KR101048032B1

KR101048032B1 - 천연 Ｓｔａｔｉｎ과 ＣｏＱ10 화합물이 강화된 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101048032B1
Application number: KR1020090098443A
Authority: KR
Inventors: 표영희
Original assignee: 성신여자대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2011-07-13
Also published as: WO2011046258A1; KR20110041339A; US20130017187A1; US8961963B2

Abstract

본 발명은 홍국균(Monascus sp.)과 인삼, 버섯류 및 잡곡류 등의 약효성 천연물 소재를 사용하여 콜레스테롤 생합성 억제제인 스타틴 화합물(mevinolin, mevinolinic acid)과 상기 스타틴의 장기적인 사용으로 인한 근육통 등의 합병증 발생 원인억제물질인 Coenzyme Q (Ubiquinone-10, CoQ₁₀; Ubiquinone-9, CoQ₉) 화합물을 동시에 함유하는 약제학적 천연 조성물을 제공하는 데 있다.

홍국균(Monascus sp.), 스타틴(메비놀린), 코엔자임 큐(유비퀴논), 약리학적 조성물

Description

천연 Ｓｔａｔｉｎ과 ＣｏＱ10 화합물이 강화된 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising of natural statin and Coenzyme Q10 compound}

본 발명은 홍국균과 약리적 효능이 있는 천연물 소재를 활용하여 콜레스테롤 생합성 억제제인 스타틴과 상기 스타틴의 경구복용에 따른 합병증의 발현 원인물질인 CoQ10 화합물이 동시에 함유된 항동맥경화와 심장기능강화 등의 복합 생리활성 기능 목적의 약제학적 천연조성물을 발효공법으로 제조하는 생산방법에 관한 것이다.

코엔자임 큐(Coenzyme Q; Ubiquinone, CoQ10)는 지용성 비타민과 유사한 퀴논물질로 모든 인간의 조직세포에 존재한다. 주요 생화학적 기능은 미토콘드리아의 세포수준의 호흡에서 전자 전달체로서 세포내 에너지(ATP) 대사에 관여한다(Sarah L. Molyneux et al., Journal of the American College of Cardiology, 52, 1435-1441, 2008). 또한 세포막의 산화적 손상을 방지하고, 반응성 산소종(Reactive oxygen species)을 제거하는 등 내인성 항산화제로서의 기능을 발휘한다. Q10의 생체합성은, 20대까지 왕성하게 만들어지다가 노화가 시작되면서 체내 합성량이 감소 되므로 Q10을 산업적으로 대량생산하여 각종 의약품, 건강기능성식품, 화장료 등에 활용하는 연구가 활발히 진행되어 왔다(Littarru et al., Nutr Res, 42, 291-305, 1972; Khatta M et al., Ann Intern Med, 132, 636-640, 2000). 인간 혈청과 생물조직에 있는 Q10의 90% 이상은 환원형의 유비퀴놀(ubiquinol, CoQ₁₀H₂)로 이것은 강력한 지용성 항산화 물질로 Q10H2/Q10의 비율과 혈청 Q10의 감소는 산화적 스트레스와 관련된다. 산화촉진제(prooxidants)와 항산화제(antioxidants)의 균형 파괴로 정의되는 산화적 스트레스는 심혈관계질환, 당뇨병, 암과 같은 병리학적 조건은 물론 노화와 관련된 주요 위험인자로 알려졌다(S. Yamashita et al., Anal Biochem, 250, 66, 1997; D. Steinberg et al., Engld J Med, 320, 915, 1989). Q10, 특히 유비퀴놀(ubiquinol)과 유비퀴논(ubiquinone)간의 비율은 오늘날 산화적 손상을 예방하거나 진단, 치료와 관련된 많은 연구에 기준치로 활용되고 있다. 혈장 지단백질의 산화는, 동맥경화증과 다른 질환 즉 파킨슨, 알츠하이머 혹은 베타-쌀라세미아 등의 유리 라디칼 형성과 관련된 질병을 야기하는 주요 요인이 된다. 이때 유비퀴놀은 페록시 라디칼을 제거하고 알파-토코페릴 라디칼을 감소시켜 LDL의 산화를 막아준다. 사실, 유비퀴놀은 혈장 항산화제인 알파-토코페롤에 비해, 혈장이 산화제에 노출될 때 농도에 상관없이 제일 먼저 반응하는 최초의 내인성 항산화제이다. 따라서 Q10을 강화하기 위해 보충제를 사용하는 것은 인간의 건강증진에 유익하며, 식품을 통해 혹은 식이보충제를 통해 Q10을 섭취하는 것은 혈중 Q10의 농도를 상승시키고 항산화제로써의 기능 강화에 도움을 줄 수 있어 세포의 산화적 손상으로 인 한 주요 질환의 발생을 예방할 수 있다.

그동안 많은 연구들이 Q10결핍, 질병상태, Q10 투여후 임상적 호전 등간의 관계를 증명하여 왔다. 무엇보다 스타틴 약제를 장기적으로 사용해야 하는 고콜레스테롤혈증과 관련된 질환자들에게 Q10을 보강하는 것은 부작용없이 스타틴 치료를 연장할 수 있고, 세포의 생체에너지 요구량을 일정하게 유지할 수 있는 효능을 입증하였다. 1987년에 최초 개발된 스타틴은 1세대 콜레스테롤 저하제로 심혈관계질환을 줄이는데 기여해 왔으나, 인류는 현재 Q10의 경우와 같이 다른 화합물의 생합성을 방해하지 않는 보다 특이적 작용을 하는 2세대 콜레스테롤 강하제의 개발을 기대하고 있다. 따라서 천연 항콜레스테롤 성분인 스타틴과 Q10의 성분이 동시에 일정농도 이상으로 함유된 천연물 소재류의 one drug(supplement)이 개발된다면 이들 두 화합물간의 부가적 혹은 상승적인 치료효과를 통해 항콜레스테롤 제재인 스타틴의 부작용을 소멸하면서 동시에 Q10의 생체활성 강화를 통한 건강상의 유익을 기대할 수 있다.

