgacattaa ttaagtatgt ggagattctt tgtggaggca cggtaatgtg tctatctagc 120 aacgcggtca agcatcagtc tcaggcacag cccgggtgtc gtttttggtt gcaatcttcc 180 gccatcccat tccaaaggca aacacaaacg tgcacgccgt agctcccact gctaagtaaa 240 aagtatgatc aacggcgaga ctgtaagctt ttacaacccc tggaaggtta ttcttgctga 300 ccacatctct gaagccagtc gcccctgctg ccgtcacggc ctgcgtgtcg acagtgggcg 360 catacttgct caggccagtt ctcaaaccgg acccaaagac aaggttagca aagtccagga 420 agagcgatcc tccaaacgtc tgtccaaaca cggcgagaga aattccgagg gcaccttgtt 480 cgggcgaaag cgtgctttgg atggcgatga taggcgtttg catgccacaa ccacgaccga 540 agcccgcgat aaattggtac atgacccatt tcacagttga tgtatggggc tggaaggtgg 600 ataccagacc tgcgcctatg gcgacgagaa cagcgctgcc tagggcccaa ggcaaatagt 660 atcctgtctt tccaattgcg aagccagaaa ccatagccat aatgacttgt ccaagaattc 720 caggcaacat gtacacacca ctcagtgtgg gagaaacatc cttcacagcc tggaagtaga 780 tcggtagata gtaggaaaag ac 802 <210> 34 <211> 562 <212> DNA <213> Penicillium citrinum <400> 34 aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttttttac taagcaatat 60 tgtgtttctt cgctaatgcg aatatttcct tatagcaacg tcgcaacaca tttatcgtct 120 tccctgaggc ctttgttgac ttgggctctt cgtctccggc ttcgtcactc caaagcacag 180 ataggagacg agaggccggc gttatggttt tattttcagc gccaaggatt tgccacgatg 240 tgcttggcat atctgatagg actagacgaa tagatgccgc agccccgtgc tcctgtgcta 300 tccccaaagc agtctcaatc ccactcaata gtcgaaggct tacacgcaat gtcgtgcatg 360 cagaagataa ggcgtgcatg aatgggtcga gatgtgaaat gagctcgccg atatgaagat 420 tagagtgaaa cgagggaagt gcttcggctc ttccattgtc atttctagtg gttgagccag 480 accagtacca atccattcgt gtgctttgct tttgtccaca aggttgggct ttcatcacct 540 cggatagtag cagctgggaa ag 562

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:80） Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:80） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:80） Ｃ１２Ｒ 1:80）

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１
   乃至３４２０３で示される塩基配列を含むことからな
   り、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることにより該
   菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴とする
   ＤＮＡ。
2. 【請求項２】形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４
   ８ ＳＡＮＫ７１１９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８０）
   より得ることができる、請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載のＤＮＡとハイブリダ
   イズし、ＭＬ−２３６Ｂ生産菌内に導入されることによ
   り該菌のＭＬ−２３６Ｂ生産能を改善することを特徴と
   するＤＮＡ。
4. 【請求項４】請求項１又は２記載のＤＮＡとストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズし、ＭＬ−２３６Ｂ生
   産菌内に導入されることにより該菌のＭＬ−２３６Ｂ生
   産能を改善することを特徴とするＤＮＡ。
5. 【請求項５】請求項１乃至４のいずれか一つに記載のＤ
   ＮＡを含む組換えＤＮＡベクター。
6. 【請求項６】形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ４
   ８ ＳＡＮＫ７１１９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８
   ０）に保持される、請求項５記載の組換えＤＮＡベクタ
   ー。
7. 【請求項７】請求項５又は６記載の組換えＤＮＡベクタ
   ーで形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】ＭＬ−２３６Ｂ生産菌であることを特徴と
   する請求項７記載の宿主細胞。
9. 【請求項９】ペニシリウム・シトリナム（Penicillium
   citrinum）であることを特徴とする、請求項８記載の宿
   主細胞。
10. 【請求項１０】請求項８又は９記載の宿主細胞を培養
    し、次いで該培養物からＭＬ−２３６Ｂを回収すること
    を特徴とする、ＭＬ−２３６Ｂの製造法。
11. 【請求項１１】大腸菌であることを特徴とする、請求項
    ７記載の宿主細胞。
12. 【請求項１２】形質転換大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＭＬ
    ４８ ＳＡＮＫ７１１９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７８
    ０）である、請求項１１記載の宿主細胞。
13. 【請求項１３】配列表の配列番号２において、ヌクレオ
    チド番号２３０４５のアデニン又はそれより５’−側の
    塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基から
    なる配列を有するＰＣＲ用プライマーＡ１。
14. 【請求項１４】請求項１３記載のＰＣＲ用プライマーＡ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＡ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＡ２は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号２３０４５乃至２３０４７に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
15. 【請求項１５】請求項１３記載のＰＣＲ用プライマーＡ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＡ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＡ３は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号２３０４５乃至２３０４７に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
16. 【請求項１６】請求項１３記載のＰＣＲ用プライマーＡ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＡ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＡ４は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号２３０４５乃至２３０４７に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
17. 【請求項１７】配列表の配列番号１において、ヌクレオ
    チド番号１４７９のシトシン又はそれより５’−側の塩
    基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基からな
    る配列を有するＰＣＲ用プライマーＢ１。
18. 【請求項１８】請求項１７記載のＰＣＲ用プライマーＢ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有する、少なくと
    も１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマー
    Ｂ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＢ２は、配列表の配
    列番号２のヌクレオチド番号３２７２０乃至３２７２２
    によりコードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
19. 【請求項１９】請求項１７記載のＰＣＲ用プライマーＢ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有する、少なくと
    も１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマー
    Ｂ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＢ３は、配列表の配
    列番号２のヌクレオチド番号３２７２０乃至３２７２２
    によりコードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
20. 【請求項２０】請求項１７記載のＰＣＲ用プライマーＢ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有する、少なくと
    も１０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマー
