JP5709154B2

JP5709154B2 - 酵母変異株

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Publication number: JP5709154B2
Application number: JP2010020440A
Authority: JP
Inventors: 岸本　憲明; 憲明岸本; 淳志倉田; 和志宮川; 一裕吉本
Original assignee: Kinki University
Current assignee: Kinki University
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2010-02-01
Publication date: 2015-04-30
Anticipated expiration: 2030-02-01
Also published as: JP2011155908A

Description

本発明は、酵母変異株に関する。さらに詳しくは、例えば、不飽和脂肪酸化合物からヒドロキシ不飽和脂肪酸、オキソ不飽和脂肪酸などの所望の不飽和脂肪酸誘導体を得るのに有用な酵母変異株に関する。

ヒドロキシ不飽和脂肪酸、オキソ不飽和脂肪酸などの不飽和脂肪酸誘導体は、抗菌作用、抗アレルギー作用などの生理活性を示すことが知られている。

しかしながら、前記不飽和脂肪酸誘導体は、その種類によっては動物や植物にごく微量でしか含まれないため、一般に、前記不飽和脂肪酸誘導体を動物や植物から大量に取得することが困難であると考えられている。また、動物や植物における前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能は、不飽和脂肪酸誘導体の種類によっては低いため、前記不飽和脂肪酸誘導体を大量に生産し、安定的に供給することが困難であると考えられている。一方、前記不飽和脂肪酸誘導体を化学的に合成する方法が考えられるが、この方法には、通常、煩雑な工程を必要とし、生産効率が低いという欠点がある。

そこで、自然界より単離されたカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属またはヤロワイア（Ｙａｌｌｏｗｉａ）属の微生物を用いて不飽和脂肪酸誘導体を生産する方法が、本発明者らによって提案されている（例えば、特許文献１参照）。

しかしながら、前記方法に用いられる微生物は、培養物中の不飽和脂肪酸誘導体の量の増加に伴い、その生育が抑制されるおそれがある。

特開２００８−１３６４８８号公報

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、不飽和脂肪酸誘導体を大量に生産し、培養物中における不飽和脂肪酸誘導体の蓄積量が増加しても良好に生育する酵母変異株を提供することを課題とする。

本発明は、
（１）一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ¹は水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ²は炭素数２〜１５のアルキル基を示す）
で表される不飽和脂肪酸化合物を、一般式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ¹は前記と同じ。Ｒ³はヒドロキシル基を有する炭素数２〜１５のアルキル基またはケトン基を有する炭素数２〜１５のアルキル基を示す）
で表される不飽和脂肪酸誘導体に変換する能力を有し、カンジダマルトーサに属する酵母変異株であって、
未変異の親株よりも低いエステラーゼ活性を有し、かつ前記未変異の親株よりも一般式（ＩＩ）に示される不飽和脂肪酸誘導体の生産性が高く、トランス−２−デセン酸エチルエステルを１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸に変換する能力を有し、
前記未変異の親株がカンジダマルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）ＫＵ８３（受託番号：ＮＩＴＥＰ-２６６）である酵母変異株、および
（２）前記酵母変異株が、カンジダマルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）ＫＵ８３−２６（受託番号：ＮＩＴＥＰ−８５５）である前記（１）に記載の酵母変異株
に関する。

本発明の酵母変異株は、不飽和脂肪酸誘導体を大量に生産し、培養物中における不飽和脂肪酸誘導体の蓄積量が増加しても良好に生育するという優れた効果が奏される。

実施例３において、培養物の培養上清中におけるトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の各濃度の経時的変化を示すグラフである。比較例１において、培養物の培養上清中におけるトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の各濃度の経時的変化を示すグラフである。実施例４で得られたカンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養上清のＨＰＬＣのクロマトグラムである。試験例１において、培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量の経時的変化を示すグラフである。実施例６において、培養物１Ｌあたりのトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量の経時的変化を示すグラフである。比較例３において、培養物１Ｌあたりのトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量の経時的変化を示すグラフである。

本発明の酵母変異株は、一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ¹は水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ²は炭素数２〜１５のアルキル基を示す）
で表される不飽和脂肪酸化合物（以下、単に「不飽和脂肪酸化合物」という）を、一般式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ¹は前記と同じ。Ｒ³はヒドロキシル基を有する炭素数２〜１５のアルキル基またはケトン基を有する炭素数２〜１５のアルキル基を示す）
で表される不飽和脂肪酸誘導体（以下、単に「不飽和脂肪酸誘導体」という）に変換する能力を有し、カンジダマルトーザに属する酵母変異株であり、
未変異の親株よりも低いエステラーゼ活性を有し、かつ前記未変異の親株よりも一般式（ＩＩ）に示される不飽和脂肪酸誘導体の生産性が高いことを特徴とする。

本発明者らは、カンジダマルトーザに変異処理を施し、当該カンジダマルトーザのエステラーゼの活性を未変異の親株よりも低減させるか、または前記エステラーゼを欠損させたところ、前記不飽和脂肪酸誘導体の１つである１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の生産能が前記未変異の親株よりも著しく向上することを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。

本発明の酵母変異株は、未変異の親株と比べてエステラーゼ産生能が低く、前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能が高いので、前記不飽和脂肪酸誘導体を工業的に大量に生産するという優れた効果を奏する。しかも、本発明の酵母変異株は、培養物中における不飽和脂肪酸誘導体の蓄積量が増加しても生育が良好であるという優れた効果を奏する。

一般式（Ｉ）において、Ｒ¹は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基である。このアルキル基の炭素数は、前記酵母変異株による基質特異性の観点から、１以上、好ましくは２以上であり、工業的生産性の観点から、４以下、好ましくは３以下である。炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基およびブチル基が挙げられる。

一般式（Ｉ）において、Ｒ²は、炭素数２〜１５のアルキル基である。このアルキル基の炭素数は、前記酵母変異株による基質特異性の観点から、２以上、好ましくは３以上であり、工業的生産性の観点から、１５以下、好ましくは９以下である。炭素数２〜１５のアルキル基としては、例えば、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などに代表される炭素数２〜１５の直鎖アルキル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などに代表される分岐鎖を有する炭素数２〜１５のアルキル基などが挙げられる。Ｒ²のなかでは、前記酵母変異株による基質特異性の観点から、ヘキシル基が好ましい。

一般式（ＩＩ）において、Ｒ¹は、一般式（Ｉ）におけるＲ¹と同じである。また、Ｒ³は、一般式（Ｉ）におけるＲ²がヒドロキシル化またはケトン化された基であり、より具体的には、ヒドロキシル基を有する炭素数２〜１５のアルキル基またはケトン基を有する炭素数２〜１５のアルキル基である。Ｒ³の炭素数は、前記酵母変異株による基質特異性の観点から、２以上、好ましくは３以上であり、工業的生産性の観点から、１５以下、好ましくは９以下である。Ｒ³の具体例としては、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシペンチル基、５−ヒドロキシペンチル基、５−ヒドロキシヘキシル基、６−ヒドロキシヘキシル基、６−ヒドロキシヘプチル基、７−ヒドロキシヘプチル基、７−ヒドロキシオクチル基、８−ヒドロキシオクチル基などに代表される炭素数２〜１５のヒドロキシアルキル基；２−プロパノニル基、３−ブタノニル基、４−ペンタノニル基、５−ヘキサノニル基などに代表される炭素数２〜１５のケトン基含有アルキル基などが挙げられる。Ｒ³のなかでは、前記酵母変異株による基質特異性の観点から、５−ヘキサノニル基が好ましい。