세계적으로 관상동맥질환은 주요 사망질환으로 특히 고콜레스테롤혈증은 가장 위험한 인자로 지목된다. 인체내 총 콜레스테롤 농도의 2/3 이상은 생합성으로 만들어지며, 이 때 합성경로의 초기 단계이자 속도제한 단계는 바로 HMG-CoA 환원효소(3-hydroxy-methyl-3-glutaryl-coenzyme reductase)가 작용하는 단계이다(도 3). 현재 전세계적으로 사용하는 HMG-CoA 환원효소 저해제(HMG-CoA reductase inhibitor), 즉 스타틴(statins; 또는 메비놀린, 로바스타틴, 모나콜린 K, 메바코르, C24H36O5)계열의 약제류는 고콜레스테롤혈증을 효과적으로 치료하여 심혈관계 질환으로 인한 인류의 사망을 막기 위해 오랫동안 사용되어 왔다. 스타틴 약물은, 전체 콜레스테롤의 80%에 해당하는 내인성 콜레스테롤의 생합성을 직접 억제하는 매우 강력한 물질이지만, 가수분해 효소(carboxyesterase)에 의해 분자구조의 고리가 열리는 활성화의 과정은 간과 신장의 손상은 물론 근질환(myopathy) 등의 부작용(Thomson PD et al., JAMA. 289: 1681-1690 2003)을 나타내므로, 의사의 처방전이 있어야만 판매하는 전문 의약품으로 분류한다. 그러나, 스타틴은 HMG-CoA reductase를 저해하여 콜레스테롤 생산을 감소시키는 한편, 생체내 전자 및 양자 전달체인 유비퀴논과 동일한 생합성경로를 공유하기 때문에 콜레스테롤뿐 아니라 Q10의 생합성에도 영향을 주어 두 물질의 생산량이 모두 저하되는 결과를 초래(도 3)하는 것으로 알려졌다. 즉 Mevalonate 수준에서 스타틴의 잠재적 영향은 불행히도 특이적이지 못해 결과적으로 Q10과 dolichol을 포함한 여러 비스테롤 이소프레노이드 물질의 생합성을 저해한다. 따라서 스타틴을 장기간 사용하는 사람은 미토콘드리아의 에너지생산에서 필수인자로 작용하는 CoQ10의 생합성의 혈중 농도가 낮아져 근육통을 비롯한 여러 가지 부작용을 야기하는 것으로 알려졌다. 즉 스타틴 사용시 혈장내 CoQ10의 농도가 감소되어 젖산/피루브산의 비율이 증가되고, 나아가 미토콘드리아 호흡계 기능을 저하시켜 결과적으로 에너지생산의 결핍은 근육의 피로도를 높혀 호기적 용량(호흡용량)을 감소시킬 수 있다.

따라서 statin 약물의 장기 사용은, 혈중 CoQ10의 함량 저하로 인한 심장기능 및 혈액순환체계를 약화시켜 심각한 부작용을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 즉 소화기계의 부작용(변비, 설사, 소화불량, 복부팽만, 복통 등)과 신경계의 부작용 (어지러움증, 두통) 및 피부발진, 시력저하 등의 부작용을 초래하는 것으로 보고되고 있다. 특히 간기능 부전 등의 부작용은 statin 약물의 복용을 중단할 만큼 심각한 증상으로 판명되어 스타틴 사용자의 혈중 CoQ10의 농도를 일정 농도로 유지하기 위한 방법이 강구되어 왔다. 관련 사안 중, 미국특허(US Patent) 05082650은 스타틴 약물(MEVACOR)을 적용받는 환자를 대상으로 사례별 혈중 CoQ10 농도의 변화와 부작용과의 관계를 관찰한 뒤 CoQ10의 보충을 통해 혈중 CoQ10의 농도와 부작용 증세의 완화 및 소멸간의 관계를 발견하여 스타틴 약물의 사용자는 CoQ10의 처방도 병행할 필요성을 제기하였다. 따라서 콜레스테롤의 혈중 농도를 일정하게 유지하기 위해 선택한 스타틴 계열의 약물 사용은, 동시에 CoQ10의 보충(매일 200mg)도 병행해야만 심장과 간에서 나타나는 심각한 부작용을 예방할 수 있는 것으로 나타났다.
이러한 목적을 달성하기 위하여 상기 미국특허를 시도하기 위한 유사한 연구결과가 한국 국내공개특허 제10-2009-28983호로 개시된 바 있다. 이는 고지혈증 치료용 합성의약물질 스타틴약물의 부작용을 막기 위해 합성의약물질 코엔자임10을 동시에 함유시킨 경구투여용 복합치료 조성물로서 물에 불용성인 lactone형의 합성스타틴의 용해성을 증가시키기 위해 폴리에틸렌글리콜과 같은 용해제, 계면활성제, 에멀전을 위한 오일류, 안정성 확보를 위한 나트륨 또는 칼슘계의 항산화제, pH조절제 등을 다량 함유시킨 약학조성물이 개시된 바 있다.
그러나, 상기 물질의 주성분인 스타틴계 약물과 CoQ10은 인공 합성한 화합물로서 수불용성이어서 장내 용해도에도 문제점이 상존하고 특히 이들 물질의 pH를 6.7로 조정한 칼슘염제는 용해도가 대단히 낮다는 결함이 있다.
그러나, 만일 천연발효공법에 의해 pH 6.5~7.0수준의 acid form의 천연스타틴화합물을 생합성할 수만 있다면 이러한 문제점을 한꺼번에 개선할 수 있는 데 ㅂ본 발명은 이러한 점을 감안하여 안출한 것이다.

