JPH09504436A - トリオールポリケチドシンターゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トリオールポリケチドシンターゼ（ＴＰＫＳ）をコードするＤＮＡを単離し、精製し、シークエンシングした。ＴＰＫＳを含む発現ベクターと、この発現ベクターで形質転換した細胞と、この形質転換細胞を使用するプロセスとを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 トリオールポリケチドシンターゼをコードするＤＮＡ 発明の背景 高コレステロール血症が、動脈硬化症のような虚血性心臓血管疾病の主な要因 の１つであることが公知である。コレステロールや他の脂質は、異なった密度の リポタンパク質によって体液中を運搬される。血液中のコレステロールの大部分 を運搬する２種類のリポタンパク質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と高密 度リポタンパク質（ＨＤＬ）である。ＬＤＬの役割は、コレステロールを肝臓外 の末梢細胞に運搬することである。細胞原形質膜上のＬＤＬレセプターはＬＤＬ と結合し、コレステロールが上記細胞内に入ることを可能にする。ＨＤＬは、上 記末梢組織中のコレステロールを捕捉して、肝臓へと運搬し、これを最終的に異 化することが可能である。ＬＤＬのレベルは冠状動脈疾患のリスクと正の相関を 有し、一方、ＨＤＬのレベルは冠状動脈疾患のリスクと負の相関を有し、ＨＤＬ コレステロールに対するＬＤＬコレステロールの比率が、冠状動脈疾患の最も適 切な指標であるとされている。従って、ＬＤＬコレステロールを低下させるメカ ニズムを生じさせる物質は、抗高コレ ステロール血症薬として有効な可能性がある。 製品として現在入手可能なＭｅｖａｃｏｒ（登録商標）（ロバスタチン；メビ ノリン）とＺＯＣＯＲ（登録商標）（シンバスタチン）は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダ クターゼ酵素を阻害することによって作用する、非常に活性が高い一群の抗高コ レステロール血症薬に属する２種である。ロバスタチンとその関連化合物は、細 胞コレステロール生合成における律速段階を阻害することによって、即ち、ＨＭ Ｇ−ＣｏＡレダクターゼ［３．７−９．１２］によるヒドロキシメチルグルタリ ル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）のメバロネートへの変換を阻害することによって 、コレステロール合成を抑制する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、細胞 ホメオスタシス機構を通してＬＤＬレセプターを増加させ、結果としてＬＤＬコ レステロールを低減させ、高コレステロール血症治療作用を及ぼす。本発明の範 囲内に含まれるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、非限定的に、コンパクチ ン（ＭＬ−２３６Ｂ）、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フル バスタチン、メバスタチンを含む。 数多くのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が、微生物を使って合成される。 本発明のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤 の生合成経路全般は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２ ０５４２によるメビノリン（ロバスタチン）の生合成がアセテートからポリケチ ド経路で進行することを示したＭｏｏｒｅらによって概略的に説明されている（ Ｒ．Ｎ．Ｍｏｏｒｅら，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｃ ｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ ｍｅｖｉｎｏｌｉｎ ｂｙ Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ ｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ，ａｎｄ ｏｘｙ ｇｅｎ ａｔｏｍｓ ｂｙ ¹³Ｃ ＮＭＲ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏ ｍｅｔｒｙ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８５，１０７：３６９４ −３７０１）。遠藤らは、類似の生合成経路がＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔ ｒｉｎｕｍ ＮＲＲＬ ８０８２とＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ Ｍ−４６８ １でもあることを実証した（Ａ．Ｅｎｄｏら，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＭＬ−２３６Ｂ（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）ａｎｄ ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ．， １９８５，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，３８：４４４−４４８）。 ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が最近市場に導入され、 このために、該ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を高い収率で製造するための プロセスが求められるようになった。プロセスの収率を改善するための方法は、 非限定的に、プロセスの規模拡大、培地の改善、又は、単離プロセスの単純化を 含む。本発明は、増大したレベルのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を生産す る微生物の使用に基づいて生産性の改善をもたらし、プロセス収率を増大させる 方法に係わる。 ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の生合成を遺伝子の発現レベルで増加させ ることが望ましい。こうした増加は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の生合 成経路において、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤生産微生物中における１つ 以上の酵素の濃度を増大させるか、その酵素活性を増大させることによって、実 現することが可能であろう。特に、律速生合成活性の濃度を増大させることが望 ましいだろう。 トリオールポリケチドシンターゼ（ＴＰＫＳ）は、その酵素活性の産物によっ て明らかに示されるように少なくとも４種の活性を有する多機能タンパク質であ る（Ｍｏｏｒｅ，上記）。ＴＫＰＳは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤化合 物の生合成において、律速酵素活性を有すると考えられている。 本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓからのトリオールポリケ チドシンターゼ（ＴＰＫＳ）をコードするＤＮＡを同定する。本発明ではＴＰＫ ＳをコードするＤＮＡを、単離し、精製し、配列決定した。ＴＰＫＳに対応する 相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列とゲノムＤＮＡ配列を作製した。ＨＭＧ−ＣｏＡレ ダクターゼ阻害剤生産微生物によるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の生産を 増大させるために、本発明のＴＰＫＳ ｃＤＮＡを使用することが可能である。 本発明のＴＰＫＳ ｃＤＮＡを、精製ＴＰＫＳを生産するために使用することも 可能である。発明の要約 トリオールポリケチドシンターゼ（ＴＰＫＳ）の全長形態をコードするＤＮＡ を同定する。このＤＮＡの配列を決定し、発現ベクターの中にクローニングする 。発現ベクターで形質転換した細胞は、増加したレベルのＴＰＫＳと、増加した レベルのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤とを生産する。このＤＮＡを組換え 全長ＴＰＫＳの生産に使用することが可能である。更に、ポリケチドを生産する ことが可能な生物（特に、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を生産することが 可能な微生物）の 中に存在するＴＰＫＳの相同体を単離し同定するために、上記ＤＮＡを使用する ことも可能である。図面の簡単な説明 図１は、トリオールポリケチドシンターゼのヌクレオチド配列である。 図２は、トリオールポリケチドシンターゼのアミノ酸配列（推定）である。 図３は、ｐＴＰＫＳ１００を示す。 図４は、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｅｎｅＷｏｒｋｓプログラムで 探査した、ＴＰＫＳタンパク質の開放読み枠と、ＴＰＫＳペプチドの全体的配置 と、ＰＫＳ活性とを示す説明図である。 図５は、ＴＰＫＳの領域上に存在するケトアシルシンターゼとアセチル／マロ ニルトランスフェラーゼとデヒドラターゼと、ラット脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ ）と、Ｐ．ｐａｔｕｌｕｍ ６ＭＳＡＳとの整合状況を示す。 図６は、ＴＰＫＳの領域上に存在するエノイルレダクターゼとケトレダクター ゼとアシル担体タンパク質の整合状況を示す。 図７は、ＴＰＫＳとその関連タンパク質のピリジンヌクレオ チド結合領域のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ２次構造予測図である。 図８は、様々な原核及び真核生物メチルトランスフェラーゼのＳ−アデノシル メチオニン結合領域を示す。 図９は、Ｍ．ｒｕｂｅｒ及びＰ．ｃｉｔｒｉｎｕｍに対する、Ａ．ｔｅｒｒｅ ｕｓ のＴＰＫＳのケトアシルシンターゼの相同性を示すサザンブロットである。発明の詳細な説明 本発明は、ＴＰＫＳ生産細胞から単離したトリオールポリケチドシンターゼ（ ＴＰＫＳ）をコードするＤＮＡ分子に係わる。ＴＰＫＳ生産性の細胞は、非限定 的に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅ ｒ 、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｂｒｅ ｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ 、Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ Ｍ２０１６、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ ．ＭＭ６０３、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ Ｍ６７３５、及び、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ Ｍ６８２８菌株を含む。 本明細書で使用する「ＴＰＫＳ」は、アセテート前駆体とＳ −アデノシルメチオニンとをトリオール生合成経路における中間体に変換する酵 素活性を意味する。トリオールノナケチドを生産するために、この中間体を更に 修飾する。細菌や菌類からのポリケチドシンターゼは、２個の炭素ユニットから ポリケチドを合成するために共通の酵素機能を使用する（例えば、Ｄ．Ａ．Ｈｏ ｐｗｏｏｄ及びＤ．Ｈ．Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９０，“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ，２４：３７−６６の総説参照）。 ポリケチドは、その構造的多様性のために、及び、抗生作用活性又は他の薬学 的活性を有するものが多いために、重要な自然生産物である。商業的に重要なポ リケチドの殆どは真菌類又は放線菌によって生産される。 ポリケチド生合成は、カルボキシレートユニットの段階的縮合を含む点で、脂 肪酸の生合成に類似している。アセテートユニットから構成される脂肪酸とは違 って、ポリケチドは、アセテートユニット、プロピオネートユニット、又は、ブ チレートユニットから構成されることが可能である。これに加えて、ポリケチド 生合成中の各縮合サイクルで付加されるβ−ケト基の 一部又は全部が、未還元のまま残されるか、又は、ヒドロキシル官能基又はエノ イル官能基まで還元されるにすぎない。構成ユニットのこうした相違と、β−ケ ト基の修飾状況の相違とが、極めて多様な生産物をもたらすと共に、異なった経 路からの生合成遺伝子の間の比較を困難なものにする。 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓは、糸状の土壌菌類である。様々な 菌株のＡ．ｔｅｒｒｅｕｓが様々なポリケチドを生産する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｊ．ら，１９７９，Ｔｅｒｒｅｔｏｎｉｎ，ａ ｔｏｘｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ．，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．２６，４８５２−４８５４）。ロバスタチンは、特定 の菌株のＡ．ｔｅｒｒｅｕｓによって生産されるポリケチドである（Ｍｏｏｒｅ 、上記）。ロバスタチンとその関連代謝物（例えば、トリオール、又は、モナコ リンＪ）に加えて、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ中に発見された他のポリケチドは、エモ ジン（ｅｍｏｄｉｎ）から得られたスロチリン（ｓｕｌｏｃｈｒｉｎ）とその関 連構造（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｒ．Ｇ．ら，１９６４，“Ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅ ｓｉｓ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９０：４３− ５１）（Ｆｕｊｉｉ，Ｉ．ら，１９８２，“Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅｍｏｄｉｎ−Ｏ −ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ （＋）−ｇｅｏｄｉｎ ｐ ｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅ ｕｓ ”，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３０（６）：２２８３−２２８６ ）と、テレイン酸（ｔｅｒｒｅｉｃ ａｃｉｄ）（Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｊ．Ｃ．ら ，１９５８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８０：５５３６）と、パツリン（ ｐａｔｕｌｉｎ）（Ｄ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，１９７６，“Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓ ｅｒ．Ｎｏ．１４９”）と、シトリニン（ｃｉｔｒｉｎｉｎ）（Ｓａｎｋａｗａ ，Ｕ．ら，１９８３，“Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ”，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３９ （２１）：３５８３−３５９１）を含む。こうした各産物は、恐らくは特定 の特異的なＰＫＳ遺伝子によってコードされた特定のＰＫＳによって生産され、 従って、トリオールＰＫＳのクローニングをより一層困難にしている。 ロバスタチンの構造と活性については、Ａ．Ａｌｂｅｒｔｓ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８０，７７：３ ９５７−３９６１）によって報告されている。ロバスタチンは、共役デセン環系 を有するノナケチドにエステル結合によって結合されたメチルブチリル基から成 る還元分子である。 Ｍｏｏｒｅら（上記）は、ロバスタチン生合成を説明している。インビボ標識 ロバスタチンのプロトン及び¹³Ｃ ＮＭＲ解析により、６位と２′位に位置する メチル基（これらのメチル基はメチオニンから得られる）を除いて、その炭素の 全てがアセテートから得られたものであることが明らかになった。