前記未変異の親株としては、カンジダマルトーザに属し、前記不飽和脂肪酸化合物を前記不飽和脂肪酸誘導体に変換する能力を有し、かつ自然界から単離された微生物が挙げられる。前記未変異の親株は、カンジダマルトーザに属に属する微生物のなかでは、前記不飽和脂肪酸化合物を前記不飽和脂肪酸誘導体に変換する能力が比較的高いことから、好ましくはカンジダマルトーザＫＵ８３株〔ＣａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａＫＵ８３と命名・表示され、受託日：２００６年１０月４日、受託番号：ＮＩＴＥＰ-２６６として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている〕である。

本発明の酵母変異株は、
（ａ）球形または短卵形の形態を有し、偽菌糸を形成している、
（ｂ）（３．６〜７．２μｍ）・（３．６〜７．９μｍ）の大きさを有する、
（ｃ）２５℃で１ヵ月間培養した場合、クリーム色を呈し、円滑な外観を有し、偽菌糸の周縁部にシワを有するコロニーを形成する、
（ｄ）グルコース、シュクロースおよびトレハロースをそれぞれ発酵する、
（ｅ）ガラクトース、シュクロース、マルトース、トレハロース、メレジトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルシトール、サリシンおよびコハク酸をそれぞれ資化する、
（ｆ）Ｑ９のキノンを有する、
（ｇ）３５．６〜３６．８ｍｏｌ％のＧ＋Ｃ含量を有する
という、カンジダマルトーザに属する微生物に共通する微生物学的性質を有する。

本発明の酵母変異株は、不飽和脂肪酸誘導体を大量に生産し、培養物中における不飽和脂肪酸誘導体の蓄積量が増加しても生育が良好であることから、カンジダマルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）ＫＵ８３−２６〔ＣａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａＫＵ８３−２６と命名・表示され、受託日：２００９年１２月２４日、受託番号：ＮＩＴＥＰ-８５５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている〕が好ましい。

本発明の酵母変異株であるカンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、
（Ａ）エステラーゼ活性が、カンジダマルトーザＫＵ８３のエステラーゼ活性と比べて低い（０．９倍以下、好ましくは０．８５倍以下）、
（Ｂ）前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能が、カンジダマルトーザＫＵ８３の前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能と比べて高い（少なくとも１．１倍、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、特に好ましくは２倍以上）、
（Ｃ）カンジダマルトーザＫＵ８３が、Ｄ−アラビトール、Ｄ−アドニトール、Ｄ−フルクトースを資化するのに対し、Ｄ−アラビトール、Ｄ−アドニトール、Ｄ−フルクトースを資化しない、
（Ｄ）カンジダマルトーザＫＵ８３が、アルブチンを分解するのに対し、Ｄ−アラビトール、Ｄ−アドニトール、Ｄ−フルクトース、アルブチンを分解しない、
（Ｅ）カンジダマルトーザＫＵ８３が、グリコーゲンを資化しないのに対して、グリコーゲンを資化する、
（Ｆ）Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−シュクロースそれぞれの資化速度が、カンジダマルトーザＫＵ８３によるＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−シュクロースそれぞれの資化速度と比べて遅い、
（Ｇ）ガラクトースの資化速度が、カンジダマルトーザＫＵ８３によるガラクトースの資化速度よりも速い、
（Ｈ）カンジダマルトーザＫＵ８３では、トランス−２−デセン二酸エチルエステルを生産しないのに対し、トランス−２−デセン二酸エチルエステルを生産する
という点で、カンジダマルトーザＫＵ８３株とは大きく異なる性質を有する。

本発明の酵母変異株は、例えば、前記未変異の親株に変異処理を施し、変異処理株を得、得られた変異処理株のうち、未変異の親株と比べてエステラーゼ産生能が低く、前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能が高い変異処理株を選別することにより作製することができる。

前記変異処理としては、特に限定されないが、例えば、前記未変異の親株に変異原物質を曝露すること、前記未変異の親株に対して紫外線または放射線を照射することなどが挙げられる。前記変異原物質としては、例えば、エチルメタンスルフォン酸、ニトロソグアニジンなどが挙げられる。

未変異の親株と比べてエステラーゼ産生能が低いことは、例えば、酪酸ｐ-ニトロフェニルを基質として用い、本発明の酵母変異株に含まれるエステラーゼにより、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、２８℃の条件下で前記基質中のエステル結合が切断されることにより１０分間に生じるｐ-ニトロフェノールの量Ａと、同条件下で、前記未変異の親株に含まれるエステラーゼにより前記基質中のエステル結合が切断されることにより１０分間に生じるｐ-ニトロフェノールの量Ｂとを比較することによって確認することができる。このとき、前記ｐ-ニトロフェノールの量Ｂと比べて前記ｐ-ニトロフェノールの量Ａが少ないことが、未変異の親株と比べて本発明の酵母変異株が低いエステラーゼ活性を有することの判断基準となる。本発明の酵母変異株のエステラーゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成するのに要するエステラーゼの量を当該エステラーゼ活性の１単位として換算すると、未変異の親株のエステラーゼ活性に対して、０．８５倍以下である。

また、本発明の酵母変異株が未変異の親株と比べて前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能が高いことは、例えば、
（１）トランス−２−デセン酸を含有する液体培地中で本発明の酵母変異株を培養するステップ、
（２）前記ステップ（１）で得られた培養物から酵母変異株の細胞を除去して培養上清を得るステップ、および
（３）前記ステップ（２）で得られた培養上清中における１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量（以下、「生産量Ａ」という）を測定するステップ、
（４）前記ステップ（３）で測定された生産量Ａと、前記（１）〜（３）と同様の条件で測定された前記未変異の親株による１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の生産量（以下、「生産量Ｂ」という）とを比較するステップ
を行なうことなどにより確認することができる。

前記ステップ（１）において、本発明の酵母変異株の培養は、当該酵母変異株の生育状態を良好に維持する観点から、好ましくは２０〜３７℃、より好ましくは２２〜３０℃、さらに好ましくは２６〜２９℃の培養温度で、２４〜６０時間の培養時間で行なうことができる。

前記ステップ（１）で用いられるトランス−２−デセン酸を含有する液体培地としては、特に限定されないが、例えば、イーストアンドモールド（ＹＭ）培地、ＬＭ培地、ポテトデキストロース（ＰＤ）培地、サブロー培地、ツァペック酵母エキス培地、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス（ＳＣＤ）培地、半合成培地などの培地にトランス−２−デセン酸を添加して得られた培地などが挙げられる。

トランス−２−デセン酸を含有する液体培地としては、特に限定されないが、例えば、トランス−２−デセン酸とグルコースとＫＨ₂ＰＯ₄とＮａ₂ＨＰＯ₄と酵母エキスとを含有し、さらに任意にポリペプトン、尿素、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏなどを含有する培地などが挙げられる。

トランス−２−デセン酸を含有する液体培地としては、特に限定されないが、例えば、トランス−２−デセン酸０．１質量％とグルコース３．０質量％とＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２質量％とＮａ₂ＨＰＯ₄ ０．３５質量％とＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５質量％と酵母エキス０．０２５質量％とポリペプトン０．０２５質量％と尿素０．３質量％とＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ０．００２質量％とＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００２質量％とＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００２質量％とを含有する培地（ｐＨ６．９）、イーストアンドモールド（ＹＭ）培地〔組成：酵母エキス０．３質量％、麦芽エキス０．３質量％、ポリペプトン０．５質量％、グルコース１．０質量％、蒸留水（残部）〕を基本培地とし、かつトランス−２−デセン酸０．１質量％を含有する培地などが挙げられる。

