CN109563504B

CN109563504B - 核苷酶

Info

Publication number: CN109563504B
Application number: CN201780049996.7A
Authority: CN
Inventors: 奥田启太; 片濑彻; 栗谷祐子; 松本直树; 藤村朋子; 水口伊玖磨; 乾隆子
Original assignee: Amano Enzyme Inc; Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc; Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2016-08-18
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: US20190177712A1; JPWO2018034289A1; JP7071265B2; EP3502249A4; WO2018034289A1; CN109563504A; EP3502249A1; US11078470B2

Abstract

本发明的课题在于提供对低嘌呤体食品或饮料的制造有用的新型酶。本发明公开一种核苷酶，含有：序列号1的氨基酸序列或与该氨基酸序列85％以上相同的氨基酸序列，或者序列号2的氨基酸序列或与该氨基酸序列88％以上相同的氨基酸序列。

Description

核苷酶

技术领域

本发明涉及一种新型核苷酶。详细而言，涉及一种在减少食品或饮料中的嘌呤体方面有用的核苷酶。本申请主张基于在2016年8月18日申请的日本专利申请第2016－160899号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照而被引入。

背景技术

由于饮食生活的欧美化、酒精摄取量的增加，高尿酸血症和以其为基础的痛风的患病率趋于上升趋势。作为这些疾病的原因之一，食品或饮料中的嘌呤体被视为问题。例如，肝类、鱼精或鱼卵、一部分鱼贝类等大量含有嘌呤体。另外，酒精饮料、特别是酿造酒(啤酒、葡萄酒等)也较多地含有嘌呤体。酒精饮料由于多日常摄取，因此，作为高尿酸血症和痛风的风险因素被认为很重要。例如，对于啤酒、发泡酒等啤酒系饮料，通常在100mL中含有3～8mg左右的来自原料(麦芽等)的嘌呤体，迫切希望提供一种降低了嘌呤体含量的啤酒/啤酒系饮料(低嘌呤体啤酒/啤酒系饮料)。

迄今为止也尝试了减少啤酒中的嘌呤体。例如，在专利文献1中记载的方法中，在制造工序中，通过使酶(嘌呤核苷磷酸化酶或核苷酶)与麦芽汁作用，将麦芽汁中的嘌呤核苷分解成核糖和游离嘌呤碱基。游离嘌呤碱基在发酵中被酵母同化。其结果，啤酒制品中的嘌呤体(游离嘌呤碱基、核苷酸、核苷)的量减少。专利文献2中也报告了对啤酒中的嘌呤体减少有用的核苷酶。另外，也提出了通过使用吸附剂而除去嘌呤体的方法(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3824326号公报

专利文献2：日本专利第3824353号公报

专利文献3：日本特开2004－113189号公报

发明内容

如上所述，虽然报告了用于除去啤酒中的嘌呤体的各种技术，但没有被实用化的例子，对制造低嘌呤体啤酒的技术的需求仍然高。另外，对于发泡酒等啤酒系饮料，虽然能够通过减少麦芽使用率或者使用麦芽以外的原料而减少嘌呤体含量，但使用的原料受限制，因此，不能说是根本性的解决对策。因此，本发明的课题在于提供特别是对减少啤酒或啤酒系饮料中的嘌呤体有用的新型酶。另外，课题也在于提供该酶的各种用途。

在上述课题下，本发明人等为了发现对低嘌呤体啤酒的制造有用的酶，以广泛种类的微生物作为对象实施了筛选。对超过一万种的微生物进行了研究，结果鉴定了4株微生物作为有希望的候补。对于这些微生物所产生的核苷酶，假设在啤酒的进料(糖化)工序中利用，对进料工序的一般条件下的作用·效果进行评价。其结果，发现了3株所产生的核苷酶可能受到基于分解产物(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤)的抑制，无法发挥期望的效果。另一方面，剩余的1株(多色青霉IFO 7569株)所产生的核苷酶不受到产物抑制，显示高分解活性。因此，尝试了由该菌株取得核苷酶。其结果，成功地纯化了不受到产物抑制，并且在腺苷、腺嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤和黄嘌呤的存在下也显示活性这样的实用性优异的2种核苷酶。通过进一步的研究，成功地鉴定了该2种核苷酶的氨基酸序列和编码其的基因，并且也成功地确定了各核苷酶的各种性质。明确了这些酶特别是在最适温度和温度稳定性方面适于在啤酒的进料工序中使用。另外，发现了在宽的pH区域和温度带显示稳定的活性，也能够应用于啤酒/啤酒系饮料以外(例如酸奶、腌渍物等发酵食品)。

如上所述，进行了深入研究，结果成功地取得对减少饮料·食品中的嘌呤体极其有用的新型核苷酶。基于该成果，提供以下的发明。

[1]一种核苷酶，含有：序列号1的氨基酸序列或与该氨基酸序列85％以上相同的氨基酸序列，或者序列号2的氨基酸序列或与该氨基酸序列88％以上相同的氨基酸序列。

[2]根据[1]所述的核苷酶，其中，氨基酸序列为与序列号1的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列。

[3]一种核苷酶，具有下述的酶学性质：

(1)作用：催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应，在腺苷、腺嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤和黄嘌呤的存在下也显示活性，

(2)分子量：不含N型糖链时的分子量约为49kDa(利用SDS-PAGE测得)，

(3)最适温度：55℃～60℃，

(4)温度稳定性：在55℃以下稳定(pH6.0、30分钟)。

[4]根据[3]所述的核苷酶，进一步具有下述的酶学性质：

(5)最适pH：3.5，

(6)pH稳定性：在pH3.5～7.5的范围内稳定(30℃、30分钟)。

[5]一种核苷酶，具有下述的酶学性质：

(2)分子量：不含N型糖链时的分子量约为40kDa(利用SDS-PAGE测得)，

(3)最适温度：50℃～55℃、

(4)温度稳定性：在65℃以下稳定(pH4.5、60分钟)。

[6]根据[5]所述的核苷酶，进一步具有下述的酶学性质：

(5)最适pH：4.5，

(6)pH稳定性：在pH3.5～7.5的范围内稳定(30℃、30分钟)。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的核苷酶，来自多色青霉。

[8]根据[7]所述的核苷酶，其中，多色青霉为IFO 7569株或其变异株。

[9]一种核苷酶剂，含有[1]～[8]中任一项所述的核苷酶或者产生[1]～[8]中任一项所述的核苷酶的微生物的培养液或其纯化物。

[10]一种核苷酶基因，由选自以下的(a)～(c)中的任一种DNA构成：

(a)编码序列号1或2的氨基酸序列的DNA，

(b)由序列号3～6中的任一种碱基序列构成的DNA，

(c)具有与序列号3～6中的任一种碱基序列等效的碱基序列，且编码具有核苷酶活性的蛋白质的DNA。

[11]一种重组DNA，含有[10]所述的核苷酶基因。

[12]一种微生物，保有[11]所述的重组DNA。

[13]一种核苷酶的制造方法，包括以下的步骤(1)和(2)：

(1)对产生[1]～[8]中任一项所述的核苷酶的微生物进行培养的步骤，

(2)从培养后的培养液和/或菌体回收核苷酶的步骤。

[14]根据[13]所述的制造方法，其中，微生物为多色青霉IFO 7569株或其变异株。

[15]一种核苷酶的制造法，包括以下的步骤(i)和(ii)：

(i)在产生所述基因编码的蛋白质的条件下将[12]所述的微生物进行培养的步骤，

(ii)回收所产生的所述蛋白质的步骤。

[16]一种核苷酶剂的制造方法，包括以下的步骤(I)和(II)：

(I)对产生[1]～[8]中任一项所述的核苷酶的微生物进行培养的步骤，

(II)在培养后除去菌体的步骤。

[17]根据[16]所述的制造方法，进一步包括以下的步骤：

(III)对除去菌体后的培养液进行纯化的步骤。

[18]根据[16]或[17]所述的制造方法，其中，微生物为多色青霉IFO 7569株或其变异株。

附图说明

图1是糖化(进料)试验的反应工序。

图2是麦芽汁中的嘌呤体量的比较。通过高效液相色谱分析糖化后的麦芽汁中的各嘌呤体量。

图3是来自多色青霉IFO 7569株的核苷酶的作用温度区域。在7种嘌呤体存在下，在各温度条件下进行酶反应，求出游离嘌呤碱基比率。

图4是来自多色青霉IFO 7569株的核苷酶的作用pH区域。在7种嘌呤体存在下，在各pH条件下进行酶反应，求出游离嘌呤碱基比率。

图5是从多色青霉IFO 7569株纯化核苷酶。示出DEAE HP柱色谱的结果。

图6是各纯化酶(峰1～3)的分子量的测定结果(SDS-PAGE)。左边为峰1、2的结果。右边为峰3的结果。将PNGase F处理后的样品(“无糖链”的泳道)和无处理的样品(“有糖链”的泳道)进行电泳，进行CBB染色。左端的泳道为分子量标记(肌球蛋白(200kDa)、β-半乳糖苷酶(116.3kDa)、磷酸化酶B(97.4kDa)、BSA(66.3kDa)、谷氨酸脱氢酶(55.4kDa)、乳酸脱氢酶(36.5kDa)、碳酸脱氢酶(31.0kDa)、胰蛋白酶抑制剂(21.5kDa)、溶菌酶(14.4kDa)、抑肽酶(6.0kDa)、胰岛素B链(3.5kDa)、胰岛素A链(2.5kDa))。