トリオール分 子は９個のアセテート構成ユニットから構成されている。その側鎖は２個のアセ テートユニットから構成されている。トリオールとブチレート側鎖のエステル化 は酵素的に生じる（Ｋｉｍｕｒａ、上記）。メチルブチレート側鎖は恐らく別の ＰＫＳによって合成される。ロバスタチンは、最初に、９個のアセテートユニッ トより長い、高度に還元された前駆体として合成され、炭素−炭素結合の酸化的 切断を含む再酸化を受ける。 コンパクチン生合成に関しては、限られた情報しか入手できない。最も可能性 が高い経路は、メチル化がジエン環系上の６ 位では生じないということを除いて、Ｍ．ｒｕｂｅｒ及びＡ．ｔｅｒｒｅｕｓに おけるロバスタチン生合成の経路と概ね同一だろう。 ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）と脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は作用の種類 によって分類される。細菌と植物とに典型的であるII型酵素は、各々の酵素活性 毎に別々のポリペプチドを有する。動物、細菌、真菌類に見い出されるＩ型酵素 は、複数種の活性を有するか、又はいくつかの作用ドメインを有する大きなポリ ペプチドから成る。こうした遺伝子では、各領域、即ち、ケトアシルシンターゼ のためのドメイン、アセチル／マロニルトランスフェラーゼのためのドメイン、 β−ケトレダクターゼのためのドメイン、エノイルレダクターゼのためのドメイ ン、デヒドラターゼのためのドメイン、及び、アシル担体タンパク質のためのド メインのアミノ酸配列が似かよっている。インビトロで作用Ｉ型ＰＫＳを得るこ とが難しいので、こうしたドメインの同定が可能ならば、その結果生じる酵素活 性の立証になるであろう（Ｓｈｅｒｍａｎ、上記）。 ＴＰＫＳゲノムＤＮＡ又は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を分子的にクローニングす るためには、様々な方法を使用することが可 能である。これらの方法は、非限定的に、適切な発現ベクター系においてＴＰＫ Ｓを含むゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを構築した後、適切な宿主中に おいてＴＰＫＳ遺伝子を直接機能発現させることを含む。この好ましい方法は、 精製ＴＰＫＳタンパク質に対する抗体を使用して、バクテリオファージ又はベク ター中に構築した、ＴＰＫＳを含むｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニング することから成る。上記抗体は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤生産細胞か ら精製ＴＰＫＳタンパク質を単離し、この精製タンパク質を適切な宿主（例えば ウサギ）に接種し、数回の追加免疫の後に、免疫血清を回収する標準的方法（Ｄ ｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．編，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ ，Ｖｏｌ．１８２）によって得る。上記動物から回収した抗体を、ｃＤＮ Ａ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用し、抗血清によって認識さ れたＴＰＫＳエピトープ発現ｃＤＮＡクローンを選択する。陽性クローンを更に 精製し、標識し、これをプローブとしてＴＰＫＳを含むゲノムライブラリー又は ｃＤＮＡライブラリーからＴＰＫＳを含む関連ＤＮＡを同定する。関連クローン の標準的な制限解析により、上記領域の制限地図を作成し、一 方、ゲノムクローン及びｃＤＮＡクローンの配列解析から上記遺伝子の構造地図 と開放読み枠とを定義する。 ＴＰＫＳをクローニングするための別の方法は、ＴＰＫＳのアミノ酸配列から 標識オリゴヌクレオチドプローブを設計し、バクテリオファージ又はプラスミド 往復ベクター内に構築したＴＰＫＳを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン グすることを含む。この方法は、ＴＰＫＳサブユニットをコードする部分ｃＤＮ Ａによって、バクテリオファージ又はプラスミド往復ベクター内に構築したＴＰ ＫＳを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることを含むことが可能で ある。この部分ｃＤＮＡは、精製ＴＰＫＳサブユニットのアミノ酸配列からの縮 重オリゴヌクレオチドプライマーの設計による、ＴＰＫＳ ＤＮＡフラグメント の特異的ＰＣＲ増幅によって得る。 他のタイプのライブラリーや、他の細胞又は細胞タイプから作製したライブラ リーを、ＴＰＫＳをコードするＤＮＡを単離するために使用できることは、当業 者には容易に明らかだろう。他のタイプのライブラリーには、非限定的に、他の 細胞又は細胞系から得られるｃＤＮＡライブラリーとゲノムＤＮＡライブラリー とを含む。 ＴＰＫＳ活性を有する細胞又は細胞系から適切なｃＤＮＡライブラリーを作製 できることは、当業者には容易に明らかだろう。ＴＰＫＳ ｃＤＮＡを単離する ためのｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用する細胞又は細胞系の選択は 、最初に、放射能標識アセテートの取り込みと、高性能液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）による産物の分離とを使用して、細胞関連ＴＰＫＳ活性を定量する ことによって行う。 ｃＤＮＡライブラリーの作製は、当業界で公知の標準的な方法で行う。公知の ｃＤＮＡライブラリー作製方法については、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）を参照されたい。 ＴＰＫＳをコードするＤＮＡを適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離でき ることも、当業者には容易に明らかだろう。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は 当業界で公知の標準的方法で行う。公知のゲノムＤＮＡライブラリー作製方法に ついては、 Ｍａｎｉａｔｉｓら（上記）を参照されたい。 ＴＰＫＳ遺伝子のクローニングを行うためには、ＴＰＫＳのアミノ酸配列を知 ることが必要だろう。これを実現するためには、ＴＰＫＳタンパク質を精製し、 部分アミノ酸配列を常法で決定する。完全なアミノ酸配列の確定は必要ではない 。適切なアミノ酸配列が決まったら、そのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列 を合成する。 遺伝コードの縮重性の故に、特定のアミノ酸をコードする２つ以上のコドンが あり得、従って、一組の類似したＤＮＡオリゴヌクレオチドの中のいずれかのＤ ＮＡオリゴヌクレオチドがアミノ酸配列をコードする。こうした一組のＤＮＡオ リゴヌクレオチドの中のＤＮＡオリゴヌクレオチドの１つだけが上記ＴＰＫＳ配 列と同一であるにすぎないが、不整合を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドがあっ ても、ＴＰＫＳ ＤＮＡとのハイブリッド形成は可能だろう。不整合ＤＮＡオリ ゴヌクレオチドでもＴＰＫＳ ＤＮＡとハイブリッド形成し、ＴＰＫＳ ＤＮＡ の同定と単離とを可能にする可能性がある。 特定の生物からのＴＰＫＳをコードするＤＮＡを、他の生物からのＴＰＫＳ相 同体を単離精製するために使用できることは、 当業者には容易に明らかであろう。このためには、適切なハイブリッド形成条件 下で、第１のＴＰＫＳ ＤＮＡを、ＴＰＫＳの相同体をコードするＤＮＡを含む サンプルと混和する。ハイブリッド形成ＤＮＡ複合体を単離し、更に、この複合 体から、相同ＤＮＡをコードするＤＮＡを精製することが可能である。 ＴＰＫＳをコードするｃＤＮＡクローンを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） に基づく方法とｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングとを使用する２段階手順 を使用して、単離することが可能である。 非変性タンパク質と、特異的タンパク質加水分解によって作製したペプチドフ ラグメントは、両方とエドマン分解を使用する、自動アミノ酸配列解析機で、ア ミノ酸配列情報を得る。所定時間培養した後に、消化を終わらせ、得られたペプ チドフラグメントを分別し、検出する。 本明細書で説明する精製プロセスによって天然起源から得られる実質的に純粋 な形態のＴＰＫＳが単一のｍＲＮＡによってコードされていることが発見された 。 上記の方法で得たクローン化ＴＰＫＳ ｃＤＮＡを、適切なプロモーターと他 の適切な転写調節エレメントとを含む発現ベ クターの中にクローニングすることによって発現させ、原核生物宿主又は真核生 物宿主の細胞中に移入して、組換えＴＰＫＳを作製することが可能である。こう した操作のための技術は当業界で公知である。 下記の実施例と詳細な説明とを簡明にするために、幾つかの術語を以下に定義 する。 「発現ベクター」は、本明細書において、遺伝子のクローン化コピーの転写と 適切な宿主内でのそのｍＲＮＡの翻訳とのために必要なＤＮＡ配列と定義される 。こうしたベクターを、細菌、緑藻類、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞のような 様々な宿主における真核生物遺伝子を発現させるために使用することが可能であ る。発現ベクターは、非限定的に、クローニングベクター、修飾クローニングベ クター、及び、特に設計したプラスミド又はウイルスを含む。特に設計したベク ターとは、宿主間（例えば、細菌−酵母菌、細菌−動物細胞）のＤＮＡの往復を 可能にするものである。適切に作製した発現ベクターは、宿主細胞中における自 律的複製のための複製起源、選択可能なマーカー、限定された数の使用可能な制 限酵素部位、高い複製数をもたらす可能性、及び、活性なプロモーターを含まな ければな らない。 発現ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物であり、ＴＰＫＳをコードするＤＮＡ 配列が、適切な宿主内においてＴＰＫＳの発現を生じさせることが可能な適切な 制御配列に操作可能な形で結合される。制御配列は、転写プロモーターと、転写 を制御するオペレーター配列（任意）と、転写と翻訳との終止を制御する配列と を含む。 増幅ベクターのような特定のベクターでは、発現制御ドメインは必要ではない が、（通常は複製起源によって与えられる）宿主内で複製する能力と、形質転換 体の認識を容易にするための選択遺伝子とが必要である。 「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合することを促してＲ ＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターとは、 ｍＲＮＡの開始反応を高い頻度で引き起こすプロモーターのことである。 ＴＰＫＳをコードするＤＮＡを、宿主細胞における発現のための発現ベクター の中にクローニングすることも可能である。宿主細胞は原核生物又は真核生物で あり、非限定的に、細菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、及び、細胞系を含 む。 形質転換、トランスフェクション、原形質体融合、及び、電気穿孔法を非限定 的に含む幾つかの方法のいずれかによって、発現ベクターを宿主細胞内に導入す ることが可能である。発現ベクターを含む細胞を単一クローンとし、こうした細 胞の各々を、それがＴＰＫＳ遺伝子を含むかどうか又はＴＰＫＳタンパク質を生 産するかどうか、個々に分析することが可能である。抗ＴＰＫＳ抗体との免疫活 性、及び、宿主細胞関連ＴＰＫＳ活性の存在を非限定的に含む幾つかの手段によ って、ＴＰＫＳ発現宿主細胞クローンの同定を行うことが可能である。 ＴＰＫＳ ＤＮＡの発現を、インビトロで作製した合成ｍＲＮＡを使用して行 うことも可能である。合成ｍＲＮＡを、様々な無細胞系（小麦胚芽抽出物と網状 赤血球抽出物を非限定的に含む）内と細胞由来の系（カエル卵母細胞内へのマイ クロインジェクションを非限定的に含む）内とにおいて効率良く翻訳することが 可能であり、カエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションが好ましい。 「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応であり、必要量が得られるまで一連のサ イクルを繰り返し、同時に標的ＤＮＡ分子の相補鎖を複製するための方法である 。 「プラスミド」は、大文字及び／又は数字がその前後に付された小文字「ｐ」 によって示されることが一般的である。本発明で使用する開始プラスミドは、市 販されているか、自由に入手可能であるか、又は、このような入手可能なプラス ミドから常法で作製できる。更に、他の同等のプラスミド又は作製物の入手方法 も、当業者には容易に明らかだろう。 「形質転換宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製したＴＰＫＳベクタ ーを用いて形質転換又はトランスフェクションした細胞である。発現したＴＰＫ Ｓは、宿主細胞の細胞膜内に蓄積されるか、細胞内に存在するか、又は、分泌さ れるだろう。 特定のアミノ酸をコードする様々なコドンに相当の重複性があり得ることも公 知である。従って、本発明は、同一のアミノ酸に翻訳されることになる他のコド ンを含むＤＮＡ配列にも係わる。本明細書では、１個以上の置換コドンを含む配 列を「縮重変異（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」と定義する。 更に、発現タンパク質の最終的な物理的属性に大きな変化をもたらさない程度の 、ＤＮＡ配列又は翻訳タンパク質における変異も、本発明の範囲内に含まれる。 例えば、バリンが ロイシンに、アルギニンがリジンに、又は、アスパラギンがグルタミンに置き換 わることは、上記ポリペプチドの機能性の変化を生じさせないことがある。 天然発生ペプチドの属性とは異なる属性を有するペプチドをコードするように 、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を変異させ得ることも公知である。ＤＮＡ配 列を変異させる方法は、非限定的に、部位特異的変異誘発を含む。変化した属性 の例は、非限定的に、基質に対する酵素の親和性の変化を含む。アミノ酸配列の 変化は属性の変化をもたらす可能性があり、それにより修飾された構造の生産に 帰結する。例えば、レダクターゼ活性部位の１つを排除することは、還元度がよ り低い化合物をもたらす可能性がある。 プラスミドｐＬＯＡ中の全長ＴＰＫＳコーディングＤＮＡを、ｐＴＰＫＳ１０ ０と表した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株であるＪＭ１０９中のｐＴＰＫＳ１００のサンプ ルを、ブダペスト条約の条項に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．，２０８５２）の永久培地コレクションに寄託し（ １９９３年９月１５日）、受託番号 ＡＴＣＣ ６９４１６が割り当てられた。 以下の実施例は、本発明を、限定することなしに例示する。実施例１ 培養条件 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓの３つの菌株を使用した。うち２つ のロバスタチン生産菌株にはＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２０５４２が含ま れていた。ロバスタチン非生産菌株も使用した。Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓのロバスタ チン非生産菌株又はロバスタチン過剰生産菌株は、公共的に入手可能なＡ．ｔｅ ｒｒｅｕｓ のロバスタチン生産菌株から作製することが可能である。公共的に入 手可能な菌株の例はＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ＭＦ−４８３３であり、受託番号２０ ５４２としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎに寄託されている。紫外線照射、エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）処置 、亜硝酸処理、ニトロソグアニジン、及び、プソラレン架橋を非限定的に含む突 然変異誘発法のような様々な方法を、ロバスタチン非生産菌株又はロバスタチン 過剰生産菌株を作製するために使用することが可能なことを、当業者は理解する だろう。栄養素要求性（即ち、親株の正常な代謝と繁 殖のために必要な最小量を上回る、特定の成長物質に対する突然変異株の要求） と、個々の培養に際してのロバスタチン生産の定量とを含む様々な方法で、突然 変異誘発の度合いを定量することが可能である。