KR100234976B1

KR100234976B1 - 세룰레닌 및 엘-메치오닌 유사체에 동시 내성을 갖는 아스퍼질 러스속 미생물 및 그를 이용한 메비놀린산의 제조방법

Info

Publication number: KR100234976B1
Application number: KR1019970053987A
Authority: KR
Inventors: 홍청일; 김경환; 박장우; 김정우; 최병택; 김병국
Original assignee: 김충환; 주식회사종근당
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 1999-12-15
Also published as: KR19990021821A; US5925551A; WO1999006531A1; AU4794097A

Abstract

본 발명은 지방산 및 폴리케타이드(polyketide) 항생제의 생합성 억제제인 세룰레닌(cerulenin) 및 메비놀린산(mevinolinic acid) 생합성 과정에서 메틸기 공여물질인 엘-메치오닌(L-methionine)의 유사체에 대해 동시 내성을 갖는 아스퍼질러스 테리우스의 변이주 및 그를 영양배지에서 호기적으로 배양하고 메비놀린산을 회수하는 공정을 포함하는 메비놀린산의 제종방법에 관한 것이다. 본 발명의 전술한 변이주는 토양에서 분리한 야생의 아스퍼질러스 테리우스에 비해, 메비놀린산의 생성능이 현저히 높으면서 부산물(메비놀린산 유사체)을 적게 생산하는 장점을 갖고 있으며, 또한 모균과는 달리 글루코스 또는 갈락토스에 의한 메비놀린산 생산의 저해가 현저히 완화되는 특징을 갖고 있다.

Description

세룰레닌 및 엘-메치오닌 유사체에 동시 내성을 갖는 아스퍼질러스속 미생물 및 그를 이용한 메비놀린산의 제조방법

본 발명은 세룰레닌(cerulenin)과 엘-메치오닌(L-methionine) 유사체에 동시 내성을 갖는 신규의 아스퍼질러스 속(Aspergillus genus) 미생물 및 그를 이용한 메비놀린산(mevinolinic acid)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 메비놀린산을 생산하는 균주인 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus)를 토양에서 분리하고 자외선 또는 화학물질에 의한 돌연변이를 유발시켜, 지방산 및 폴리케타이드(polyketide) 항생제의 생합성 억제제인 세룰레닌에 내성을 갖는 변이주 및 메비놀린산 생합성 과정에서 메틸기 공여물질인 엘-메치오닌의 유사체에 대해 내성을 갖는 변이주를 각각 얻은 다음, 이들 변이주를 세포융합시켜 얻은, 세룰레닌과 엘-메치오닌 유사체에 대한 동시 내성, 메비놀린산의 고생산성 및 메비놀린산 유사체 생성의 최소화를 나타내는 신규의 변이주 및 그를 영양배지에서 호기적으로 배양하고 메비놀린산을 회수하는 공정을 포함하는 메비놀린산의 제조방법에 관한 것이다.

로바스타틴(Lovastatin, 메비놀린'이라고도 함)은 인체내에서 콜레스테롤 생합성의 율속단계 효소의 하나인 HMG-CoA(3-hydroxy-3-methlyglutaryl-Coenzyme A) 환원효소의 저해제로서, 인체의 과콜레스테롤혈증 및 과지방혈증등의 치료에 유용한 물질이며, 곰팡이, 아스퍼질러스 테리우스(참조 : 대한민국 특허공고 제83-2438호; 미국특허 4,231,938) 또는 모나스커스(Monascus) 속(참조 : 대한민국 특허공고 제83-2329호) 등 특정 미생물의 발효에 의해서 생성된 메비놀린산을 락톤화하여 제조되고, 다른 HMG-CoA 환원효소 저해제인 심바스타틴(Simvastatin)(참조 : 대한민국 특허공고 제85-669호; 미국특허 4,444,784)의 합성에 필요한 출발물질이기도 하다.

로바스타틴은 화학적으로 [1S-[1α(R^*), 3α,7β,8β (2S^*,4S^*), 8αβ]]-2-메틸부탄산 1,2,3,7,8,8a-헥사히드로-3,7-디메틸-8-[2-(테트라히드로-4-히드록시-6-옥시-2H-피란-2-일)에틸]-1-나프탈레닐 에스테르([1S-[1α(R^*), 3α,7β,8β (2S^*,4S^*), 8αβ]]-2-methylbutanonic acid 1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7-dimethyl-8-[2-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl)ethyl]-1-naphthalenyl ester)이며, 그 생산 균주는 로바스타틴의 산형태(acid form)인 메비놀린산을 생성하고, 분리·회수과정에서 락톤 형태인 로바스타틴(메비놀린)으로 전환된다.

