JP4792252B2 - 新規なジグリコシダーゼ及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
このような状況下、本願の出願人は微生物に由来しその給源が限定的でない、二糖配糖体に作用して二糖単位の糖とアグリコンとを遊離する酵素活性を有するジグリコシダーゼを提案している(特許文献2参照)。
即ち、本発明は、以下の理化学的性質を有するペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5(FERM P-20232)の微生物が生産する新規なジグリコシダーゼを要旨とする。
(1)作用及び基質特異性
β−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離する活性を有する。
(2)至適pH
4.5付近である。
(3)pH安定性
37℃、30分間の処理条件において、pH4.0〜8.0の間で安定であり、pH4.0以下でも80%以上の活性が残存する。
(4)至適温度
酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH5.5)中、60℃付近である。
(5)熱安定性
酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH5.5)中、50℃以下で安定であり、60℃、40分処理においても45%の活性が残存する。
(6)分子量
SDS-PAGEにより測定で40000±5000ダルトンである。
(7)等電点
約pI4.3である。
(a)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
(b)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。
(c)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。
(a)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
(b)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。
(c)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。
(a)配列表の配列番号5で表される塩基配列を有するDNA。
(b)配列表の配列番号5で表される塩基配列において、1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質をコードしているDNA。
寄託機関名:茨城県つくば市東1−1−1中央第6独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
寄託日:2004年9月29日、
寄託番号:FERM P-20232
1.形態(ツァペック・ドックス寒天平板又は麦芽エキス寒天で、25℃培養)
(1)分生子柄:長さ20〜240μ、直径1.6〜3.6μ、表面は滑面、先端は膨らむ、3.2〜5.2μ
(2)ペニシリ:単輪生体。
(3)フィアライド:長さ7.2〜12μ、直径2.4〜3.2μ。
(4)分生子:大きさ2.4〜3.2μ、球形〜亜球形、表面は滑面、ゆるいカラム状の連鎖を形成。
(5)子のう胞子:形成しない。
(6)菌核:形成しない。
本発明者らは、本菌株がペニシリウム属のどの種に該当するかについて系統解析を行った。この系統解析は、次のように行った。まず、本菌株の28S rDNAのD2領域が配列表の配列番号18のような配列(321塩基)となっていることが判明した。
本発明者らは、ホモロジー検索システムBLASTを利用して、本菌株の28S rDNAのD2領域と既知のペニシリウム属菌株(31株)の28S rDNAのD2領域の各々について、塩基配列の比較を行った。但し、既知のペニシリウム属菌株のうち、ペニシリウム・マルチカラーの4菌株については、アクセッション番号(Accession number)が与えられていないので、本菌株と同様にして28S rDNAのD2領域についての塩基配列を求めたところ、ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor) NBRC 5725とペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor) NBRC6042については、本菌株と100%の相同性を有することが分かり、ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor) NBRC 7569とペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor) NBRC 7817については、本菌株と98.3%の相同性を有することが分かった。表1に系統分析に用いたアスペルギルロイデス亜属(Subgenus Aspergilloides)の菌株を示した。