图7是各纯化酶(峰1～3)的分子量。也示出N末端氨基酸分析的结果。

图8是基因克隆中使用的探针的序列。上段：PN1用(序列号18)、下段：PN2用(序列号19)。

图9是基因克隆的结果。示出编码峰3的酶(PN1)的基因组序列(上段。序列号4)和编码峰1、2的酶(PN2)的基因组序列(下段。序列号6)。

图10是基因克隆的结果。示出编码峰3的酶(PN1)的cDNA序列(上段。序列号3)和编码峰1、2的酶(PN2)的cDNA序列(下段。序列号5)。

图11是基因克隆的结果。示出峰3的酶(PN1)的氨基酸序列(上段。序列号1)和峰1、2的酶(PN2)的氨基酸序列(下段。序列号2)。

图12是基因克隆的结果。将cDNA碱基数、内含子数、氨基酸长度、分子量和推定pI在峰3的酶(PN1)与峰1、2的酶(PN2)之间进行比较。

图13是纯化酶(PN1)的最适温度。

图14是纯化酶(PN1)的温度稳定性。

图15是纯化酶(PN1)的最适pH。

图16是纯化酶(PN1)的pH稳定性。

图17是重组生产的酶(PN2)的电泳的结果。

图18是纯化酶(PN2)的最适温度。

图19是纯化酶(PN2)的温度稳定性。

图20是纯化酶(PN2)的最适pH。

图21是纯化酶(PN2)的pH稳定性。

图22是使用了重组生产的酶(PN2)的糖化(进料)试验的结果。

图23是糖化(进料)试验的反应工序。

图24是麦芽汁中的嘌呤体量的比较。以pH4.5～5.5进行糖化试验。通过高效液相色谱分析糖化后的麦芽汁中的各嘌呤体量。

具体实施方式

1.术语

本说明书中术语“经分离的”可以与“经纯化的”交换使用。术语“经分离的”是为了与天然的状态，即，在自然界中存在的状态的物质进行区别而使用。通过分离这样的人为操作，成为与天然的状态不同的状态即“经分离的状态”。经分离的物质与天然物本身明显且决定性地不同。

经分离的酶的纯度没有特别限定。但是，如果预知要应用于要求纯度高的用途，则优选经分离的酶的纯度高。

2.核苷酶和其生产菌

本发明的第1方面提供核苷酶和其生产菌。本发明人等成功地从多色青霉(Penicillium multicolor)取得了对减少食品·饮料中的嘌呤体有用的2种核苷酶(以下，与实施例中的表述对应地称为“PN1”和“PN2”。另外，有时将这两种核苷酶汇总称为“本酶”)，并且鉴定了其基因序列和氨基酸序列。基于该成果，本酶具有如下特征：含有序列号1的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列或者与这些氨基酸序列中任一种等效的氨基酸序列。应予说明，序列号1的氨基酸序列对应于PN1，序列号2的氨基酸序列对应于PN2。

此处的“等效的氨基酸序列”是指与作为基准的序列(序列号1的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列)一部分不同，但该不同不会对蛋白质的功能(此处为核苷酶活性)造成实质性影响的氨基酸序列。因此，具有由等效的氨基酸序列构成的多肽链的酶显示核苷酶活性。活性的程度只要能够发挥作为核苷酶的功能就没有特别限定。但是，优选与具有由基准序列构成的多肽链的酶同等程度或者比其高。

“氨基酸序列的一部分不同”典型而言是指因构成氨基酸序列的1～几个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的缺失、取代、或者1～几个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的附加、插入或者这些的组合而导致氨基酸序列发生变异(变化)。此处的氨基酸序列的不同只要可保持核苷酶活性就被允许(也可以活性稍微变动)。只要满足该条件，则氨基酸序列不同的位置没有特别限定，另外，可以在多个位置产生不同。此处的“多个”，对于序列号1的氨基酸序列而言是相当于小于全部氨基酸的约15％的数量，优选为相当于小于约10％的数量，进一步优选为相当于小于约5％的数量，更进一步优选为相当于小于约3％的数量，最优选为相当于小于约1％的数量。另一方面，对于序列号2的氨基酸序列而言是相当于小于全部氨基酸的约12％的数量，优选为相当于小于约10％的数量，进一步优选为相当于小于约5％的数量，更进一步优选为相当于小于约3％的数量，最优选为相当于小于约1％的数量。即，在序列号1的氨基酸序列成为基准的情况下，等效蛋白质具有例如约85％以上、优选约90％以上、进一步优选约95％以上、更进一步优选约98％以上、最优选约99％以上的同源性，在序列号2的氨基酸序列成为基准的情况下，具有例如约88％以上、优选约90％以上、进一步优选约95％以上、更进一步优选约98％以上、最优选约99％以上的同源性。应予说明，氨基酸序列的不同可以在多个位置产生。

优选通过在对核苷酶活性不必需的氨基酸残基产生保守性氨基酸取代而得到等效的氨基酸序列。此处的“保守性氨基酸取代”是指将某个氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而被分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)之类的几个家族。保守性氨基酸取代优选为相同家族内的氨基酸残基间的取代。

然而，两个氨基酸序列或两个核酸序列(以下，作为包括它们的术语，使用“两个序列”)的同源性(％)例如可以通过以下的步骤来确定。首先，以能够进行最佳的比较的方式将两个序列进行排列(例如，可以在第一序列导入空位(gap)而使其与第二序列的比对最佳化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列的对应的位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。两个序列的同源性是该两个序列所共同的相同位置的数量的函数(即，同源性(％)＝相同位置的数量/位置的总数×100)，优选将比对的最佳化所需的空位的数量和尺寸也纳入考虑。

两个序列的比较和同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为可用于序列比较的数学算法的具体例，有在Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于此。这样的算法已被编入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)。为了得到等效的核苷酸序列，例如只要在NBLAST程序中使score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索即可。为了得到等效的氨基酸序列，例如只要在XBLAST程序中使score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等(1997)Amino AcidsResearch 25(17):3389-3402中记载的Gapped BLAST。在利用BLAST和Gapped BLAST的情况下，可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细而言，请参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。作为可用于序列比较的其它数学的算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4:11-17中记载的算法。这样的算法例如已被编入可在GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序。在氨基酸序列的比较中利用ALIGN程序的情况下，例如可以使用PAM120残基质量表，使空位长罚分＝12，空位罚分＝4。

可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，使空位权重＝12、10、8、6或4，空位长权重＝2、3或4来确定两个氨基酸序列的同源性。另外，可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com中利用)的GAP程序，使空位权重＝50，空位长权重＝3来确定两个核酸序列的相同度。

本酶可以为更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分。作为在融合蛋白质中附加的序列，例如可举出多重组氨酸残基这样的对纯化有用的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。

具有上述氨基酸序列的本酶可以通过基因工程学方法而容易地制备。例如可以通过用编码本酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)，回收转化体内表达的蛋白质而制备。所回收的蛋白质可以根据目的而适当地纯化。如果如此得到本酶作为重组蛋白质，则可以进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入相同的载体并使用该载体进行重组蛋白质的生产，则能够得到由连接有任意的肽或蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。另外，可以实施糖链和/或脂质的附加、或者产生N末端或C末端的处理这样的修饰。通过如上所述的修饰，能够简化重组蛋白质的提取、纯化，或者附加生物学功能等。

本发明人等也明确了成功取得的新型核苷酶PN1和PN2的酶学特性。因此，也可以用以下的酶学性质来表征作为本酶的PN1和PN2。

＜PN1的酶学性质＞

(1)作用

PN1为核苷酶，催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应。嘌呤核苷是嘌呤碱基与糖的还原基以N-糖苷键键合而成的糖苷。嘌呤核苷的例子为腺苷、鸟苷、肌苷。另外，嘌呤碱基是具有嘌呤骨架的碱基的总称，具体例为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。应予说明，除嘌呤核苷和嘌呤碱基以外，还包含嘌呤核苷酸等，将具有嘌呤骨架的化合物总称为嘌呤体。

PN1在腺苷、腺嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤和黄嘌呤的存在下也显示活性。即，不会受到基于分解产物的实质性抑制。该特征在将本酶应用于食品、饮料的制造方面特别重要。利用显示该特征的PN1，在食品、饮料的制造过程中，能够将来自原料的嘌呤核苷有效地分解。