別の尺度には、アクリフラビン のような挿入色素の使用を含み、こうした挿入色素は、プレート１枚当たり１０ ，０００個の胞子を平板培養する時には、親（ロバスタチン生産）菌株の成長を 防止するが、突然変異誘発後は、プレート１枚当たり約３個から５個の集落の成 長を可能にする。或いは、突然変異誘発の度合いを、突然変異誘発をしていない 、親株とは異なる形態と色を有する集落の視覚的観察によることも可能である。 突然変異株を再び単離してプールし、更に別の突然変異誘発を行い、こうした手 順を反復することによって、ロバスタチンを生産しないか又は過剰生産するＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ の突然変異株を得ることが可能である。 Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＡＴＣＣ ２０６５７と、Ｐｅｎｉｃｉｌｌ ｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＡＴＣＣ ２０６０６を、ハイブリッド形成の調査 のために使用した。 菌株をＹＭＥ＋ＴＥ培地上に保持した。ＹＭＥ＋ＴＥ培地の処方は次の通りで ある。 水１リットル中に、 酵母抽出物 ０．４％（ｗ／ｖ） 麦芽抽出物 １．０％（ｗ／ｖ） グルコース ０．４％（ｗ／ｖ） 微量元素（ＴＥ） ０．５％（ｖ／ｖ） 寒天 ２．０％（ｗ／ｖ） （ｐＨ ７．２）。 微量元素（ＴＥ）の処方は次の通りである。 水１リットル中に、 ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．１％（ｗ／ｖ） ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ ０．１％（ｗ／ｖ） ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．００２５％（ｗ／ｖ） ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．０１３２％（ｗ／ｖ） Ｈ₃ＢＯ₃ ０．００５６％（ｗ／ｖ） （ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ ０．００１９％（ｗ／ｖ） ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％（ｗ／ｖ）実施例２ 発酵条件 胞子ストックの作製のために、相対湿度６５％、２８℃において８日間、ＹＭ Ｅ＋ＴＥプレート上で成長させることによって、単集落を形成させた。単集落を 取り除き、ＹＭＥ＋ＴＥ斜面培地上に塗布した。この斜面培地を、湿度６５％、 ２８℃において８日間、インキュベートした。２ｍｌのＳｐｏｒｅ Ｓｕｓｐｅ ｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＳＳ）を加えて胞子を回収した。ＳＳＳは、 水中にグリセロール１０％（ｖ／ｖ）とラクトース５％（ｗ／ｖ）とを含む。無 菌接種ループを用いて胞子を擦り取ってＳＳＳ中にいれ、カウントした。この懸 濁液を−２０℃で保存した。 ロバスタチンの生産には、胞子懸濁液からの２段階発酵を使用した。１×１０⁸ 個の胞子を２ｍｌ／１５ｍｌ培養チューブのＨＬＣ培地中に接種することによ って、種培養を開始した。 ＨＬＣ培地の処方は次の通りである。 水１リットル中に ＫＨ₂ＰＯ₄ １．５％（ｗ／ｖ） セレロース ２．０％（ｗ／ｖ） Ａｒｄａｍｉｎｅ ｐＨ（Ｃｈａｍｐｌａｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ） ０．１％（ｗ／ｖ） Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ） １．５％（ｗ／ｖ） 乳酸 ０．２％（ｖ／ｖ） クエン酸アンモニウム ０．４％（ｗ／ｖ） 滅菌の前にＨＬＣ培地のｐＨをｐＨ ７．２に調整した。 ２２０ｒｐｍで回転する振幅直径７０ｍｍの回転振とう機上で、２８℃で約 ２８時間、３０度の角度で培養を振とうした。２５０ｍｌフラスコ内のＧＰ−９ 培地２５ｍｌに接種するために、２ｍｌの種培養を使用した。 ＧＰ−９培地の処方は次の通りである。 水１リットル（ｐＨ ７．２）中に、 クエン酸アンモニウム ０．９％（ｗ／ｖ） Ａｒｄａｍｉｎｅ ｐＨ ０．１２％（ｗ／ｖ） セレロース １．２％（ｗ／ｖ） Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ ４．０％（ｗ／ｖ） ラクトース ２４．５％（ｗ／ｖ） Ｐ ２０００ ０．２％（ｖ／ｖ） ３０度の角度を使用しないこと以外は、種培養のインキュベーションと同様に した。１２日間の発酵の後に、ロバスタチン生産状況を観察した。 形質転換又はＤＮＡ調製のための栄養菌糸体を形成するためには、ＣＭ培地中 でのＡ．ｔｅｒｒｅｕｓの１段階発酵を使用した。１×１０⁸個の分生胞子を２ ５０ｍｌフラスコ内のＣＭ培地５０ｍｌ中に接種することによって、発酵を開始 させた。 完全培地（ＣＭ）の処方は次の通りである。 水１リットル中に、 Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ塩 ５０ｍｌ Ｖｏｇｅｌ微量元素 ２．０ｍｌ トリプトン ０．５％（ｗ／ｖ） 酵母抽出物 ０．５％（ｗ／ｖ） グルコース １．０％（ｗ／ｖ） Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ塩の処方は次の通りである。 Ｎａ₂ＮＯ₃ １２．０％（ｗ／ｖ） ＫＣｌ １．０２％（ｗ／ｖ） ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０４％（ｗ／ｖ） ＫＨ₂ＰＯ₄ ３．０４％（ｗ／ｖ） Ｖｏｇｅｌ微量元素の処方は次の通りである。 ＺｎＣｌ₂ ０．００４％（ｗ／ｖ） ＦｅＣｌ₃ ０．０２％（ｗ／ｖ） ＣｕＣｌ₂ ０．００１％（ｗ／ｖ） ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ ０．００１％（ｗ／ｖ） ＮａＢ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏ ０．００１％（ｗ／ｖ） （ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・７Ｈ₂Ｏ ０．００１％（ｗ／ｖ）実施例３ ベクターｐＬＯ９の作製 ｐＬＯ９は、コスミドライブラリーの構築と真菌類の形質転換の両方に適する ように作製した５．６ｋｂベクターである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒ ｅｕｓ における優性選択に関しては、ｐＬＯ９は、Ａ．ｎｉｇｅｒ β−チュー ブリンプロモーターによって推進され、且つＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ ターミネーター配列によって終止される、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌ ｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓフレオマイシン耐性遺伝子を含む 。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける選択に関しては、 上記ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、λパッケージングに関しては 、上記ベクターは、λｃｏｓ部位を含む。ｐＬＯ９の構築は下記で説明する。 プレオマイシン耐性マーカーはＳ．ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓから得られ、終止 配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＣＹＣ１遺伝子から得られた。制限酵素 ＢａｍＨＩとＢｇｌIIでｐＵＴ７１３（ＣＡＹＬＡ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ Ｃｅｄ ｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を消化して、ｐＵＴ７１３由来の１つのＤＮＡフラグメン ト上にある両配列を単離した。この単離したフラグメントをＢａｍＨＩで消化し たｐＵＣ１８の中にクローニングし、ベクターｐＬＯ１を作製した。Ａ．ｎｉｇ ｅｒ ＡＴＣＣ １０１５からのβ−チューブリン遺伝子のゲノムコピーを、ｐ ＵＣ８内の４．３ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングし、ｐ３５ −Ｃ−１４を作製した。幾つかの修飾をゲノム配列に対して行った。即ち、Ｅｃ ｏＲＩ部位を、インビトロ突然変異誘発によって開始ＡＴＧに導入した。エキソ ヌクレアーゼによる消化と、Ｋｌｅｎｏｗ酵素による修飾と、再連結反応とによ って、上記プロモーター内のＨｉｎｄIII部位を取り除いた。最後に、ＥｃｏＲ Ｉによる消化と、Ｋｌｅｎｏｗ酵素 による修飾と、リガーゼを用いた再連結反応によるＰｓｔＩリンカーの付加とに よって、上流のＥｃｏＲＩ部位をＰｓｔＩ部位に変換した。その後、ｐＣ１５− １を作製するために、β−チューブリンプロモーターを、ｐＵＣ８のＰｓｔＩ− ＥｃｏＲＩフラグメントにサブクローニングした。ＥｃｏＲＩによる消化と、Ｋ ｌｅｎｏｗ酵素による修飾と、ＸｂａＩリンカーの添加と、再連結反応とによっ て、ＸｂａＩ部位を導入した。得られたベクターをｐＴＬ１１３と名付けた。Ｐ ｓｔＩとＸｂａＩとによってｐＴＬ１１３を切断し、単離したプロモーターセグ メントをｐＬＯ１のＰｓｔＩ部位とＸｂａＩ部位との中にクローニングすること によって、β−チューブリンプロモーターをフレオマイシン遺伝子の上流にクロ ーニングし、ｐＬＯ３を作製した。修飾反応とブラントエンド連結反応とによっ て、ＢｇｌII部位を取り除き、ｐＣＳ１２ベクターを作製した。β−チューブリ ンプロモーターとフレオマイシン耐性遺伝子とターミネーター配列とを含むＰｓ ｔＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを、ｐＵＣ８ベクターの中にクローニングし、 ｐＬＯ６を作製した。ＡＴＧにおけるＸｂａＩ部位を、修飾及び連結反応とによ って取り除き、ｐＬＯ７を得た。ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIIIを、１つ のフラグメントとして、ＸｍａＩ部位が修飾されてＢｇｌIIリンカーで置き換え られているｐＵＣ１８骨格の中に移した。その結果得たベクターをｐＬＯ８と名 付けた。ｐＪＬ２１からのλｃｏｓ部位を含むＰｓｔＩフラグメントを上記ベク ター内に挿入し、ｐＬＯ９を作製した。実施例４ ゲノムＤＮＡの単離 栄養菌糸体を２８℃において２２０ｒｐｍで４８時間、ＣＭ培地中で発生させ た。菌糸体を寒冷紗で濾過することによって回収し、一晩液体窒素中で冷凍し、 凍結乾燥させた。凍結乾燥した菌糸体を、乳鉢と乳棒とを使用して砂で粉砕し、 ５ｍｌのＢｒｅａｋｉｎｇ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１％ ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ 膵臓ＲＮａ ｓｅ、５０μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）中に懸濁した。この混合物を、１２ ５ｍｌフラスコに移し、等容のＴｒｉｓ−飽和フェノール／クロロホルム（５０ ：５０）を加えた。このフラスコを、３７℃において２００ｒｐｍで１時間、振 とうした。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、水性層を取り除いた。そ の水性層をフェノール／クロ ロホルムでさらに２回抽出し、最後に、クロロホルムで１回抽出した。０．１容 の３Ｍ ＮａＣｌと２．５容のエタノールとを加えて、ＤＮＡを水性層から沈殿 させ、−７０℃で１０分間冷凍した。１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈 殿ＤＮＡを収集した。ペレット化したＤＮＡを乾燥し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌと１ｍＭ ＥＤＴＡとを含む溶液（ｐＨ ７．５）中に再懸濁した。波長２ ６０ｎｍにおける吸光度の測定により、ＤＮＡ濃度を定量した。実施例５ Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓライブラリーの構築 Ａ ．ゲノムフラグメントの調製 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓゲノムＤＮＡを上記のように単離した。上記ベクター内に 挿入するための大型ランダムＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｓａｕ３Ａで１０ μｇのＤＮＡを部分消化することによって単離した。その消化ＤＮＡを１．０％ アガロースゲル上で電気泳動した。ゲノムライブラリー用に、９−２３ｋｂサイ ズのフラグメントを含む領域をゲルから切断した。コスミドライブラリー用には 、３０−６０ｋｂサイズのフラグメントを含む別のゲルセグメントを切断した。 上記ゲルスライス 中に含まれた大型染色体ＤＮＡフラグメントを電気溶出した。そのＤＮＡを、０ ．１容の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２．５容のエタノールとを加えて濃縮し、−７ ０℃で１５分間冷凍し、１０分間１０，０００ｒｐｍで遠心し、ＤＮＡを沈殿さ せた。Ｂ ．Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓコスミドライブラリーの作製 λパッケージングに必要な２本のアームとｃｏｓ部位とを供給するために、ｐ ＬＯ９コスミドＤＮＡを使用した。パッケージング反応のために２個のフラグメ ントをｐＬＯ９から単離した。 ＸｂａＩでｐＬＯ９を消化し、ＨＫホスファターゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で加水分解し、ＢｇｌIIで消化し、１％アガロースゲ ル上で電気溶出し、０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエタノールとを 加えて濃縮し、−７０℃で１５分間冷凍し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心 してＤＮＡを沈殿させることによって、フラグメント１を単離した。 ＳｍａＩでｐＬＯ９を消化し、ＨＫホスファターゼで加水分解し、ＢｇｌIIで 消化することによって、フラグメント２を単離した。フラグメント２を、フラグ メント１に関して説明した 手順を用いて単離した。フラグメント１と、フラグメント２と、単離Ａ．ｔｅｒ ｒｅｕｓ インサートＤＮＡとを、各ＤＮＡ濃度０．５μｇで１：１：２の比率で 連結した。Ｃ ．λファージ内へのパッケージングと平板培養 連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＨＢ２６８８（Ａｍｅｒｓｈａｍ）抽出物Ａ １０μｌとＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＨＢ２６９０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）抽出物Ｂ １５μｌと共に混合することによって、λファージ内へのパッケージングを行っ た。パッケージング混合物を２２℃で１２０分間インキュベートした。その後、 ５００μｌのＳＭ（０．５８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．２０％（ｗ／ｖ）Ｍｇ ＳＯ₄、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチ ン）と、１０μｌのクロロホルムを、パッケージング混合物に加えた。 ＬＢ＋マルトース培地中において波長６００ｎｍで１．０の光学密度に細胞を 成長させ、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５をトランスフェクション用に調製した。ＬＢ ＋マルトース培地は、１．０％（ｗ／ｖ）バクトトリプシン、０．５％（ｗ／ｖ ）バクト酵母抽出物、１．０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（ｐＨ ７．５）から構成さ れ、高圧滅菌後に０．２％（ｖ／ｖ）マルトースを 加えた。 細胞を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄中に再懸濁 した。５０μｌの上記パッケージング混合物を２００μｌの再懸濁ＤＨ５細胞に 加え、３７℃で３０分間インキュベートした。５００μｌのＬＢ培地アリコート を加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。