例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいはペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。更に、ジグリコシダーゼを生産蓄積せしめるために培地に各種の誘導物質を添加することができる。誘導物質としては、例えば、糖類を使用でき、好ましくはゲントース(例えば、ゲントース#80、日本食品化工(株))、ゲンチビオース、ゲンチオリゴ糖(例えば、ゲンチオリゴ糖、和光純薬工業(株))等を利用できる。これらの誘導物質の添加量は目的とするジグリコシダーゼの生産能が増大される量であれば特に限定されないが、好ましくは0.01〜5%が添加される。培地のpHは例えば約3〜8、好ましくは約5〜6程度に調整し、培養温度は通常約10〜50℃、好ましくは約30℃程度で、1〜15日間、好ましくは4〜7日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。しかし、上述した各種の培養条件等は、本発明のジグリコシダーゼが生産される条件等であれば、特に限定されない。
(c)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列と65%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子がある。
形質転換体の培養物から本発明の酵素を精製するには上述のように、遠心分離、UF濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことができる。
ジグリコシダーゼは、各種成分、例えば植物材料の香気、色、生理活性含有量等を増強したり、これらの成分の抽出効率を調節することに使用できる。従って、より香気の高い食物、飲料やより香りの高いスパイスや香料、香水などの製造に利用でき、更に前述の製造時における処理において適宜利用することにより、好ましくない香りの早期放出にも使用できる。また、色に関しては植物材料、食物、飲料の色合い改善、発色、あるいは色素の製造に利用できる。更には、香気成分と同様に、品質上好ましくない色素前駆体の分解除去にも使用でき、生理活性に関しては生薬、ハーブ、その他植物性成分の薬理成分や有用生理活性成分の増強やあるいは好ましくない成分の分解除去に使用できる。即ち、各種の二糖配糖体成分に本発明のジグリコシダーゼを作用させることによって前述の作用をもたらすことが可能である。
更に、本発明のジグリコシダーゼを上記生理活性物質等と混合して投与する、あるいは、混合せずに同時または短時間の間隔で投与することにより、生理活性物質等のより効率的な体内吸収が可能になる。
本発明のジグリコシダーゼが好ましく利用される対象としては、香気成分を有する食品が挙げられる。具体的に述べるとウーロン茶、ジャスミン茶等の製造において、例えば「萎調」の工程で使用したり、紅茶(CTC法によるティーパック用紅茶など)の香気増強、ワインの香気増強に利用できる。また、化粧品の香気保持や香水の香気保持、医薬品における香気の改善や薬理効果の改善にも利用できる。
1.β−プリメベロシダーゼ活性測定法 自動生化学分析装置(島津社製、CL-8000)を用い、所定量の組成物を含む試料溶液27μLをパラニトロフェニル(pNP)−β−プリメベロシド2mMとなるように20mMクエン酸緩衝液(pH4.7)に溶解せしめたもの120μLと混合し、37℃で302秒反応させた後、0.5Mの炭酸ナトリウム水溶液150μLを加え、276秒後に405nmの吸光度を測定する。試料溶液由来のブランク測定は、基質溶液の代わりに20mMクエン酸緩衝液(pH4.7)を用いて同様に測定する。405nmの吸光度とパラニトロフェノール濃度との関係から、自動生化学分析装置での測定値は酵素反応で生じた遊離パラニトロフェノール量へと換算することができる。
この条件下で、反応時間1分間当たりに1μモルのパラニトロフェノールを遊離する酵素量を1単位(unit)とした。
なお、上記のpNP−β−プリメベロシドは、pNP−β−グルコシド(メルク社製)とキシロオリゴ糖(和光純薬社製)を酵素β−キシロシダーゼ(シグマ社製)を用いて反応させ、pNP−β−グルコシドにキシロースをβ−1,6結合で1残基転移させることにより合成した。
自動生化学分析装置(島津社製、CL-8000)を用い、所定量の組成物を含む試料溶液27μLをパラニトロフェニル(pNP)−β−グルコシド2mMとなるように20mM クエン酸緩衝液(pH4.7)に溶解せしめたもの120μLと混合し、37℃で302秒反応させた後、0.5Mの炭酸ナトリウム水溶液150μLを加え、276秒後に405nmの吸光度を測定する。試料溶液由来のブランク測定は、基質溶液の代わりに20mMクエン酸緩衝液(pH4.7)を用いて同様に測定する。405nmの吸光度とパラニトロフェノール濃度との関係から、自動生化学分析装置での測定値は酵素反応で生じた遊離パラニトロフェノール量へと換算することができる。
この条件下で、反応時間1分間当たりに1μモルのパラニトロフェノールを遊離する酵素量を1単位(unit)とした。
この条件下で、反応時間1分間当たりに1μモルのパラニトロフェノールを遊離する酵素量を1単位(unit)とした。
プリメベロースはキシロースとグルコースからなる二糖である。従って、β−キシロシダーゼとβ−グルコシダーゼの共同反応によって擬β−プリメベロシダーゼ活性(見かけのβ−プリメベロシダーゼ活性)を示す。これら夾雑酵素による擬β−プリメベロシダーゼ活性のβ−プリメベロシダーゼ活性への寄与を調べるため、ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)IAM7153株の培養ブロスを分画し、β−プリメベロシダーゼは存在せずβ−キシロシダーゼとβ−グルコシダーゼが存在する画分を得た後、両酵素の活性割合とβ−プリメベロシダーゼの活性測定値とを比較して、擬β−プリメベロシダーゼ活性の算出方法を決定した。