(2)分子量

PN1为天然型时含有糖链(即，是糖蛋白)，N型糖链除去前的分子量约为53kDa(利用SDS-PAGE测得的分子量)。如果通过凝胶渗透色谱进行测定，则约为126kDa，推测形成二聚体。另一方面，如果在N型糖链除去后利用SDS-PAGE测定分子量，则显示约49k Da。因此，不含N型糖链时的本酶的分子量约为49kDa(利用SDS-PAGE测得的分子量)。

(3)最适温度

PN1的最适温度为55℃～60℃。如此最适温度高在应用于经历较高温下的处理工序的食品、饮料的制造中是有利的。最适温度可以通过使用乙酸缓冲液(pH4.3)并以鸟苷作为底物，对作为反应产物的核糖进行定量来评价。

(4)温度稳定性

PN1在乙酸缓冲液(pH4.5)中处理60分钟时，在45℃以下的温度条件下维持80％以上的活性。因此，如果例如处理时的温度为5℃～45℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

另一方面，将PN1在磷酸缓冲液(pH6.0)中处理30分钟时，在55℃以下的温度条件下维持80％以上的活性。因此，如果例如处理时的温度为5℃～55℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

如此显示优异的温度稳定性的PN1可以在啤酒的进料工序等较高温的条件下也显示高活性。

可以用以下的酶学性质(5)和(6)进一步表征PN1。

(5)最适pH

PN1的最适pH为3.5。最适pH例如可以基于对于pH2.5～3.5的pH区域在柠檬酸缓冲液、对于pH3.5～5.5的pH区域在乙酸缓冲液、对于pH5.5～6.5的pH区域在磷酸钾缓冲液中测得的结果来判断。

(6)pH稳定性

PN1在宽的pH区域显示稳定的活性。例如，如果供于处理的酶溶液的pH为3.5～7.5的范围内，则30℃、30分钟的处理后，显示最大活性的80％以上的活性。另外，在50℃、60分钟的处理的情况下，如果供于处理的酶溶液的pH为3.5～7.5的范围内，则处理后，显示最大活性的80％以上的活性。应予说明，pH稳定性例如可以基于对于pH2.5～3.5的pH区域在柠檬酸缓冲液、对于pH3.5～5.5的pH区域在乙酸缓冲液、对于pH5.5～6.5的pH区域在磷酸钾缓冲液中测得的结果来判断。

＜PN2的酶学性质＞

(1)作用

PN2为核苷酶，催化将嘌呤核苷分解成D-核糖和嘌呤碱基的反应。

PN2在腺苷、腺嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤和黄嘌呤的存在下也显示活性。即，不会受到基于分解产物的实质性抑制。该特征在将本酶应用于食品、饮料的制造方面特别重要。利用显示该特征的PN1，在食品、饮料的制造过程中，能够将来自原料的嘌呤核苷有效地分解。

(2)分子量

PN2为天然型时含有糖链(即，是糖蛋白)，N型糖链除去前的分子量约为51kDa(利用SDS-PAGE测得的分子量)。如果通过凝胶渗透色谱进行测定，则约为230kDa。另一方面，如果在N型糖链除去后利用SDS-PAGE测定分子量，则显示约40kDa。因此，不含N型糖链时的本酶的分子量约为40kDa(利用SDS-PAGE测得的分子量)。

(3)最适温度

PN2的最适温度为50℃～55℃。如此最适温度高在应用于经历较高温下的处理工序的食品、饮料的制造中是有利的。最适温度可以通过使用乙酸缓冲液(pH4.3)并以鸟苷作为底物，对作为反应产物的核糖进行定量来评价。

(4)温度稳定性

PN2在乙酸缓冲液(pH4.5)中处理60分钟时，在65℃以下的温度条件维持80％以上的活性。因此，如果例如处理时的温度为5℃～65℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

另一方面，将PN2在磷酸缓冲液(pH6.0)中处理30分钟时，在55℃以下的温度条件下维持80％以上的活性。因此，如果例如处理时的温度为5℃～55℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

如此显示优异的温度稳定性的PN2可以在啤酒的进料工序等较高温的条件下也显示高活性。

可以用以下的酶学性质(5)和(6)进一步表征PN2。

(5)最适pH

PN2的最适pH为4.5。最适pH例如可以基于对于pH2.5～3.5的pH区域在柠檬酸缓冲液、对于pH3.5～5.5的pH区域在乙酸缓冲液、对于pH5.5～6.5的pH区域在磷酸钾缓冲液中测得的结果来判断。

(6)pH稳定性

PN2在宽的pH区域显示稳定的活性。例如，如果供于处理的酶溶液的pH为3.5～7.5的范围内，则30℃、30分钟的处理后，显示最大活性的80％以上的活性。另外，在50℃、60分钟的处理的情况下，如果供于处理的酶溶液的pH为4.5～7.5的范围内，则处理后，显示最大活性的80％以上的活性。应予说明，pH稳定性例如可以基于对于pH2.5～3.5的pH区域在柠檬酸缓冲液、对于pH3.5～5.5的pH区域在乙酸缓冲液、对于pH5.5～6.5的pH区域在磷酸钾缓冲液中测得结果来判断。

本酶优选为来自多色青霉(Penicillium multicolor)的核苷酶。此处的“来自多色青霉的核苷酶”是指被分类为多色青霉的微生物(可以为野生株，也可以为变异株)生产的核苷酶或者利用多色青霉(可以为野生株，也可以为变异株)的核苷酶基因并通过基因工程学方法得到的核苷酶。因此，利用导入了由多色青霉取得的核苷酶基因(或者改变了该基因的基因)的宿主微生物生产的重组体也属于“来自多色青霉的核苷酶”。

为了方便说明，将成为本酶来源的多色青霉称为本酶的生产菌。

如后述的实施例所示，本发明人等成功地从多色青霉IFO 7569株分离·纯化了具备上述性质的核苷酶。应予说明，多色青霉IFO 7569株是保存在独立行政法人制品评价技术基础机构(千叶县木更津市上总镰足2－5－8)的菌株(在NBRC Culture Catalogue作为NBRC 7569被登载)，可以通过经由规定的手续而获得。

3.编码核苷酶的基因、重组DNA、转化体

本发明的第2方面涉及一种编码本酶的基因。在一个方式中本发明的基因含有编码序列号1或2的氨基酸序列的DNA。该方式的具体例为由序列号3的碱基序列构成的DNA(与编码序列号1的氨基酸序列的cDNA对应)、由序列号4的碱基序列构成的DNA(与编码序列号1的氨基酸序列的基因组DNA对应)、由序列号5的碱基序列构成的DNA(与编码序列号2的氨基酸序列的cDNA对应)、由序列号6的碱基序列构成的DNA(与编码序列号2的氨基酸序列的基因组DNA对应)。

编码本酶的基因典型而言被用于本酶的制备。根据使用了编码本酶的基因的基因工程学制备法，能够得到更均质状态的本酶。另外，该方法在制备大量的本酶时也可以说是适当的方法。应予说明，编码本酶的基因的用途并不限于本酶的制备。例如，也可以利用该基因作为以阐明本酶的作用机制等为目的的实验用工具或者用于设计或制作本酶的变异体(改变体)的工具。

本说明书中，“编码本酶的基因”是指使其表达时可得到本酶的核酸，自然包括具有与本酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，还包括在这样的核酸中附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，也考虑密码子的简并。

本发明的基因可以通过参考本说明书或附加的序列表所公开的序列信息，利用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法、化学合成、PCR法(例如重叠PCR)或它们的组合而制备成经分离的状态。

一般而言，对编码某种蛋白质的DNA的一部分实施改变时，有时改变后的DNA所编码的蛋白质与改变前的DNA所编码的蛋白质具有同等的功能。即有时DNA序列的改变不对所编码的蛋白质的功能造成实质性影响，所编码的蛋白质的功能在改变前后得以维持。因此，本发明作为其它方式提供具有与作为基准的碱基序列(序列号3～6中的任一种序列)等效的碱基序列且编码具有核苷酶活性的蛋白质的DNA(以下，也称为“等效DNA”)。此处的“等效的碱基序列”是指与作为基准的碱基序列所示的核酸一部分不同，但其所编码的蛋白质的功能(此处为核苷酶活性)不会因该不同而受到实质性影响的碱基序列。

等效DNA的具体例是在严格条件下对与作为基准的碱基序列互补的碱基序列进行杂交的DNA。此处的“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照Molecular Cloning(ThirdEdition,Cold Spring Harbor La boratory Press,New York)、Current protocols inmolecular biology(edited b y Frederick M.Ausubel et al.,1987)进行设定。作为严格条件，例如可举出使用杂交液(50％甲酰胺，10×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约50℃进行温育，然后，使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃进行清洗的条件。作为进一步优选的严格条件，例如可举出使用作为杂交液的50％甲酰胺、5×SSC(0.15MNaC l,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。