細胞混合物を、１００ μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗布し、 ３７℃でインキュベートした。合計１０，０００個の集落を、このライブラリー によって作製した。Ｄ ．Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓゲノムライブラリーの構築 λ置換ベクターであるＥＭＢＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ゲノムライブラリー の作製のために使用した。このベクターを、ゲノムインサートによる連結反応に 直ちに使用できるよう予備消化したアームとして購入した。２本のアームを１： １：２の比率で９−２３ｋｂ ゲノムインサートに連結反応させ、λファージ内 にパッケージングし、上記の通りに、選択したプローブとのハイブリッド形成の ために平板培養した。実施例６ Ｅ．ｃｏｌｉからのコスミドＤＮＡの単離 Ｅ．ｃｏｌｉ内のＡ．ｔｅｒｒｅｕｓコスミドライブラリーを、１００μｇ／ ｍｌのアンピシリンを補足したＬＢ寒天２００ｍｌを収容した２５ｃｍ×２５ｃ ｍプレート上で成長させた。ほぼ全面に分布した集落を上記プレートから擦り取 り、１０ｍｌの冷ＴＳ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、１０％（ｗ ／ｖ）スクロース）中に入れた。０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）中に１ ０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む２．０ｍｌアリコートを加え、更に、０．２５ Ｍ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）８ｍｌを加えた。混合物を数回に亙っ て反転させ、氷上で１０分間インキュベートした。１０％ ＳＤＳ溶液の４ｍｌ アリコートを、ガラス棒で静かに攪拌しながら、ゆっくりと加えた。次に、６． ０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを、ガラス棒で攪拌しながら、ゆっくりと加えた。細胞 リゼイトを氷上で１時間インキュベートした後、遠心した。上清を保存し、等容 のＴｒｉｓ−飽和フェノール／クロロホルム（５０：５０）で２回抽出した。２ 容のエタノールを加え、−７０℃で１５分間冷凍し、３，０００ ｒｐｍで１５分間遠心することによって、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したコスミ ドＤＮＡを乾燥し、９ｍｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。 １０ｇｍのＣｓＣｌ₂をＤＮＡ懸濁液中に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌ 臭化エチ ジウム２５０μｌを加えることによって、コスミドＤＮＡを塩化セシウム密度勾 配精製用に調製した。コスミドＤＮＡを、Ｔｉ８６５．１ Ｓｏｒｖａｌｌｒｏ ｔｏｒ内で５５，０００ｒｐｍで２０時間遠心し、帯遠心分離した。コスミドＤ ＮＡを示すＤＮＡバンドを勾配から回収し、臭化エチジウムを水−飽和ブタノー ルで抽出することによって除去した。３容の水と１０容のエタノールとを加え、 ３０分間氷上でインキュベートし、遠心することによって、コスミドＤＮＡを沈 殿させた。ＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、０．１容の３Ｍ酢酸ナ トリウムと２．５容のエタノールを加えてＤＮＡを再沈殿させた。ＤＮＡを−７ ０℃で１０分間凍結させ、遠心し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。 そのＤＮＡ懸濁液を、ｐＬＯ９ ＤＮＡによる汚染を除去するために０．５％ 低温溶融アガロース（ＢｉｏＲａｄ）ゲルを 通して電気泳動した。インサートの入ったコスミドＤＮＡを含むバンドを、上記 ゲルから切断し、２容のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡと共に６５℃に加熱した。溶融アガ ロースをＴｒｉｓ飽和フェノールで３回抽出し、クロロホルムで１回抽出した。 ０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエタノールを加え、１５分間−７０ ℃で冷凍し、１５分間１０，０００ｒｐｍで遠心することによって、コスミドラ イブラリーＤＮＡを沈殿させた。そのＤＮＡを乾燥し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中に 再懸濁させた。２６０ｎｍにおける光学密度を定量することによってＤＮＡの濃 度を確認した。実施例７ Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓの形質転換 ２５０ｍｌ 三角フラスコ内のＣＭ培地５０ｍｌの中に１×１０⁸個の分生子 柄を接種することによって、培養を成長させた。２８℃において２００ｒｐｍで ２４時間から３０時間、培養を成長させた。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通して重力濾 過することによって菌糸体を収集した。菌糸体（４ｇ）を、ＫＭＰ １００ｍｌ を含む５００ｍｌ三角フラスコに移した。ＫＭＰは、 ７００ｍＭ ＫＣｌ、８００ｍＭ マンニトール、及び、２０ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄ から成り、ｐＨは６．３だった。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ からの溶菌酵素（１００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を加えた。２８℃において１８時間 １００ｒｐｍでフラスコを振とうした。 Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通して重力濾過することによってスフェロプラストを収 集した。濾液を５０ｍｌ円錐遠心チューブ中に集め、遠心によって濃縮し、スフ ェロプラスト化細胞をＫＣＭ溶液１５ｍｌ中に再懸濁させることによって洗浄し た。ＫＣＭは、７００ｍＭ ＫＣｌと１０ｍＭ ＭＯＰＳから成り、ｐＨを５． ８に調整されている。洗浄を２回繰り返した。洗浄したスフェロプラストを５× １０⁷個／ｍｌの濃度でＫＣＭＣ中に再懸濁させた。ＫＣＭＣは、５％ １Ｍ ＣａＣｌ₂と、９５％ ＫＣＭとで構成されている。 各々の形質転換のために、５μｇのＤＮＡのサンプルをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ中 で２０μｌの体積にし、ＫＣＭＣ ６．５μｌ中の５単位のヘパリンを加えた。 次に、スフェロプラスト懸濁液の２００μｌアリコートを、ＤＮＡを含む溶液に 加えた。 最後に、１Ｍ ＣａＣｌ₂ ５％とＰＣＭＣ（４０％ ＰＥＧ ８０００、１０ ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ ５．８、０．０５Ｍ ＣａＣｌ₂）９５％とを含む溶液 のアリコート５０μｌを加えた。その混合物を氷上で３０分間インキュベートし た。 ＫＣＭＣ溶液のアリコート（６００μｌ）を４５℃の平衡ＭＡ溶液に加えた。 ＭＡは、５％（ｖ／ｖ）Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ塩、０．５％（ｗ／ｖ）トリプ トン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１．０％（ｗ／ｖ）グルコース、２３． ４％（ｗ／ｖ）マンニトール、及び、３％寒天で構成されている。この懸濁液を 、予め重量を計量した５枚のペトリ皿の上に分配し、２８℃で４時間インキュベ ートした。各ペトリ皿の中の寒天の重量を計量し、等量のオーバーレイ（ＯＬ） を各ペトリ皿に加ペた。このＯＬは、１％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｗ／ｖ） 寒天、及び、１００μｇ／ｍｌから１５０μｇ／ｍｌのフレオマイシン（菌株Ａ ＴＣＣ ２０５４２）から構成されていた。ペトリ皿を７日間から１０日間温度 ２８℃且つ湿度６５％でインキュベートし、その後、形質転換した集落を回収し た。実施例８ Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓからのコスミドＤＮＡのレスキュー 染色体ＤＮＡを単離し、λファージ粒子内にパッケージングすることによって 、形質転換コスミドＤＮＡをＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ形質転換細胞からレスキュー（ ｒｅｓｃｕｅ）した。ゲノムＤＮＡの単離とλファージ内へのパッケージングを 、上記の通りに行った。実施例９ ロバスタチンの検出 ２容の試薬アルコールを発酵フラスコに加え、そのフラスコを温度２８℃にお いて２２０ｒｐｍで１５分間振とうすることによって、発酵抽出物を調製した。 １５分間内容物が沈殿するままにし、液体１ｍｌを取り除いた。サンプルをメタ ノール中に１／２０に希釈し、濾過し、ＨＰＬＣで分析した。８ｍｍ×１０ｃｍ のＣ１８ ４μｍ Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａｐａｋカラムを使用したＷａｔｅｒ ｓ ＨＰＬＣで、ロバスタチンを検出した。移動相は、Ａ（トリフルオロ酢酸０ ．０２％を含むアセトニトリル）と、Ｂ（トリフルオロ酢酸０．０２％を含む蒸 留水）であった。勾配を１．５ｍｌ／分の速度で流した。 初期条件はＡが３５％でＢが６５％であり、サンプル注入後１分間、この条件を 維持した。３分間かけて勾配をＡが６５％でＢが３５％となるように形成し、３ ．６分間維持した。ロバスタチンアンモニウム塩を２３９ｎｍで検出した。実施例１０ ＤＮＡのサザン分析 ＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ及び０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）中の１． ０％アガロースゲル上で、５μｇの消化ＤＮＡを電気泳動することによって、サ ザン分析を行った。上記ゲルを３０分間溶液Ａ（１．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．５ Ｍ ＮａＯＨ）中に漬けることによって、上記ゲル中のＤＮＡを変性した。その 後ゲルを３０分間溶液Ｂ（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ及び１．５Ｍ ＮａＣｌ）中で中 和した。１０×ＳＣＣ溶液で一晩ブロッティングすることによって、ＤＮＡをニ トロセルロース膜又はナイロン膜に移した。このＳＣＣは、８．７５％（ｗ／ｖ ）ＮａＣｌと、４．４％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウムから構成され、ｐＨ７． ０だった。３０分間真空下で８０℃においてＤＮＡをニトロセルロース上に焼き 付けた。 標準的なハイブリッド形成条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ． ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９（Ｃｈｒｉｓ Ｎｏｌａｎ 編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）の説明の通りとした 。ハイブリッド形成のための膜を、ハイブリッド形成緩衝液（６×ＳＳＣ、５× Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０、５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性したフラグ メント化サケ精子ＤＮＡ、４０％ホルムアミドから構成）中で４２℃でインキュ ベートすることによって調製した。２時間インキュベートした後に、変性標識プ ローブを加え、更に一晩４２℃でインキュベートした。特に言及しない限り、フ ィルターは、室温で６×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中において２回１５分間ず つ洗浄し、その後、０．１×ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳ中において４２℃で２ 回３０分間ずつ洗浄した。シグナルを視覚化するためにフィルターをＸ線フィル ムに露出した。実施例１１ Ａ ．Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓからのトリオールポリケチドシンターゼの単離 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓの菌糸体をＧＰ−９培地中で成長させた。４８時間後に、 菌糸体を真空濾過によって収集し、冷水で洗浄 し、液体窒素中で冷凍して、凍結乾燥した。特に言及しない限り、その後に続く 精製ステップの全ては、氷上又は３℃で行った。 凍結乾燥した菌糸体（６ｇ）を、均質化緩衝液１３５ｍｌ中において、乳鉢と 乳棒とを使用して２０ｇのガラスビーズ（０．２ｍｍ）で粉砕することによって 均質化した。この均質化緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８）、１０％ グリセロール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ アスコルビン 酸、３．８μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１７．７μｇ／ｍｌ キモスタチン、２ ．０μｇ／ｍｌ ペプスタチン、４２μｇ／ｍｌ シチメンチョウトリプシン阻 害剤、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び、２．２％（乾燥ｗｔ／ｖ）水和ポリビニル ポリピロリドンによって構成されていた。ホモジネートを１０分間７，６５０× ｇで遠心し、上清を、緩衝液Ａ中で平衡化したＳＨ−アフィニティーカラム（Ａ ｆｆｉ−ｇｅｌ ５０１有機水銀アガロース、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１．５×８．０ ｃｍ）に３０ｍｌ／時間の割合で注入した。緩衝液Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ ｐＨ ８）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び、５ｍＭ アスコル ビン酸によって構成されていた。 そのカラムを２５ｍｌの緩衝液Ａ、及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含む７５ｍｌの緩 衝液Ａで洗浄した。５０ｍｌの緩衝液Ａで上記カラムを再び平衡化した後に、１ ００ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えた４０ｍｌの緩衝液Ａで結合タ ンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質フラクションを、４．２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ ペプスタチン、１８μｇ／ｍｌ キモスタチン 、及び、０．２ｍＭ ＰＭＳＦに入れ、１６時間１８０，０００×ｇで超遠心分 離することによってペレット化した。上清を捨て、ペレットを緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８）、５ｍＭ アスコルビン酸、１ｍＭ ＤＴＴ、及び、１ ｍＭ ＥＤＴＡで構成）で洗浄した。洗浄したペレットを、２ｍｌの緩衝液（４ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ６．８）、２０ｍＭ ＤＴＴ、及び、２％ ＳＤＳで 構成）中に再懸濁させ、１０分間９０℃に加熱し、氷上に置いた。 再懸濁させたペレットの２５０μｌアリコートを、等容のサンプル緩衝液（１ ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ６．８）、２０％ グリセロール、０．００５％（ ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、及び１．５Ｍ βメ ルカプトエタノールで構成）と組み合わせ、１０分間９５℃に加熱 した。Ｌａｅｍｍｅｌｉ電極緩衝液系（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリ シン、及び、０．１％ ＳＤＳ）を使用して、調製用１．５ｍｍ、４％アクリル アミドＳＤＳプレキャストゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で、サンプルを２時間１４５Ｖ で電気泳動した。予め染色した２００ｋＤ基準標準が上記ゲルの底から１．４ｃ ｍに達した時に、電気泳動を終止した。 