その結果、擬β−プリメベロシダーゼ活性は、[β−キシロシダーゼ活性]:[β−グルコシダーゼ活性]=1:1の時、その1/10の値が擬β−プリメベロシダーゼ活性として活性値に反映されると判明したので、これを擬β−プリメベロシダーゼ活性値と定義した。
ジグリコシダーゼをより効率よく生産する為にペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)IAM7153株の育種を行った。なお、ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)IAM7153株は、東京大学分子細胞生物学研究所所蔵のタイプカルチャーで入手可能である。
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)IAM7153株をポテトデキストロース寒天培地(バレイショ浸出液200g/L、ブドウ糖20g/L、寒天15g/L、pH5.6±0.2)含有斜面培地へ接種し10-14日間27〜30℃で培養した。菌体が十分増殖した斜面培地へ滅菌した0.9%ツイーン80溶液10mlを入れ、分生胞子を懸濁した。分生胞子懸濁液を滅菌したグラスフィルターG3(ハリオ社製)を用いて濾過し分生胞子液とした。得られた分生胞子を0.9%ツイーン80溶液10mLにて洗浄、再懸濁した。
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5株をまずポテトデキストロース寒天培地(バレイショ浸出液200g/L、ブドウ糖20g/L、寒天15g/L、pH5.6±0.2)含有斜面培地に画線し、それらの培地を良好な胞子形成が達成されるまで10-14日間27-30℃で培養した。十分増殖した斜面培地から、滅菌した白金耳で菌体を約5mm四方程度かき取り、これを前培養培地に接種した。
至適pHは以下のようにして測定した。pH2.0-4.0の20mM 酢酸ナトリウム−HC1緩衝液、pH4.0-5.5の20mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5-8.0の20mM Na2HPO4-KH2PO4緩衝液で各pHに調製した2mM pNP-β−プリメベロシド溶液400μ1に上記で得られた精製ジグリコシダーゼの酵素液90μ1を加え37℃で10分間反応を行った。O.5M炭酸ナトリウム溶液500μ1を加え反応を停止させ、420nmの吸光度を測定し、活性測定を行った。その結果、至適pHは4.5付近であることが分かった(図2を参照)。
pH4.0-5.5の20mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5-8.0の20mM Na2HPO4-KH2PO4緩衝液で精製ジグリコシダーゼの酵素溶液を100倍希釈し、各pHにおいて37℃で30分間処理した後、その90μ1を37℃で5分間予熱した2mM pNP-β−ブリメベロシド溶液(pH4.5)400μ1と混合し、10分聞反応した。0.5M炭酸ナトリウム溶液500μ1を添加して反応を停止させ、420nmの吸光度を測定して活性測定を行い残存活性を求めた。その結果pH安定性は、pH4.0〜8.0であった(図3を参照)。
1.ジグリコシダーゼのN末端アミノ酸配列の決定
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5株の産生するジグリコシダーゼの解析を行った。
実施例2で得られたジグリコシダーゼをプロテインシークエンサー(ヒュレット・パッカード社製)に供し、配列番号1に示す15残基のN末端アミノ酸配列を決定した。
配列番号1
Ser-Thr-Tyr-Leu-Asn-Trp-Thr-Thr-Phe-Asn-Ala-Val-Gly-Ala-Asn
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5株をYPD培地で3日間振盪培養後、得られた菌体をブフナー漏斗とNo.2のろ紙(アドバンテック社)で集めて滅菌水で洗浄した。余分な水分を除去したあと、-80℃で凍結し、FREEZONE(LABCONCO社)を用いて凍結乾燥した。乾燥後、海砂と共に乳鉢ですりつぶして微粉末状にし、この菌体破砕物に12mlの抽出溶液〔3.3% SDS、 10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA〕を加えて撹拌した。得られた溶菌液をフェノール/クロロホルム抽出して、夾雑するタンパク質を除去後、等量のイソプロパノールを加えて、DNAをガラス棒で巻き取った。このDNAを0.1mg/mlのRNaseを含むTE溶液に溶解して、37℃、30分間反応させた後、さらに0.2mg/mlのプロテイナーゼKを含むTE溶液を加え、37℃で30分間反応させた。この溶液をフェノール/クロロホルム抽出した後、2.5倍容の冷エタノールで沈殿させた。この沈殿物を70% エタノールへ浸漬した後乾燥し、TE溶液に溶解した。