지금까지, 홍국(red yeast rice, red koji)은 붉은 색의 사상균인 모나스커스(Monascus)속의 균을 쌀에 접종하여 제조한 것으로, 중국을 중심으로 동아시아의 여러 지역에서 천연의 식품 착색제나 가공품 및 소화촉진과 혈류개선의 소재로 오랜 동안 사용되어 왔다. 특히 홍국균이 생성하는 2차 대사산물인 천연 스타틴(HMG-CoA reductase inhibitor)이 콜레스테롤 생합성 효소인 HMG-CoA 환원효소를 강력하게 저해하여 혈중지질 농도와 콜레스테롤 생합성 저하에 따른 각종 생체활성의 기능성이 보고된(Wang IK et al., J. Agri. Food Chem. 48: 3183-3189 2000; Endo A. et al., J. Antibiotechnol. 38: 420-422 1985; Manzoni M & Rollini M. App. Microbiol. Biotechnol. 58: 555-564 2002; Wei W. et al., J. Nutri. Biochem. 14: 314-318 2003) 이후부터 한방에서는 홍국은 생약소재류로 널리 활용하고 있다.

그런데, 지금까지 홍국 배양물의 제조는 대부분 액체배양의 심부발효법(submerged fermentation)을 이용한 것으로, 주로 색소 성분과 기능성 대사산물인 스타틴(메비놀린)을 얻기 위한 최적의 발효조건 및 균주탐색, 홍국을 첨가한 기능성 제품의 제조 등이 연구되어 왔다. 그리고 고체 발효법(solid state fermentation) 역시, 색소를 비롯한 일부 기능성 성분을 얻기 위한 수단으로 시도되었지만, 사용된 배지의 주요 곡물은 쌀이 대부분이고 그 밖에 보리와 밀이 사용되었으며, 콩(백태)의 경우에는 단백질 함량이 높아 홍국균의 고체배지로는 적합하지 않은 것으로 알려져 왔다. 그러나, 본 발명자는 쌀 대신 콩을 고상배지의 기질로 하여 발효조건을 완성하고 홍국발효콩 유래의 스타틴 생산방법을 개발하여 국내외 최초로 특허등록한 바 있다(대한민국 특허등록 제10-0734612호). 하지만, 상기 발명은 스타틴(메비놀린) 생합성을 위한 고체배지 조성시, 쌀 대신 콩을 적용하여 홍국균을 발효함에 있어서 신장 또는 간장의 독소성분으로 작용하는 시트리닌(citrinin)을 생산하지 않는 성공적인 홍국발효콩의 생산에만 그 목적이 제한되 어 있었다.

본 발명자는 상기한 바와 같은 배지조성의 한계를 극복하기 위해 종배양액의 배지(culture medium)조성을 획기적으로 변화시켜 스타틴의 생합성량을 10%이상 강화시키면서 CoQ10을 동시에 다량 집적할 수 있는 안전하고 개선된 고지혈 예방 및치료용 천연 약학 조성물을 제공하고자 시도하였다. 아울러, 본 발명에서는 인체내 약리기능 메카니즘상 곰팡이의 대사산물로서 신장과 간장 기능 장해 독소성분으로 작용하는 모나스커스 유래의 시트리닌(citrinin)의 생합성 여부의 확인도 시도하였다.

본 발명의 홍국균의 특정 배지조성 및 본 발명이 목적하는 상기 복합 생리활성물질의 동시적 생합성과 관련하여 조사된 선행기술로는 스타틴을 함유하는 백혈병치료용 조성물에 대하여 대한민국특허 제2005-13188호가, 스타틴과 오메가-3지방산 및 그 조합물을 이용한 치료에 관하여는 대한민국특허 제2007-7022964호가, 신규한 스타틴 악제학적 조성물 및 관련치료방법에 대하여는 대한민국특허 제2007-7003811호가, 스타틴과 기관지 확장제와의 조성물에 대하여는 대한민국특허 제2007-7000831호가 스타틴 및 가스제거제를 포함하는 제콜레스테롤 혈증치료제 조성물에 대하여는 대한민국특허 제2006-7015689호가, 스타틴-캡슐화된 나노입자를 함유하는 약학적 조성물에 대하여는 대한민국특허 제2009-7004090호가 각각 조사되었으며, 그러나 이와 같은 선행기술들은 본 발명의 스타틴과 CoQ10의 천연 복합 생리활성물질의 동시적 생합성하는 것과 관련한 액체배양배지와 상기 물질의 동시적 생산방법에 대하여 발명의 신규성과 진보성을 부정할 만한 문헌임을 확인할 수 없었다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 천연 복합 생리활성물질로서 스타틴과 유비퀴논을 동시에 생합성할 수 있는 액체배양배지를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발견한 액체배지를 사용하여 발효된 액상배양물을 종배양액으로 하여 천연물 소재의 다양한 혼합곡물로 조성된 고체배지에 접종후 일정기간 발효시켜 상기 두가지 화합물이 동시에 강화된 고상발효물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 고상발효물을 사용하여 천연 스타틴 약제의 부작용을 줄임과 동시에 심혈관질환 예방 및 치료에 활용할 수 있는 건강기능성 식품 또는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 홍국균과 약리적 효능이 있는 천연물 소재를 활용하여 콜레스테롤 생합성 억제제인 천연 스타틴 화합물과 상기 스타틴의 경구복용에 따른 합병증의 발현 원인물질이 되는 CoQ10이 동시에 함유된 항동맥경화와 심장기능 강화 등의 복합 생리활성 화합물을 동시에 생합성할 수 있는 천연 액상배양배지를 제공하는 단계와; 상기 액상배지를 사용하여 우량균주를 선별하는 단계와; 상기 배지를 이용하여 홍국균의 액상배양물을 얻고; 이를 고체배지에 접종하여 일정기간 발효시켜 상기 천연 스타틴과 유비퀴논의 복합 생리활성물질의 농도를 강화하는 단계와; 상기 생산된 복합 생리활성물질의 화학적 구조의 특성을 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 실시예를 통하여 상세히 설명하지만, 약효성 액체배지 및 혼합곡물로 구성된 고체배지성분의 단순한 변경 나아가 고상 발효방법의 단순한 설계변경은 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 물론이다.