タンパク質を次のように視覚化した。ゲルを蒸留Ｈ₂Ｏ中で５秒間洗浄し、振 とうしながら０．２Ｍ イミダゾール中で１０分間すすぎ、５分間振とうしなが ら０．３Ｍ 酢酸亜鉛溶液中に移した。その後ゲルを水中ですすいだ。見掛け分 子量２３５ｋＤで移動したＴＰＫＳは、０．５３の（ゲル底部に対しての）相対 移動度位置に局在した。そのＴＰＫＳタンパク質は、ゲル上で大部分を占めるタ ンパク質であり、より低いＲ_fを有する有意なタンパク質バンドは存在しなかっ た。見掛け分子量が２３５ｋＤのタンパク質バンドをゲルから切除し、約５分間 、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ及び０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ ９．５）中で脱色し た。 脱色ゲルスライスを２枚のガラス板の間で押しつぶし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、ｐＨ ８．０を５ｍｌ含む５０ｍｌチューブの中に入れた。このチューブを３７℃で ４８時間回転振とう機上で振とうした。ゲルフラグメントを遠心して取り除き、 溶出タンパク質を含む上清を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０ 小型濃縮器（Ａｍｉ ｃｏｎ）で１００μｌに濃縮した。Ｂ ．分子量の測定 ゲル精製タンパク質をＬａｅｍｍｌｉロード緩衝液中に再懸濁させ、５分間９ ５℃に加熱し、Ｌａｅｍｍｌｉ電極緩衝系中の４→１５％勾配ＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ Ｒｅａｄｙ−Ｇｅｌ）上で電気泳動した。染色後 に、分子量標準タンパク質と比較することによって、タンパク質の分子量を測定 した。Ｃ ．抗体の作製 タンパク質をアクリルアミドゲルマトリックスから電気溶出させなかったこと を除いて、上記説明の通りに、ＴＰＫＳタンパク質を、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ によって調製した。脱色の後に、ゲルスライスを２枚のガラス板の間で押しつぶ し、最初に、１８ゲージ注射針の中を通し、その後２５ゲージ注射針の中を通し た。２５ゲージ針を通した溶出液の０．５ｍｌアリコ ートを、等容のフロインド完全アジュバントと混合し、１匹の雄ニュージーラン ド白ウサギの体の５つの部位に皮内注射した。２１日目と４２日目に、上記の通 りに調製したタンパク質を使用して追加免疫した。最後の免疫から１０日後に、 ウサギを瀉血し、抗血清を集めた。Ｄ ．抗体のアフィニティー精製 アフィニティー精製した抗体を、調製用ＳＤＳポリアクリルアミドゲルからの トランスファーによってＴＰＫＳタンパク質をＰＶＤＦ膜に固定化した。そのＴ ＰＫＳを視覚化し、上記膜のＴＰＫＳ区域を切り出した。１時間ＴＴＢＳ中の５ ％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳の中でブロッキングした後に、上記膜をＴＴＢＳ中で５ 分間ずつ３回洗浄した。抗血清の２ｍｌアリコートを、１％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂 乳を加えたＴＴＢＳで１：１に希釈し、５時間固定化した抗原と共にインキュベ ートした。上記膜をＴＴＢＳで４回洗浄し（１回の洗浄につき１０分間）、結合 抗体を０．１Ｍ グリセリン２ｍｌで溶出させた（ｐＨ ２．８）。溶出した抗 体を、５０μｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ９．５）で中和し、２０倍に濃縮 した。Ｅ ．ウエスタンブロット分析 精製ＴＰＫＳタンパク質と、有機水銀溶出液の部分精製タンパク質試料とを、 ４％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＯＶＥＸ、プレキャスト１．０ｍｍ厚 ガラス）によって分割し、２時間２４０ｍＡで、Ｔｏｗｂｉｎトランスファー緩 衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン（ｐＨ ８．３）、２０％ メタノール、及び、０．０５％ ＳＤＳ）中のニトロセルロースにトランスファ ーした。以後のステップ全ては、振とうしながら室温で行った。 ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ）中で１ 分間ニトロセルロースブロットをすすぎ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＴ ＢＳ）と５％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳とを加えたＴＢＳ中で２時間ブロッキングし た。そのブロットを、１次抗体（１％（ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳を含むＴＴＢＳ中の ウサギ抗血清の１：１０００希釈液）を使用して１６時間インキュベートした。 そのブロットを５分間ずつ３回ＴＴＢＳ中で洗浄した。そのブロットを、１％（ ｗ／ｖ）乾燥脱脂乳を含むＴＴＢＳ中で２時間２次抗体（ヤギ抗ウサギアルカリ 性ホスファターゼ接合体の１：１０００希釈液）とインキ ュベートした。ＴＴＢＳ中で４回洗浄した後に（洗浄１回につき１０分間）、６ ６ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ９．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、及び、５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（１１５μｇ ／ｍｌ）とニトロブルーテトラゾリウム（３３０μｇ／ｍｌ）を使用して発色さ せた。実施例１２ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＲＮＡの単離 Ａ ．全ＲＮＡの単離 ２２０ｒｐｍで動作する回転振とう機を用いてＡ．ｔｅｒｒｅｕｓを４８時間 ２８℃において２５ｍｌのＧＰ−９発酵培地中で成長させた。菌糸体をＭｉｒａ ｃｌｏｔｈと寒冷紗を通して真空濾過することによって回収し、約１００ｍｌの 蒸留水で洗浄した。菌糸体をフィルターから擦り取り、プラスチックビーカー内 に入れ、液体窒素で凍結させた。使用の必要が生じるまで、凍結菌糸体を−８０ ℃で保存した。 凍結菌糸体の重量を測り、液体窒素で冷やした乳鉢内に入れた。約２ｇの２ｍ ｍガラスビーズを加え、混合物を乳棒で微粉末に粉砕した。菌糸体を常に凍結状 態に保つために、液体 窒素を必要に応じて加えた。約２．５ｍｌ／ｇのブレーキング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び 、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで構成）と、等容のＴｒｉｓ−飽和フェノール：クロロ ホルム：イソアミルアルコール（５０：５０：１）と、バナジルリボヌクレオシ ド複合体（ＢＲＬ）とを収容したフラスコに、粉砕した菌糸体を約２ｍＭの最終 濃度になるように加えた。混合物を３７℃で２０分間回転振とう機上でインキュ ベートし、４℃で１０分間１２０００×ｇで遠心した。水性層を取り除き、等容 のＴｒｉｓ−飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：５ ０：１）で抽出した。第２の抽出を１Ｍ Ｔｒｉｓ−飽和フェノール：クロロホ ルム（５０：５０）で、第３の抽出をクロロホルムで行った。最終の水性層を等 容の６Ｍ ＬｉＣｌと混合し、−２０℃で４時間以上静置した。４℃において２ ０分間１２，０００×ｇで沈殿物をペレット化し、０．１％ピロ炭酸ジエチル（ ＤＥＰＣ）で処理した水０．６ｍｌ中に再懸濁させた。全ＲＮＡを、０．１容の 酢酸ナトリウムと２．５容のエタノールとで再沈殿させた。最終的に得たペレッ トを、０．１％ ＤＥＰＣで処理した水０．３ｍｌの中に 溶解した。Ｂ ．ポリアデニル化ＲＮＡの単離 ０．２ｍｌから０．１ｍｌの水の中で約５００μｇの全ＲＮＡを５分間６５℃ に加熱し、氷上で冷却し、１０×サンプル緩衝液（０．１％ＤＥＰＣ処理水中の １０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び、５Ｍ ＮａＣ ｌで構成）１×の最終濃度になるように加えた。処理したサンプルを、製造者（ Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｋ^TM ｍＲＮＡ精製キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指 示に従って調製したオリゴ（ｄＴ）セルロースのカラムに注入した。そのカラム を高塩濃度緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 及び、０．５Ｍ ＮａＣｌ）で２回洗浄し、低塩濃度緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び、０．１Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗 浄した。６５℃に加熱しておいた溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７． ５）、及び、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の４×２００μｌアリコートで、ポリＡ ｍＲ ＮＡをカラムから溶出させた。２６０ｎｍにおける吸光度を使用して分光光度法 でＲＮＡ濃度を測定した。実施例１３ λｇｔ−１１ ｃＤＮＡライブラリーの構築 オリゴ（ｄＴ）カラム上で２回精製してある４〜５μｇのポリアデニル化ＲＮ Ａを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡの作製と、アダプタ ーの付加と、［³²Ｐ］ｄＣＴＰ以外のλｇｔ−１１アームの連結反応とのための 試薬を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^TM Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＬ）に よって得、これらの試薬を製造者の指示に従って使用した。 ０．０５μｇのランダム６量体及び０．５μｇのオリゴ（ｄＴ）_12-18、又は 、１μｇのオリゴ（ｄＴ）_12-18単独のどちらかを使用して、第１の鎖の合成を 開始させた。この反応を２０μｌの最終体積（最終組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ ｐＨ ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、 ５００μＭ ｄＡＴＰ、５００μＭ ｄＣＴＰ、５００μＭ ｄＧＴＰ、５００ μＭ ｄＴＴＰ、プライマー、ｍＲＮＡ、１０μＣｉ［³²Ｐ］ｄＣＴＰ、及び、 ２００Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^TM逆転写酵素／μｇ ｍＲＮＡ）で行った。 反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後氷上 に置いた。 第２の鎖の合成を、第１の鎖の反応混合物１８μｌを使用して１５０μｌの最 終体積中で行った。反応混合物の最終組成は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７． ５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０ ．１５ｍＭ Ｂ−ＮＡＤ＋、２５０μＭ ｄＡＴＰ、２５０μＭｄＣＴＰ、２５ ０μＭ ｄＧＴＰ、２５０μＭ ｄＴＴＰ、１．２ｍＭ ＤＴＴ、６５Ｕ／ｍｌ ＤＮＡリガーゼ、２５０Ｕ／ｍｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び、１３Ｕ／ｍ ｌ ＲＮａｓｅ Ｈであった。この反応混合物を２時間１６℃でインキュベート し、１０ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、更に５分間インキュベーション を１６℃で続けた。反応混合物を氷上に置き、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを 加えることによって反応を停止させた。その混合物を１５０μｌのＴｒｉｓ−飽 和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出 した。水性層を取り除き、０．５容の７．５Ｍ 酢酸アンモニウムと３．５容の エタノールとでｃＤＮＡを沈殿させた。そのｃＤＮＡペレットを７０％エタノー ルで洗浄した。６６ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 １ｍＭ ＡＴＰ、１４ｍＭ ＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌ ＥｃｏＲＩ（ＮｏｔＩ ）アダプター、及び、１００Ｕ／ｍｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼから構成された反 応混合物中で、ＥｃｏＲＩ（ＮｏｔＩ）アダプターを上記ｃＤＮＡと連結反応さ せた。反応混合物を１６時間１６℃でインキュベートし、７０℃に加熱し、氷上 に置いた。３０ＵのＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼを反応混合物に加え、３７ ℃で３０分間インキュベートすることによって、受容（ａｄａｐｔｅｄ）ｃＤＮ Ａをリン酸化した。１０分間７０℃に加熱してキナーゼを不活化した。反応が完 了した反応物を９７μｌのＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５） 、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び、２５ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈し、製造者（ＢＲ Ｌ）の指示に従って調製したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）ＤＮＡサイジング カラム上に加えた。そのＤＮＡをＴＥＮ緩衝液で溶出し、フラクションを収集し た。各フラクション毎にＣｅｒｅｎｋｏｖカウントを得、ｃＤＮＡ／フラクショ ンの量を計算した。５０ｎｇ ｃＤＮＡのが集まるまで、溶出の順にカラムフラ クションをプールした。このプールしたフラクションを、５μｌの酵母ｔＲＮＡ と０．５容の７．５Ｍ 酢酸アンモニウムと２容のエタ ノール（−２０℃）とによって沈殿させた。その結果得たペレットを７０％エタ ノールで洗浄し、乾燥し、λｇｔ−１１アームと連結した。連結反応物の最終組 成は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＡＴＰ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１ｍＭ ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ λベクターＥｃｏＲＩアーム、１０μｇ／ｍｌ ｃＤＮＡ、及び、２００Ｕ／ｍ ｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼであった。混合物を室温で３時間インキュベートした 。ｃＤＮＡ／λｇｔ−１１連結反応物を、上記のように感染性λファージ粒子内 にパッケージングした。実施例１４ Ａ ．λｇｔ−１１ライブラリーの抗体スクリーニング Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｙ１０９０を、λファージ感染用の宿主として使用し、１％ （ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ ａＣｌ、及び、１．５％寒天から成るＬＢ／アンピシリンプレート上に保持し、 高圧滅菌前にｐＨを７．５に調節し、高圧滅菌後に１００μｇ／ｍｌのアンピシ リンを加えた。１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、０ ．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、及び、 ０．２％（ｗ／ｖ）マルトースから成るＬＢ／マルトースブイヨン３ｍｌ中で３ ７℃で回転振とう機上で一晩単集落をインキュベートすることによって、ファー ジ感染のために培養を成長させた。Ｂ ．抗血清の前処理 Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質に対する交差反応を低減させるように、スクリーニン グ前にＥ．ｃｏｌｉリゼイトで抗血清を処理した。Ｅ．ｃｏｌｉリゼイトを、２ ２０ｒｐｍの回転振とう機上で３７℃でＬＢブイヨン中で一晩成長させたＹ１０ ９０細胞から調製した。