아스퍼질러스 테리우스가 생산하는 메비놀린산은 지방산 생합성과 유사하게 초산을 전구체로 하여 폴리케타이드 경로를 거쳐 생합성되며, 구조적으로 9개의 초산 단위로부터 형성된 주골격과 2개의 초산단위로 이루어진 곁가지가 있고(참조 : Moore et al., J. Am. Chem. Soc., 107:3694-3701(1985); Yoshizawa et al., J. Am. Chem. Soc., 116 : 2696-2694(1994)), 에스-아데노실 메치오닌(SAM)으로부터 전이된 2개의 메칠기를 갖고 있다(참조 : Ming-Shi Shiao and Hsiao-Sheck Pon, Proc. Natl. Sci. Counc. B. ROC, 11(3) : 223-231(1987)).

초산으로부터 형성되는 메비놀린산의 구조 중 곁가지(α-methylbutyrate)를 제외하고 1개의 메칠기를 포함한 주골격구조를 형성하는데 관여하는 트리올폴리케타이드의 생합성효소 및 그의 유전자가 아스퍼질러스 테리우스로부터 분리되었고, 이 효소의 아미노산 서열 및 예상되는 활성 위치가 지방산 생합성 효소와 거의 유사한 것으로 확인되었다(참조 : WO95/12661). 또한, 메비놀린산 생합성 과정에서 18개 탄소 및 4개 탄소로 구성된 폴리케타이드들이 각각 형성된 직후에 엘-메치오닌으로부터 에스-아데노실메치오닌(SAM)을 통해서 메칠기가 전이(methyltransferation)되는 것으로 알려져 있다(참조 : Ming-Shi Shiao and Hsiao-Sheck Pon, Proc. Natl. Sci. Counc. B. ROC, 11(3) : 223-231(1987)).

한편, 세룰레닌은 HMG-CoA 환원효소의 활성을 저해함으로써 스테롤 생합성을 억제하며(참조 : Ohno et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 57(4) : 1119-1124(1974)), 또한 지방산 생합성에 있어서는 지방산 생합성 효소에서 축합반응을 담당하는 부분의 시스테인과 반응하여 공유결합을 형성함으로써 지방산 생합성 효소의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다(참조 : Funabashi et al., J. Biochem., 105 : 751-755(1989)).

이와 같이 지방산 및 스테롤 생합성의 억제제인 세룰레닌은 폴리케타이드의 생합성도 저해하는 것으로 알려져 있다(참조 : Satoshi Omura, Bacteriol, Rev., 40(3) : 681-697(1976)). 또한, 폴리케타이드 생합성 경로를 갖는 루코마이신(Leucomycin)(참조 : Omura et al., J. Biochem., 75 : 193-195(1974)), 6-메칠살리실산(참조 : Ohno et al., J. Biochem., 78 : 1149-1152(1975)). 캔디시딘(Candicidin)(참조 : Martin et al., Biochemica et Biophysica Acta, 411 : 186-194(1975)), 플라바논(Flavanone)(참조 : Kreuzaler, F & K. Hahlvroch, Eur. J. Biochem., 56 : 205-213(1975)), 얼터나리올(Alternariol)(참조 : Hiltunen et al., Applied and Environmental Microbiology, 58(3) : 1043-1045(1992)) 등이 모두 세룰레닌에 의해 생합성이 저해받는 것으로 알려져 있다.

세룰레닌이 지방산의 생합성을 저해함에도 불구하고, 세룰레닌을 생산하는 미생물인 세팔로스포리엄 카에룰렌스(Cephalosporium caerulens)의 경우, 약 100ug/ml의 고농도 세룰레닌이 첨가된 배지에서도 성장에 영향을 받지 않으며, 이러한 세룰레닌 내성의 원인은 지방산 생합성 효소의 세룰레닌에 대한 내성 때문인 것으로 보고된 바 있다(참조 : Kawaguchi et al., Archives of Biochemistry and Biohysics, 197(1) : 30-35(1979)). 또한, 캔디다 알비칸에서 분리된 세룰레닌 내성균주를 특성화한 결과, 세룰레닌 내성의 원인은 세룰레닌의 세포내 흡수가 모균에 비해 현저히 저하될 분만 아니라, 지방산 생합성 효소의 활성에 대한 세룰레닌의 저해 현상이 완화되었기 때문인 것으로 보고되고 있다(참조 : Cail McElhaney-Feser and Ronald L., Cihlar, Microbiology, 141 : 1553-1558(1995)).