본 발명은 지금까지 국내외에서 시도된 바 없는 홍국균을 활용한 천연 항콜레스테롤 제재인 스타틴 화합물과 스타틴의 장기 사용에 따라 결핍될 수 있는 유비퀴논의 화합물을 동시에 함유한 천연의 액상배양물 및 고상발효물을 제공하는 효과가 있고, 나아가 고부가가치의 상기 복합 생리활성물질을 동시에 함유하는 건강기능성 식품 또는 약제학적 천연조성물을 안전하게 제공하여 종래의 합성 의약물질과 차별하는 탁월한 효과가 있다.

본 발명은 홍국균을 쌀가루가 함유된 액체배지에 인삼, 버섯, 등 약효성 천연물 소재들을 함께 첨가하여 1차 발효액인 액상 배양물을 제조하거나, 상기 종배양액을 혼합곡물을 포함하는 고체배지에 접종하여 2차 발효액인 고상발효물을 제조하는 것을 포함한다.

본 발명에서 상기 약효성 천연물 소재는 인삼류, 피망류, 버섯류, 토마토를 지칭하고 이들 물질의 가공전후의 소재를 모두 포함하며 천연 스타틴과 유비퀴논 등 주요 천연 화합물을 생합성하는 방법을 포함한다. 이 때, 실험결과 인삼가루 1~2, 적색피망가루 0.5~1.5, 표고버섯가루 0.5~1.5, 토마토가루 0.5~1.5%(w/v)가 가장 바람직한 것으로 나타났다.

본 발명에서 상기 홍국균은 모나스커스 앵카(M. anka), 모나스커스 퍼푸레우스(M. purpureus), 모나스커스 필로수스(M. pilosus), 모나스커스 카올리앙(M. kaoliang), 모나스커스 루버(M. ruber), 모나스커스 비트레우스(M. vitreus) 중에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 천연 스타틴과 유비퀴논 화합물이 공존하는 복합 생리활성 조성물을 생산하는 방법을 포함한다.

본 발명에 따르면, 상기 홍국균 중에서 우량균주임을 특징으로 하는 천연 스타틴과 유비퀴논 등 주요 화합물을 함유하는 천연조성물을 생산하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 홍국균 종배양액은 PDA배지에서 배양한 홍국균을 약효성 천연물 소재류인 인삼류, 버섯류, 피망류, 토마토 등의 소재가 하나 이상 함유된 영양배지에 접종하여 배양한 것을 특징으로 하는 천연 스타틴과 유비퀴논 화합물이 동시에 함유된 천연의 약제학적 조성물을 생산하는 방법을 포함한다.

그리고, 본 발명에 따르면, 상기 천연 액체배지의 조성은 쌀가루 2~10, 펩톤 0.5~2.0, 글라이신 1~5, 포도당 6~20, 고기추출물(meat extract) 0.1~1.0%(w/v)임이 바람직하고 약효성 천연 배지소재로는 인삼가루 0.5~1.5, 적색피망가루 0.5~1.5, 버섯가루 0.5~1.5, 토마토가루 0.5~1.5%(w/v)의 조성비율로 첨가되고 상기 배지의 초기 pH는 6.0±0.5임을 특징으로 하는 메비놀린과 유비퀴논을 동시적으로 생산하는 방법을 포함한다.

본 발명은 지금까지 시도되지 않았던 약효성 천연물 소재류와 모나스커스속 균주를 사용하여 항콜레스테롤 합성 성분인 스타틴과 내인성의 지용성 항산화제이며 스타틴 약제의 부작용을 막아주는 조효소 Q10을 주요 화합물로 포함하는 천연의 약리학적 조성물 및 상기 조성물을 생산하기 적합한 약효성 소재류를 개발하기 위해 수행되었다.

먼저 15종의 모나스커스 속의 균주를 대상으로 영양배지로서 종배양액을 조성하고 그에 따라 스타틴과 유비퀴논의 생산량을 평가하였다. 본 발명자가 기왕에 홍국발효에 사용했던 액상배양액은 콩(백태)에 적용하여 2차 발효과정인 고상발효에서는 정상적인 발효만을 목표로 하였기 때문에 당보다 단백질 함량이 높은 두류의 경우, 성분 조성상 성공적인 홍국발효가 쌀 소재 보다 발효조건이 취약하므로 액상발효를 위한 최적의 액상배지 조성 및 성분별 농도를 독성물질인 시트리닌(citrinin)을 생산하지 않는 조건의 확립만을 시도하였던 것이다. 그러나 본 발명에서는 약효성 천연물 소재류를 다양하게 조사하여 선택하고 최적 첨가량을 조성하여 액체배지조건을 얻고 이에다가 홍국균주를 접종 배양하여 그 액상배양물 시료에서 본 발명이 목표로 하는 복합 생리활성물질 스타틴과 유비퀴논의 생합성을 분석평가하여 우량균주를 선별하고, 나아가 이 액상배양물을 종배양액으로 하고 단일 곡류 혹은 이들 혼합곡을 고체배지성분으로 하여 고상발효를 실시했을 때, 액상조성물에 비해 상기 두가지 생리활성 유효성분의 농도를 강화할 수 있는 내용을 목표로 하는 약효성의 천연 조성물 생산을 주요 목표로 하였다. 따라서 본 발명의 가장 독창적인 사항은 우량균주의 선발, 스타틴과 유비퀴논을 동시에 함유하는 약효성 액상 배양물 제조, 그리고 상기 액상배양물을 단일 곡류 또는 이들의 혼합곡 등의 고체배지에 접종하여 상기 생리활성 유효성분의 농도를 강화시킨 2차 발효물을 제조하는 고상발효로 요약할 수 있다. 액상의 종배양액 제조에 사용되는 천연 소재류 성분의 공통점은 모두 분자구조에 이소프렌 단위(isoprene unit)나 벤조퀴노핵을 갖고 있어 유비퀴논의 시스템을 함유하는 모나스커스균주의 유비퀴논 생합성 대사를 보완하거나 촉진할 수 있다(도1~도2). 따라서 본 발효공법은, 목표물질인 유비퀴논과 스타틴의 대사산물을 동시에 효율적으로 생산할 수 있는 독창적인 발효공법을 제시하는 데 그 특징이 있다(도3).