４℃で１０，０００×ｇで遠心することによって細胞を ペレット化し、３ｍｌのリゼイト緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０） 、及び、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。細胞をドライアイス／エタノ ール浴中で凍結させ、室温で解凍した。凍結／解凍プロセスを反復した。懸濁液 を、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を使用し、定動作周期、出力コ ントロール４で、１０秒間ずつ５回超音波処理した。各パルスの後で細胞を氷上 に１０秒間置いた。リゼイト中のタンパク質濃度を、製造者の指示に従ってＢｒ ａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して評価した。使 用が必要となるまで、超音波処理したリゼイトを−２０℃で保存した。抗血清を 、１％（ｗ／ｖ）乾燥乳を加えたＴＢＳＴで１０倍に希釈し、１／２０容のＥ． ｃｏｌｉリゼイトと混合した。この溶液を回転振とう機上で２時間室温でインキ ュベートした。Ｃ ．λｇｔ−１１ファージプラークのスクリーニング １００μｌのＳＭ中で６×１０³ｐｆｕに希釈した組換えファージを、一晩培 養したＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０培養６００μｌに加え、３０分間３７℃で吸収 させた。細胞をＬＢ Ｔｏｐアガロース／ＭｇＳＯ₄（０．１％（ｗ／ｖ）トリ プトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、及び、 １０ｍＭ ＭｇＳＯ₄）の４７℃溶液７．５ｍｌに加え、１４０ｍｍＬＢ寒天プ レートに載せた。小さいプラークが目に見えるまで、そのプレートを４２℃で約 ５時間インキュベートした。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシド）の１０ｍＭ 溶液で飽和させた１３７ｍｍのニトロセルロースフィル ターをプレート上に重ね、空気乾燥した。プレートのインキュベーションを一晩 ３７℃で続けた。フィルターを取り除き、１５分間ずつ３回洗浄した。洗浄は全 て室温で回転 振とう機上で行った。室温において回転振とう機上で３０分間、５％（ｗ／ｖ） 乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｉｎｓｔａｎｔ ｎｏｎ−ｆａｔ ｄｒｉｅｄ ｍｉｌｋ）を加えたＴＢＳＴ中で、フィルターをブロッキングした。フィルター を１５分間ずつ３回洗浄し、２時間、１％（ｗ／ｖ）乾燥乳を加えたＴＢＳＴ中 のヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ接合体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１ ：１０００希釈液で培養した。フィルターを１５分間ずつ３回洗浄し、ＮＢＴ（ ニトロブルーテトラゾリウム）を最終濃度０．３３ｍｇ／ｍｌに加え且つＢＣＩ Ｐ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート）を最終濃度０．１ ６５ｍｇ／ｍｌに加えたＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ９．５）、 １００ｍＭ ＮａＣｌ、及び、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で２−５分間発色させた 。フィルターを水で洗浄することによって色反応を停止させた。陽性プラークを 採取し、１０μｌのクロロホルムを加えた１ｍｌのＳＭに加え、使用が必要とな るまで４℃で保存した。 フィルター上の全てのプラークが陽性になるまで陽性プラークを更に精製した 。精製は、約１００ｐｆｕ／プレートに調整したファージで、１００ｍｍ ＬＢ ／寒天プレート上で行った。 １：１００に希釈したアフィニティー精製抗体でスクリーニングすることによっ て、陽性プラークを確認した。実施例１５ λＤＮＡの調製 ファージを、一晩培養したＥ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０培養１．５ｍｌに、３７ ℃において３０分間０．０１の感染多重度で吸収させ、３００ｍｌのＬＢ培地に 加えた。３７℃で回転振とう機上で６時間細胞を（細胞が破壊されるまで）イン キュベートした。溶菌を完了させるために、１ｍｌのクロロホルムを加えた。細 胞破片を４℃で１０分間に１０，０００×ｇで遠心することによってペレット化 した。使用が必要になるまで、リゼイトを４℃で保存した。 リゼイトを、３７℃で１時間ＤＮａｓｅＩ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）とＲＮａ ｓｅ Ｈ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）とで処理した。Ｓｏｒｖａｌｌ ＡＨ−６２ ９ローター中で２７，０００ｒｐｍで９０分間遠心することによってファージを ペレット化し、チューブを反転させて排出させた。ファージペレットを０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８）２００ｐｌ中に再懸濁させ、２０分間激しく振とうす ることによってＴｒｉｓ−飽和フェノ ール２００μｌで抽出した。混合物をミクロ遠心分離機で遠心し、水性層を保存 した。その水性層をフェノールで抽出し、クロロホルム２００μｌで２回抽出し た。ＤＮＡを、室温で、０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと６容のエタノールとで 沈殿させた。ＤＮＡをミクロ遠心分離機でペレット化し、７０％エタノールで洗 浄し、乾燥し、ＴＥ ｐＨ ８．０（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ） １００μｌ中に再懸濁させた。実施例１６ ＥＭＢＬ３ゲノムライブラリーのスクリーニング ³²Ｐ標識ＤＮＡプローブによるスクリーニングのためにＥＭＢＬ３ゲノムライ ブラリーを平板培養した。約１０，０００個のプラークを平板培養し、ハイブリ ッド形成のためにニトロセルロースにトランスファーした。２時間フィルターを 予備ハイブリッド形成させ、³²Ｐ−ｄＣＴＰ（Ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋ ｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で標識したＤＮＡプローブの存在下でハイブリッド 形成緩衝液中で一晩ハイブリッド形成させた。ＥＭＢＬ−１の選択のために、Ｄ ＮＡプローブは、２３５ｋＤタンパク質に対する抗体を使用して同定したλｇｔ −１１ ２−９のＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡインサートから構成さ れていた。サザンハイブリッド形成に使用するプロトコルを使用してフィルター を洗浄し、一晩フィルムに露出した後に、陽性プラークを同定した。陽性ＥＭＢ Ｌ−３ファージからのＤＮＡを上記の通りに調製した。実施例１７ シークエンシング方法と分析 トリオールＰＫＳ遺伝子を含む、ゲノムＥＭＢＬ−１クローンからの一連の重 複クローンを、Ｍ１３ｍｐ１８とＭ１３ｍｐ１９との中で作製した。これらのク ローンの中の幾つかのクローンの入れ子式削除（ｎｅｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏ ｎ）を、Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｉ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ） を使用して行った。一本鎖ＤＮＡを、２０％ポリエチレングリコール−２．５Ｍ ＮａＣｌを用いた沈殿によって精製し、フェノールで抽出し、エタノールで沈 殿させた。上記ＤＮＡの両方の鎖のヌクレオチド配列を、ＵＳＢ Ｓｅｑｕｅｎ ａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）を使 用して決定した。上記キットからの−４０シークエンシングプライマー、又は、 特別に合成したオリゴヌクレオチドを、反応開始のために使用した。ＧＣ圧縮を 含む領域を、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰを使用して再シークエンシングした。 シークエンシング反応物を、６％ポリアクリルアミド変性ゲル上で分離させた。 検証のために、３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ゲノムＭ１３クローンを再シークエ ンシングした。ｃＤＮＡの配列分析によってイントロン部分を同定した。ＧＰ９ 培地中で１６時間成長させた培養からＲＮＡを調製し、ＡＭＶ逆転写酵素を使用 してｃＤＮＡを合成した。特別に合成したオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲによる ｃＤＮＡの短い重複ストレレッチの増幅のために使用した。ＰＣＲ条件、試薬、 及び、産物精製は、ＰＣＲ／Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ＰＣＲ Ａｍｐｌ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ｍａｎｕａｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）におけるゲノムＤＮ ＡによるＰＣＲに関する説明の通りに行った。ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ ｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００を 使用して行った。ＰＣＲ産物をＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏ ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｍａｎｕａｌ（Ａｐｐｌｉｅ ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）における説明の通りにシークエンシング し、シークエンシング反応物を３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用し て分析した。全ての配列分析と演算を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ コンピュータ（Ａ ｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）上でＧｅ ｎｅＷｏｒｋｓ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ ，ＣＡ）を使用して行った。実施例１８ Ａ ．ｐＴＰＫＳ１００の構築 形質転換ベクターｐＴＰＫＳ１００は、トリオール構造のノナケチド骨格の合 成を生じさせるポリケチドシンターゼ遺伝子と、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓにおける選 択のためのフレオマイシン耐性遺伝子と、Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択のためのア ンピシリン耐性遺伝子とを含んでいた。 このベクターは、ｐＵＴ７１５ベクター（Ｃａｙｌａ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ Ｃ ｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）から構築し、この ｐＵＴ７１５ベクターは、Ｓ．ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓからのフレオマイシン耐 性マーカーと、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣｙｃ１遺伝子からの終止配列とを 含んでいた。ｐＵＴ７１５ベクターをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶとで消化した。β −チューブリン遺伝子プロモーターを、次のようにフレオマイシンマーカー遺伝 子の前部に挿入した。ＥｃｏＲＩによる消化と、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによ る修飾と、ＢｇｌII消化による上記ベクターからの上記フラグメントの放出とに よって、β−チューブリンプロモーターをｐＴＬ１１３から取り除いた。β−プ ロモーターをｐＵＴ７１５ベクター内に連結し、ｐＣＬＳ７を形成した。Ｎｄｅ ＩとＢｇｌIIによる消化と、部位修飾と、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔ ｒａｔｅｇｅｎｅ）のＳｍａＩ部位内への連結反応とによって、β−チューブリ ンプロモーターと、フレオマイシンマーカーと、Ｃｙｃ１ターミネーターをＰＣ ＬＳ７から取り除いた。このベクターをｐＬ０Ａと名付けた。 ポリケチドシンターゼ遺伝子を２段階のプロセスでｐＬ０Ａ内に挿入した。プ ロモーターとＰＫＳ遺伝子の５′末端を、ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと してＥＭＢＬ−１から得、 ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで消化しておいたｐＬ０Ａ内に連結させた。このベクター をＴＰＫＳ Ａと名付けた。ＥｃｏＲＩでＴＰＫＳを消化し、ＥＭＢＬ−１から 単離した３′ＥｃｏＲＩ遺伝子フラグメント内で連結反応させることによって、 ＰＫＳ遺伝子の３′末端を上記構造に加えた。その結果得たベクターをｐＴＰＫ Ｓ１００と名付けた。 ｐＴＰＫＳ１００でロバスタチン非生産菌株を形質転換すると、ロバスタチン 生産能が生じた。ＡＴＣＣ ２０５４２（ロバスタチン生産菌株）の形質転換は 、非形質転換細胞に比較してロバスタチン生産を増大させた。実施例１９ Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２０５４２の形質転換 ロバスタチン生産菌株におけるＰＫＳ遺伝子の複製数の増加がロバスタチンの 生産量の増加に反映したかどうかを確認するために、一連の実験をＡ．ｔｅｒｒ ｅｕｓ ＡＴＣＣ ２０５４２を使用して行った。ＡＴＣＣ ２０５４２を、ｐ ＴＰＫＳ−１００を用いて形質転換した。形質転換体がフレオマイシンマーカー を含むことを確認するために、形質転換体をＰＣＲで検査したが、真の形質転換 体だった。単一の胞子を単離した後に、形質転換体を発酵させ、ＨＰＬＣによっ てロバスタチン生 産を定量した。最高の結果を示す単離した単一胞子の場合（菌株３−１７−７♯ ７）、形質転換体の方がその親の場合よりも３２％大きかった。実施例２０ ＴＰＫＳタンパク質配列のキャラクタリゼーション 上記ＤＮＡ配列からのイントロンのスプライシングと、９１１４ヌクレオチド 開放読み枠の翻訳とによって、２６９，０９０ダルトンの分子量を有する３０３ ８アミノ酸残基のタンパク質を得た。ＴＰＫＳタンパク質の最終的なアミノ酸配 列を図２に示す。以下に論ずる特徴を、次の表に示すアミノ酸位置によって表す 。 ポリケチドシンターゼ活性と脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）活性とに関連してい ることが知られている活性部位の残基とパターンに関して、ＴＰＫＳアミノ酸配 列を調べることによって、推定される作用部位の同定を行った。これらの部位を 、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ社のＧｅｎｅＷｏｒｋｓプログラムを使用し てアミノ酸配列とアミノ酸相同性の検索を行うことによって同定した。上記タン パク質の開放読み枠と、アラインメントによって示されたＴＰＫＳペプチドとＰ ＫＳ活性とを部分配列分析することによって得られるＴＰＫＳペプチド配列の全 体的配置との説明図を、第４図に示している。ＦＡＳには存在しないメチルトラ ンスフェラーゼが存在することを除いて、ＴＰＫＳタンパク質上の一連の活性部 位は、ラットＦＡＳタンパク質に観察されるものと同一であった。各々の活性部 位として最適の候補を識別するために、ＴＰＫＳと、ラットＦＡＳと、Ｐｅｎｉ ｃｉｌｌｉｕｍ ｐａｔｕｌｉｎの６−メチルサリチル酸シンターゼ（６−ＭＳ ＡＳ）との領域上で行ったアラインメントも、第５、６図に示してある。実施例２１ ケトアシルシンターゼ領域の同定 大部分の５′部位は、縮合酵素としても知られるβ−ケトアシルシンターゼ（ ＫＡＳ）であった。この活性部位の中心には活性部位システインがあり、入来（ ｉｎｃｏｍｉｎｇ）アシルユニットの侵入と縮合との前にアシル鎖がこの活性部 位システインに付着させられる。ケトアシルシンターゼアラインメント図に示す 領域は、ラットＦＡＳ配列と６−ＭＳＡＳ配列の両方と比較した場合に３０％の 相同性を有した。