한편, 메비놀린산을 생산하는 공지의 미생물 아스퍼질러스 테리우스 ATCC 20541과 ATCC 20542 또는 기타 공지의 생산균주(참조 : 대한민국 특허공고 제83-2438호;USP 4,231,938; Menaghan et al., Can. J. Bot., 73(suppl. 1) : S925-S931(1995))는 메비놀린산 생산능력이 낮고(예를 들면, 아스퍼질러스 테리우스 ATCC 20541의 메비놀린산 생산성은 10~80μg/ml이고, 아스퍼질러스 테리우스 ATCC 20542의 메비놀린산 생산성은 50~850μg/ml이다), 메비놀린산 유사체를 다량 생성시킨다는 단점을 가지고 있었다. 또한, 아스퍼질러스 테리우스 ATCC 20542에 통상의 돌연변이화 및 선발 과정을 적용하여, 술로크린(Sulochrin)과 같은 유사체가 모균에 비해 83% 감소되고, 메놀린산 생산이 20% 증가된 변이주를 얻은 보고가 있지만(참조 : Vinci et al., Journal of Industrial Microbiology, 8 : 113-120(1991)), 트리올산을 포함한 몇가지 유사체들의 생산량이 많고, 메놀린산의 생산능력 또한 만족할 만한 수준에 도달하지 못하는 문제점을 가지고 있었다. 빈시(Vinci) 등의 문헌에는 아스테르산(Asterric acid), 부티로락톤(Butyrolactone), 시트리닌(Citrinin), 에모딘(Emodin), 이타콘산(Itaconic acid), 제오딘(Geodin), 술로크린(Sulochrin) 및 테레토닌(Terretonin) 등이 메놀린산 유사체인 것으로 보고되고 있다(참조 : Vinci et al., Journal of Industrial Microbiology, 8 : 113-120(1991)).

본 발명자들은 메비놀린산의 생산성이 낮고 그 유사체들의 생산량이 높다는 공지 미생물들의 문제점을 해결하고자 예의 연구노력한 결과, 로바스타틴의 생합성 과정이 폴리케타이드 경로로 진행되며 이에 관여하는 효소가 지방산 생합성 효소와 유사하고, 2개의 메칠기가 엘-메치오닌으로부터 에스-아데노실메치오닌(SAM)을 통하여 전이되며, 또한 엘-메치오닌 유사체들이 메치오닌의 생합성 과정 및 메치오닌의 에스-아데노실메치오닌으로의 전환, 나아가서 에스-아데노실메치오닌으로부터 메칠기의 전이과정 등을 저해한다는(참조 : Chattopadhyay et al., Biotechnology Letters, 17(6) : 567-570(1995); Shiomi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 42 : 730-733(1995); Hoffman et al., The Journal of Biological Chemistry, 255(22) : 10822-10827(1980)) 공지의 사실에 착안하였다.

또한, 미생물에 의한 생합성 경로에서 부반응을 줄여 전구체의 공급을 극대화시키는 것이 목적산물의 고생산에 효과적이라는 사실에 입각하여, 메비놀린산 생합성 효소가 지방산 생합성 효소와 별개이지만 초산을 공통된 전구체로 이용하므로, 생체내 전구체의 이용성이 지방산 및 스테롤 쪽보다는 메비놀린산 생합성에 집중되도록 함으로써, 메비놀린산의 고생산 균주를 개발할 수 있음에 착안하였다.

그리하여, 지방산, 스테롤 및 폴리케타이드 항생제 등의 생합성 억제제인 세룰레닌 및 엘-메치오닌의 유사체인 디엘-에치오닌에 대한 내성 균주를 메비놀린산 생산균주인 아스퍼질러스 테리우스에 통상의 돌연변이원을 처리하여 각각 선발하였고, 이들의 세포 융합주로부터 세룰레닌 및 엘-메치오닌 유사체에 대해 동시 내성을 나타내고, 모균인 전기 아스퍼질러스 테리우스에 비해 메비놀린산 생산성이 15배 이상 증가되었으며, 메비놀린산 유사체들의 생산량이 약 90% 이상 감소된 변이주를 발견하고, 그를 '아스퍼질러스 테리우스 CLS216-7'라 명명하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 세룰레닌과 엘-메치오닌 유사체에 동시 내성을 갖는 신규의 아스퍼질러스 속(Aspergillus genus) 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 미생물을 이용한 메비놀린산을 제조방법을 제공하는 것이다.

제1도는 야생주 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) CKL031의 배양액을 아세톤으로 추출하고, 그를 고속액체크로마토그래피한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

제2도는 본 발명의 세포융합 변이주 CLS216-7의 배양액을 아세톤으로 추출하고, 그를 고속액체크로마토그래피한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명은 토양으로부터 분리한 야생의 메비놀린산 생산균주인 아스퍼질러스 테리우스(이하, '아스퍼질러스 테리우스 CKL031'이라 함)에 통상의 돌연변이 수단, 예를 들면 자외선 또는 화학물질을 가하여, 메비놀린산 생성능이 증가되고 그의 유사체 생성이 감소된 변이주(이하, '아스퍼질러스 테리우스 CKL043'이라 함)를 선발하였다. 이렇게 선발된 변이주 CKL043은 세룰레닌 내성 변이주와 엘-메치오닌 유사체 내성 변이주를 각각 얻기 위한 친주로 사용되었다.