前記ステップ（２）において、培養上清は、前記ステップ（１）で得られた培養物を遠心分離に供し、酵母変異株の細胞を除去する方法、前記培養物を適切な孔径（例えば、０．４５μｍ）のフィルターに供し、酵母変異株の細胞を除去する方法などによって得ることができる。

前記ステップ（３）において、前記生産量Ａは、例えば、前記培養上清を、適切な溶離液を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）に供し、波長２１５ｎｍにおける吸光度をモニターし、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の標品と同じ保持時間のピークの面積を算出し、検量線と比較することにより求めることができる。

前記ＨＰＬＣには、例えば、全多孔性球状シリカゲル（例えば、平均粒子径：約５μｍ、平均細孔径：約１２ｎｍ、比表面積：約３００ｍ²／ｇ、化学結合：三反応性基型オクタデシル基結合など）を用いたカラム（カラムの大きさ：４．６ｍｍ・２５０ｍｍ）などを用いることができる。カラムとしては、特に限定されないが、ナカライテスク(株)製、商品名：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ₁₈−ＡＲ−ＩＩＷａｔｅｒｓｔｙｐｅカラム（カラムの大きさ：４．６ｍｍ・２５０ｍｍ、ＣｏｄｅＮｏ．３８１４５−２１）などが挙げられる。このカラムを用いる場合、例えば、カラム温度３５℃および流速１ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液Ａ〔アセトニトリル／テトラヒドロフラン／蒸留水（容量比）＝４０．６／１７．４／４２．０〕による１５分間の溶出、溶出液Ｂ（アセトニトリル）による１５分間の溶出、および前記溶出液Ａによる２５分間の溶出を順に行なうことにより、ＨＰＬＣを行なうことができる。

前記ステップ（４）において、前記生産量Ａが前記生産量Ｂと比べて多いことが、本発明の酵母変異株が未変異の親株と比べて１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の高い生産性を有することの判断基準となる。本発明の酵母変異株による１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の生産量Ａが未変異の親株による１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の生産量Ｂに対して、少なくとも１．１倍、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、特に好ましくは２倍以上であることが、未変異の親株と比べて１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の生産性が高いことの判断基準となる。

トランス−２−デセン二酸エチルエステルの産生能は、例えば、
（Ｉ）トランス−２−デセン酸を含有する液体培地中で本発明の酵母変異株を培養するステップ、
（II）前記ステップ（Ｉ）で得られた培養物から酵母変異株の細胞を除去して培養上清を得るステップ、および
（III）前記ステップ（II）で得られた培養上清中におけるトランス−２−デセン二酸エチルエステルの存在の有無を評価するステップ
を含む方法によって確認することができる。

前記ステップ（Ｉ）および（II）は、前記ステップ（１）および（２）と同様にして行なうことができる。

前記ステップ（III）において、トランス−２−デセン二酸エチルエステルの存在の有無は、例えば、前記培養上清を、適切な溶離液を用いたＨＰＬＣに供し、波長２１５ｎｍにおける吸光度をモニターし、トランス−２−デセン二酸エチルエステルの標品と同じ保持時間のピークの有無を検出することにより、確認することができる。前記ＨＰＬＣは、前記ステップ（３）の場合と同様にして行なうことができる。

本発明の酵母変異株は、未変異の親株と比べてエステラーゼ産生能が低く、前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能が高いので、前記不飽和脂肪酸化合物を前記不飽和脂肪酸誘導体に変換することができ、しかも、前記未変異の親株と比べて、前記不飽和脂肪酸誘導体を高い効率で大量に製造することができる。

前記不飽和脂肪酸誘導体の製造方法は、前記不飽和脂肪酸化合物を当該酵母変異株、前記酵母変異株の細胞破砕物または前記酵母変異株の無細胞抽出物に接触させることを特徴とする。

前記製造方法は、不飽和脂肪酸誘導体を製造する際に、前記酵母変異株、前記酵母変異株の培養物、前記酵母変異株の細胞破砕物または前記酵母変異株の無細胞抽出物が用いられている点に、１つの大きな特徴を有する。

したがって、前記製造方法によれば、例えば、化学的合成法によって不飽和脂肪酸誘導体を製造する場合のような煩雑な工程を必要としないので、簡便な操作で不飽和脂肪酸誘導体を製造することができるという優れた効果が奏される。また、前記製造方法によれば、不飽和脂肪酸誘導体を製造する際に前記酵母変異株が用いられているので、本質的に内在している酵素を利用して不飽和脂肪酸化合物から不飽和脂肪酸誘導体への変換反応を行なうことができることから、安定した変換活性が得られるという優れた効果が奏される。さらに、前記酵母変異株は、未変異の親株と比べてエステラーゼ産生能が低く、不飽和脂肪酸誘導体の生産能が高く、しかも、培養物中における不飽和脂肪酸誘導体の蓄積量が増加しても生育が良好である。したがって、前記製造方法によれば、前記酵母変異株の培養物中における不飽和脂肪酸誘導体の蓄積量が増加しても、前記未変異の親株を用いて不飽和脂肪酸誘導体を製造する場合と比べて、不飽和脂肪酸誘導体を大量に、かつ継続して安定的に製造することができる。

前記酵母変異株、前記酵母変異株の細胞破砕物および前記酵母変異株の無細胞抽出物のなかでは、不飽和脂肪酸誘導体を簡便に製造する観点から、前記酵母変異株が好ましい。

不飽和脂肪酸化合物と前記酵母変異株との接触は、例えば、不飽和脂肪酸化合物を含有する培地中で前記酵母変異株を培養する方法、前記酵母変異株を担体に固定化させた固定化酵母変異株担体または前記酵母変異株を包括剤に包括固定化させた包括物を、不飽和脂肪酸化合物を含有する培地または不飽和脂肪酸化合物を含有する緩衝液中で維持する方法などによって行なうことができる。

不飽和脂肪酸化合物を含有する培地中で前記酵母変異株を培養する場合、用いられる培地（以下、「変換培地」ともいう）としては、例えば、不飽和脂肪酸化合物とグルコースとを含有する培地などが挙げられる。

前記変換培地中の不飽和脂肪酸化合物の濃度は、不飽和脂肪酸誘導体への変換率を高める観点から、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上であり、前記酵母変異株を良好な生育状態で維持させる観点から、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下、さらに好ましくは１質量％以下である。

また、前記変換培地中のグルコース濃度は、前記酵母変異株による不飽和脂肪酸化合物から不飽和脂肪酸誘導体への変換効率をより高める観点から、好ましくは３質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは７．５質量％以上であり、不飽和脂肪酸誘導体への変換を十分に行ない、かつ不飽和脂肪酸誘導体への変換の経済性を高める観点から、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１５質量％以下である。

培養前の前記変換培地のｐＨは、前記酵母変異株の生育を良好にする観点から、好ましくは５以上、より好ましくは６．５以上であり、高い効率で変換反応を行なう観点から、好ましくは８以下、より好ましくは７．５以下である。

前記変換培地には、所望のｐＨとなるようにするために、例えば、ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｎａ₂ＨＰＯ₄などを用いることができる。前記変換培地中のＫＨ₂ＰＯ₄の濃度は、前記酵母変異株による不飽和脂肪酸化合物から不飽和脂肪酸誘導体への変換効率をより高める観点から、好ましくは０．０５〜５質量％、より好ましくは０．１〜１質量％、さらに好ましくは０．１〜０．３質量％である。また、前記変換培地中のＮａ₂ＨＰＯ₄の濃度は、前記酵母変異株による不飽和脂肪酸化合物から不飽和脂肪酸誘導体への変換効率をより高める観点から、好ましくは０．０５〜５質量％、より好ましくは０．１〜１質量％、さらに好ましくは０．３〜０．５質量％である。