しかし、ＴＰＫＳ ＫＡＳ領域は、ラットＦＡＳ配列に最も類 似しており、この領域全体に亙って、６−ＭＳＡＳの場合の４１％に比較して、 ４９％の相同性を示した。実施例２２ アセチルマロニルトランスフェラーゼの同定 ＣＯＯＨ末端に向かって進む場合に、同定したその次の作用部位はアセチル／ マロニルトランスフェラーゼであり、このトランスフェラーゼは、β−ケトシン ターゼの活性チオール（プライミングアセチルユニットの場合）又はＡＣＰ−パ ンテテイン−ＳＨの活性部位チオール（マロニルビルディングブロック の場合）のどちらかへのトランスファーのための入来基質を受容する役割を果た す。アセチル／マロニルトランスフェラーゼ部位を、活性部位セリンを有する数 多くのタンパク質に発見される「ＧＸＳＸＧ」パターンを検索することによって 同定した（Ｗａｋｉｌ，Ｓ．Ｊ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８ ：４５２３−４５３０）。図に示すように、ＴＰＫＳタンパク質におけるこのパ ターンの保存を、アミノ酸６５４に始めに観察した。実施例２３ デヒドラターゼの同定 ＦＡＳタンパク質と共通なその次の部位は、デヒドラーゼである。ラットＦＡ Ｓだけでなく６−ＭＳＡＳとエリトロマイシンＳＵ４にも一貫して発見されるデ ヒドラターゼパターンは、「ＨＸＸＸＧＸＸＸＸＰ」配列を有した（Ｄｏｎａｄ ｉｏ，Ｓ．及びＫａｔｚ，Ｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ，１１１，５１−６０．） 。このシグネチュア配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の外側の相 同性は著しく低かった。実施例２４ エノイルレダクターゼ及びケトレダクターゼの同定 ラットＦＡＳタンパク質上で同定したその次の２つの活性部位は、エノイルレ ダクターゼ（ＥＲ）とケトレダクターゼ（ＫＲ）だった。一般的には、数多くの タンパク質におけるピリジンヌクレオチド結合部位を表現するものとして提示さ れている「ＧＸＧＸＸＧ／Ａ」パターンを検索することによって、ＥＲとＫＲを 同定する（Ｗｉｅｒｅｎｇａ，Ｒ．Ｋ．及びＨｏｌ，Ｗ．Ｇ．Ｊ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ，３０２，８４２−８４４）。ＫＲとＥＲの両方に関して、このパ ターンに対する一致がラットＦＡＳで確認されている（Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ｖ ．ら，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８，５７１−５７９）。 ＴＰＫＳタンパク質を調べ、上記パターンに対する３つの一致を確認した。第１ の一致は、β−ケトシンターゼ作用部位とアセチル／マロニルトランスフェラー ゼ作用部位との間の位置３２１で始まった。しかし、この部位は、タンパク質内 で５′位置を占めると同時に高い相同性を有する領域内に位置するので、上記レ ダクターゼ活性部位のどちらの候補としても適切ではないと考えられた。しかし 、「ＧＸＧＸＸＧ」 パターンは位置１４４６−１４５１に再び現れ、これはメチルトランスフェラー ゼドメインの一部分と考えられた。上記パターンが３番目に現れたのは位置２４ ３８であり、ＡＣＰ活性部位セリンの６０アミノ酸５′側に位置した。同様の「 ＧＸＧＸＸＧ」パターンが、ラットＦＡＳにおいては、ＡＣＰの１２５アミノ酸 前に現れ、及び、６−ＭＳＡＳにおいては、１２９アミノ酸５′側に現れた。Ｋ ＲとＥＲのＮＡＤ（Ｐ）結合部位としての候補部位がＴＰＫＳタンパク質内に発 見できなかったので、相同性の検索を、これらの部位を含むラットＦＡＳの領域 とＴＰＫＳタンパク質の同様の領域との間で行った。 エノイルレダクターゼのアラインメントに示されているように、デヒドラター ゼとケトレダクターゼとの間に位置し且つラットＦＡＳエノイルレダクターゼに 対する最良のアラインメントを示すＴＰＫＳタンパク質の領域は、ＧＸＧＸＸＧ パターンに対する又は上記領域一般に対する高い相同性を示さなかった。より著 しく高い相同性がエリトロマイシンＡIIのＳＵ４のＥＲドメインとラットＦＡＳ 配列との間で明らかだった。ラットＦＡＳ及び６−ＭＳＡＳケトレダクターゼ領 域のＴＰＫＳとケト レダクターゼとのアラインメントは、全遺伝子間におけるグリシンに富む保存領 域を取り囲む３０アミノ酸のうちの６アミノ酸と、ＦＡＳ又は６−ＭＳＡＳとＴ ＰＫＳとの間に保存された３０アミノ酸のうちの１３アミノ酸とに関して、上記 領域よりも僅かに高い相同性を示した。 上記グリシンに富むセグメントは、数多くのタンパク質のピリジン−ヌクレオ チド結合ドメインのための構造パターン全体の一部分である（Ｗｉｅｒｅｎｇａ ，前出；Ｓｃｒｕｔｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．ら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４３，３ ８−４３；Ｍａ，Ｑ．ら，１９９２，２６７，２２２９８−２２３０４；Ｈａｎ ｕｋｏｇｌｕ，Ｉ．及びＧｕｔｆｉｎｇｅｒ，Ｔ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． ，１８０，４７９−４８４）。この構造パターンは、グリシンに 富む領域が中間部における強い回転シグナルをコードするβシート−ターン−α ヘリックスから成っていた。これに加えて、下流の酸性又は塩基性アミノ酸が、 ２′リボース位置上のリン酸塩（ＮＡＤＰ）又はヒドロキシル基（ＮＡＤ）に結 合する位置にあった。このことは、モデルＮＡＤＰ結合タンパク質としてのウマ アルコールデヒドロゲナーゼの二次構造のＣｈｏｕ Ｆａｓｍａｎ分析で 明らかになった。Ｃｈｏｕ Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを使用した構造特徴の分 析によって、この構造パターンがラットＦＡＳ ＥＲ及びＫＲドメインに保存さ れていることが判明した（Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ，Ａ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，１９８，５７１−５７９）。ＴＰＫＳ ＥＲ及びＫＲと、６ −ＭＳＡＳ ＫＲとのアミノ酸配列の構造の推定は、上記モデルの変形を示して いた。推定した構造の全てが、アミノ酸の相同性が高くない時にさえβシートが 回転領域に入ることを示した。構造モデルからの逸脱が基質特異性の相違を反映 する可能性があることが示唆されている（Ｍａ，Ｑ．，上記）。こうした構造的 変化がＰＫＳのプログラミングに重要であり、トリオール前駆体の生合成の連続 サイクル中にβ−ケト基の様々なレベルの還元に結果すると考えられる。アライ ンメント全体に一貫しているのは、相同性の検索によって同定される「グリシン に富む」領域から２０−２３アミノ酸の位置における塩基性アミノ酸の存在であ った。構造的類似性と、こうした塩基性アミノ酸の存在とが、こうした領域が実 際にＴＰＫＳタンパク質のケトレダクターゼとエノイルレダクターゼに相当する ということを示唆した。実施例２５ アシル担体タンパク質の同定 ラットＦＡＳとＴＰＫＳとのアラインメントによって同定した最後の活性部位 は、４′−ホスホパンテテイン補欠分子族に結合するアシル担体タンパク質（Ａ ＣＰ）活性部位セリンであった。活性部位セリンをまたぐ３０アミノ酸の中の６ アミノ酸だけが、ＴＰＫＳ、ラットＦＡＳ、及び、６−ＭＳＡＳに保存されてい たが、ラットＦＡＳ又は６−ＭＳＡＳと、ＴＰＫＳとの間に、高度の相同性（３ ０アミノ酸の中の１３アミノ酸）を確認した。実施例２６ メチルトランスフェラーゼの同定 ラットＦＡＳ内に存在しないＴＰＫＳタンパク質の開放読み枠内に同定した１ つの活性部位は、メチル基をＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）から６位のポ リケチド鎖にトランスファーさせる役割をするメチルトランスフェラーゼだった 。ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び、タンパク質基質をメチル化させる役割をする真核生物 メチルトランスフェラーゼと原核生物メチルトランスフェラーゼの両方を比較す ることによって、ＳＡＭ結合ドメイン の一部であると考えられる配列パターンを確認した（Ｉｎｇｒｏｓｓｏ，Ｄ．ら ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２０１３１−２０１３９；Ｗ ｕ，Ｇ．ら，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ，１３８，２１０１−２１１２ ）。この結合パターンと、推定したＴＰＫＳのメチルトランスフェラーゼとのそ のアラインメントとを、添付図面に示す。 コンパクチンにメチル基が存在しないことは、上記メチルトランスフェラーゼ ドメインがコンパクチンＰＫＳでは存在しないか変化している可能性があること を示唆した。実施例２７ Ａ ．Ｍ．ｒｕｂｅｒの形質転換 上記手順に概ね従って、Ｍ．ｒｕｂｅｒ菌株Ｍ４６８１及びＭ８２１２１の培 養を成長させ、スフェロプラスト化し、形質転換させた。ペトリ皿を、湿度６５ ％且つ温度２８℃で７日間から１０日間インキュベートし、形質転換集落を採取 した。Ｂ ．Ｍｏｎａｓｃｕｓの発酵 形質転換した培養を、１０日間、２５℃で、培地（７％ グリセロール、３％ グルコース、３％ 肉抽出物、０．８％ ペプトン、０．２％ ＮａＮＯ₃、及び、０．１％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含む ）中で好気的に成長させた（Ｋｉｍｕｒａら，１９９０，“Ｂｉｏｓｙｎ．ｏｆ Ｍｏｎａｃｏｌｉｎｓ，Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｊ．Ｔｏ Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ（Ｍｅｖｉｎｏｌｉｎ）”，Ｊ．ｏｆ Ａｎ ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ，Ｖｏｌ．ＸＬIII Ｎｏ．１２，１６２１−１６２２）。Ｍ ．ｒｕｂｅｒ Ｍ８２１２１を、２５℃で１１日間、培地（１１％ グリセロ ール、１％ グルコース、５％ 大豆粉末、０．８％ ペプトン、０．１％ Ｎ ａＮＯ₃、０．０５％ Ｚｎ（ＮＯ₃）₂、及び、０．５％ オリーブ油を含み、 ｐＨ ６．５）中で好気的に成長させた（Ｅｎｄｏら，“Ｄｉｈｙｄｒｏｍｏｎ ａｃｏｌｉｎ Ｌ ａｎｄ Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｘ，Ｎｅｗ Ｍｅｔａｂｏｌ ｉｔｅｓ Ｔｈｏｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｂｉｏｓｙ ｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，Ｖｏｌ．ＸＸＸVIII Ｎｏ．３， ３２１−３２７）。培養ブイヨンを溶媒（メタノール又はジクロロメタン）で抽 出し、濃縮し、ＨＰＬＣのような方法で分析した。非形質転換宿主、又は、ＴＰ ＫＳ 遺伝子なしのｐＬ０９を含むＭ．ｒｕｂｅｒ培養との比較によって、宿主又はそ の誘導体を含むＴＰＫＳ１００は、増加したレベルのロバスタチン、トリオール 、モナコリン、ジヒドロモナコリンＬ、又は、モナコリンＸを生産した。実施例２８ Ａ ．Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｉｓの形質転換 上記手順に概ね従って、Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｓ菌株Ｌ−６３を成長させ、スフェ ロプラスト化し、形質転換させた。ｐＴＰＫＳ１００又はその誘導体を使用して 細胞を形質転換させた。こうした誘導体の例は、ＴＰＫＳタンパク質のメチルト ランスフェラーゼ活性をコードするＤＮＡが、活性メチルトランスフェラーゼを 生産しないように変更されている誘導体である。ペトリ皿を、湿度６５％且つ温 度２８℃で７日間から１０日間インキュベートし、形質転換集落を採取した。Ｂ ．Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓの発酵 Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｓ Ｌ−６３を、４日間、２５℃で、培地（７％ グリセロ ール、３％ グルコース、３％ 肉抽出物、０．８％ ペプトン、０．２％ Ｎ ａＮＯ₃、及び、０．１％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ含む）中で好気的に成長させた（Ｋｉｍｕｒａら、上記） 。培養ブイヨンを溶媒（メタノール又はジクロロメタン）で抽出し、必要に応じ て蒸発によって濃縮した。非形質転換宿主、又は、ＴＰＫＳ遺伝子なしのｐＬ０ Ａを含むＰ．ｖｉｒｉｄｉｓ培養との比較によって、形質転換宿主が、増加した レベルのＭＬ−２３６Ａとコンパクチンとを生産したと推定できた。実施例２９ Ａ．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍの形質転換 Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍの適切な培養（例えば、Ｎａｒａら，１９９３，“Ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ，ＭＬ−２３６Ｂ（ｃｏｍｐａｃｔ ｉｎ）−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｎｇｕｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔ ｒｉｎｕｍ”．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２３，２８−３２）を、ｐＴＰＫＳ１ ００又は適切なその誘導体を用いて従来の方法で形質転換させた。Ｂ ．Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍの発酵 形質転換した培養を酵母−麦芽抽出物寒天傾斜培地（４ｇ／ｌ デキストロー ス、１０ｇ／ｌ 麦芽抽出物、４ｇ／ｌ 酵母抽出物、及び、２０ｇ／ｌ 寒天 を含み、滅菌前にｐＨ ７とする）上に保持した。その傾斜培養を洗浄し、ＫＦ 種培地（１０ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂、５ｇ／ｌ コーンスティープ液、４０ｇ／ｌ トマトペースト、１０ｇ／ｌ オートミール、１０ｇ／ｌ セレロース、及び 、１リットルあたり１０ｍｌの微量元素を含み、ｐＨ ６．８であり、この微量 元素は、ｄＨ₂Ｏ １リットル中の、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ、ＭｎＳＯ₄・４ Ｈ₂Ｏ １ｇ、ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ２５ｍｇ、ＣａＣｌ₂ １００ｍｇ、Ｈ₃Ｂ Ｏ₃ ５６ｍｇ、（ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・Ｈ₂Ｏ １９ｍｇ、及び、ＺｎＳＯ₄・７ Ｈ₂Ｏ ２００ｍｇから成る）を収容したフラスコに接種するために使用した。 ＫＦ種培地を収容したフラスコを、約２８℃の温度で２２０ｒｐｍで約３日間イ ンキュベートした。約１．５ｍｌを、２５０ｍｌフラスコ１個当たり４０ｍｌの ＬＭ生産培地に接種するために使用した。ＬＭ培地は、２０ｇ／ｌ デキストロ ース、２０ｍｌ／ｌ グリセロール、１０ｇ／ｌ アルダ ミンｐＨ、２０ｇ／ｌ 麦芽抽出物、８ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、及び、 ０．２５％ ポリグリコール Ｐ２０００を含み、ｐＨ ７．０だった。５日間 から１０日間、振とう機上で２５℃で振とうした後に、ブイヨンを集め、抽出し 、濃縮した。形質転換した培養は、形質転換していない親培養の場合よりも多い コンパクチンとジヒドロコンパクチンとを生産した。実施例３０ 哺乳動物発現ベクター内へのＴＰＫＳ ｃＤＮＡのクローニング ＴＰＫＳ ｃＤＮＡ発現カセットを、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位にお いて、強力な普遍哺乳動物プロモーターを含む次のベクターに連結させた。 上記プロモーターに対して正の方向にＴＰＫＳ ｃＤＮＡを含むカセットを、 上記プロモーターの適切な制限部位３′内に連結し、制限部位マッピング及び／ 又はシークエンシングで同定した。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、標準的な 方法（エレクトロポレーション、又は、化学的方法（カチオンリポソーム、ＤＥ ＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を非限定的に含む）によって様々な宿主 細胞の中に導入した。