상기의 친주 아스퍼질러스 테리우스 CKL043으로부터 본 발명의 변이주중 하나인 세룰레닌 내성 변이주를 얻기 위하여, 친주 CKL043을 한천 사면배지에서 배양하여 포자를 획득하고, 이 포자의 현탁액에 통상의 돌연변이 수단, 예를 들면 자외선 또는 화학물질을 가하여 변이를 유발시킨 다음, 세룰레닌이 첨가된 배지에서 내성을 갖는 변이주들을 선별하고, 이들 중 검정균에 대한 생육저지가 크면서 액체배양시 메비놀린산을 다량 생산하는 변이주를 선발하였다. 이렇게 선발된 상기의 변이주는 배양 10일째에 모균 CKL031에 비하여 메비놀린산을 약 4.4배 이상 생산하였다.

아울러, 친주인 아스퍼질러스 테리우스 CKL043으로부터 본 발명의 변이주 중 하나인 엘-메치오닌 유사체 내성 변이주를 얻기 위하여, 친주 CKL043을 한천 사면배지에서 배양하여 포자를 획득하고, 이 포자의 현탁액에 통상의 돌연변이 수단, 예를 들면 자외선 또는 화학물질을 가하여 변이를 유발시킨 다음, 엘-메치오닌 유사체가 첨가된 배지에서 내성을 갖는 변이주들을 선별하고, 이들 중 검정균에 대한 생육저지가 크면서 액체배양시 메비놀린산을 다량 생산하는 변이주를 선발하였다. 이때, 사용한 엘-메치오닌 유사체는 디엘-에치오닌(DL-ethionine), 디엘-노루이신(DL-Norleucine), 셀레노 메치오닌(seleno methionine), 알파-메칠 메치오닌(α-methylmethionine) 또는 시네펀진(sinefungin)등이며, 엘-메치오닌 유사체의 사용량은 3.5~5mg/ml이었다.

이렇게 선발된 상기의 변이주는 배양 10일째에 모균 CKL031에 비하여 메비놀린산을 약 3.8배 이상 생산하였다.

상기에서 얻은 세룰레닌 내성균과 엘-메치오닌 유사체 내성균으로부터, 세룰레닌 및 엘-메치오닌 유사체에 대해 동시 내성을 갖는 변이주를 얻기 위하여, 전기 두가지 내성균을 키리무라(Kirimura) 등의 방법(참조 : Kirimura et al., J. Ferment. Technol., 64(6) : 473-479(1986))으로 세포융합(protoplast fusion)시켰다. 각 내성균의 원형질체를 제조한 다음, 이들을 혼합하여 세룰레닌과 엘-메치오닌 유사체가 첨가된 배지에 도말하였다. 세룰레닌 및 엘-메치오닌 유사체가 첨가된 배지에서 자라는 군락을 선발하고, 이들을 다시 이형이배체(heterodiploid) 유발물질인 디-켐포(d-camphor)를 포함한 고체제한배지에서 배양하여 이들을 회수한 다음, 액체 배양하여 메비놀린산 생산성이 세룰레닌 내성균주에 비해 4배 이상 증가하였고, 모균 CKL031에 비해 15배 이상 증가한 변이주 CLS216-7을 선발하였다.

한편, 선발된 균을 적절히 희석한 후, 1배체(haploid) 유발물질인 베노밀(benomyl)을 첨가하거나 첨가하지 않은 고체배지에 각각 도말하였을 때, 베노밀 첨가배지에서는 각 군락내에서 균의 모양이 서로 다른 2개의 구역을 형성하였다(참조 : Kirimura et al., J. Ferment. Technol., 64(6) : 473-479(1986)). 따라서, 세룰레닌과 엘-메치오닌 유사체에 동시내성을 갖는 본 발명의 변이주 CLS216-7는 균의 메비놀린산 생산능력을 안정적으로 유지하여 산업적 이용에 바람직함을 알 수 있다.

또한, 본 발명에서 선발한 메비놀린산 고생산의 변이주 CLS216-7는 모균에 비해 메비놀린산 유사체의 함량이 약 90%이상 감소하였고, 세룰레닌 내성균 및 엘-메치오닌 유사체 내성균에 비하여 각각 25%, 28%씩 감소하였기 때문에, 산업적 규모의 메비놀린산 생산에 있어서, 발효 후 메비놀린산의 분리 및 정제과정을 단축함으로써 생산원가를 월등히 낮출 수 있는 장점을 갖는다.

본 발명의 변이주 CLS216-7는 탄소원, 질소원, 무기물 및 소포제 등을 포함한 배지에서 25~36℃, 바람직하게는 27~30℃의 배양온도 및 pH 5.5~7.5의 조건에서 배양한다. 이때, 탄소원으로는 락토오스, 덱스트린, 말토오스, 전분, 수용성 전분, 프락토스, 수크로스, 자일로스, 글루코스, 갈락토스, 글리세롤 등을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있는데, 예를 들면 락토오스와 덱스트린, 락토오스와 수용성 전분, 락토오스와 전분, 혹은 말토오스와 수용성 전분 등의 조합이 가능하다. 질소원으로는 콘스팁리커, 건조효모, 펩톤, 카제인, 대두분, 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨 등의 유기태 및 무기태 질소원을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 무기물은 사용하는 배지에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 철, 망간, 구리, 칼슘, 붕소, 몰리브덴, 아연 등을 사용하는 것이 바람직하다. 소포제로서는 실리콘계 다가알콜인 SAG^TM(OSi Specialties Inc., USA), PPG2000(polypropylene glycol 2000) 등을 사용할 수 있다. 특히, 변이주 CLS216-7는 모균과는 달리 글루코스 및 갈락토스와 같은 단량류에 의한 메비놀린산 생산의 저해가 현저히 완화되는 특징을 갖고 있다.