作为等效DNA的其它具体例，可举出由对作为基准的碱基序列包含1个或多个(优选为1～几个)碱基的取代、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列构成并且编码具有核苷酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位产生。此处的“多个”根据该DNA所编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40个碱基，优选为2～20个碱基，更优选为2～10个碱基。

等效DNA相对于作为基准的碱基序列(序列号3～6中的任一种序列)，具有例如70％以上、优选80％以上、进一步优选约90％以上、更进一步优选95％以上、最优选99％以上的同源性。

如上所述的等效DNA例如可以通过利用限制性内切酶处理、利用核酸外切酶、DNA连接酶等的处理、基于定位突变导入法(Molecular Clon ing,Third Edition,Chapter13,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yor k)、随机突变导入法(MolecularCloning,Third Edition,Chapter 13,Cold S pring Harbor Laboratory Press,NewYork)的变异的导入等，以包含碱基的取代、缺失、插入、附加和/或倒位的方式对具有基准碱基序列的DNA进行改变而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其它方法而得到等效DNA。作为等效DNA的又一个例子，可举出由于以SNP(单核苷酸多态性)为代表的多态性而确认到如上所述的碱基的不同的DNA。

本发明的其它方式涉及具有与本发明的编码本酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的又一方式提供具有相对于本发明的编码本酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％相同的碱基序列的核酸。

本发明的又一方面涉及含有本发明的基因(编码本酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。本说明书中术语“载体”是指能够将插入该载体的核酸输送至细胞等靶内的核酸性分子。

可以根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)并且考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其改变体、λ噬菌体或其改变体、pBR322或其改变体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可例示pYepSec1、pMFa、pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可举出pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可例示pCDM8、pMT2PC等。

本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入该载体的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内且能够在该细胞内表达的载体。表达载体通常含有插入的核酸的表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用含有选择标记的表达载体。使用该表达载体时，可以利用选择标记来确认有无导入表达载体(和其程度)。

DNA向载体的插入、选择标记基因的插入(在需要的情况下)、启动子的插入(在需要的情况下)等可以使用标准的重组DNA技术(例如，可以参照Molecular Cloning,ThirdEdition,1.84,Cold Spring Harbor Laborat ory Press,New York，使用限制性内切酶和DNA连接酶的众所周知的方法)进行。

本发明进一步涉及导入有本发明的重组DNA(含有本发明的基因)的宿主细胞(转化体)。在本发明的转化体中，本发明的重组DNA作为外源性的分子存在。本发明的转化体优选通过使用了上述本发明载体的转染或转化而制备。转染、转化可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、脂质转染(Felg ner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))、显微注射(Graessmann,M.&Graessmann,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73,366-370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.166,557-580(1983))、乙酸锂法(Schiestl,R.H.et al.,Curr.Genet.16,339-346(1989))、原生质体－聚乙二醇法(Yelton,M.M.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.81,1470-1474(1984))等来实施。

宿主细胞只要表达本酶就没有特别限定，例如可以从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，乳球菌(Lactococcus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等乳酸菌，埃希杆菌(Escherichia)、链霉菌(Streptomyces)等其它细菌，酵母菌(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、圆酵母(Torula)、球拟酵母(Torulopsis)等酵母，米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉菌(Aspergillus)属，青霉(Penicillium)属，木霉(Trichoderma)属，镰刀菌(Fusarium)属等丝状菌(真菌)等中选择。

4.核苷酶的制造方法

本发明的第3方面提供核苷酶的制造方法。在本发明的制造方法的一个方式中，进行对产生本酶的微生物进行培养的步骤(步骤(1))以及从培养后的培养液和/或菌体回收核苷酶的步骤(步骤(2))。产生本酶的微生物例如为多色青霉，优选为多色青霉IFO 7569株或其变异株。变异株可以通过紫外线、X射线、γ射线等的照射、利用亚硝酸、羟基胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍等的处理等而得到。

培养条件、培养法只要可生产本酶就没有特别限定。即，可以将可生产本酶作为条件而适当地设定适于使用的微生物的培养的方法、培养条件。作为培养法，液体培养、固体培养中的任一种均可，优选利用液体培养。以液体培养为例，对其培养条件进行说明。

作为培养基，只要是使用的微生物可生长的培养基就没有特别限定。例如可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，进一步添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉提取物等氮源，进一步添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进使用的转化体的生长，可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调整为约3～8，优选调整为约4～7左右，培养温度通常为约20～40℃，优选为约25～35℃左右，在需氧条件下培养1～20天、优选3～10天左右。作为培养法，例如可利用振荡培养法、利用发酵罐的需氧深层培养法。

在以上的条件下培养后后，从培养液或菌体回收目标酶(步骤(2))。从培养液回收时，例如通过对培养上清液进行过滤、离心处理等而除去不溶物后，适当地组合利用了超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种层析等而进行分离、纯化，由此能够得到本酶。另一方面，从菌体内回收时，例如通过加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上述同样地进行分离、纯化，由此能够得到本酶。应予说明，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。

在本发明的其它方式中，使用上述的转化体制造核苷酶。在该方式的制造法中，首先，在产生由导入其中的基因编码的蛋白质的条件下培养上述的转化体(步骤(i))。关于各种载体-宿主体系，转化体的培养条件是公知的，只要是本领域技术人员就能够容易地设定适当的培养条件。在培养步骤之后，将所产生的蛋白质(即，核苷酶)回收(步骤(ii))。对于回收和其后的纯化，与上述方式的情况同样地进行即可。

核苷酶的纯化度没有特别限定。最终的形态可以为液态，也可以为固态(包括粉体状)。

也可以将如上所述得到的纯化酶通过例如冷冻干燥、真空干燥或者喷雾干燥等制成粉末而提供。此时，可以预先将纯化酶溶解于乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、tris-盐酸缓冲液、GOOD的缓冲液。优选可以使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，此处，作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。

5.酶剂(核苷酶剂)

本酶例如可以以酶剂(核苷酶剂)的形态提供。本酶剂除有效成分(即，本酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为有效成分的本酶的纯化度没有特别限制。即，可以为粗酶，也可以为纯化酶。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、麦芽糊精、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

在本酶剂的一个方式中，为了以简单的操作得到液状的酶剂，通过包括以下的步骤(I)和(II)的制造方法制造酶剂。

(I)对产生本酶的微生物进行培养的步骤

(II)在培养后除去菌体的步骤

步骤(I)与本酶的制造法中的上述步骤(1)同样，因此，省略其说明。在接着步骤(I)的步骤(II)中，利用离心分离、过滤、过滤器处理等除去菌体。如此得到的不含菌体的培养液直接或者经由进一步的处理(即，将菌体除去后的培养液纯化的步骤(步骤(III))后，作为酶剂使用。作为此处的进一步的处理，例如可举出利用超滤膜的浓缩。

6.核苷酶的用途

本发明的再一方面提供本酶或本酶剂的用途。作为第1用途，可提供啤酒或啤酒系饮料的制造方法。“啤酒系饮料”包含减少了麦芽的使用率的“发泡酒”、以与啤酒、发泡酒不同的原料、制法制作的啤酒风味的发泡酒精饮料(一般称为“第3啤酒”)。第3啤酒大致分为原料不使用麦芽而酿造的啤酒以及在发泡酒中混合其它的酒精饮料(代表地为大麦酒)而得的啤酒。在现在的酒税法上，前者被分类为其它酿造酒(发泡性)(1)，后者被分类为利口酒(发泡性)(1)。以下，以在啤酒的制造中应用本酶或本酶剂的情况为例，对使用方式进行说明。应予说明，应用于啤酒系饮料的情况也以此为准。

将本酶或本酶剂应用于啤酒的制造时，在啤酒的制造过程中使本酶作用于麦芽汁，将芽汁中的嘌呤核苷分解成D-核糖和嘌呤碱基。啤酒的发酵中使用的酵母通常无法同化嘌呤核苷，但能够同化游离嘌呤碱基。因此，如果通过本酶的作用将麦芽汁中的嘌呤核苷转换成游离嘌呤碱基，则在发酵工序中酵母将游离嘌呤碱基同化，可得到嘌呤体的总量减少了的啤酒。

本酶或本酶剂在减少除啤酒或啤酒系饮料以外的食品或饮料中的嘌呤体的目的中也有用。如果在食品或饮料的制造过程中使用本酶或本酶剂，则能够将来自原料的嘌呤核苷转换成游离嘌呤碱基。如果游离嘌呤碱基在其后的制造过程被除去，则可得到嘌呤体含量减少了的食品·饮料。因此，可以对在制造过程中可除去游离嘌呤碱基的食品或饮料的制造应用本酶或本酶剂。对应的食品·饮料的例子为利用了能够将游离嘌呤碱基同化的微生物的发酵的食品和饮料，即发酵食品和发酵饮料。具体而言，可举出各种腌渍物、味噌、酱油、酸奶、发酵乳、乳酸菌饮料、绍兴酒、葡萄酒等。在这些食品、饮料的制造中应用本酶/本酶剂时，例如，将本酶/酶剂添加在发酵前或发酵中的原料中使其作用，将原料中的嘌呤核苷分解成D-核糖和嘌呤碱基。生成的嘌呤碱基典型而言在发酵中被微生物同化。其结果，可得到嘌呤体的总量减少了的食品或饮料。