본 발명은 홍국균과 천연물 소재류의 분말을 일정비율 첨가하여 스타틴과 유비퀴논을 함유한 약효성 액상 조성물의 제조를 포함한다. 여기에서 천연물 소재류는 분자구조 중에 이소프렌 단위나 벤조퀴논핵을 갖고 있는 버섯류, 인삼류, 피망, 토마토 등을 지칭하며 천연상태로 건조된 분말이나 가공된 분말을 적어도 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 약효성 천연 조성물을 제조하기 위해 사용된 재료 물질은 서울특별시 가락동 시장에서 구입하여 시료로 사용하였다. 또한, 동정된 모나스커스속의 균주는 한국식품연구원(Korea Food Research Institute)에서 분양받아 우량균주 선발에 사용하였다.

본 발명에서 액상 배양의 시료로 사용된 천연물 소재류는 수세후 잘 다듬은 다음, 동결건조후 분말화하여 일정비율로 첨가하였다.

본 발명에서 고상발효에 사용한 곡류는 5~15시간 동안 침지한 다음, 물빼기를 하여 중량 약 100g(수분함량 35~45%)정도를 500mL의 삼각플라스크에 넣고 지전으로 밀봉하여 멸균한 다음 시료로 사용하였다.

상기 곡류 시료는 도정한 멥쌀, 보리, 밀, 수수, 조를 단독 또는 이들의 혼 합곡의 배합비(중량비)를 1:1:1:1:1로 하여 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용한 각각의 홍국균 균주들은 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 30±5℃ 조건으로 3~4일 동안 배양하여 종균으로 사용하였다. 쌀가루, 펩톤, 글라이신, 포도당 그리고 약효성 천연물 소재류의 분말을 포함하는 액체배지에 상기의 홍국균 배양물을 균질화하여 종균으로 시료 중량의 5~10%(v/w)를 취하여 접종하고 30℃의 교반 배양기에서 3~5일 동안 진탕배양하여 약효성의 액상배양물을 제조하였다. 상기에서 홍국균 종배양액의 배양을 위한 액체배지는, 쌀가루 2~10, 펩톤 0.5~2.0, 글리세롤 1~5, 포도당 5~20%(w/v), 약효성 천연물 소재류의 분말 1~10%(w/v)의 비율로 정제수에 첨가하여 초기 pH 6.0±0.5로 조정된 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 홍국균의 액상배양물을 곡류의 고체시료에 접종하여 30±5℃의 배양기에서 30±5일 동안 고상발효하여 유효 활성성분이 강화된 약효성의 고상발효물을 생산하였다. 고상발효시 모든 배양물은 발효 2일째부터 하루에 한 번씩 뒤집어 주는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 모나스커스(Monascus)속 균주가 액상 및 고체배지에서 2차 대사산물로서 천연 생리활성물질인 스타틴과 유비퀴논의 생산이 균주에 따라 어떠한 차이가 있는지 조사평가하였다.

본 발명에 의하면 메비놀린을 생산하기 위하여 홍국균은 모나스커스 앵카(M. anka), 모나스커스 퍼푸레우스(M. purpureus), 모나스커스 필로수스(M. pilosus), 모나스커스 카올리앙(M. kaoliang) 중에서 하나 이상 선택하여 사용하는 것이 바람직하였다. 또한, 본 발명의 우량균주에 대한 선별에서 액상과 고상의 배지에서 정상적인 발효와 함께, 유효 활성성분인 스타틴과 동시에 유비퀴논이 공존하는 보다 우량한 균주는 모나스커스 앵카(M. anka), 모나스커스 퍼푸레우스(M. purpureus), 모나스커스 필로수스(M. pilosus), 모나스커스 루버(M. ruber), 모나스커스 아라네오수스(M. araneosus) 그리고 모나스커스 카올리앙(M. kaoliang) 균주들이다. 특히 모나스커스 필로수스(M. pilosus) 균주는 나머지 균주들 보다 3.9배에서 4.5배로 유효활성 화합물의 농도가 높게 나타나 액상 및 고상 발효에 가장 적합한 우량 균주로 평가되었다.

이하 본 발명의 내용을 실시 예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시 예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시 예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 종배양액의 제조

실험재료 및 시약

약효성 천연발효 조성물의 제조를 위한 모든 천연 소재류는 서울특별시 가락동 시장에서 구입하여 사용하였다. 유비퀴논과 메비놀린 화합물을 추출하기 위한 에탄올, 핵산 등의 모든 용매는 HPLC용(Fisher Co., USA)을 사용하였다. 표준품 메비놀린(mevinolin; lactone form), 시트리닌(citrinin)과 유비퀴논(CoQ10, CoQ9)은 Sigma사(St. Louis, Mo., USA)로 부터 구입하여 사용하였으며, 에시드형의 메비놀린(이하 메비놀리닉 에시드)은 Friedrich 등(Friedrich J. et al., J. Chromatogr. A. 704: 363-367 1995)의 알칼리 가수 분해법을 일부 변경하여 제조하였다. 즉, 표준품의 메비놀린에 0.1M의 NaOH를 가하여 1시간 동안 50℃에서 가온한 뒤, 1M HCl를 사용하여 pH 7.7로 보정한 후 여과(0.22 μm, Millipore Co., Bedford, MA, USA)하여 HPLC (JASCO PU-987 pump, Tokyo, Japan)로 분석하였다. 표준품의 메비놀린과 메비놀리닉 에시드 및 시트리닌의 분리는 UV 스펙트럼(UV spectra, λmax)과 체류시간(retention time, tR) 으로 확인한 후 표준물질의 검량선에 따라 정량하였다. 유비퀴논의 분리 및 정량은 electrospray ionization (ESI)이 장착된 LC-MS를 통해 실시하였다.