변이주 CLS216-7로부터의 메비놀린산 제조는 통상의 아스퍼질러스 속 균주를 배양하여 이차 대사산물을 얻는 방법에 따라 행할 수 있으며, 메비놀린산은 배양액 및 균체 중에 산 형태(acid form)로 축적되므로, 통상의 방법으로 아세톤과 같은 유기 용매와 혼합한 후 추출 과정을 거쳐 메비놀린 형태로 회수할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

아스퍼질러스 테리우스 CKL043의 제조

토양으로부터 분리한 야생의 아스퍼질러스 테리우스 CKL031을 한천 사면배지(복합배지)에서 배양하고, 생성된 포자를 5ml의 20% 글리세린 용액에 현탁한 다음, 충분히 진탕시키고 탈지면으로 여과하여 포자 현탁액을 회수하였다. 회수된 현탁액을 식염수로 10배 희석하고, 300uw/cm²강도의 자외선으로 90초 동안 처리한 다음, 하기 표 1의 고체복합배지 혹은 고체최소배지에 도말하였다. 이어, 28℃에서 10~15일 동안 배양하여 고체배지상에 나타나는 군락 중에서, 메비놀린산 고생산 변이주에 대한 지표로 사용할 수 있는 아스퍼질러스 나이거를 검정균으로 하여, 이에 대한 생육 저지원이 큰 군락을 분리하여 고체 복합배지에 도말하였다.

그런 다음, 상기에서 도말된 고체복합배지를 28℃에서 20일 동안 배양하고, 20% 글리세린 용액 5ml를 가하여 포자 현탁액을 회수한 다음, 그를 액체배양하였다. 즉, 100ml 삼각 플라스크에 하기 표 2의 전배양 배지 30ml를 넣고, 포자 현탁액을 전배양액에 대하여 5%(v/v) 접종한 다음, 28℃ 및 240rpm의 진탕배양기에서 균주의 생육 정도에 따라 24~48시간 동안 전배양하였다. 이어, 하기 표 2의 본배양 배지 30ml를 포함한 100ml 삼각플라스크에 전기한 전배양액을 본배양액에 대하여 10%(v/v) 접종한 다음, 28℃ 및 240rpm의 진탕배양기에서 균주의 생육 정도에 따라 10~15일 동안 배양하였다.

이렇게 본배양된 배양액(균체포함) 3ml를 아세톤 3ml와 혼합하여 28℃, 240rpm의 진탕배양기에서 30분간 교반하고, 추출액을 원심분리한 다음, 상등액 일정량을 분취하여, 메비놀린산과 그의 유사체를 분석할 수 있는 하기의 조건에서 고속액체클마토그래피(HPLC)하였다.

HPLC의 조건 :

칼럼(column) : Partisil 50DS-3(3um, 4.6×250cm, Whatman, USA)

이동상 : 아세토니트릴 : 0.1% H₃PO₄in D.W. = 60 : 40

온도 : 실온

이동상 유속 : 1.0ml/min

검출 : 235nm

그 결과, 모균 아스퍼질러스 테리우스 CKL031에 비해 메비놀린산 생성능이 약 4.4배 증가되고, 유사체의 함량이 35% 가소된 균주 CKL043을 선발하였다. 이 변이주를 하기 실시예의 세룰레닌 내성균의 디엘-에치오닌 내성균을 각각 선발하는데 사용하였다.

[실시예 2]

세룰레닌 내성균의 제조

실시예 1에서 제조된 친주 아스퍼질러스 테리우스 CKL043을 한천 사면배지(포도당 4g/L, 효모추출물 4g/L, 맥아추출물 10g/L 및 한천 20g/L로 구성된 배지)에서 15~20일간 배양하여 생성된 포자를 20% 글리세린 용액으로 회수한 다음, 충분히 진탕시키고 탈지면으로 여과하여 포자현탁액을 회수하였다. 수득한 현탁액을 식염수로 세척하고, 300uw/cm²의 자외선으로 90초간 처리하여 변이를 유발한 다음, 세룰레닌이 100ug/ml(0.45mM) 첨가된 고체최소배지에 도말하고, 28℃에서 8~12일간 배양하여 생육가능한 변이주들을 분리하였다.

분리된 세룰레닌 내성변이주들은 검정균인 아스퍼질러스 나이거에 대한 생육저지 정도가 친주에 비하여 큰 것들을 일차적으로 선발하고, 이를 실시예 1과 동일한 방법으로 액체배양하여, 메비놀린산 고생산 변이주 5주를 선발하였다.