移入細胞と細 胞培養上清とを採取し、下記の通りにＴＰＫＳ発現に関して分析した。 哺乳動物移行発現のために使用したベクターを、ＴＰＫＳを発現する安定細胞 系統を確認するために使用することも可能である。実施例３１ 昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクターの中へのＴＰＫＳ ｃＤＮＡのクローニング ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムから得られるバキュロウイルスベクターを、Ｓｆ ９系統の昆虫細胞においてｃＤＮＡの高レベルの発現を生じさせるように設計し た。ＴＰＫＳ ｃＤＮＡを発現させる組換えバキュロウイルスを、主として標準 的な方法によって作製した（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａｃ Ｍａｎｕａ ｌ） 。ＴＰＫＳ ｃＤＮＡ産物を、様々なバキュロウイルストランスファーベク ター（ｐＡＣ３６０、及び、ＢｌｕｅＢａｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ） を非限定的に含む）内のポリヘドリン遺伝子の中に連結した。組換えバキュロウ イルスを、相同組換えと、その後の、Ｓｆ９細胞中へのバキュロウイルストラン スファーベクターと直線化ＡｃＮＰＶゲノムＤ ＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１８，５６６７（ １９９０）］との同時トランスフェクションとによって作製した。プラーク精製 の後に、ＴＰＫＳ発現を上記アッセイによって定量した。 真正の酵素活性ＴＰＫＳを、感染細胞の細胞質中に発見した。低張性溶菌又は 洗剤溶菌によって、活性ＴＰＫＳを自然条件の下で感染細胞から抽出した。実施例３２ 酵母菌発現ベクター内へのＴＰＫＳ ｃＤＮＡのクローニング 外来性タンパク質の細胞内又は細胞外発現を引き起こすように設計された発現 ベクターの中に最適ＴＰＫＳ ｃＤＮＡシストロンを挿入した後に、組換えＴＰ ＫＳを酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で作製した。細胞内発現の場合には、Ｅ ｍＢＬｙｅｘ４又はその類似物のようなベクターを、ＴＰＫＳシストロンと連結 した［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，５４３−５４５ （１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５ ，４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現の場合には、分泌シグナル（ 酵母又は哺乳動物ペプチド）をＴＰＫＳタンパク質のＮＨ₂ 末端に融合させる酵母発現ベクターの中に、ＴＰＫＳシストロンを結合させた［ Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ，８５，５１１−５１６（１９８９）； Ｒｉｅｔｔ Ｌ．及びＢｅｌｌｏｎ Ｎ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８，２９４１ −２９４９（１９８９）］。実施例３３ ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤のインビトロ生産のためのＴＰＫＳの使用 複合体タンパク質を含む組換えタンパク質を、異型細胞内で過剰発現させるこ とが可能である（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９３，“Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ ｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｆ ａｎ ｉｎｔａｃ ｔ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｒｙｔｈ ｒｏｍｙｃｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓ ｅ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１４，３０５−３１１）。組換えタンパ ク質を細胞封入体内で生産する場合には、所期タンパク質の復元を酵素アッセイ の前に行う（Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９３）。 適切な宿主細胞を、ＴＰＫＳ遺伝子をコードするベクターで 形質転換した。ＴＰＫＳの発現を可能にする条件の下で形質転換宿主細胞を成長 させた。発現ＴＰＫＳを単離し、部分的に精製した。アセチル−ＣｏＡ又は他の 挿入アシル化合物、適切なコファクター、及び、緩衝液を含む反応混合物に、回 復させた活性ＴＰＫＳ酵素を加えることが可能である。この系をインキュベート することによって、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を作製することが可能で ある。実施例３４ ＴＰＫＳ遺伝子を使用した他のＰＫＳ遺伝子のクローニング ＴＰＫＳの一部に相当するＤＮＡを、他の生物（例えば、Ｍ．ｒｕｂｅｒ又はＰ ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）から単離したゲノムＤＮＡと交差ハイブリッド形成させ ることによって、親生物からの相同遺伝子をクローニングすることが可能である 。これを行うために、Ｍ．ｒｕｂｅｒ又はＰ．ｃｉｔｒｉｎｕｍのゲノムライブ ラリーを、従来の方法でゲノムＤＮＡから作製した。例えばＥＭＢＬベクターを 使用して、ＥＭＢＬゲノムライブラリーを作製し、平板培養し、ＴＰＫＳ遺伝子 からのＰｓｔＩフラグメントから成る³²Ｐ標識ＤＮＡプローブとのハイブリッド 形成によってスクリーニングした。ＰｓｔＩフラグメントは、上 記遺伝子のケトシンターゼ配列を含んでいた。陽性プラークを選択し、精製した 交差反応プラークを選択するまで、追加のスクリーニングを行った。陽性クロー ンに含まれたＤＮＡを、制限マッピング、サザンハイブリッド形成、及び、ＤＮ Ａシークエンシングのような物理的方法で更に解析した。定義した遺伝子の作用 を、適切な形質転換ベクター内での上記遺伝子のクローニングと、このベクター によるロバスタチン非生産菌株の形質転換とによって解析した。Ｍ．ｒｕｂｅｒ の場合には、交差反応するＰＫＳが、Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ（ロバスタチン） の生産を回復させ、一方、機能性Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ ＰＫＳの導入がコンパ クチンの生産をもたらすと推定された。実施例３５ 他の菌株に対するＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ＴＰＫＳの相同性 ケトシンターゼ領域を含むＡ．ｔｅｒｒｅｕｓＴＰＫＳ遺伝子の５′末端の大 型セグメントを、Ｍ．ｒｕｂｅｒ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、及び、Ｐ．ｂｒｅｖ ｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ を含む他の菌株に対する上記領域の交差ハイブリッド形成 を検索するために使用した。２つのプローブを使用してサザン分析によって相同 性を調べた。サザン分析によって、３つの菌株全てに 交差ハイブリッド形成が確認された。 第１のプローブは、ＫＡＳ活性部位全体に及ぶＰｓｔＩフラグメント８００ｂ ｐプローブだった。このプローブは、ＫＡＳ領域全体に加えて活性部位システイ ンのイントロン１５′を含んでいた。このプローブを、上記３つの菌株全てにお ける相同性を検出するために使用した。Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓは、制限地図から予 測された交差反応バンドのプロフィルを示した。別のロバスタチン生産生物であ るＭ．ｒｕｂｅｒと、コンパクチン生産生物であるＰ．ｃｉｔｒｉｎｕｍは、互 いに異なってはいるが強いハイブリッド形成をプローブに対して示した。 第２のプローブは、次の配列を有する合成オリゴヌクレオチドプローブであっ た。 ５′ＧＡＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴＴＣ ＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＡ３’（配列番号：３） このプローブに対するハイブリッド形成シグナルは、第１のプローブに対する ハイブリッド形成よりも弱かったが、その結果は、ＰｓｔＩフラグメントを用い て行った観察を裏付けた。 ３′末端ｃＤＮＡプローブを使用した時には、上記３つの菌株全てに対する交 差反応が観察された。消化物の多くにおける 単一の交差反応バンドは、各菌株のゲノムＤＮＡに１つの遺伝子だけが検出され たことを示していた。これらのデータは、Ｍ．ｒｕｂｅｒとＰ．ｃｉｔｒｉｎｕ ｍ とが、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓのＴＰＫＳ遺伝子に対する著しく高い相同性を有 する遺伝子を含むことを示唆していた。実施例３６ 突然変異ＴＰＫＳの使用 変化したＴＰＫＳ遺伝子を作製するために、ＴＰＫＳをコードするＤＮＡを標 準的方法で突然変異させた。治療に使用するための変化させたトリオールポリケ チド又は変化させたポリケチドを生産するために、変化させたＴＰＫＳで宿主細 胞を形質転換させた。こうした変化させたＴＰＫＳタンパク質を単離精製するこ とが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:66） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｓ，ＵＺ (72)発明者 コンダー，マイクル・ジエイ アメリカ合衆国、バージニア・22801、ハ リソンバーグ、ノースフイールド・コー ト・767 (72)発明者 マカダ，フイリス・シー アメリカ合衆国、ワシントン・98072、ウ ツデンビル、エヌ・イー、ワンハンドレツ ド・セブンテイ・サード・アベニユー・ 15611 (72)発明者 リーブス，クリストフアー・デイー アメリカ合衆国、ワシントン・98072、ウ ツデンビル、エヌ・イー・ツーハンドレツ ズ・サード・プレイス・19403 (72)発明者 ランボーセツク，ジヨン アメリカ合衆国、ワシントン・98115、シ アトル、エヌ・イー、セブンテイーンス・ アベニユー・7701 (72)発明者 デイビス，チヤールズ・レイ アメリカ合衆国、ワシントン・98037、リ ンウツド，ダブリユー、シクステイ・シク スス・プレイス・17727 (72)発明者 ヘンドリツクソン，リー・イー アメリカ合衆国、ワシントン・98014、カ ーネイシヨン、エヌ・イー・ワンハンドレ ッド・トウエレブス・ストリート・35915

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． トリオールポリケチドシンターゼをコードする精製ＤＮＡ分子。 ２． 前記ＤＮＡが微生物由来のトリオールポリケチドシンターゼをコードし、 その微生物が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ 、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒ ｍｕｓ 、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ Ｍ２０１６、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌ ｉｕｍ ｓｐ．ＭＭ６０３、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉ ａｔｕｍ Ｍ６７３５、及び、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉ ｎｇｉｉ Ｍ６８２８から成る群から選択される請求項１に記載の精製ＤＮＡ分 子。 ３． 前記ＤＮＡが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓからのトリオー ルポリケチドシンターゼをコードする請求項２に記載の精製ＤＮＡ分子。 ４． 次の配列を有する請求項１に記載の精製ＤＮＡ分子。 ５． 図１に示される配列を有する請求項１に記載の精製ＤＮＡ分子。 ６． 請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む、宿主細胞内のクローン化遺伝子の発 現のための発現ベクター。 ７． 前記宿主細胞が真菌類細胞である請求項６に記載の発現ベクター。 ８． ｐＴＰＫＳ１００（ＡＴＣＣ ６９４１６）と称される請求項６に記載の 発現ベクター。 ９． 前記ＤＮＡ分子が図１の配列を有する請求項６に記載の発現ベクター。 １０． 請求項１に記載の精製ＤＮＡ分子を含む宿主細胞。 １１． 請求項１に記載のＤＮＡによってコードされる精製トリオールポリケチ ドシンターゼ。 １２． 次のアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のトリオールポリケチドシ ンターゼ。 １３． 図２のアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のトリオールポリケチド シンターゼ。 １４． 請求項１０に記載のトリオールポリケチドシンターゼに対して免疫反応 性である抗体。 １５． ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を生産するためのプロセスであって 、 （ａ）請求項１に記載のＤＮＡ分子によって細胞を形質転換することと、 （ｂ）前記ＤＮＡ分子の発現を可能にする条件の下で、形質転換した前記細 胞を培養することと、 （ｃ）前記ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を回収すること を含む前記プロセス。 １６． 前記ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を、ロバスタチン、シンバスタ チン、プラバスタチン、トリオール、及び、コンパクチンから成る群から選択す る請求項１５に記載のプロセス。 １７． 前記培養を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｍｏｎａｓｃ ｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ 、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｈ ｙｐｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ Ｍ２０１６、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＭＭ６０３、Ｔｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ Ｍ６７３５、及び、Ｔｒｉ ｃｈｏｄｅｒｍａ ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ Ｍ６８２８から成る群から 選択する請求項１５に記載のプロセス。 １８． ポリケチドシンターゼをコードするＤＮＡを単離するための方法であっ て、 （ａ）ポリケチドシンターゼをコードするＤＮＡを含むサンプルと請求項１ に記載のＤＮＡをハイブリッド形成させて、複合体を形成することと、 （ｂ）前記複合体を精製すること を含む前記方法。 １９． 前記サンプルを微生物から得、その微生物を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃ ｉｔｒｉｎｕｍ 、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｈｙ ｐｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃ ｅｓ ｓｐ Ｍ２０１６、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＭＭ６０３、Ｔ ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ Ｍ６７３５、及び、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ Ｍ６８２８から成る 群から選択する請求項１８に記載の方法。 ２０． インキュベートすること、又は、約２５℃から５５℃で約０．１５Ｍの 塩化ナトリウムと約０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムもしくはその同等物を使 用して洗浄することを含む低厳密度条件下で、トリオールポリケチドシンターゼ をコードする核酸とハイブリッド形成することが可能な、機能性トリオールポリ ケチドシンターゼをコードする精製核酸。