实施例

1.新型核苷酶的取得

为了发现对低嘌呤体啤酒的制造有用的酶，以超过一万种的微生物作为对象实施了筛选。其结果，鉴定了4株微生物，即多色青霉(Penicillium multicolor)IFO 7569株、短杆菌(Bacillus brevis)IFO 15304株、亚麻短杆菌(Brevibacillus linens)IFO 12141株、爪哇毛霉(Mucor javanicus)4068株作为有希望的候补。对于这些微生物所产生的核苷酶，假设在啤酒的进料工序中利用，对在进料工序的一般的条件(糖化试验)下的作用·效果进行评价。

(1)多色青霉IFO 7569株的培养方法

将多色青霉IFO 7569株接种于下述的培养培养基B 100mL，在500mL容量坂口烧瓶中在27℃振荡培养48～72小时。将该前培养液移至下述培养培养基B 2L，在27℃通气搅拌培养120～188小时。将该培养液进行硅藻土过滤而除去菌体，将得到的培养上清液利用超滤膜进行浓缩，得到冷冻干燥粉末。

＜培养培养基A＞

1％Lustergen FK(日淀化学)

1％酵母提取物(Difco)

0.5％NaCl

pH7.0

＜培养培养基B＞

1％Lustergen FK(日淀化学)

1％酵母提取物(Difco)

2％玉米粉(Matsumoto Nohsan)

0.5％NaCl

pH6.5

(2)短杆菌IFO 15304株、亚麻短杆菌IFO 12141株、爪哇毛霉4068株的培养方法

将短杆菌IFO 15304株和亚麻短杆菌IFO 12141株接种于上述培养培养基A 10mL，在试验管中在30℃振荡培养48小时。另一方面，将爪哇毛霉IFO 4068株接种于上述培养培养基B 10mL，在相同条件下进行培养。将培养液分别移至相同组成的本培养培养基50mL，在30℃振荡培养120小时。将该培养液通过离心分离除去菌体，由得到的上清液得到冷冻干燥粉末。

(3)核苷酶活性的测定

核苷酶活性通过对由以鸟苷为底物的反应生成的核糖进行定量来定义。反应液1mL中含有0.1M乙酸缓冲液(pH4.3)、8mM鸟苷和适当量的酶。反应在添加鸟苷时开始，在55℃反应30分钟。添加1.5mL的0.5％二硝基水杨酸溶液使反应停止后，进行10分钟煮沸处理。测定冷却后的反应溶液的540nm的吸光度，由减去了未添加酶的反应溶液的吸光度的值算出活性值。将在30分钟生成1μmol的核糖的酶量定义为酶活性1U。

(4)糖化试验

添加粉碎麦芽80g、水320mL以及320U当量的核苷酶进行糖化试验，制备麦芽汁。将反应工序示于图1。糖化后的麦芽汁中的各嘌呤体量通过高效液相色谱在下述条件下进行定量分析。

＜HPLC条件＞

柱：Asahipak GS-220HQ

流动相：150mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)

温度：35℃

流速：0.5mL/分钟

检测：260nm

将分析结果示于图2。图中也示出由以下的计算式算出的游离嘌呤碱基比率。

游离嘌呤碱基比率(％)＝{嘌呤碱基/(嘌呤核苷+嘌呤碱基)}×100添加了来自多色青霉IFO 7569株(P.multicolor)的核苷酶的麦芽汁的嘌呤核苷减少，嘌呤碱基增加。对照来看，认为来自短杆菌(Bacillus brevis)IFO 15304株、亚麻短杆菌(Brevibacilluslinens)IFO 12141株、爪哇毛霉(Mucor javanicus)4068株的核苷酶可能受到基于分解产物(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤)的抑制，嘌呤核苷的量没有大的变化。

(5)来自多色青霉IFO 7569株的核苷酶(多色青霉核苷酶)的特性的研究

为了调查多色青霉核苷酶的特性，使用以下组成的溶液(以下为模拟麦芽汁)，对作用温度区域和作用pH区域进行了研究。

腺苷 0.08mmol/L

腺嘌呤 0.43mmol/L

肌苷 0.49mmol/L

次黄嘌呤 0.08mmol/L

鸟苷 0.67mmol/L

鸟嘌呤 1.45mmol/L

黄苷 0.00mmol/L

黄嘌呤 0.08mmol/L

(5－1)作用温度区域

在模拟麦芽汁2mL中添加9U的多色青霉核苷酶，在各温度下在pH5.5下进行1小时反应后，用HPLC的流动相150mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)稀释至10倍并利用高效液相色谱进行定量分析。由以下的计算式算出游离嘌呤碱基比率。在50℃～60℃的反应温度下，游离嘌呤碱基比率为90％以上(图3)。

游离嘌呤碱基比率(％)＝{嘌呤碱基/(嘌呤核苷+嘌呤碱基)}×100

(5－2)作用pH区域

在模拟麦芽汁2mL中添加9U的多色青霉核苷酶，在各pH下在55℃进行1小时反应后，用HPLC的流动相150mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)稀释至10倍并利用高效液相色谱进行定量分析。pH4.5～pH6.0使用柠檬酸缓冲液，pH6.0～6.5使用MES缓冲液。与作用温度区域的研究的情况同样地算出游离嘌呤碱基比率。在柠檬酸缓冲液时，在pH4.5～pH5.5，游离嘌呤体比率为80％以上。在MES缓冲液时，在pH6.0～pH6.5，游离嘌呤体比率为80％以上(图4)。

(6)来自多色青霉IFO 7569株的核苷酶的纯化

通过羟基磷灰石柱、阴离子交换柱、疏水柱、凝胶过滤柱色谱将核苷酶纯化。以下示出一系列的纯化工序。首先，将由多色青霉IFO 7569株的培养液制备的冷冻干燥粉末0.1g用5mL的缓冲液(5mM磷酸钾缓冲液(pH6)+0.3M NaCl)溶解，供于用相同缓冲液平衡了的羟基磷灰石柱(BioRad)。将吸附的蛋白质用5mM～300mM的磷酸梯度洗脱并回收活性馏分。将得到的活性馏分用缓冲液(20mM磷酸钾缓冲液(pH5.5))透析，供于用相同缓冲液平衡了的DEAE HP柱(GE Healthcare)。将吸附的蛋白质用0mM～500mM的NaCl梯度洗脱，结果确认到3个峰(图5)。将Fr.2确定为峰1，将Fr.8、9确定为峰2，将Fr.14、15确定为峰3。

将回收的峰3用缓冲液(20mM乙酸缓冲液(pH4.5)+30％饱和硫酸铵)透析，供于用相同缓冲液平衡了的Phenyl HP柱(GE Healthcare)。将吸附的蛋白质用30％饱和～0％的硫酸铵梯度洗脱并回收活性馏分。将得到的活性馏分用缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液(pH6))透析后，使用超滤膜浓缩至0.5mL。将浓缩的活性馏分供于用相同缓冲液平衡了的HiLoad16/60Superdex200(GE Healthcare)并回收活性馏分。得到的纯化酶通过SDS-PAGE确定为单一条带(图6)。分子量通过SDS-PAGE推定为约53kDa，通过凝胶过滤色谱推定为约126kDa(图7)。将得到的纯化酶的糖链用PNGaseF(New England BioLabs)除去。处理方法依照所附说明。由处理后的SDS-PAGE示出通过除去N型糖链而分子量从约53kDa变为约49kDa(图6、7)。对于回收的峰1、2也同样地纯化，通过SDS-PAGE和凝胶过滤色谱来确定分子量。分子量通过SDS-PAGE推定为约51kDa，通过凝胶过滤色谱推定为约230kDa(图7)。将得到的纯化酶的糖链用PNGaseF(New England BioLabs)除去。由处理后的SDS-PAGE显示通过除去N型糖链而分子量从约51kDa变为约40kDa(图6、7)。

将各纯化酶(峰1～3)的N末端氨基酸序列用蛋白质测序仪(岛津制作所)进行分析，结果推定为以下所示的序列。

峰1的N末端氨基酸序列：ADKHYAIMDNDWYTA(序列号7)

峰2的N末端氨基酸序列：ADKHYAIMDNDWYTA(序列号8)

峰3的N末端氨基酸序列：VETKLIFLT(序列号9)