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5株をアマルティシロップ 3%、大豆粕 1%、バクトペプトン(またはポリペプトン)4%、KH2PO4 2% 〔pH5.5〕の培地にて27℃、4日間振とう培養後、得られた菌体をブフナー漏斗とNo.2のろ紙(アドバンテック社)で集めて滅菌水で洗浄した。余分な水分を除去した後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で微粉末状にした。この菌体破砕物に1 mlのトリゾール試薬(インビトロジェン社製)を加えて懸濁し、チューブに移した。5分間静置後、0.2 mlのクロロホルムを加えてよく撹拌し、室温で3分間静置した。これを遠心して上層と下層に分離し、上層を別のチューブに移した。続いて0.5 mlのイソプロパノールを加えて、室温で10分間静置した。遠心処理した後、上清を除き、ゲル状の沈殿物を得た。75%エタノールを1 ml加えて撹拌した後、遠心処理した。沈殿物をRNaseフリーの水に溶かして全RNA溶液を得た。この全RNAからMicro Fast Track Kit 2.0 (インビトロジェン社製)を用いてmRNA精製を行った。
方法はKitに添付されている説明書に従った。
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5株の産生するジグリコシダーゼのN末端アミノ酸配列解析の結果得られた15アミノ酸の配列情報を基に、以下に示す3種類のミックスプライマーを設計した。合成の際には、NをI(イノシン)として合成した。
配列番号2 LD-A: 5’ACNTAYYTNAAYTGGAC 3’
配列番号3 LD-B: 5’TGGACNACNTTYAAYGC 3’
配列番号4 LD-C: 5’TTYAAYGCNGTNGGNGC 3’
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5株のmRNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いて3'-RACE(3'-Rapid Amplification of cDNA Ends)を行った。3'-RACE反応は、3'-Full RACE Core Set(タカラバイオ株式会社製)を用いて行い、方法は添付のマニュアルに従って行った。いずれのプライマーを用いた場合にも約1400bpのDNA断片が増幅された。
LD-Aプライマーで増幅された断片(DG1400A)を、LD-Bプライマーを用いて塩基配列決定を行い約800bpの塩基配列を決定した。ここで得られた塩基配列情報を基に、アミノ酸配列を推定したところオープンリーディングフレームが認められた。LD-Bプライマーで増幅されたPCR断片をpBluescriptII KS(+)にサブクローニングした。
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5株から調製した染色体DNAを各種の制限酵素とBglIIを組み合わせて消化した。得られた各制限酵素処理液を用いてサザンブロット解析を行った。この解析にはプローブとしてLD-Bプライマーで増幅されたPCR断片1.4KbのDNAを用いた。この結果を基に制限酵素地図を作成したところ、EcoRI-SpeI消化によって、約6000塩基対付近に単一のバンドが得られることが確認できた。
染色体DNAをEcoRI-SpeIで完全消化後、アガロースゲル電気泳動に供して約6000塩基対の長さのDNA断片を回収、精製した。これを、ベクターpUC19のマルチクローニングサイトに挿入連結し、これを用いて大腸菌を形質転換し、遺伝子ライブラリーを作製した。
A.オロチジン-5’-リン酸脱炭酸酵素欠損株の取得
ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)IAM7153株の分生胞子懸濁液にUV照射後、その胞子を5-フルオロオロト酸(5-fluoro-orotic acid、5-FOA)培地(Boeke他 Mol. Gen. Genet. 197: 345-346, 1984)に塗布し、27℃で6〜8日間培養した。生育した5-FOA耐性株を最少培地(0.3% NaNO3、0.05% KCl、0.05% MgSO4・7H2O、0.001% FeSO4・7H2O、0.1% KH2PO4、2% グルコース、1.5% アガー、pH6.0)、5mM ウラシルを含む最少培地に各々ピックアップし、27℃で3〜5日間培養した。5mM ウラシルを含む最少培地でのみ生育するウラシル要求株を、5mM ウリジンを含むYPM培地(1%酵母エキス、2% ペプトン、2% マルトース、pH6.0)に接種し、27℃ 140(往復/分)3日間振盪培養した。氷上の冷却した乳鉢に菌糸 1g、海砂 1gを加え、菌糸を十分にすりつぶし、10mlの50 mM Tris-HCl, pH8.0を乳鉢に加え懸濁した。
その懸濁液を36,000×g、10分遠心分離により上清を集めた。その上清についてBelser他(Meth.Enzymol. 51: 155-167, 1978)の方法に従い、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(OPRTase)活性を測定し、活性がある株をオロチジン-5’-リン酸脱炭酸酵素欠損株(IAM7153ΔpyrG株)と判断した(Horiuchi他 Curr. Genet. 27: 472-478, 1995)。