사용균주 및 배지

동정된 모나스커스(Monascus)속의 균주 15 종을 한국식품연구원(Korea Food Research Institute)으로 부터 분양받아 우량균주 선발에 활용하였다. 먼저 모든 균주들은 PDA배지(potato dextrose agar; Difco, MI, USA)를 이용하여 30℃에서 5일 동안 배양한 다음, 포자의 현탁액을 균질화하여 종배양액에 직접 접종하였다.

선별 종배양액의 제조

고상발효를 위한 영양배지로 광범위하게 사용되어 왔던 다양한 영양 배지액을 표 1과 같이 변형하여 조제하였다. 1차 배양에서 분리한 각각의 균주를 조제액에 1백금이 접종한 후, 30℃의 교반 배양기에서 3~5일 동안 배양한 다음 균체만을 모아 동결건조 후 스타틴과 유비퀴논의 함량을 추출,정량하거나 고상발효에 종배양액으로 사용하였다.

[실시예 2] 우량 균주의 선별

메비놀린과 메비놀리닉 에시드의 추출 및 정량

액상배양물 및 고상발효물의 분말 0.1g에 메탄올이나 70% 에탄올, 0.1% H3PO4 아세톤니트릴(acetonitrile)의 용매를 각각 1.0㎖씩 넣고, 초음파기(sonic & materials Inc. USA)를 사용하여 50℃에서 2시간 동안 균체를 파쇄한 후 12,000× g로 10분 동안 원심분리 하였다. 상등액을 여과(0.45㎛)한 다음 HPLC를 이용하여 2차 대사산물의 함량을 측정하였으며, Capcell Pak C18 UG120 column(250x4.6mm, SHISEIDO CO., Tokyo, Japan)을 사용하였다. 이동상의 용매는 아세톤니트릴과 0.1% H3PO4을 65 : 35(v/v)의 비율, 그리고 0.8 ㎖/min의 유속으로 용출하였다. 두 가지 화합물의 검색은 각 화합물의 최대파장 238㎚에서 동시에 측정하였다. 메비놀린과 메비놀리닉 에시드의 함량은 각 화합물의 표준물질을 사용하여 작성한 검량선을 이용하여 정량하였다.

유비퀴논의 추출 및 정량

액상배양물 및 고상발효물의 분말 1.0g에 물 25ml, 메탄올 70ml, 피로가롤(pyrogallol) 2g, 가성소다(NaOH) 10g을 넣고 환류냉각장치가 부착된 중탕기(90~95 ℃)에서 30분~60분간 가수분해 한다. 반응이 끝나면 냉각한 후 50ml의 헥산을 넣고 5분간 진탕한 후 원심분리로 헥산층을 따로 분리한다. 동일과정을 세 번 반복하여 모은 헥산층을 감압증발기(40℃)로 모두 제거하여 최종적으로 이소-프로판올로 용해하고 PTFE membrane filter(0.2μm)로 여과한 후 LC-MS(Agilent 1100 quaternary pump, Agilent 1100 autosampler, Agilent 1100 column heater, Agilent 1100 UV detector; YMC Pro C18, 3μm, 2.0 x50 mm column, 0.8mL/min, 5μL, 275 nm)로 분리 정량한다. CoQ10과 CoQ9의 정량은 표준물질을 사용하여 작성한 검량선의 식에 따라 시료 중의 유비퀴논 물질을 정량하였다.

우량 균주의 선별

모나스커스(Monascus)속 균주 15 종을 각각 PDA배지에 배양한 뒤, 1.5×1.5 ㎝의 균주 배양물에 5배의 멸균수를 혼합하여 균질화한 후, 시료 중량의 10%(v/w)를 취하여 액체배지 및 고체배지에 무균적으로 접종하여 각 각 5일과 30일간 발효시켰다. 모나스커스 균주의 종류에 따른 스타틴과 유비퀴논 및 시트리닌의 생성량을 검토한 결과, 표 2와 같이 나타났다.

액상발효물에 함유된 유효한 대사산물, 유비퀴논과 메비놀린의 생성량이 각각 일정량 이상 검출되면서 독성의 부산물인 시트리닌이 생산되지 않는 균주는, 모 나스커스 앵카(M. anka IFO 478), 모나스커스 퍼푸레우스(M. purpureus ATCC 489), 모나스커스 필로수스(M. pilosus IFO 201, 480), 그리고 모나스커스 카올리앙(M. kaoliang ATCC 595) 및 기타 균주(M. sp. IFO 301)들로 선발되었다. 특히 모나스커스 필로수스(M. pilosus) 균주는 스타틴과 메비놀린의 함량이 최대 각 각 3.9배에서 4.5배로 나머지 균주들 보다 높게 나타나 유용한 대사산물을 가장 많이 생성하면서도 시트리닌은 검출되지 않는 우량 균주로 확인되었다. 또한, 표 3 에서 보듯이 홍국콩 발효물에 존재하는 메비놀린의 형태는 비활성형의 락톤형이 아니라, 활성형의 하이드록시카르복실레이트인 메비놀리닉 에시드 화합물이 주요성분으로 현재 pravastatin 등의 약제와 동일구조의 활성형이 함유된 것으로 나타났다. 현재 국내의 홍국발효 제품에 대한 식약청의 기준고시 규격안은 홍국발효 제품이 건강 기능성식품으로 활용되기 위해서는 메비놀린의 함량과 시트리닌의 함량이 각각 0.05% 이상과 50ppb 이하의 기준안에 부합될 것을 제시하였다.

따라서 스타틴함량 뿐 아니라 유비퀴논의 함량을 보다 강화하기 위해 우량 균주로 선정된 모나스커스 필로수스(Monascus pilosus)의 두 균주 중 하나를 선택하여 종균배양한 뒤, 표 1과 같이 5가지 유형으로 조제한 액체배지를 배양하여 각 균주의 생장과 증식을 활성화하여 스타틴과 유비퀴논의 함량을 강화하였다. 또한 선정된 액체 배양물의 10%(v/w)를 천연의 고체배지에 접종하여 일정 기간 발효하면서 유효 활성물질의 생성량을 측정하였다.