그런 다음, 세룰레닌 내성이 있고 동시에 메비놀린산을 다량 생산하는 상기의 선발 변이주들을 세룰레닌 농도가 점차 증가하는 고체최소배지(ml당 110,120,130,140,150mg 세룰레닌)에 계대배양하여, 내성도가 가장 증가된 변이주(이하, '아스퍼질러스 테리우스 CLC063'이라 함)를 선별하였다. 이 변이주 CLC063 모균인 CKL031과 친주인 CKL043에 비해 각각 4.4배 및 2.1배의 메비놀린산 생산능을 나타내었는데, 이를 하기 실시예 4의 세포 융합에 사용하였다.

이렇게 선발된 세룰레닌 내성 변이주는 고체배양 및 액체배양시 모균 및 친주에 비해 균증식이 현저히 저하되고, 현미경 관찰시 균사 마디가 짧은 특성을 갖고 있었다.

[실시예 3]

엘-메치오닌의 유사체 내성균의 제조

엘-메치오닌 유사체 내성 변이주는 자외선을 처리한 친주 아스퍼질러스 테리우스 CKL043의 포자 현탁액을 3g/ml 디엘-에치오닌이 포함된 고체최소배지에 도말한다는 점을 제외하고는, 실시예 2의 세룰레닌 내성 변이주의 선발과정과 동일한 방법으로 분리하였다.

분리된 디엘-에치오닌 내성변이주들은 검정균인 아스퍼질러스 나이거에 대한 생육저지 정도가 친주에 비하여 큰 것들을 일차적으로 선발하고, 이를 실시예 1과 동일한 방법으로 액체배양하여, 메비놀린산 고생산 변이주 6주를 선발하였다.

그런 다음, 디엘-에치오닌 내성이 있고 동시에 메비놀린산을 다량 생산하는 상기의 선발 변이주들을 디엘-에치오닌 농도가 점차 증가하는 고체최소배지(ml당 3.5,4.0,4.5,5mg 디엘-에치오닌)에 계대배양하여, 내성도가 가장 증가된 변이주(이하, '아스퍼질러스 테리우스 CLE082'이라 함)를 선별하였다. 이 변이주 CLE082의 메비놀린산 생산능은 2.8g/L로서, 모균인 CKL031에 비해 3.8배, 친주인 CKL043에 비해 1.8배 증가하였으며, 이를 하기 실시예 4의 세포융합에 사용하였다.

한편, 디엘-에치오닌 내성 변이주 CLE082는 액체배양시 1.0g/L 엘-메치오닌을 첨가하였을 때, 메비놀린산 생산성이 엘-메치오닌 무첨가의 경우에 비해 약 10% 증가하였고, 같은 농도의 엘-메치오닌을 첨가한 모균 CKL031 및 친주 CKL043에서는 각각 20%, 15%씩 감소하였다.

[실시예 4]

세룰레닌 및 디엘-에치오닌 동시 내성균인 아스퍼질러스 테리우스 CLS216-7의 제조

(1) 원형질체의 제조

세룰레닌 내성 변이주인 CLC063과 디엘-에치오닌 내성 변이주인 CLE082를 각각 포자 농도가 2×10⁶/ml 되도록 액체제한 배지 50ml를 포함하는 500ml 사까구치(Sakaguchi) 플라스크에 현탁한 다음, 28℃ 및 230rpm의 진탕배양기에서 24시간 동안 호기적으로 배양하였다.

이와 같이 배양한 균사체를 제한 입자크기가 20~30um인 글래스필터(Shibata Scientific Technology, Ltd., JAPAN)로 여과한 다음, 0.7M KC1이 포함된 0.05M 인산완충용액(pH 6.0)으로 두 번 세척하고 균사체를 회수하였다. 이어, 균사체를 Whatman No.1의 필터 페이퍼(Whatman, USA)로 옮긴 후, 다시 완충용액으로 세척하고, 세척된 균사체 250mg(wet weight)을 취하여 세포벽 분해효소 혼합용액(Novozym 234(Novo Enzyme Products Ltd, Denmark) and 셀룰레이즈 CP(John and E. sturge Ltd, United Kingdom)) 10ml에 현탁한 다음, 50ml 엘렌마이어 플라스크에서 30℃, 60rpm으로 2시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 혼합물을 제한 입자크기가 20~30um인 글래스필터로 여과하여 균사체 찌꺼기를 제거하였고, 필터를 통과한 여액내의 원형질체의 수는 현미경하에서 헤미사이토메터로 측정하였다.

원형질체들을 순수분리하기 위하여, 필터를 통과한 여액 8ml를 1.4M 솔비톨 용액 1ml에 가한 다음, 800×g에서 15분 동안 원심분리하여 솔비톨 층에 모이는 원형질체를 회수하고, 완충용액을 가하여 원심분리하고 세척하였다.