1.pyrG特異的なPCRフラグメントの合成
既知のオロチジン-5’-リン酸脱炭酸酵素遺伝子であるペニシリウム・クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum) pyrG (Cantoral他, Nucleic Acid Res. 16 (16) : 8177, 1988)、 アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)pyrG (EMBL Acc. No. Y13811)、 アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)pyrG (Wilson他,Nucleic Acid Res. 16 (5): 2339, 1988)、 アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans )pyrG(Oakley他, Gene 61: 385-399, 1988)、 アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)pyrG(Weidner, Curr.Genet. 33(5): 378-385, 1988)の相同性の高い領域から、以下の6種の混合オリゴヌクレオチドをDNA合成機により合成し、PCRプライマーとした。
配列番号8
センス・プライマー:
5’-GCGCCCTGCAGGATGTC(CGT)TC(CG)AAGTC(CG)CA(AC)(CT)T-3’
配列番号9
センス・プライマー:
5’-GCGCCCTGCAGGCACATCGA(CT)ATCCTC(AT)C(CT)GA-3’
配列番号10
センス・プライマー:
5’-GCGCCCTGCAGGAAGCACAA(CT)TT(CT)(CT)T(CGT)ATCTT-3’
配列番号11
センス・プライマー:
5’-GCGCCCTGCAGGGA(AG)GA(CT)CGCAA(AG)TTCATCGA-3’
配列番号12
アンチセンス・プライマー:
5’-GCGCCCTGCAGGTG(AG)TA(CT)TGCTG(ACT)CC(ACG)AGCTT-3’
配列番号13
アンチセンス・プライマー:
5’-GCGCCCTGCAGGAT(AG)AT(AG)AAGTC(ACGT)GCACC(TCG)CG-3’
<PCR反応液>
10xPCR反応緩衝液(Perkin Elmer社) 10μl
dNTP混合液(各2mM、Perkin Elmer社) 10μl
25mM MgCl2(Perkin Elmer社) 6μl
染色体DNA溶液(100μg/ml) 1μl
50μM センス・プライマー 2μl
50μM アンチセンス・プライマー 2μl
滅菌水 68.5μl
Amplitaq Gold(5u/μl、Perkin Elmer社) 0.5μl
<PCR反応条件>
ステージ1: 変性(95℃、9分) 1サイクル
ステージ2: 変性(94℃、45秒) 30サイクル
アニール(55℃、1分)
伸長(72℃、2分)
ステージ3: 伸長(72℃、10分) 1サイクル
反応液について0.6% TAE-アガロースゲルで電気泳動を行った。配列番号8と12、8と13、9と12、9と13、10と12、10と13、11と12、11と13の組み合わせにおいてPCR断片を確認した。各PCR断片の塩基配列を決定したところ、プライマー配列以外の領域はすべて一致した。各PCR断片を制限酵素Sse8387Iで消化後、アガロース電気泳動から回収し、puc19(TOYOBO社)のSse8387Iサイトにクローニングした。
ゲノムDNAライブラリーの作製は、ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)IAM7153株の染色体DNAを制限酵素SmaIで消化後、アガロース電気泳動から回収して、pUC19(TOYOBO社)のSmaIサイトに連結して得たプラスミドDNAを用いて、コンピテントセルDH5(TOYOBO社)を形質転換しゲノムDNAライブラリーを得た。
前記1で得たクローン化PCR断片をDIG-High Prime(Roche社製)を用いて標識し、これをDNAプローブとしてスクリーニングした。DIG Easy Hyb Granules(Roche社製)を用いて42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った後、フィルターを2xSSC/0.1% SDS(室温)、0.5xSSC/0.1% SDS(68℃)で洗浄した。次にDIG Nucleic Acid Detection Kit(Roche社製)で4ヶの陽性コロニーを検出した。得られた陽性コロニーから約4.7kbpのゲノムDNAを含むプラスミドpPMPYRGを取得した。
ゲノムクローンを含むプラスミドpPMPYRGからKpnIで切り出される約2.2kbpのDNA断片の塩基配列を決定して得たペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)pyrG