[실시예 3] 종배양액 조성의 영향

상기 A~E의 5 가지 유형의 액체배지를 조성한 후, 30℃에서 5일 동안 발효시켰다. 발효에 의한 2차 대사산물 및 유효활성성분의 함량을 측정한 결과는 표 3과 같다. 즉, A형은 총 메비놀린의 함량이 20.5 μg/g으로 나타나, 천연 약효성 소재류를 사용한 다른 시료들에 비해 유효 활성물질의 생성량이 최대 2.6배나 낮은 함량으로 나타났다. 특히 D형은 E형과 함께 메비놀린의 총 생성량이 각각 54.3과 51.9 μg/g로 나타났으며, 두 가지 유형에서 모두 유비퀴논의 함량은 각 각 28.6과 28.2 μg/g로 나타나 가장 적합한 액상 배양물로 평가되었다. 기대했던 대로, 본 발명의 액상 배양물에 함유된 메비놀린의 주성분은 하기 에시드 형(hydroxy acid form)의 메비놀리닉 에시드(b)로 나타났으며, 락톤 형의 메비놀린(a)은 약 8%에 불과하여 본 배양물에 함유된 천연 스타틴의 유형은 활성형 약물(active drug)이 약 92% 이상 함유된 인체 흡수가 용이한 상태의 약물임을 특징으로 한다.

여기에 더하여, 본원발명은 수용성인 에시드형 천연 스타틴물질 뿐만 아니라, 이 약물의 장기적인 사용으로 인한 근육통 등 합병증 발생원인 억제물질인 CoQ9, CoQ10의 천연 유비퀴논 화합물을 동시에 생합성하여 제공한다는 장점을 가진다(표 3). 더우기, 고지혈증 예방 또는 치료제로 사용시 별도의 용해제나 pH 안정화제의 사용없이도 직접 분리정제된 천연물질을 경구투여할 수 있도록 약학 조성물로 제제화할 수 있는 장점도 있다.

Hajjaj 등(Hajjaj H. et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 2596-2602 2001) 역시 로바스타틴(lovastatin) 등의 2차 대사산물의 생산은, 각기 다른 배지와 배양조건에 따라 유의적으로 변한다고 하여 균주배양 조건의 중요성을 강조한 바 있다. 그러나 Monascus sp.를 접종한 약효성 천연물질을 이용한 액상배양물을 발효하여 유비퀴논 화합물을 얻고자 시도한 연구는 아직까지 국내외적으로 발견되지 않는다.

표 1에서와 같이 B형의 액체 배양물은, A형의 조성에서 인삼가루를 제외한 나머지 성분 즉 쌀가루(rice powder), 포도당(glucose), 펩톤(peptone), 글라이신(glycine) 및 고기추출물(meat extract) 등은 나머지 유형과 동일한 조성으로 구성된다. B형에 포함된 인삼가루와 C, D, E형에 첨가한 버섯류와 피망류 등의 기타 천연물 소재류의 첨가는 천연 스타틴의 함량은 물론 유비퀴논의 농도를 증진시키는 것으로 나타났으며, 가장 적합한 유형은 D형으로 평가되어 이후의 고상 발효에 종배양액으로 사용하였다. D형의 조성은, 조제액의 양을 기준으로 쌀가루(rice powder) 3.0, 펩톤 1.5, 글라이신 1.5, 포도당 10.5, 고기추출물 0.1, 인삼가루 1.5, 적색피망과 표고버섯가루를 각 각 1.0의 농도(w/v, %)로 조제하였으며, 30℃에서 5일간 교반 배양기(shaking incubator)로 배양한 다음, 고상시료를 발효하기 위한 종배양액으로 사용하였다.

[실시예 4] 멥쌀 단독 및 혼합곡을 이용한 고상 발효

고상 발효에 사용되는 공시재료는 도정한 멥쌀만으로 된 것과, 도정한 멥쌀, 보리, 소맥, 수수, 조를 중량비 1:1:1:1:1(w/w)로 배합하여 각 10시간 동안 침지한 다음, 물빼기를 한 시료 100g (수분함량 35~40%)을 500mL의 삼각플라스크에 넣고 지전으로 밀봉한 뒤, 121℃에서 20분간 멸균하였다. 액체배지로 배양한 상기 실시예 3의 유형 중 D형의 종배양액을 시료 중량의 10%(v/w)를 취하여 고체배지에 무균적으로 접종하였다. 접종한 시료는 30℃의 배양기에서 40일 동안 발효하면서, 기간별로 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40일 동안 발효한 시료를 채취하여 스타틴과 유비퀴논의 함량을 각 각 정량하여 발효시간에 따른 대사산물의 함량 변화를 관찰한 결과는 표 4와 같았다. 이때 모든 배양물은 배양 2일째부터 하루에 한 번씩 뒤집기 하였으며, 채취한 시료는 동결건조 후 분말화하여 사용할 때까지 냉동고에 보관하였다. 실험실시결과, 합성된 두가지 생리활성물질은 건조시료 중량(DW)기준으로 발효시간 제30일째, 스타틴 791.5㎍/g DW, 유비퀴논 250.1㎍/g DW로서 최대치에 도달하였으며, 천연 스타틴의 경우 통상의 700㎍/g DW이하의 수율보다 본 발명 시료에서 발효한 결과 13%이상 수율이 향상되었음이 확인되었다.

고상배지에서의 약효성 물질의 생산량은 쌀 단독보다 혼합곡을 골고루 사용할 때 천연 스타틴과 유비퀴논의 함량이 각 각 1.9 배와 14.2 배 증가되었다. 특히 유비퀴논의 생산량은 혼합곡에서 두드러진 증량효과를 나타냈다. 따라서, 약리적 효능이 있는 두가지 화합물의 동시적 생산을 위한 기질로서 고상배지는 쌀 등 단독곡물보다 혼합곡이 더 적합한 것으로 평가되었다.