前記変換培地には、前記酵母変異株の生育能や前記酵母変異株による変換効率を高める観点から、酵母エキスが含まれていてもよい。前記変換培地中の酵母エキスの濃度は、前記酵母変異株による不飽和脂肪酸化合物から不飽和脂肪酸誘導体への変換効率をより高める観点から、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０２質量％以上であり、不飽和脂肪酸誘導体への変換を十分に行なうとともに、不飽和脂肪酸誘導体への変換の経済性を高める観点から、好ましくは５質量％以下、より好ましくは１質量％以下、さらに好ましくは０．０３質量％以下である。

前記変換培地には、必要により、ポリペプトン、尿素、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏなどが含まれていてもよい。

前記変換培地としては、特に限定がないが、例えば、不飽和脂肪酸化合物がトランス−２−デセン酸である場合、トランス−２−デセン酸を０．０１〜１０質量％（例えば、０．１質量％など）と、グルコースを３〜２０質量％（例えば、３質量％など）と、ＫＨ₂ＰＯ₄を０．０５〜５質量％（例えば、０．２質量％など）と、Ｎａ₂ＨＰＯ₄を０．０５〜５質量％（例えば、０．３５質量％など）と、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを０．０１〜１質量％（例えば、０．０５質量％など）と、酵母エキスを０．０１〜５質量％（例えば、０．０２５質量％など）と、ポリペプトンを０〜１質量％（例えば、０．０２５質量％など）と、尿素を０．０３〜３質量％（例えば、０．３質量％など）と、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏを０．０００１〜０．０１質量％（例えば、０．００２質量％など）と、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを０．０００１〜０．０１質量％（例えば、０．００２質量％など）と、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを０．０００１〜０．０１質量％（例えば、０．００２質量％など）と、蒸留水（残部）とを含有する培地〔ｐＨ５〜８（例えば、ｐＨ６．９など）〕、トランス−２−デセン酸を０．０１〜１０質量％（例えば、０．１質量％など）を含有し、かつイーストアンドモールド（ＹＭ）培地を基本培地とした培地などが挙げられる。前記変換培地は、例えば、乾燥状態の組成物として入手することができる。前記変換培地は、例えば、乾燥状態の変換培地の組成物を水に溶解させ、滅菌フィルターなどで濾過することにより、得ることができる。

前記酵母変異株の培養温度は、酵母変異株の生育状態を良好に維持する観点から、好ましくは２０〜３７℃、より好ましくは２４〜３０℃、さらに好ましくは２７〜２９℃である。前記酵母変異株の培養時間は、不飽和脂肪酸誘導体の生産性を高める観点から、好ましくは１２〜１２０時間、より好ましくは２４〜６０時間である。

なお、より高い変換効率で１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を製造する観点から、前記ステップ（１）において、例えば、ドデカンなどの中鎖の炭化水素、好ましくは炭素数５〜１２の炭化水素を含む培地を用いて前培養を行なった後、前記変換培地で培養することが好ましい。

不飽和脂肪酸誘導体の生産量を向上させるとともに、酵母変異株の生育を十分に行なう観点から、当該酵母変異株の培養中における変換培地のｐＨが一定に維持されるように、培養中に変換培地のｐＨを調整することが好ましい。培養中における変換培地のｐＨは、不飽和脂肪酸誘導体の生産量を向上させる観点から、６．７以上が好ましく、７以上がより好ましく、酵母変異株の生育を十分に行なう観点から、８．３以下が好ましく、８以下がより好ましい。

また、本発明の酵母変異株の培養中における変換培地中に含まれる基質、成分などの量が一定に維持されるように変換培地中に含まれる基質、成分などの量を調整することにより、前記不飽和脂肪酸化合物から前記不飽和脂肪酸誘導体への変換効率が著しく向上する。したがって、前記不飽和脂肪酸化合物から前記不飽和脂肪酸誘導体への変換効率を向上させ、前記不飽和脂肪酸誘導体の生産量を増加させる観点から、当該酵母変異株を半回分培養または連続培養により、基質、成分などの量を調整しながら培養することが好ましい。

さらに、前記不飽和脂肪酸誘導体の生産量を増加させる観点から、本発明の酵母変異株の培養中における変換培地に適宜通気を行なって、変換培地中の溶存酸素量が、培養開始時の変換培地における溶存酸素量（酸素飽和状態）を１００％として、６５〜１１０％に維持されるように、培養中に変換培地中の溶存酸素量を調整することが好ましい。前記溶存酸素量は、培養開始時の変換培地における溶存酸素量（酸素飽和状態）を１００％としたとき、前記不飽和脂肪酸誘導体の生産量を増加させる観点から、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、酵母変異株の生育を十分に行なう観点から、１１０％以下が好ましく、１００％以下がより好ましい。

前記酵母変異株を担体に固定化させた固定化酵母変異株担体は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、生化学的特異的結合法などの方法により、前記酵母変異株を適切な担体に固定化させることによって得ることができる。前記担体としては、特に限定されないが、例えば、セルロース、アガロースなどに代表される多糖；多孔質ガラス、金属酸化物などに代表される無機物質；ポリアクリルアミド、ポリスチレンなどの合成高分子化合物などが挙げられる。

前記酵母変異株を包括剤に包括固定化させた包括物は、包括剤で前記酵母変異株を包むことによって得ることができる。前記包括剤としては、特に限定されないが、例えば、アルギン酸、カラギーナンなどの多糖；ポリアクリルアミドなどが挙げられる。

不飽和脂肪酸化合物と前記酵母変異株とを接触させる際に用いられる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水などが挙げられる。

また、不飽和脂肪酸化合物と前記酵母変異株の細胞破砕物または前記酵母変異株の無細胞抽出物との接触は、前記と同様の緩衝液中で不飽和脂肪酸化合物と前記酵母変異株の細胞破砕物とを混合することなどによって行なうことができる。

本発明においては、前記酵母変異株、前記酵母変異株の細胞破砕物または前記酵母変異株の無細胞抽出物が不飽和脂肪酸化合物に作用するので、不飽和脂肪酸化合物が目的とする不飽和脂肪酸誘導体に変換し、変換した不飽和脂肪酸誘導体が培養上清または緩衝液中に蓄積される。

前記不飽和脂肪酸誘導体が蓄積された培養上清または緩衝液を、適切な溶離液が用いられたＨＰＬＣなどの分取手段に供し、波長２１５ｎｍにおける吸光度をモニターし、不飽和脂肪酸化合物の標品と同じ保持時間を示す画分を分取することにより、不飽和脂肪酸誘導体を実質的に単離することができる。

より具体的には、例えば、不飽和脂肪酸誘導体として、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸が蓄積された培養上清または緩衝液を、全多孔性球状シリカゲル（例えば、平均粒子径：約５μｍ、平均細孔径：約１２ｎｍ、比表面積：約３００ｍ²／ｇ、化学結合：三反応性基型オクタデシル基結合など）を用いたカラム（カラムの大きさ：４．６ｍｍ・２５０ｍｍ）、例えば、商品名：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ₁₈−ＡＲ−ＩＩＷａｔｅｒｓｔｙｐｅカラム〔カラムの大きさ：４．６ｍｍ・２５０ｍｍ、ナカライテスク(株)製、ＣｏｄｅＮｏ．３８１４５−２１〕に供し、カラム温度３５℃で、溶出液Ａ〔アセトニトリル／テトラヒドロフラン／蒸留水（容量比）＝４０．６／１７．４／４２．０〕による１５分間の溶出、溶出液Ｂ（アセトニトリル）による１５分間の溶出、および前記溶出液Ａによる２５分間の溶出をこの順序で流速１ｍＬ／ｍｉｎで行ない、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の標品（保持時間約３．２分間）に相当する画分を分取することや、前記カラムの代わりに、商品名：ＨｉｂａｒＰｒｅ−ＰａｃｋｅｄＣｏｌｕｍｎＲＴ２５０−４Ｗａｔｅｒｓｔｙｐｅカラム（４．０ｍｍ・２５０ｍｍ、メルク（ＭＥＲＣＫ）社製、商品番号：ＯＢ５５８２９１）に供し、カラム温度４０℃で、溶出液〔メタノール／０．４体積％酢酸水溶液（容量比）＝６５／３５〕による４０分間溶出を流速１ｍＬ／ｍｉｎで行ない、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の標品（保持時間約３．２分間）に相当する画分を分取することなどにより、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を単離することができる。