(2) 원형질체의 세포융합

상술한 방법으로 각각 제조한 세룰레닌 내성 변이주 CLC063과 디엘-에치오닌 내성 변이주 CLE082의 원형질체를 2×10⁷: 2×10⁷근처에서 몇가지 서로 다른 비율로 혼합한 다음, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 용액(30%(w/v) PEG 6000, 0.01M CaCl₂및 0.5M KCl를 포함한 0.05M 글리신-NaOH 완충용액(pH 7.5))을 첨가하여 최종 부피 5ml가 되도록 하였다. 이어, 30℃에서 10분 동안 방치하고 0.7M KCl이 포함된 0.05M 인산 완충용액(pH 6.0)으로 천천히 희석한 다음, 800×g에서 15분 동안 원심분리하고 전기 완충용액으로 재현탁하였다. 재현탁된 원형질체들을 희석하여, 0.7M KCl을 포함하는 고체최소배지(SMM) 및 150ug/ml의 세룰레닌과 5mg/ml의 디엘-에치오닌을 포함하면서 0.7M KCl을 포함하는 고체최소배지(SMMCE)에 각각 도말한 다음, 별도로 0.5% 한천을 추가로 포함하는 전기 고체최소배지(SMM) 및 고체최소배지(SMMCE)를 40℃로 미리 예열하여, 전기 도말 고체배지 위에 0.3cm 두께로 따른 후, 30℃에서 5일 동안 배양하여 원형질체를 재생시켰다.

그 결과, 원형질체 재생률은 모균의 경우 12%이었으며, 세룰레닌 내성균과 엘-메치오닌 유사체 내성균의 경우 각각 7% 및 11%이었다. 또한, 고체최소배지(SMMCE)와 고체최소배지(SMM)에서 형성되는 군락 수의 비율로서 표현되는 세포융합 빈도는 5.8%이었다. 한편, 재생과정에서 셀룰레닌 및 디엘-에치오닌 내성균들이 다시 천주인 CLC063 및 CLE082의 특성으로 전환되는 비율(reversion frequency)은 각각 2.5×10^-6, 5.8×10^-6정도로서 무시할 만큼 낮았다.

상술한 방법에 따라 세룰레닌과 디엘-에치오닌을 첨가한 고체최소배지에서 자라는 군락을 여러주 선발하였고, 이들을 다시 이형이배체(heterodiploid) 유발물질인 디-캠포(d-camphor) 0.5g/L 포함한 고체최소배지에서 3세대에 걸쳐 각각 10일 동안 배양한 후, 최종적으로 세룰레닌과 디엘-에치오닌에 대해 동시내성을 보유하고 메비놀린산의 생산능력이 가장 증가된 변이주 CLS216-7를 선발하였다. 또한, 변이주 CLS216-7은 2g/L 효모추출물을 포함한 고체최소배지에서 10세대 동안 균의 형태적 특성, 세룰레닌 및 디엘-에치오닌에 대한 동시 내성, 그리고 메비놀린산의 고생산 능력을 일정하게 유지함을 확인하였다.

이에, 본 발명의 변이주 아스퍼질러스 테리우스 CLS216-7는 1997년 7월 29일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0359BP로 기탁되었다.

[실시예 5]

세포융합 변이주 CLS216-7와 야생균주 CKL031의 균학적 특성

본 발명의 세포융합 변이주 CLS216-7와 야생균주 CKL031를 표 2에 본배양 배지에서 13일간 배양한 균주의 특성을 형태학적, 배양상 및 생리학적 측면에서 조사하여 비교한 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 본 발명에서 지방산 생합성 억제제인 세룰레닌을 내성균 선발에 이용하였고, 지방산 및 스테롤 생합성이 메비놀린산 생합성과 전구체(Acetyl-CoA) 이용에 있어서 경쟁관계에 있기 때문에, 메비놀린산 고생산의 변이주 CLS216-7와 모균 CKL031 사이에 지방산 및 스테롤의 함량을 비교하였다. 이때, 지방산 및 스테롤은 호소부치(Hosobuchi) 등(참조 : Hosobuchi et al., Biosci. Biotech. Biochem., 57(9) : 1414-1419(1933))의 방법으로 분석하였다.

상기 표 3에서 보듯이, 변이주 CLS216-7는 야생균(CKL031)에 비해 고체 배지상에서 포자 형성능이 현저히 줄었으며, 세포막 구성성분인 올레산 17% 감소하고, 에르고스테롤 양은 1/6 수준이며, 세룰레닌과 디엘-에치오닌에 의한 생육 최소저지 농도가 각각 3배와 4.5배로 증가한 특성을 나타내었다. 또한, 액체배양시 균의 생육속도 및 생육정도는 모균에 비해 변이주 CLS256-7에서 휠씬 감소하였는데, 모균(CKL031)의 비성장속도는 0.40이고 배양 24시간에 L당 7.2g의 건조세포증량을 나타내었지만, 변이주 CLS256-7의 비성장속도는 0.31이고 배양 48시간에 이르러서야 L당 5.6g의 건조세포중량을 나타내었다.