遺伝子の翻訳領域の塩基配列を配列番号14に示した。翻訳領域(配列表の配列番号14)の塩基配列からイントロンを推定し、pyrG蛋白質のアミノ酸配列を推定した。得られたアミノ酸配列(配列表の配列番号15)はペニシリウム・クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum)pyrG (Cantoral他, Nucleic Acid Res. 16 (16) : 8177, 1988)と88%一致した。
上記で得たペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)IAM7153株のオロチジン−5’−リン酸脱炭酸酵素欠損株(IAM7153ΔpyrG株)を完全培地2(0.6% NaNO3、0.052% KCl、0.052% MgSO4・7H2O、0.152% KH2PO4、0.15% Trace-elements sol、1% グルコース、0.1% ウリジン、0.5% イーストエキストラクト、0.5% カザミノ酸、0.5 % カルボキシメチルセルロース、pH6.5)100ml−坂口フラスコ500mlに接種し、27℃ 140(往復/分)4〜6日振盪培養した。テトロン網(230メッシュ)を通したろ過により菌糸を集め、プロトプラスト溶液(0.8M NaCl、10mM NaH2PO4、20mMCaCl2、3.0mg/ml Yatalase、0.3mg/ml Novozyme234)40mlに懸濁後、 30℃ 1時間穏やかに振とうした。テトロン網を通したろ過によりプロトプラストを回収し、440×g、5分遠心分離により、プロトプラストを沈殿物として得た。この沈殿物を0.8M NaCl溶液 10mlに懸濁し、440×g、5分遠心分離により沈殿物を集めた。0.8M NaCl, 50mM CaCl2溶液 10mlに再懸濁し、440×g、5分遠心分離により沈殿物を集めた。適当量の0.8M NaCl、50mM CaCl2溶液に懸濁し、プロトプラスト溶液を得た。次にこのプロトプラスト溶液50μlに、マーカー遺伝子であるオロチジン-5’-リン酸脱炭酸酵素遺伝子(pyrG)を含むプラスミドpPMPYRG 20μg、12.5μlのPEG溶液(25% PEG6000、50mM CaCl210mM Tris-HCl、pH7.5)を加え混合後、氷上に20分静置した。次に0.5mlのPEG溶液を加え混合後、氷上に5分静置した。次に1mlの0.8M NaCl、50mM CaCl2溶液を加え混合した。この混合液0.75mlを、2%アガーを含む再生培地2(0.6% NaNO3、0.152%KH2PO4、0.052% KCl、0.052% MgSO4・7H2O、1% Glucose、1.2M Sorbitol、pH6.5)20ml上に塗布し、27℃で5〜8日培養した。
宿主と形質転換体8株についてYPM培地(1% 酵母エキス、2% ペプトン、2% マルトース、pH6.0)100ml−坂口フラスコ500mlに接種し、27℃ 140(往復/分)6日間振盪培養した。Hynes他(Mol. Cell. Biol 3 (8):1430-1439, 1983)の方法に従い染色体DNAを調製した。制限酵素EcoRVで消化後、アガロース電気泳動、ブロッティングを行った。DIG-High Prime(Roche社製)を用いて標識したpyrG遺伝子DNA断片とフィルターを、DIG Easy Hyb Granuls(Roche社製)を用いて42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った後、フィルターを2xSSC/0.1% SDS(室温)、0.1xSSC/0.1% SDS(68℃)で洗浄した。次にDIG NucleicAcid Detection Kit(Roche社製)で検出した。その結果、すべての形質転換株についてpyrGの遺伝子導入を確認した。
pPMPYRGのpyrG遺伝子を含むDNA断片を切り出す為にpyrG遺伝子下流にXhoI認識部位を導入する目的で変異導入用プライマーを作製した。
配列番号16
センス・プライマー(pyrGF):CGGGGTACCTTCTGGCTGG
配列番号17
アンチセンスプライマー(pyrGXhoR):GTTGGCTCGAGGGCTCTTAG
pPMPYRGを鋳型としてプライマーpyrGFとpyrGXhoRを用いてPCR反応を行い約1.8KbのDNA断片を得た。増幅されたPCR断片をXhoIとKpnIで消化して得た約1.8KbのDNA断片をpBluescript II KS(+)をXhoI-KpnIで切断して得たプラスミドと連結しpPYRGKXを作製した。pPYRGKXの挿入断片にはXhoI認識部位が作製されていると共に内部配列に変化が無いことを塩基配列の決定により確認した。
実施例3で得られたpBNDGの挿入DNA断片を解析したところ、ジグリコシダーゼ遺伝子は、SpeIとClaIで切り出される約2.5KbのDNA断片中に存在することが分かった。pBNDG からSpeIとClaIで切り出される約2.5KbのDNA断片をpBluescript II KS(+)のSpeI-ClaI切断部位に挿入連結してpBNDG-SCを得た。pBNDG-SCをXhoI-KpnIで切断したプラスミドとpPYRGKXをXhoI-KpnIで切断して得たpyrG遺伝子を含むDNA断片約1.9Kbとを連結しpBNDGPYRGを得た。pBNDGPYRGをSpeI−KpnIで切断しアガロースゲル電気泳動後、ジグリコシダーゼ遺伝子とpyrG遺伝子を含むDNA断片約4.3Kbを含むゲルを回収しGene CleaneIIIkit(BIO 101, Inc社製)にてDNA抽出した。得られたDNAを用いて実施例4に示した方法で以下のようにTS1ΔpyrG株を形質転換した。