    Ｂ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＢ４は、配列表の配
    列番号２のヌクレオチド番号３２７２０乃至３２７２２
    によりコードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
21. 【請求項２１】配列表の配列番号２において、ヌクレオ
    チド番号１１７４８のアデニン又はそれより５’−側の
    塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基から
    なる配列を有するＰＣＲ用プライマーＣ１。
22. 【請求項２２】請求項２１記載のＰＣＲ用プライマーＣ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＣ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＣ２が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１１７４８乃至１１７５０に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
23. 【請求項２３】請求項２１記載のＰＣＲ用プライマーＣ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＣ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＣ３が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１１７４８乃至１１７５０に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
24. 【請求項２４】請求項２１記載のＰＣＲ用プライマーＣ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＣ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＣ４が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１１７４８乃至１１７５０に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
25. 【請求項２５】配列表の配列番号１において、ヌクレオ
    チド番号１４３６２のチミン又はそれより５’−側の塩
    基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基からな
    る配列を有するＰＣＲ用プライマーＤ１。
26. 【請求項２６】請求項２５記載のＰＣＲ用プライマーＤ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＤ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＤ２は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１９８３７乃至１９８３９に
    よりコードされるセリン残基をＣ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
27. 【請求項２７】請求項２５記載のＰＣＲ用プライマーＤ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＤ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＤ３は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１９８３７乃至１９８３９に
    よりコードされるセリン残基をＣ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
28. 【請求項２８】請求項２５記載のＰＣＲ用プライマーＤ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＤ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＤ４は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１９８３７乃至１９８３９に
    よりコードされるセリン残基をＣ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
29. 【請求項２９】配列表の配列番号１において、ヌクレオ
    チド番号１１７９６のアデニン又はそれより５’−側の
    塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基から
    なる配列を有するＰＣＲ用プライマーＥ１。
30. 【請求項３０】請求項２９記載のＰＣＲ用プライマーＥ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＥ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＥ２が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号１１７９６乃至１１７９８に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
31. 【請求項３１】請求項２９記載のＰＣＲ用プライマーＥ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＥ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＥ３が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号１１７９６乃至１１７９８に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
32. 【請求項３２】請求項２９記載のＰＣＲ用プライマーＥ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＥ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＥ４が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号１１７９６乃至１１７９８に
    よりコードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
33. 【請求項３３】配列表の配列番号２において、ヌクレオ
    チド番号２０７２３のチミン又はそれより５’−側の塩
    基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基からな
    る配列を有するＰＣＲ用プライマーＦ１。
34. 【請求項３４】請求項３３記載のＰＣＲ用プライマーＦ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＦ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＦ２が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号１３４７６乃至１３４７８に
    よりコードされるシステイン残基をＣ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
35. 【請求項３５】請求項３３記載のＰＣＲ用プライマーＦ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＦ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＦ３が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号１３４７６乃至１３４７８に
    よりコードされるシステイン残基をＣ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
36. 【請求項３６】請求項３３記載のＰＣＲ用プライマーＦ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＦ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＦ４が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号１３４７６乃至１３４７８に
    よりコードされるシステイン残基をＣ末端とするポリペ
    プチドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲ
    に用いられ得る）。
37. 【請求項３７】配列表の配列番号１において、ヌクレオ
    チド番号２４３２１のアデニン又はそれより５’−側の
    塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基から
    なる配列を有するＰＣＲ用プライマーＧ１。
38. 【請求項３８】請求項３７記載のＰＣＲ用プライマーＧ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＧ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＧ２が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号２４３２１乃至２４３２３で
    コードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
39. 【請求項３９】請求項３７記載のＰＣＲ用プライマーＧ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＧ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＧ３が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号２４３２１乃至２４３２３で
    コードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
40. 【請求項４０】請求項３７記載のＰＣＲ用プライマーＧ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＧ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＧ４が、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号２４３２１乃至２４３２３で
    コードされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