また、不飽和脂肪酸誘導体として、９−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸が蓄積された培養上清または緩衝液を用いる場合、前記と同様にして９−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の標品に相当する画分を分取することにより、９−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を単離することができる。

前記製造方法においては、不飽和脂肪酸化合物としてトランス−２−デセン酸を用いた場合、９−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸または１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を効率よく得ることができる。より具体的には、例えば、不飽和脂肪酸化合物としてトランス−２−デセン酸を用いた場合、トランス−２−デセン酸から実質的に単離された１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を高い変換効率で得ることができる。

なお、本発明において、一般式（Ｉ）で表される不飽和脂肪酸化合物において、Ｒ¹が
炭素数１〜４のアルキル基である不飽和脂肪酸アルキルエステルであるとき、対応する不飽和脂肪酸誘導体を効率よく製造する観点から、前記不飽和脂肪酸アルキルエステルから一般式（ＩＩ）で表される不飽和脂肪酸誘導体を製造した後、さらに該不飽和脂肪酸誘導体に、該不飽和脂肪酸誘導体のエステル結合を加水分解させる酵素を作用させることが好ましい。これにより、一般式（ＩＩ）において、Ｒ¹が水素原子であり、Ｒ³がヒドロキシル基またはケトン基を有する炭素数２〜１５のアルキル基である不飽和脂肪酸アルキルエステルを得ることができる。

前記酵素としては、例えば、リパーゼ、エステラーゼなどが挙げられる。

前記酵素を作用させる不飽和脂肪酸誘導体として、９−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸アルキルエステルを用い、該９−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸アルキルエステルに、前記酵素を作用させた場合、９−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を効率よく得ることができる。

また、前記酵素を作用させる不飽和脂肪酸誘導体として、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸アルキルエステルを用い、該１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸アルキルエステルに、前記酵素を作用させた場合、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を効率よく得ることができる。

本発明の酵母変異株は、培養中における変換培地のｐＨが、６．７〜８．３に維持されるように、培養中に変換培地のｐＨを調整し、かつ培養中における変換培地中の溶存酸素量が、培養開始時の変換培地における溶存酸素量（酸素飽和状態）を１００％として、６５〜１１０％に維持されるように、培養中に変換培地中の溶存酸素量を調整しながら培養を行なった場合、未変異の親株と比べて、不飽和脂肪酸誘導体をより大量に生産することができる。

以上説明したように、本発明の酵母変異株によれば、簡便な操作で不飽和脂肪酸誘導体を製造することができる。また、本発明の酵母変異株によれば、不飽和脂肪酸化合物から不飽和脂肪酸誘導体を高い効率で製造することができる。
したがって、本発明の酵母変異株は、例えば、不飽和脂肪酸化合物からヒドロキシ不飽和脂肪酸、オキソ不飽和脂肪酸などの所望の不飽和脂肪酸誘導体を製造するのに有用である。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例によって限定されるものではない。

なお、各実施例などで用いられた培地は、あらかじめオートクレーブ中で１２０℃の温度で１５〜２０分間滅菌された培地である。

（実施例１）
カンジダマルトーザＫＵ８３株〔ＣａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａＫＵ８３と命名・表示され、受託日：２００６年１０月４日、受託番号：ＮＩＴＥＰ-２６６として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている〕を、ＹＭ液体培地｛培地の組成：酵母エキス〔ベクトン、ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）社製〕０．３質量％、麦芽エキス０．３質量％、グルコース１．０質量％、ポリペプトン〔日本製薬(株)製〕０．５質量％、蒸留水（残部）、ｐＨ６．２｝１００ｍＬに播種し、２８℃で４８時間培養した。その後、得られた培養物からカンジダマルトーザＫＵ８３株の細胞を回収した。得られた細胞を滅菌生理食塩水で洗浄し、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁し、細胞懸濁液を得た。

つぎに、前記細胞懸濁液１０ｍＬに、５質量％エチルメタンスルフォン酸水溶液４ｍＬを添加した。その後、得られた混合液を２８℃で１５分間インキュベーションして、変異処理を行なった。インキュベーション後の混合液を１５１００×ｇで５分間の遠心分離（２０℃）に供して、細胞を回収した。回収した細胞に、５質量％チオ硫酸ナトリウム水溶液１．４ｍＬを添加して混合した。さらに、前記細胞を滅菌水で洗浄し、滅菌水１．４ｍＬに懸濁した。得られた懸濁液を、ＹＭ寒天培地｛培地の組成：酵母エキス〔ベクトン、ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）社製〕０．３質量％、麦芽エキス０．３質量％、グルコース１．０質量％、ポリペプトン〔日本製薬(株)製〕０．５質量％、寒天〔ナカライテスク(株)製〕１．５質量％、蒸留水（残部）、ｐＨ６．２｝に塗布し、２８℃で２４時間培養した。

つぎに、前記ＹＭ寒天培地に生えてきた細胞５０００株を、それぞれ、多ウェルマイクロプレートのウェル中の０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）１１８μＬに懸濁し、懸濁液を得た。その後、前記ウェル中の懸濁液に５ｍＭ酪酸ｐ−ニトロフェニル−エタノール溶液１．６μＬを添加し、得られた混合物を２８℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、前記混合物に、１．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液８０μＬを添加した。対照として、前記ＹＭ寒天培地に生えてきた細胞の代わりにカンジダマルトーザＫＵ８３株を用いたことを除いて前記と同様に操作を行なった。

その後、前記ＹＭ寒天培地に生えてきた細胞を含む混合物におけるｐ−ニトロフェノールに基づく黄色の発色強度を、カンジダマルトーザＫＵ８３株を含む混合物におけるｐ−ニトロフェノールに基づく黄色の発色強度と比較した。そして、カンジダマルトーザＫＵ８３株を含む混合物におけるｐ−ニトロフェノールに基づく黄色の発色強度と比べて弱い株を選別した。これにより、カンジダマルトーザＫＵ８３株と比べて、エステラーゼ活性が低い変異株５８株を得た。

つぎに、得られた５８株の変異株のそれぞれについて、トランス−２−デセン酸エチルエステルから、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸への変換能を調べた。まず、変異株を前記ＹＭ液体培地１００ｍＬ中、２８℃で４８時間培養した。培養後の変異株を回収し、得られた変異株を滅菌生理食塩水に懸濁し、ＯＤ₆₆₀が１００である懸濁液を得た。得られた懸濁液１ｍＬを、バッフル付三角フラスコ中のＬＭ改良培地｛培地の組成：ポリペプトン〔日本製薬(株)製〕０．０２５質量％、尿素０．３質量％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５質量％、酵母エキス〔ベクトン、ディッキンソン・アンド・カンパニー社製〕０．０２５質量％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００２質量％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００２質量％、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ０．００２質量％、トランス−２−デセン酸エチルエステル〔東京化成工業(株)製〕０．１質量％、蒸留水（残部）、ｐＨ６．９｝１４９ｍＬに添加した。その後、変異株を１４０ｍｉｎ^-1で振盪しながら２８℃で培養した。なお、ＬＭ改良培地による培養開始から０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間および１６８時間の時点で、５ｍＬずつ培養物を採取し、かかる培養物より培養上清を得た。