この混合液0.75mlを、2%アガーを含む再生培地2(10mM NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% KCl、0.05% MgSO4・7H2O、2% Glucose、1.2M Sorbitol、pH6.5)20ml上に塗布し、27℃で5〜8日培養した。生じたコロニーをPDK寒天培地(ポテトデキストロース寒天培地、2%KCl)に釣菌し、27℃で3〜4日間培養した。生育した菌体を前培養培地(2.0%小麦胚芽、2.0% ぶどう糖、0.3% ミーストP1G(アサヒビール食品製)、0.5% KH2Po4、pH5.5)に接種し、27℃、300rpm、4日間前培養した。前培養液を本培養培地(1.3% 脱脂大豆、2.7% ファーマメテ゛ィア(TRADERS)、4.0% アマルティシロップ(東亜化成社製)、2.0% KH2PO4 pH5.5)に1%接種し、27℃、200rpm、7日間培養した。培養終了後の菌液から得た培養上清中の酵素活性を測定した(表3参照)。形質転換体(TF1〜3)の産生するジグリコシダーゼは18.8〜21.5 U/mlであった。
Claims (8)
- 以下の理化学的性質を有するペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5(FERM P-20232)の微生物が生産する新規なジグリコシダーゼ。
(1)作用及び基質特異性
β−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離する活性を有する。
(2)至適pH
4.5付近である。
(3)pH安定性
37℃、30分間の処理条件において、pH4.0〜8.0の間で安定であり、pH4.0以下でも80%以上の活性が残存する。
(4)至適温度
酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH5.5)中、60℃付近である。
(5)熱安定性
酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH5.5)中、50℃以下で安定であり、60℃、40分処理においても45%の活性が残存する。
(6)分子量
SDS-PAGEにより測定で40000±5000ダルトンである。
(7)等電点
約pI4.3である。 - 以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質。
(a)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
(b)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。
(c)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。 - 以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質をコードする遺伝子。
(a)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
(b)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。
(c)配列表の配列番号6で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質。 - 以下の(a)又は(b)のDNAからなる遺伝子。
(a)配列表の配列番号5で表される塩基配列を有するDNA。
(b)配列表の配列番号5で表される塩基配列において、1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、かつβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼ活性を有する蛋白質をコードしているDNA。 - 請求項3又は請求項4に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項5に記載の組換えベクターにより宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項6に記載の形質転換体を培地に培養し、β−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼを生成させ、該ジグリコシダーゼを採取することを特徴とするジグリコシダーゼの製造方法。
- ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)TS-5(FERM P-20232)を培養し、請求項1に記載のβ−プリメベロシドに作用して糖とアグリコンとを遊離するジグリコシダーゼを生成させ、該ジグリコシダーゼを採取することを特徴とするジグリコシダーゼの製造方法。
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