峰1和峰2的分子量和N末端氨基酸序列一致，推定是相同的酶(图7)。在以下的研究中，将该酶称为PN2，将峰3的酶称为PN1。

2.基因克隆

由确定的N末端氨基酸序列和核苷酶保守序列设计以下的简并引物，以多色青霉基因组DNA作为模板而实施PCR。

＜PN1用简并引物＞

FW：ACIAARTAYMGNTTYYTIAC(序列号10)

RV：CATNCCNCKNGTCCAYTGNCC(序列号11)

＜PN2用简并引物＞

FW：GCNATHATGGAYAAYGAYTGGTAYAC(序列号12)

RV：GCNGCNGTYTCRTCCCARAANGG(序列号13)

将得到的扩增片段亚克隆于pMD20-T(TaKaRa)并进行测序，使用图8所示的探针实施Southern印迹和菌落杂交。对得到的片段进行测序而鉴定PN1和PN2的基因组中的碱基序列(图9)。

接着，由多色青霉的基因组DNA制备mRNA，使用SMARTER RACE5'/3'(TaKaRa)由该mRNA制备cDNA。然后，使用以下的引物进行PCR，对扩增片段进行测序，确定cDNA中的PN1和PN2的碱基序列(图10)。另外，由确定的碱基序列鉴定PN1和PN2的氨基酸序列(图11)。应予说明，在图12中比较了PN1和PN2。

＜PN1用PCR引物＞

FW：ATGGCACCTAAGAAAATCATCATTG(序列号14)

RV：TTAGTGGAAGATTCTATCGATGAGG(序列号15)

＜PN2用PCR引物＞

FW：ATGCATTTCCCTGTTTCATTGCCGC(序列号16)

RV：TCAACGCTCATTTCTCAGGTCGG(序列号17)

3.酶PN1的各种性质的研究

(1)最适温度

对从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶(PN1)的最适温度进行分析。将各温度的结果示于图13。该条件下的最适温度为55℃～60℃。

(2)温度稳定性

对从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶的温度稳定性进行分析。在各温度下以pH4.5处理60分钟时，到45℃为止显示残留活性80％，以pH6.0处理30分钟时，到55℃为止显示残留活性80％，(图14)。

(3)最适pH

对从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶的最适pH进行分析。pH2.5和pH3.5使用柠檬酸缓冲液，pH3.5、pH4.5和pH5.5使用乙酸缓冲液，pH5.5和pH6.5使用磷酸钾缓冲液。最适pH为pH3.5(图15)。

(4)pH稳定性

对将从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶以各pH在30℃处理30分钟时和在50℃处理60分钟时的pH稳定性进行分析。缓冲液使用与最适pH的研究时相同的缓冲液，对于pH7.5，使用磷酸钾缓冲液。在30℃处理30分钟时，在pH3.5～7.5显示80％以上的残留活性，在50℃处理60分钟时，在pH3.5～7.5显示80％以上的残留活性(图16)。

4.酶PN2的重组生产

将PN2的cDNA片段插入表达用载体的克隆位点，构建PN2表达载体。用该表达载体转化米曲霉(A.oryzae(pyrG-))。将得到的转化体进行液体培养4天(30℃、300rpm)。回收培养上清液，测定核苷酶活性。其结果，得到显示活性的转化体。另外，对培养上清液进行糖链除去处理，进行电泳，结果确认到与所推定的分子量一致的尺寸的条带(图17)。

5.酶PN2的各种性质的研究

使用重组生产的PN2研究各种性质。实验方法、条件等与PN1的研究时同样。

(1)最适温度

最适温度为50℃～55℃(图18)。

(2)温度稳定性

在各温度下以pH4.5处理60分钟时，到65℃为止显示残留活性80％，以pH6.0处理30分钟时，到55℃为止显示残留活性80％(图19)。

(3)最适pH

pH2.5和pH3.5使用柠檬酸缓冲液，pH3.5、pH4.5和pH5.5使用乙酸缓冲液，pH5.5和pH6.5使用磷酸钾缓冲液。最适pH为pH4.5(图20)。

(4)pH稳定性

对以各pH在30℃处理30分钟时和在50℃处理60分钟时的pH稳定性进行分析。缓冲液使用与最适pH的研究时相同的缓冲液。在30℃处理30分钟时，在pH3.5～7.5显示80％以上的残留活性，在50℃处理60分钟时，在pH4.5～7.5显示80％以上的残留活性(图21)。

6.酶PN2的糖化试验

使用重组生产的PN2进行糖化试验。试验方法、条件等与上述1.(4)同样。将糖化后的麦芽汁中的各嘌呤体量用高效液相色谱进行定量分析。将分析结果示于图22。可知添加了PN2(核苷酶)的麦芽汁的嘌呤核苷减少，嘌呤碱基增加。

7.低pH条件下的糖化试验

为了进一步确认来自多色青霉IFO 7569株的核苷酶在啤酒或啤酒系饮料的制造中的有用性，在该酶的最适pH附近(pH4.5～5.5)进行糖化试验，研究是否可得到期望的效果(即，嘌呤体减少)。添加粉碎麦芽80g、水320mL以及2400U当量的核苷酶，将起始(52℃)和60℃工序的pH调整为pH4.5、pH5.0或pH5.5进行糖化试验，制备麦芽汁。将反应工序示于图23。糖化后的麦芽汁中的各嘌呤体量利用高效液相色谱在下述条件下进行定量分析。将分析结果示于图24。可知本核苷酶即使在pH4.5～5.5进行糖化，游离嘌呤碱基比率也为90％以上，嘌呤核苷充分减少，嘌呤碱基增加。(图24)

＜HPLC条件＞

柱：Asahipak GS-220HQ

流动相：150mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)

温度：35℃

流速：0.5mL/分钟

检测：260nm

8.总结

来自多色青霉IFO 7569株的核苷酶显示适于在啤酒的进料工序中采用的最适温度和温度稳定性。另外，明确了pH稳定性和温度稳定性优异，不限于啤酒或啤酒系饮料的制造，能够应用于各种用途。如此，成功地取得了对减少饮料·食品中的嘌呤体极其有用的新型核苷酶。

产业上的可利用性

本发明的核苷酶显示如下特征：即使在分解产物的嘌呤体存在下也显示活性。在低嘌呤体啤酒等各种低嘌呤体食品或饮料的制造中可以利用本发明。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限定。在不脱离权利要求书的记载的情况下，在本领域技术人员能够容易地想到的范围内进行的各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等的内容通过援引而引用其全部内容。

序列表

<110> 天野酶制品株式会社

三得利控股株式会社

<120> 核苷酶

<130> AE15007P

<150> JP P2016-160899

<151> 2016-08-26

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 1

Met Ala Pro Lys Lys Ile Ile Ile Asp Thr Asp Pro Gly Ile Asp Asp

1 5 10 15

Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Ser Lys Pro Glu Asp Val Glu

20 25 30

Ile Leu Leu Ile Ser Leu Thr Phe Gly Asn Ile Glu Val Lys Asn Cys

35 40 45

Leu Arg Asn Val Val Ser Met Phe His Ile Leu Glu Arg Glu Ile Gln

50 55 60

Trp Arg Arg Gly Asn Gly Lys Ser Glu Gly Tyr Gly Thr Met Arg Ala

65 70 75 80

Phe Arg Pro Val Val Ala Val Gly Ala Glu Asp Pro Leu Glu Asp Gln

85 90 95

Lys Met Leu Ala Asp Tyr Phe His Gly Thr Asp Gly Leu Gly Gly Ile

100 105 110

His Ala Ser His Pro His Leu Thr Pro Ser Lys Ala Trp Glu His Leu

115 120 125

Phe Thr Pro Ala Val Asp Pro Gln Gly Ile Glu Pro Val Gln Thr Gly

130 135 140

Ala Gly Pro Gly Asp His Ser Phe Ile Pro Ser Arg Leu Pro Ala His

145 150 155 160

Lys Glu Ile Leu Arg Ala Leu Arg Gln Asn Glu Pro Asp Thr Val Thr

165 170 175

Leu Val Ala Val Gly Pro Leu Thr Asn Leu Ala Leu Ala Ala Ala Glu

180 185 190

Asp Pro Glu Thr Phe Leu Arg Val Lys Glu Val Val Val Met Gly Gly

195 200 205

Ala Ile Asn Gln Pro Gly Asn Val Thr Pro Val Gly Glu Phe Asn Ala

210 215 220

Tyr Ala Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Val Phe Ala Leu Thr Ser Pro

225 230 235 240

Asn Pro Asn Ser Thr Leu Pro Pro Thr Thr Ser Pro Leu Leu Gly Leu

245 250 255

Tyr Pro Ala Lys Leu Ser Arg Gln Leu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Leu