이같은 결과는, 쌀 이외의 다른 곡류에 함유된 개별적인 미량성분 및 영양소 성분들이 모나스커스 균주세포의 최대생장 또는 상기 두 생리활성물질의 생합성 증 가에 영향을 미친 것으로 판단된다.

[실시예 5] 발효시간의 영향

상기 실시예 4의 고체배지에 액상배양물(Type D, pH 6, M. pilosus IFO 480)을 종배양액으로 시료 중량의 10% (v/w)로 접종한 다음, 30℃의 배양기에서 30일간 발효시킨 결과는 건조시료 중량 당 30일 발효 후 스타틴의 함량은 791.5 μg/g, 유비퀴논은 250.1 μg/g으로 나타나 액상발효물에 비해 두 화합물 모두 각 각 8.7배와 14.6배로 증가되어 약효성의 액체배지를 고체배지에 접종하여 발효시키면 생체활성 대사산물의 생산량이 크게 증가되는 것으로 평가되었다 (표 4). 전체적으로 발효시간이 경과할수록 유비퀴논과 메비놀린의 생성량은 증가하는 경향으로 나타났으며 두 화합물의 생성량은 비슷한 양상으로 증가하거나 감소하였다. 발효 30일에 스타틴과 유비퀴논은 각각 0.079%와 0.025%로 측정되었고, 발효 25일에 약간 감소하는 듯 하였지만 발효가 종료될 때까지 생산이 멈추지는 않았다. 일반적으로 스타틴의 생합성은 사용 균주(Bang IY et al., Korean J. Food Sci. Technol. 35: 442-446 2003)와 생장 및 증식조건(Kwak EJ, Cha SK, Lim SI. Korean J. Food Sci. Technol. 35: 830-834 2003; Hajjaj H. et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: 2596-2602 2001)에 따라 그 생산량이 좌우되는 것으로 알려져 왔다. 즉, 배지의 종류에 대한 균주의 최대성장이 발현되는 시점에서 2차 대사산물의 생산도 최대량에 도달되는 것으로 나타났다.

본 발명의 고상 발효물에서 검출된 스타틴 화합물은 에시드형이 물-알코올의 용매조건에서 락톤(lactone)형보다 더 안정한 형태로 관찰되었다. 따라서 모나스커스 필로수스(Monascus pilosus) 균주를 이용한 고상발효물은 내인성 콜레스테롤의 합성효소(HMG-CoA reductase)의 저해성분인 천연 스타틴을 활성형으로 평균 0.07% 함유하며 동시에 스타틴의 합병증을 억제할 수 있는 유비퀴논의 함량은 건조물 중량당 평균 200~250μg/g 함유하는 것으로 나타났다.

본 발명은 홍국균과 천연물소재를 사용하여 복합 생리활성물질로서 스타틴과 유비퀴논을 동시에 생산하여 제공하는 효과가 있으므로 건강기능성식품산업 또는 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 CoQ9 의 화학적 구조와 LC-MS의 스펙트럼 그림을 나타낸다.

도 2는 CoQ10 의 화학적 구조와 과 LC-MS의 스펙트럼 그림을 나타낸다.

도 3은 스타틴 (메비놀린)과 유비퀴논의 생합성 도식도를 나타낸다.

Claims

모나스커스속 홍국균을 분자구조중에 이소프렌단위 또는 벤조퀴논핵을 가지는 천연물 소재분말 하나 이상과 쌀가루, 글루코스, 펩톤, 글라이신, 고기추출물 및 정제수로 이루어진 액체배지에 접종하고 30℃에서 진탕배양하여 천연 메비놀린과 유비퀴논 화합물을 동시에 생합성시키는 것을 특징으로 하는 홍국균의 액상배양물의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 천연물 소재분말은 인삼분말, 적색피망분말, 버섯분말, 토마토분말 중 하나 이상 첨가된 것임을 특징으로 하는 홍국균의 액상배양물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 홍국균은 모나스커스 앵카(M. anka), 모나스커스 퍼푸레우스(M. purpureus), 모나스커스 필로수스(M. pilosus), 모나스커스 루버(M. ruber), 모나스커스 아라네오수스(M. araneosus), 모나스커스 카올리앙 ATCC 595(M. kaoliang ATCC 595), 모나스커스 sp. IFO 301(M. vitreus sp. IFO 301)속중에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 홍국균의 액상배양물의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 홍국균은 모나스커스 필로수스 sp. IFO 202, 및 모나스커스 필로수스 sp. IFO 480 중 어느 하나의 우량균주임을 특징으로 하는 홍국균의 액상배양물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 액상배양물은 PDA배지에서 배양한 홍국균의 종균을 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 홍국균의 액상배양물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 액체배지는 쌀가루 2~10, 펩톤 0.5~2.0, 글라이신 1~5, 포도당 6~20, 고기추출물 0.1~1.0, 인삼가루 0.5~1.5, 적색피망가루 0.5~1.5, 표고버섯가루 0.5~1.5%(w/v)와 나머지 정제수로 이루어지고 초기 pH 6.0±0.5로 조정된 배지임을 특징으로 하는 홍국균의 액상배양물의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 액체배지에 토마토가루 0.5~1.5%(w/v)를 더 추가함을 특징으로 하는 홍국균의 액상배양물의 제조방법.
제1항의 방법으로 제조되어 천연 메비놀린과 유비퀴논 화합물을 동시에 강화시킨 것이 특징인 홍국균의 액상배양물.
삭제
제9항 기재의 홍국균의 액상배양물 10%(v/w)를 종배양액으로 하고 멥쌀, 보리, 소맥, 수수, 조 중 하나 또는 그 이상의 혼합곡류로 조성된 멸균 고체배지에 무균적으로 접종하여 30℃에서 발효함을 특징으로 하는 천연 스타틴과 유비퀴논 화합물을 동시에 강화시킨 것이 특징인 홍국균의 고상발효물.
삭제