得られた培養物５ｍＬに、６Ｎ塩酸０．２ｍＬを添加し、さらに酢酸エチル５ｍＬを添加して、抽出物を得た。得られた抽出物をアセトニトリル１ｍＬに溶解し、試料を得た。

得られた試料を、(株)島津製作所製、商品名：ＳＨＩＭＡＤＺＵＳＣＬ−６Ａおよびナカライテスク(株)製、商品名：ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ₁₈−ＡＲ−ＩＩＷａｔｅｒｓｔｙｐｅカラム（４．６ｍｍ・２５０ｍｍ、ＣｏｄｅＮｏ．３８１４５−２１）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、トランス−２−デセン酸エチルエステルおよびその変換産物の存在を分析した。

なお、ＨＰＬＣは、カラム温度３５℃および流速１ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液Ａ〔アセトニトリル／テトラヒドロフラン／蒸留水（容量比）＝４０．６／１７．４／４２．０〕による１５分間の溶出、溶出液Ｂ（アセトニトリル）による１５分間の溶出、および前記溶出液Ａによる２５分間の溶出を順に行なうことによって実施した。また、トランス−２−デセン酸エチルエステルおよびその変換産物を２１５ｎｍの波長で検出した。対照として、前記変異株の代わりにカンジダマルトーザＫＵ８３株を用いたことを除いて前記と同様に操作して、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を２１５ｎｍの波長で検出した。そして、カンジダマルトーザＫＵ８３株を用いたときの試料中の１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量と、各変異株を用いたときの試料中の１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量とを比較し、カンジダマルトーザＫＵ８３株と比べて、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の高い生産性を有する酵母変異株を選別した。

これにより、前記５８株の変異株のうち、カンジダマルトーザＫＵ８３株と比べて１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の最も高い生産性を有する酵母変異株として、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６を得た。なお、前記カンジダマルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）ＫＵ８３−２６は、ＣａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａＫＵ８３−２６と命名・表示され、受託日：２００９年１２月２４日、受託番号：ＮＩＴＥＰ-８５５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。

（実施例２）
カンジダマルトーザＫＵ８３−２６について、光学顕微鏡、酵母様真菌同定キット〔シスメックスビオメリュー（株）製、商品名：アピＣオクサノグラム〕および最近同定研究用キット〔シスメックスビオメリュー（ＳＹＳＭＥＸｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）製、商品名：アピＣオクサノグラムおよび商品名：アピ５０ＣＨ〕を用いて、一般的な微生物学的性質を調べた。その結果を以下に示す。

微生物学的性質：
（ａ）球形または短卵形の形態を有し、偽菌糸を形成している、
（ｂ）（３．６〜７．２μｍ）・（３．６〜７．９μｍ）の大きさを有する、
（ｃ）２５℃で１ヵ月間培養した場合、クリーム色を呈し、円滑な外観を有し、偽菌糸の周縁部にシワを有するコロニーを形成する、
（ｄ）グルコース、シュクロースおよびトレハロースをそれぞれ発酵する、
（ｅ）ガラクトース、シュクロース、マルトース、トレハロース、メレジトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−グルシトール、サリシンおよびコハク酸をそれぞれ資化する、
（ｆ）Ｑ９のキノンを有する、
（ｇ）３５．６〜３６．８ｍｏｌ％のＧ＋Ｃ含量を有する

前記結果から、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、カンジダマルトーザに属する微生物に共通する性質を有することがわかる。

さらに、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６の性質と、未変異の親株であるカンジダマルトーザＫＵ８３の性質とを対比した。その結果を以下に示す。

カンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、
（Ａ）エステラーゼ活性が、カンジダマルトーザＫＵ８３のエステラーゼ活性と比べて低い（０．９倍以下、好ましくは０．８５倍以下）、
（Ｂ）前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能が、カンジダマルトーザＫＵ８３の前記不飽和脂肪酸誘導体の生産能と比べて高い（少なくとも１．１倍、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、特に好ましくは２倍以上）
（Ｃ）カンジダマルトーザＫＵ８３が、Ｄ−アラビトール、Ｄ−アドニトール、Ｄ−フルクトースを資化するのに対し、Ｄ−アラビトール、Ｄ−アドニトール、Ｄ−フルクトースを資化しない、
（Ｄ）カンジダマルトーザＫＵ８３が、アルブチンを分解するのに対し、Ｄ−アラビトール、Ｄ−アドニトール、Ｄ−フルクトース、アルブチンを分解しない、
（Ｅ）カンジダマルトーザＫＵ８３が、グリコーゲンを資化しないのに対して、グリコーゲンを資化する、
（Ｆ）Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−シュクロースそれぞれの資化速度が、カンジダマルトーザＫＵ８３によるＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−シュクロースそれぞれの資化速度と比べて遅い、
（Ｇ）ガラクトースの資化速度が、カンジダマルトーザＫＵ８３によるガラクトースの資化速度よりも速い、
（Ｈ）カンジダマルトーザＫＵ８３では、トランス−２−デセン二酸エチルエステルを生産しないのに対し、トランス−２−デセン二酸エチルエステルを生産する。

以上の結果から、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、未変異の親株であるカンジダマルトーザＫＵ８３とは大きく異なる性質を有することがわかる。

（実施例３および比較例１）
カンジダマルトーザＫＵ８３−２６（実施例３）およびカンジダマルトーザＫＵ８３（比較例１）それぞれについて、実施例１と同様にして、前記ＬＭ改良培地中で、１４０ｍｉｎ^-1で振盪しながら２８℃培養した。ＬＭ改良培地による培養開始から０時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の時点で、５ｍＬずつ培養物を採取し、かかる培養物より培養上清を得た。得られた培養物５ｍＬに、６Ｎ塩酸０．２ｍＬを添加し、さらに酢酸エチル５ｍＬを添加して、抽出物を得た。得られた抽出物をアセトニトリル１ｍＬに溶解し、試料を得た。得られた試料を用い、実施例１におけるＨＰＬＣと同様にして、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６およびカンジダマルトーザＫＵ８３の培養物の培養上清中におけるトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の各濃度の経時的変化を調べた。

実施例３において、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養物の培養上清中におけるトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の各濃度の経時的変化を図１に示す。また、比較例１において、カンジダマルトーザＫＵ８３の培養物の培養上清中におけるトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の各濃度の経時的変化を図２に示す。図１および図２中、黒四角はトランス−２−デセン酸の濃度、黒三角はトランス−２−デセン酸エチルエステルの濃度、黒丸は１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の濃度をそれぞれ示す。

図１に示された結果から、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養物中における１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸量は、ＬＭ改良培地による培養開始から約２４時間経過後に最も高くなることがわかる。

また、図１および図２に示された結果から、ＬＭ改良培地による培養開始から約２４時間経過後において、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養物の培養上清中における１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の濃度は、カンジダマルトーザＫＵ８３の培養物の培養上清中における１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の濃度の２倍以上であることがわかる。したがって、これらの結果から、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、カンジダマルトーザＫＵ８３と比べて、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の生産性が高いことがわかる。