260 265 270

Asp Ile Thr Leu Arg His Asn Leu Ser Arg Gly Gln Phe Arg Gln Ala

275 280 285

Val Glu Pro Leu Leu Ala Thr Gly Ser Pro Leu Ala Glu Trp Val Thr

290 295 300

Ala Phe Met Gly His Thr Phe Arg Thr Leu Glu Arg Leu His Pro Gly

305 310 315 320

His Glu Gly Asp Glu Ala Gln Leu Ser Leu His Asp Pro Val Cys Val

325 330 335

Trp Tyr Ala Leu Thr Ala Glu Asp Ser His Trp Thr Pro Ser Ala Asn

340 345 350

Ser Pro Glu Asp Ile Arg Val Glu Thr Leu Gly Gln Trp Thr Arg Gly

355 360 365

Met Cys Val Ile Asp Gly Arg Asn Arg His Lys Ile Asp Gly Asp Glu

370 375 380

Glu Ser Ser Ser Asp His Gly Leu Trp Leu Ser Ala Arg Ala Gly Asn

385 390 395 400

Arg Ile Leu Arg Met Asp Gly Ser Pro Ala Glu His Thr Phe Gly Lys

405 410 415

Ile Leu Ile Asp Arg Ile Phe His

420

<210> 2

<211> 380

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 2

Met His Phe Pro Val Ser Leu Pro Leu Leu Cys Gly Ser Leu Leu Pro

1 5 10 15

Leu Ile Thr Gly Thr Leu Ala Val Pro Lys Ala Ser Arg Ala Asp Lys

20 25 30

His Tyr Ala Ile Met Asp Asn Asp Trp Tyr Thr Ala Gly Phe Val Pro

35 40 45

Tyr Leu Ile Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Val Leu Gly Leu Ala Ser

50 55 60

Asp Thr Ala Asn Thr Trp Gln Pro Gln Val Ala Leu His Ala Val Ala

65 70 75 80

Thr Leu Glu Ala Gly Asn Leu Ser Cys Ile Pro Val Tyr Pro Gly Ser

85 90 95

Thr Trp Pro Leu Ile Asn Thr Pro Asn Arg Phe Gln Ala Trp Glu Met

100 105 110

Val His Gly Lys Leu Pro Trp Glu Gly Ala Phe Ala Pro Glu Asn Lys

115 120 125

Thr Leu Glu Ala Glu Gly Asn Asp Pro Thr Ser Gly Asn Pro Asn Arg

130 135 140

Ile Val Lys Ala Ala Phe Lys Glu Gly Phe Pro Lys Gly Lys Pro Glu

145 150 155 160

Asn Arg Thr Ser Ala Ala Asn Phe Met Val Glu Met Val His Lys Tyr

165 170 175

Pro Gly Gln Val Ser Ile Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Thr Asn Val Ala