한편, 야생주 CKL031 및 세포융합 변이주 CLS216-7의 배양액을 아세톤으로 추출하고, 그를 실시예 1의 HPLC 조건에서 고속액체크로마토그래피하였다(참조 : 제1도 및 제2도). 제1 및 2도에서, A는 유기산, B는 아세톤, C는 유사체, D는 메비놀린산 및 E는 메비놀린을 각각 나타낸다. 제1 및 2도에서 보듯이, 배양액에 축적되는 유사체의 양이 야생균(CKL031)에 비해 세룰레닌 및 디엘-에치오닌 동시 내성 변이주 CLS216-7에서는 90% 이상 감소하는 것을 알 수 있었다.

이와 같은 메비놀린산 유사체의 현저한 감소와 더불어 메비놀린산 생산능이 약 17배 이상 증가(참조 : 상기 표 3)하였기 때문에, 변이주 CLS216-7는 산업적 규모의 메비놀린산 발효생산에 매우 효과적임을 알 수 있었다.

[실시예 6]

변이주 CLS216-7와 야생균주 CKL031의 탄소원 종류에 따른 메비놀린산 생산량 조사

상기 실시예 1에서와 같이 배양하되, 본배양 배지의 탄소원을 하기 표 4와 같이 변경하고 13일간 배양하였을 때, 모균 CKL031 및 변이주 CLS216-7에 의한 메비놀린산의 생산량을 조사하여 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 보듯이, 글루코스 또는 갈락토스를 이용한 발효에서 메비놀린산 생산능력이 현저히 저하되는 모균 CKL031과는 달리, 본 발명의 변이주 CLS216-7는 전기 단당류를 이용한 발효에 있어서도 다당류를 이용한 발효에서 생성되는 메비놀린산의 양과 별 차이가 없는 것으로 확인되었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 세룰레닌과 엘-메치오닌 유사체에 대해 동시 내성을 갖는 본 발명의 변이주 CLS216-7은 모균인 아스퍼질러스 테리우스 CKL031 및 친주 CKL043에 비해 메비놀린산의 생성능이 현저히 높으면서 부산물(메비놀린산 유사체)을 적게 생산하는 장점을 갖고 있으며, 또한 모균과는 달리 탄소원인 글루코스 및 갈락토스에 의한 메지놀린산 생산의 저해가 현저히 완화되는 특징을 갖고 있다.

Claims

메비놀린산(mevinolinic acid) 고생산능을 가지며, 세룰레닌(cerulenin) 및 엘-메치오닌(L-methionine) 유사체에 대해 동시 내성을 갖는 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus)CLS216-7 (KCTC 0359BP).
제1항에 있어서, 엘-메치오닌 유사체는 디엘-에치오닌(DL-ethionine), 디엘-노루이신(DL-Norleucine), 셀레노 메치오닌(seleno methionine), 알파-메칠 메치오닌(α-methylmethionine) 또는 시네펀진(sinefungin)인 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus)CLS216-7 (KCTC 0359BP).
제1항에 있어서, 토양에서 분리한 야생의 아스퍼질러스 테리우스에 자외선 또는 화학물질의 돌연변이원을 처리하여 얻은 세룰레닌 내성 변이주와 엘-메치오닌 유사체 내성 변이주를 원형질체의 세포융합법에 융합시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) CLS216-7(KCTC 0359BP).
제1항에 있어서, 메비놀린산의 생산능은 모균인 야생의 아스퍼질러스 테리우스 CKL031(KCTC 0359BP)에 비해 15배 이상 증가한 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) CLS216-7(KCTC 0359BP).
제1항에 있어서, 글루코스 또는 갈락토스를 탄소원으로 이용한 발효시, 이들 단당류에 의한 메비놀린산 생산의 저해는 나타나지 않는 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) CLS216-7(KCTC 0359BP).
제1항에 있어서, 메비놀린산 유사체의 생산능은 모균인 야생의 아스퍼질러스 테리우스에 비해 약 90% 이상 감소한 것을 특징으로 하는 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) CLS216-7(KCTC 0359BP).
제1항의 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) CLS216-7(KCTC 0359BP)를 영양배지에서 호기적으로 배양하여 메비놀린산을 축적한 후, 배양액으로부터 메비놀린산을 회수하는 공정을 포함하는 메비놀린산의 제조방법.
제7항에 있어서, 아스퍼질러스 테리우스(Aspergillus terreus) CLS216-7(KCTC 0359BP)는 탄소원, 질소원, 무기물 및 소포제를 포함한 배지에서 25~36℃의 배양온도 및 pH 5.5~7.5의 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 메비놀린산의 제조방법.
제8항에 있어서, 영양배지에 첨가되는 락토오스, 덱스트린, 말토오스, 수용성 전분, 전분, 프락토스, 수크로스, 자일로스, 글루코스, 갈락토스 및 글리세롤로 구성된 그룹에서 선택되는 1종 이상의 당인 것을 특징으로 하는 메비놀린산의 제조방법.