（実施例４）
カンジダマルトーザＫＵ８３−２６を前記ＹＭ液体培地１００ｍＬ中、２８℃で４８時間培養した。培養後のカンジダマルトーザＫＵ８３−２６の細胞を回収し、得られた細胞を滅菌生理食塩水に懸濁し、ＯＤ₆₆₀が１００である懸濁液を得た。得られた懸濁液１ｍＬを、バッフル付三角フラスコ中の前記ＬＭ改良培地１４９ｍＬに添加した。その後、変異株を１４０ｍｉｎ^-1で振盪しながら２８℃で２４時間培養した。

得られた培養物の培養上清を、内部標準（１−ナフトール）を含有する溶出液Ａ（アセトニトリル／テトラヒドロフラン／蒸留水（容量比）＝４０．６／１７．４／４２．０）で１０倍希釈し、試料を得た。得られた試料を、(株)島津製作所製、商品名：ＳＨＩＭＡＤＺＵＳＣＬ−６Ａおよびナカライテスク(株)製、商品名：ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）５Ｃ₁₈−ＡＲ−ＩＩＷａｔｅｒｓｔｙｐｅカラム（４．６ｍｍ・２５０ｍｍ、ＣｏｄｅＮｏ．３８１４５−２１）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、トランス−２−デセン酸エチルエステルおよびその変換産物の存在を分析した。なお、ＨＰＬＣでは、カラム温度３５℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液Ａ（アセトニトリル／テトラヒドロフラン／蒸留水（容量比）＝４０．６／１７．４／４２．０）による１５分間の溶出、溶出液Ｃ（アセトニトリル／テトラヒドロフラン（容量比）＝４０．６／１７．４）による１５分間の溶出、および前記溶出液Ａによる２５分間の溶出を順に行ない、波長２１５ｎｍでトランス−２−デセン酸、トランス−２−デセン酸エチルエステルおよび１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を検出した。実施例４で得られたカンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養上清のＨＰＬＣのクロマトグラムを図３に示す。

図３に示された結果から、実施例４で得られたカンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養上清のＨＰＬＣのチャートにおいて、トランス−２−デセン酸（図中、ピークＢ）、トランス−２−デセン酸エチルエステル（図中、ピークＣ）および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸（図中、ピークＡ）それぞれに対応するピークが検出されることがわかる。また、実施例４で得られたカンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養上清のＨＰＬＣのチャートにおいては、トランス−２−デセン酸、トランス−２−デセン酸エチルエステルおよび１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸それぞれに対応するピークとは異なるピーク（図中、ピークＤ）が検出されることがわかる。前記ピークＤは、カンジダマルトーザＫＵ８３の培養上清では検出されないことから、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、カンジダマルトーザＫＵ８３によって生産することができない物質の産生能を獲得していることが示唆される。

そこで、ピークＤに対応する画分を分取し、分取した画分を減圧乾固することによって得られた物質を、プロトン核磁気共鳴（¹Ｈ−ＮＭＲ）分析およびカーボン．サーティーン核磁気共鳴（¹³Ｃ−ＮＭＲ）分析に供した。

その結果、得られた物質は、以下の物性を有していることから、トランス−２−デセン二酸エチルエステルであることが確認された。この結果から、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、トランス−２−デセン二酸エチルエステルの産生能を有することがわかる。

¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ（ｐｐｍ）：１．２（７Ｈ，ｍ，Ｃ１，Ｃ８，Ｃ９），１．４（２Ｈ，ｍ，Ｃ７），１．５６（２Ｈ，ｍ，Ｃ１０），２．１１（２Ｈ，ｍ，Ｃ６），２．２８（２Ｈ，ｔ，Ｃ１１），４．１０（２Ｈ，ｍ，Ｃ２），５．７３（１Ｈ，ｄ，Ｃ４），６．８８（１Ｈ，ｍ，Ｃ５）

¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣ_l3）δ（ｐｐｍ）：１４．３（Ｃ１），２４．５（Ｃ１０），２７．７（Ｃ９），２８．７（Ｃ８），２８．８（Ｃ７），３２．１（Ｃ６），３３．８（Ｃ１１），６０．２（Ｃ２），１２１．３（Ｃ４），１４９．３（Ｃ５），１６６．８（Ｃ３），１７８．９（Ｃ１２）

（実施例５および比較例２）
カンジダマルトーザＫＵ８３−２６（実施例５）およびカンジダマルトーザＫＵ８３（比較例２）を、それぞれ、実施例１と同様にして、バッフル付三角フラスコ中の前記ＬＭ改良培地中、１４０ｍｉｎ^-1で振盪しながら２８℃で培養した。培養開始から２４時間および５１時間経過後に、培養液のＯＤ₆₆₀を測定した。

その結果、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６のＯＤ₆₆₀は、培養開始から２４時間経過後では、１４であり、培養開始から５１時間経過後では、１３であった。一方、カンジダマルトーザＫＵ８３のＯＤ₆₆₀は、培養開始から２４時間経過後では、１１であり、培養開始から５１時間経過後では、１２であった。これらの結果から、カンジダマルトーザＫＵ８３は、培養開始から２４時間経過後において、生育が抑制されているのに対して、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、培養開始から５１時間経過後においても生育が抑制されていないことがわかる。

以上の結果から、本発明の酵母変異株であるカンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、未変異の親株であるカンジダマルトーザＫＵ８３と比べて、不飽和脂肪酸誘導体を大量に生産することができ、しかも培養物中における不飽和脂肪酸誘導体の蓄積量が増加しても生育が良好であることがわかる。したがって、本発明の酵母変異株であるカンジダマルトーザＫＵ８３−２６は、不飽和脂肪酸誘導体を工業的に大量に生産するのに好適である。

（試験例１）
カンジダマルトーザＫＵ８３−２６を、バッフル付三角フラスコ中の前記ＬＭ改良培地１５０ｍＬ中、１４０ｍｉｎ^-1で振盪しながら、培養物のＯＤ₆₆₀が５になるまで２８℃で培養した。その後、得られた培養物を、卓上型培養装置〔（株）丸菱バイオエンジ製、商品名：Ｂｉｏｎｅｅｒ５００−５Ｌ、容量：５Ｌ〕中の大量培養用変換培地〔培地の組成：ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２質量％、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ０．３５質量％、ポリペプトン〔日本製薬(株)製〕０．０２５質量％、尿素０．３質量％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５質量％、酵母エキス〔ベクトン、ディッキンソン・アンド・カンパニー社製〕０．０２５質量％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００２質量％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００２質量％、ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ０．００２質量％、トランス−２−デセン酸エチルエステル〔東京化成工業(株)製〕１．０質量％、ｐＨ６．９〕２．５Ｌに添加し、２８℃で培養した。なお、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養中には、大量培養用変換培地のｐＨを調整しなかった。また、培養中、培養開始から培養開始後５時間までの間は１００ｍ≡ｎ^-1で撹拌しながら１．０Ｌ／ｍｉｎで通気を行ない、培養開始後５時間から７時間までの間は２５０ｍ≡ｎ^-1で撹拌しながら２．０Ｌ／ｍ≡ｎで通気を行ない、培養開始後７時間以降は３００ｍ≡ｎ^-1で撹拌しながら３．０Ｌ／ｍ≡ｎで通気を行なうことにより、大量培養用変換培地中の溶存酸素量が、培養開始時の大量培養用変換培地における溶存酸素量（酸素飽和状態）を１００％として、６５〜１１０％に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地中の溶存酸素量を調整した。

培養開始から一定時間経時毎に培養物４ｍＬを採取した。前記培養物に、６Ｎ塩酸０．２ｍＬを添加し、さらに酢酸エチル４ｍＬを添加して、抽出物を得た。得られた抽出物を減圧下に乾固した。得られた乾固物をメタノール１ｍＬに溶解し、試料を得た。