180 185 190

Leu Ala Val Arg Met Asp Pro Gln Phe Ala Ser Leu Ala Lys Glu Leu

195 200 205

Val Ile Met Gly Gly Tyr Val Asp Leu Asn Met Leu Gln Ala Thr Gly

210 215 220

Ser Val Leu Leu Ala Asp Leu Gln Ser Asp Ile Asn Leu Met Ile Asp

225 230 235 240

Pro Glu Ala Ser Lys Ile Ala Leu Thr Ala Glu Phe Pro Asn Ile Thr

245 250 255

Ile Ala Gly Asn Val Ala Asn Gln Val Phe Pro Thr Lys Glu Phe Val

260 265 270

Asp Glu Ile Ala Ser Val Pro Asn Pro Tyr Ser Lys Leu Phe His Asp

275 280 285

Tyr Tyr Asp Leu Ser Phe Pro Phe Trp Asp Glu Thr Ala Ala Ala Leu

290 295 300

Met Val Asp Pro Thr Leu Ala Thr Asn Gln Thr Ser Val Phe Leu Asp

305 310 315 320

Val Asp Thr Ala Tyr Gly Ser Pro Asn Tyr Gly Asn Ile His Val Tyr

325 330 335

Gln Lys Ala Leu Ala Pro Val Gly Ile Arg Glu Val Asn Phe Val Phe

340 345 350

Gln Val Asp Gly Asp Arg Leu Lys Gln Arg Ile Lys His Ser Leu Gln

355 360 365

Tyr Pro Lys Ser Cys Ala Asp Leu Arg Asn Glu Arg

370 375 380

<210> 3

<211> 1275

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 3

atggcaccta agaaaatcat cattgacact gacccgggta tcgatgacat cctggcactg 60

ctgctggctc tgtcatctaa gccagaggat gttgagattc tacttatctc tttaacattt 120

ggaaacattg aggtgaagaa ctgtcttcga aatgtggtct ccatgtttca tatcctcgag 180

cgcgagatcc agtggcgtcg tggtaacggc aagtccgaag gctatggcac tatgcgtgct 240

ttccgcccag tagtagccgt gggagcggaa gatcccttgg aagaccagaa gatgctcgct 300

gattatttcc atggaaccga tggccttggt ggcatccatg ctagtcaccc acatctcact 360

ccaagcaagg cctgggagca tctattcacc ccggccgtgg atccccaggg gatcgagcct 420

gtgcaaacgg gagctggtcc cggcgaccat tcctttatcc catcaagact acctgcacac 480

aaggagattc ttcgtgcact gcgccagaat gagcctgaca ccgtgactct cgtggcggtt 540

ggtccactga ccaacttggc cttggcagca gcagaggatc ccgaaacctt cctacgtgtc 600

aaggaggtcg ttgtgatggg tggagcaatc aaccagcctg gaaatgtcac ccccgttgga 660

gaattcaacg cctacgcaga cgccgttgca gctgcgcgag tctttgcgct gacatcacct 720

aatcccaact cgactctacc accgaccacg agtccactac ttggcctgta ccctgcaaag 780

ctcagccgac aattgactct gcgtctcttc ccgctggaca tcaccctgcg ccataacctg 840

tcccgcggcc aattccgcca agcagttgag cctctcctcg caacaggctc acccctcgct 900

gaatgggtga cagcattcat gggacacacg ttccgaaccc tggaacgcct gcaccccggc 960

catgagggcg atgaagccca gctgagtctc cacgaccctg tctgtgtgtg gtatgccctt 1020

acagcagagg attcgcactg gactccctcc gccaattccc cagaggacat tcgtgttgag 1080

acattgggcc agtggacgcg tggtatgtgc gtaatcgatg gccgaaaccg ccataagatt 1140

gatggcgacg aggaaagctc gagtgatcat ggtctgtggt tgagtgctcg tgcaggaaac 1200

cgcattttgc gaatggatgg atcgccagcc gaacacacgt tcggcaagat cctcatcgat 1260

agaatcttcc actaa 1275

<210> 4

<211> 1016

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 4

gtacccattt tctaacacta tctggacagc acccacatct cactccaagc aaggcctggg 60

agcatctatt caccccggcc gtggatcccc aggggatcga gcctgtgcaa acgggagctg 120

gtcccggcga ccattccttt atcccatcaa gactacctgc acacaaggag attcttcgtg 180

cactgcgcca gaatgagcct gacaccgtga ctctcgtggc ggttggtcca ctgaccaact 240

tggccttggc agcagcagag gatcccgaaa ccttcctacg tgtcaaggag gtcgttgtga 300

tgggtggagc aatcaaccag cctggaaatg tatgaacccc gtcgaaacac ccatttgata 360

ataagtcatt aaccgcgatt gactaggtca cccccgttgg agaattcaac gcctacgcag 420

acgccgttgc agctgcgcga gtctttgcgc tgacatcacc taatcccaac tcgactctac 480

caccgaccac gagtccacta cttggcctgt accctgcaaa gctcagccga caattgactc 540

tgcgtctctt cccgctggac atcaccctgc gccataacct gtcccgcggc caattccgcc 600

aagcagttga gcctctcctc gcaacaggct cacccctcgc tgaatgggtg acagcattca 660

tgggacacac gttccgaacc ctggaacgcc tgcaccccgg ccatgagggc gatgaagccc 720

agctgagtct ccacgaccct gtctgtgtgt ggtatgccct tacagcagag gattcgcact 780

ggactccctc cgccaattcc ccagaggaca ttcgtgttga gacattgggc cagtggacgc 840

gtggtatgtg cgtaatcgat ggccgaaacc gccataagat tgatggcgac gaggaaagct 900

cgagtgatca tggtctgtgg ttgagtgctc gtgcaggaaa ccgcattttg cgaatggatg 960

gatcgccagc cgaacacacg ttcggcaaga tcctcatcga tagaatcttc cactaa 1016

<210> 5

<211> 1143

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 5

atgcatttcc ctgtttcatt gccgctgttg tgcggctctt tgctgcctct catcaccggc 60

accctggcag tgcccaaggc ctcgcgtgcc gacaagcact atgccatcat ggacaatgat 120

tggtacacag cgggtttcgt gccttacctg atcgccctcg atggcgatgt ggaggttctg 180

ggcctagcct ctgacaccgc aaacacctgg cagcctcagg tcgctctgca cgctgtcgca 240

actctggaag ctggcaactt gagctgtatc cccgtttacc caggctcgac atggccgctc 300

atcaacaccc ccaaccgctt ccaggcgtgg gaaatggttc atggcaagct gccatgggag 360

ggtgcttttg cgccggagaa caagactctc gaggccgagg gtaacgatcc tacctctggc 420

aaccccaacc gtatcgtcaa ggccgctttc aaggaagggt tccccaaggg caagcccgag 480

aacagaacat ctgctgccaa cttcatggtc gagatggtgc acaagtaccc cggccaggtc 540

tcgatctact ctgctggagc cctgaccaat gttgcgctgg ctgtgcgcat ggatccccag 600

tttgcatctc tggctaagga gttggttatc atgggtggat acgtcgattt gaatatgctc 660

caggccactg gaagtgtctt gctggctgat cttcaatctg atatcaactt gatgattgat 720

cccgaggcct ccaagatcgc attgactgcc gaattcccca atatcaccat cgccggtaac 780

gtcgccaacc aggtctttcc taccaaggag ttcgtcgacg agatcgcctc cgttccaaac 840

ccctacagca agctcttcca cgactactac gatctgtcct tccccttctg ggatgagacg 900

gctgccgcgc tgatggttga ccctactctt gctaccaacc agacctctgt cttcctcgac 960

gtggataccg cttatggtag ccccaactat ggtaacattc acgtttacca gaaggctctt 1020

gcccctgttg gtatccggga ggtcaacttt gtcttccagg ttgatgggga tagacttaag 1080

cagcgcatca agcactctct gcagtacccc aagtcatgcg ccgacctgag aaatgagcgt 1140

tga 1143

<210> 6

<211> 847

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 6

acgatcctac ctctggcaac cccaaccgta tcgtcaaggc cgctttcaag gaagggttcc 60

ccaagggcaa gcccgagaac agaacatctg ctgccaactt catggtcgag atggtgcaca 120

agtaccccgg ccaggtctcg atctactctg ctggagccct gaccaatgtt gcgctggctg 180

tgcgcatgga tccccagttt gcatctctgg ctaaggagtt ggttatcatg ggtggatacg 240

tcgatttgaa tatgctccag gccactggaa gtgtcttgct ggctgatctt caatctgatg 300

tatgtttcat tcccggcttc tatcagctgt gttcatctgc taacttctct ttagatcaac 360

ttgatgattg atcccgaggc ctccaagatc gcattgactg ccgaattccc caatatcacc 420

atcgccggta acgtcgccaa ccaggtcttt cctaccaagg agttcgtcga cgagatcgcc 480

tccgttccaa acccctacag caagctcttc cacgactact acgatctgtc cttccccttc 540

tgggatgaga cggctgccgc gctgatggtt gaccctactc ttgctaccaa ccagacctct 600

ggtgagttta atctcgcatt gacacttgta tgaacaaatc taacagctta tagtcttcct 660

cgacgtggat accgcttatg gtagccccaa ctatggtaac attcacgttt accagaacgc 720

tcttgcccct gttggtatcc gggaggtcaa ctttgtcttc caggttgatg gggatagact 780

taagcagcgc atcaagcact ctctgcagta ccccaagtca tgcgccgacc tgagaaatga 840

gcgttga 847

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 7

Ala Asp Lys His Tyr Ala Ile Met Asp Asn Asp Trp Tyr Thr Ala

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 8

Ala Asp Lys His Tyr Ala Ile Met Asp Asn Asp Trp Tyr Thr Ala

1 5 10 15

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 9

Val Glu Thr Lys Leu Ile Phe Leu Thr

1 5

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> 肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> g or a

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> a or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> any of a, g, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> 肌苷

<400> 10

acnaartaym gnttyytnac 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> any of a, g, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> any of a, g, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> g or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> any of a, g, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> any of a, g, c, or t

<400> 11

catnccnckn gtccaytgnc c 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> any of a, g, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> a, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> t or c

<400> 12

gcnathatgg ayaaygaytg gtayac 26

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> any of a, g, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> any of a, g, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> g or a

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> g or a

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> any of a, g, c, or t

<400> 13

gcngcngtyt crtcccaraa ngg 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

atggcaccta agaaaatcat cattg 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ttagtggaag attctatcga tgagg 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

atgcatttcc ctgtttcatt gccgc 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

tcaacgctca tttctcaggt cgg 23

<210> 18

<211> 574

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 18

gaggatcccg aaaccttcct acgtgtcaag gaggtcgttg tgatgggtgg agcaatcaac 60

cagcctggaa atgtatgaac cccgtcgaaa cacccatttg ataataagtc attaaccgcg 120

attgactagg tcacccccgt tggagaattc aacgcctacg cagacgccgt tgcagctgcg 180

cgagtctttg cgctgacatc acctaatccc aactcgactc taccaccgac cacgagtcca 240

ctacttggcc tgtaccctgc aaagctcagc cgacaattga ctctgcgtct cttcccgctg 300

gacatcaccc tgcgccataa cctgtcccgc ggccaattcc gccaagcagt tgagcctctc 360

ctcgcaacag gctcacccct cgctgaatgg gtgacagcat tcatgggaca cacgttccga 420

accctggaac gcctgcaccc cggccatgag ggcgatgaag cccagctgag tctccacgac 480

cctgtctgtg tgtggtatgc ccttacagca gaggattcgc actggactcc ctccgccaat 540

tccccagagg acattcgtgt tgagacattg ggcc 574

<210> 19

<211> 509

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 19

agacaccgca aacacctggc agcctcaggt cgctctgcac gctgtcgcaa ctctggaagc 60

tggcaacttg agctgtatcc ccgtttaccc aggctcgaca tggccgctca tcaacacccc 120

caaccgcttc caggcgtggg aaatggttca tggcaagctg ccatgggagg gtgcttttgc 180

gccggagaac aagactctcg aggccgaggg taacgatcct acctctggca accccaaccg 240

tatcgtcaag gccgctttca aggaagggtt ccccaagggc aagcccgaga acagaacatc 300

tgctgccaac ttcatggtcg agatggtgca caagtacccc ggccaggtct cgatctactc 360

tgctggagcc ctgaccaatg ttgcgctggc tgtgcgcatg gatccccagt ttgcatctct 420

ggctaaggag ttggttatca tgggtggata cgtcgatttg aatatgctcc aggccactgg 480

aagtgtcttg ctggctgatc ttcaatctg 509

Claims

1.一种核苷酶，由以下氨基酸序列构成：

序列号2的氨基酸序列，或

由将序列号12和13作为引物并使用序列号19的探针且利用多色青霉IFO 7569株而得到的碱基序列所编码的氨基酸序列、或者由将序列号16和17作为引物且利用多色青霉IFO7569株而得到的碱基序列所编码的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的核苷酶，具有下述的酶学性质：

(2)分子量：不含N型糖链时的分子量约为40kDa，所述分子量是利用SDS-PAGE测得的分子量，

(3)最适温度：50℃～55℃、

(4)温度稳定性：在65℃以下稳定，条件为pH4.5、60分钟。

3.根据权利要求2所述的核苷酶，进一步具有下述的酶学性质：

(5)最适pH：4.5，

(6)pH稳定性：在pH3.5～7.5的范围内稳定，条件为30℃、30分钟。

4.一种核苷酶剂，含有权利要求1～3中任一项所述的核苷酶或者产生权利要求1～3中任一项所述的核苷酶的微生物的培养液或其纯化物。

5.一种核苷酶基因，由选自以下的(a)～(c)中的任一种DNA构成：

(a)编码序列号2的氨基酸序列的DNA，

(b)由序列号5的碱基序列构成的DNA，

(c)具有与序列号5的碱基序列等效的碱基序列，且编码具有核苷酶活性的蛋白质的DNA。

6.一种重组DNA，含有权利要求5所述的核苷酶基因。

7.一种微生物，保有权利要求6所述的重组DNA，不是多色青霉IFO 7569株或其变异株。

8.一种核苷酶的制造方法，包括以下的步骤(1)和(2)：

(1)对产生权利要求1～3中任一项所述的核苷酶的微生物进行培养的步骤，

(2)从培养后的培养液和/或菌体回收核苷酶的步骤。

9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，微生物为多色青霉IFO 7569株或其变异株。

10.一种核苷酶的制造方法，包括以下的步骤(i)和(ii)：

(i)在产生所述基因编码的蛋白质的条件下将权利要求7所述的微生物进行培养的步骤，

(ii)回收所产生的所述蛋白质的步骤。

11.一种核苷酶剂的制造方法，包括以下的步骤(I)和(II)：

(I)对产生权利要求1～3中任一项所述的核苷酶的微生物进行培养的步骤，

(II)在培养后除去菌体的步骤。

12.根据权利要求11所述的制造方法，进一步包括以下的步骤：

(III)对除去菌体后的培养液进行纯化的步骤。

13.根据权利要求11或12所述的制造方法，其中，微生物为多色青霉IFO 7569株或其变异株。