41. 【請求項４１】配列表の配列番号２において、ヌクレオ
    チド番号６３１２のチミン又はそれより５’−側の塩基
    を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基からなる
    配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ１。
42. 【請求項４２】請求項４１記載のＰＣＲ用プライマーＨ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＨ２は、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号２７８８７乃至２７８８９で
    コードされるアルギニン残基をＣ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
43. 【請求項４３】請求項４１記載のＰＣＲ用プライマーＨ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＨ３は、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号２７８８７乃至２７８８９で
    コードされるアルギニン残基をＣ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
44. 【請求項４４】請求項４１記載のＰＣＲ用プライマーＨ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＨ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＨ４は、配列表の配列
    番号１のヌクレオチド番号２７８８７乃至２７８８９で
    コードされるアルギニン残基をＣ末端とするポリペプチ
    ドをコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用
    いられ得る）。
45. 【請求項４５】配列表の配列番号２において、ヌクレオ
    チド番号３５４５のアデニン又はそれより５’−側の塩
    基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基からな
    る配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ１。
46. 【請求項４６】請求項４５記載のＰＣＲ用プライマーＩ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＩ２が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号３５４５乃至３５４７でコー
    ドされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いら
    れ得る）。
47. 【請求項４７】請求項４５記載のＰＣＲ用プライマーＩ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＩ３が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号３５４５乃至３５４７でコー
    ドされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いら
    れ得る）。
48. 【請求項４８】請求項４５記載のＰＣＲ用プライマーＩ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＩ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＩ４が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号３５４５乃至３５４７でコー
    ドされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いら
    れ得る）。
49. 【請求項４９】配列表の配列番号１において、ヌクレオ
    チド番号２８４７２のチミン又はそれより５’−側の塩
    基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基からな
    る配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ１。
50. 【請求項５０】請求項４９記載のＰＣＲ用プライマーＪ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＪ２は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号５７２７乃至５７２９により
    コードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペプチド
    をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
    られ得る）。
51. 【請求項５１】請求項４９記載のＰＣＲ用プライマーＪ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＪ３は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号５７２７乃至５７２９により
    コードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペプチド
    をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
    られ得る）。
52. 【請求項５２】請求項４９記載のＰＣＲ用プライマーＪ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＪ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＪ４は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号５７２７乃至５７２９により
    コードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペプチド
    をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
    られ得る）。
53. 【請求項５３】配列表の配列番号２において、ヌクレオ
    チド番号４００のアデニン又はそれより５’−側の塩基
    を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基からなる
    配列を含むＰＣＲ用プライマーＫ１。
54. 【請求項５４】請求項５３記載のＰＣＲ用プライマーＫ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＫ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＫ２が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号４００乃至４０２によりコー
    ドされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いら
    れ得る）。
55. 【請求項５５】請求項５３記載のＰＣＲ用プライマーＫ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＫ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＫ３が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号４００乃至４０２によりコー
    ドされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いら
    れ得る）。
56. 【請求項５６】請求項５３記載のＰＣＲ用プライマーＫ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＫ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＫ４が、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号４００乃至４０２によりコー
    ドされるメチオニン残基をＮ末端とするポリペプチドを
    コードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用いら
    れ得る）。
57. 【請求項５７】配列表の配列番号１において、ヌクレオ
    チド番号３２２８７のシトシン又はそれより５’−側の
    塩基を５’−末端とする、少なくとも１０個の塩基から
    なる配列を含むＰＣＲ用プライマーＬ１。
58. 【請求項５８】請求項５７記載のＰＣＲ用プライマーＬ
    １の塩基配列と７０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＬ
    ２（但し、該ＰＣＲ用プライマーＬ２は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１９１２乃至１９１４により
    コードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペプチド
    をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
    られ得る）。
59. 【請求項５９】請求項５７記載のＰＣＲ用プライマーＬ
    １の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＬ
    ３（但し、該ＰＣＲ用プライマーＬ３は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１９１２乃至１９１４により
    コードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペプチド
    をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
    られ得る）。
60. 【請求項６０】請求項５７記載のＰＣＲ用プライマーＬ
    １の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、少なくとも
    １０個の塩基からなる配列を含むＰＣＲ用プライマーＬ
    ４（但し、該ＰＣＲ用プライマーＬ４は、配列表の配列
    番号２のヌクレオチド番号１９１２乃至１９１４により
    コードされるアラニン残基をＣ末端とするポリペプチド
    をコードするｃＤＮＡを増幅させるためのＰＣＲに用い
    られ得る）。