得られた試料を、(株)島津製作所製、商品名：ＳＨＩＭＡＤＺＵＳＣＬ−１０^aおよびメルク（ＭＥＲＣＫ）社製、商品名：ＨｉｂａｒＰｒｅ−ＰａｃｋｅｄＣｏｌｕｍｎＲＴ２５０−４Ｗａｔｅｒｓｔｙｐｅカラム（４．０ｍｍ・２５０ｍｍ、商品番号：ＯＢ５５８２９１）を用いてＨＰＬＣに供し、トランス−２−デセン酸エチルエステルおよびその変換産物の存在を分析した。なお、ＨＰＬＣは、カラム温度４０℃および流速１ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液メタノール／０．４％酢酸水（容量比）＝６５／３５で４０分間溶出を行なうことによって実施した。また、トランス−２−デセン酸エチルエステルおよびその変換産物を２１５ｎｍの波長で検出した。そして、培養物の培養上清中の１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の濃度の経時的変化を調べた。

その結果、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６の培養物の培養上清中の１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の濃度は、基質であるトランス−２−デセン酸エチルエステルが残存しているにもかかわらず低下する傾向を示した。そこで、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６を大量培養する際の大量培養用培地の至適ｐＨ条件を検討した。

培養中における大量培養用変換培地のｐＨが６．０（実験１）、６．５（実験２）、７．０（実験３）、７．５（実験４）、８．０（実験５）または８．５（実験６）に保たれるように、硫酸または水酸化ナトリウムを用いて前記ｐＨを適宜調整したことを除き、前記と同様にしてカンジダマルトーザＫＵ８３−２６を培養した。

培養開始から２４時間および４８時間経過後に、培養液のＯＤ₆₆₀を測定した。また、培養開始から２４時間および４８時間経過後に、培養物４ｍＬを採取した。採取された培養物に、６Ｎ塩酸０．２ｍＬを添加し、さらに酢酸エチル４ｍＬを添加して、抽出物を得た。得られた抽出物を減圧下に乾固した。得られた乾固物をメタノール１ｍＬに溶解し、試料を得た。

得られた試料を用い、前記と同様にして、培養物の培養上清中の１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の濃度の経時的変化を調べた。試験例１において、試験例１において、培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量の経時的変化を図４に示す。図４中、黒矩形は実験１、黒四角は実験２、黒三角は実験３、白四角は実験４、白丸は実験５および黒丸は実験６それぞれを示す。

図４に示された結果から、培養中における大量培養用変換培地のｐＨが７〜８に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地のｐＨを調整し、かつ培養中における大量培養用変換培地中の溶存酸素量が、培養開始時の変換培地における溶存酸素量（酸素飽和状態）を１００％として、７０〜１００％に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地中の溶存酸素量を調整した場合（実験３〜５）、培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量が２ｇ以上であることがわかる。なかでも、培養中における大量培養用変換培地のｐＨが７．５に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地のｐＨを調整し、かつ培養中における大量培養用変換培地中の溶存酸素量が、培養開始時の変換培地における溶存酸素量（酸素飽和状態）を１００％として、７０〜１００％に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地中の溶存酸素量を調整した場合（実験４）、培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量が短時間で最も多くなることがわかる。

また、実験１〜６に関して、基質であるトランス−２−デセン酸エチルエステルから１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸への変換率を求めた。その結果を表１に示す。

表１に示された結果から、培養中における大量培養用変換培地のｐＨが７〜８に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地のｐＨを調整した場合（実験３〜５）、基質であるトランス−２−デセン酸エチルエステルから１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸への変換率が２５％以上であることがわかる。なかでも、培養中における大量培養用変換培地のｐＨが７．５に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地のｐＨを７．５に調整した場合（実験４）、前記変換率が最も高くなることがわかる。

以上の結果から、本発明の酵母変異株であるカンジダマルトーザＫＵ８３−２６の大量培養を行なう場合、培養中における大量培養用変換培地のｐＨがｐＨ７〜８に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地のｐＨを調整することにより、１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸を効率よく大量に生産することができることが示唆される。

（実施例６および比較例３）
培養中における大量培養用変換培地のｐＨが７．５に維持されるように、培養中に大量培養用変換培地のｐＨを調整したことを除き、試験例１と同様にしてカンジダマルトーザＫＵ８３−２６（実施例６）およびカンジダマルトーザＫＵ８３（比較例３）を培養した。

培養開始から１８時間、２１時間、２４時間、４２時間、４５時間、４８時間、５１時間および６６時間経過後に、培養液のＯＤ₆₆₀を測定した。また、培養開始から１８時間、２１時間、２４時間、４２時間、４５時間、４８時間、５１時間および６６時間経過後に培養物４ｍＬを採取し、試験例１におけるＨＰＬＣと同様にして、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６（実施例６）およびカンジダマルトーザＫＵ８３（比較例３）それぞれの培養物中におけるトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸それぞれの量の経時的変化を調べた。

実施例６において、培養物１Ｌあたりのトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量の経時的変化を図５に示す。また、比較例３において、培養物１Ｌあたりのトランス−２−デセン酸エチルエステル、トランス−２−デセン酸および１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量の経時的変化を図６に示す。図５および６中、黒三角はトランス−２−デセン酸エチルエステルの量、黒矩形はトランス−２−デセン酸の量および黒四角は１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の量それぞれを示す。

図５および６に示された結果から、カンジダマルトーザＫＵ８３−２６（実施例６）では、培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の最大量が３．２ｇ／Ｌとなるであることがわかる（図５）。これに対して、カンジダマルトーザＫＵ８３（比較例３）では、培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の最大量がわずか０．５６ｇ／Ｌであることがわかる（図６）。これらの結果から、本発明の酵母変異株であるカンジダマルトーザＫＵ８３−２６による培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の最大量は、未変異の親株であるカンジダマルトーザＫＵ８３による培養物１Ｌあたりの１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸の最大量の５７１％にまで向上していることがわかる。

以上の結果から、本発明の酵母変異株であるカンジダマルトーザＫＵ８３−２６（実施例６）は、培養中における変換培地のｐＨが６．７〜８．３に維持されるように、培養中に変換培地のｐＨを調整し、かつ培養中における変換培地中の溶存酸素量が、培養開始時の変換培地における溶存酸素量（酸素飽和状態）を１００％として、６５〜１１０％に維持されるように、培養中に変換培地中の溶存酸素量を調整しながら培養を行なった場合、未変異の親株であるカンジダマルトーザＫＵ８３（比較例３）と比べて、不飽和脂肪酸誘導体を大量に生産することができることがわかる。

Claims

一般式（Ｉ）：

（式中、Ｒ¹は水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ²は炭素数２〜１５のアルキル基を示す）
で表される不飽和脂肪酸化合物を、一般式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ¹は前記と同じ。Ｒ³はヒドロキシル基またはケトン基を有する炭素数２〜１５のアルキル基を示す）
で表される不飽和脂肪酸誘導体に変換する能力を有し、カンジダマルトーサに属する酵母変異株であって、
未変異の親株よりも低いエステラーゼ活性を有し、かつ前記未変異の親株よりも一般式（ＩＩ）に示される不飽和脂肪酸誘導体の生産性が高く、トランス−２−デセン酸エチルエステルを１０−ヒドロキシ−トランス−２−デセン酸に変換する能力を有し、
前記未変異の親株がカンジダマルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）ＫＵ８３（受託番号：ＮＩＴＥＰ-２６６）である酵母変異株。
前記酵母変異株が、カンジダマルトーザ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）ＫＵ８３−２６（受託番号：ＮＩＴＥＰ−８５５）である請求項１に記載の酵母変異株。