CN109803544A

CN109803544A - 核酸系调味料的制造方法

Info

Publication number: CN109803544A
Application number: CN201780061527.7A
Authority: CN
Inventors: 奥田启太
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2019-05-24
Also published as: JPWO2018066617A1; JP7130554B2; EP3524063B1; EP3524063A4; US11278045B2; JP2022119910A; US20190223480A1; DK3524063T3; WO2018066617A1; EP3524063A1

Abstract

本发明的课题在于提供呈味性得到改善的核酸系调味料。本发明提供一种核酸系调味料的制造方法，包括利用核苷酶对含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤。

Description

核酸系调味料的制造方法

技术领域

本发明涉及一种核酸系调味料。详细而言，涉及一种酵母提取物等核酸系调味料的制造方法。本申请主张基于2016年10月7日提出申请的日本国专利申请第2016-199543号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照而引入本说明书。

背景技术

以酵母提取物为代表的核酸系调味料出于赋予或增加鲜味、醇厚味等目的而被用于各种食品等。酵母提取物大致分为富含氨基酸的高氨基酸型和核酸含量多的高核酸型。后者的酵母提取物中的主要的呈味成分为5’-鸟苷酸(GMP)和5’-肌苷酸(IMP)。为了提高其效果，进行了着眼于这些呈味成分的各种研究(例如，参照专利文献1～3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平6-113789号公报

专利文献2：国际公开第2015/141531号小册子

专利文献3：国际公开第2003/055333号小册子

发明内容

鉴于核酸系调味料被利用于广泛的食品·饮料等的现状、消费者对更美味的食品、新的食味的欲求等，期望进一步增强核酸系调味料的呈味性。为了应对这样的期望，本发明的课题在于提供呈味性得到改善的核酸系调味料。

作为高核酸型的酵母提取物的呈味成分之一的GMP是通过使核酸酶作用于酵母中的核酸而生成的。因此，酵母提取物中的GMP量依赖于原料酵母中原本含有的核酸的量，即使将酶的作用条件优化等来提高生成效率，其含量也自然受到限制。另一方面，IMP是利用AMP-脱氨酶对通过核酸酶处理而产生的5’-腺苷酸(AMP)进行转化而产生的。因此，与GMP同样地，IMP的含量也依赖于原料的酵母。因此，本发明人等从与迄今为止不同的视点出发进行了研究。具体而言，着眼于酵母提取物的制造过程中生成的核苷酸，研究了通过加入利用可能以该核苷酸为底物而发挥作用的酶即核苷酶的处理工序，是否能够增强呈味性或者赋予新的呈味性。研究的结果，令人吃惊的是发现核苷酶处理对呈味性的改良或增强是有效的。除了并不认为作为核苷酶的反应生成物的嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤等)是呈味性物质的事实以外，预测通过核苷酶的作用而作为呈味性物质的GMP和IMP的量减少，从这样的方面考虑，可以说该成果是非常出乎意料的。

以下的发明主要基于上述的成果和结论。

[1]一种核酸系调味料的制造方法，其中，包括利用核苷酶对含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤。

[2]根据[1]所述的制造方法，其中，所述含核糖核苷酸的材料是对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理而得到的。

[3]根据[2]所述的制造方法，其中，包含以下的步骤(1)和(2)：

(1)准备含核糖核苷酸的材料的步骤，其中，所述含核糖核苷酸的材料是利用核糖核酸酶对含核糖核酸的材料进行处理而得到的，和

(2)利用AMP-脱氨酶和核苷酶分别或同时对所述含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤。

[4]根据[3]所述的制造方法，其中，步骤(2)由以下的步骤(2-1)和(2-2)构成：

(2-1)利用AMP-脱氨酶对所述含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤，和

(2-2)利用核苷酶对步骤(2-1)后的处理物进行处理的步骤。

[5]根据[1]所述的制造方法，其中，所述含核糖核苷酸的材料是对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理和AMP-脱氨酶处理而得到的。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，含核糖核苷酸的材料含有嘌呤核苷酸。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制造方法，其中，所述含核糖核酸的材料为酵母溶解物。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶含有序列号1的氨基酸序列或与该氨基酸序列85％以上相同的氨基酸序列，或者序列号2的氨基酸序列或与该氨基酸序列88％以上相同的氨基酸序列。

[9]根据[8]所述的制造方法，其中，所述核苷酶的氨基酸序列为与序列号1的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列。

[10]根据[1]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶具有下述的酶学性质：

(1)作用：催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应，

(2)分子量：不含N型糖链时的分子量为约49kDa(利用SDS-PAGE测得)，

(3)最适温度：55℃～60℃，

(4)温度稳定性：在55℃以下稳定(pH6.0、30分钟)。

[11]根据[10]所述的制造方法，其中，所述核苷酶进一步具有下述的酶学性质：

(5)最适pH：3.5，

(6)pH稳定性：在pH3.5～7.5的范围内稳定(30℃、30分钟)。

[12]根据[1]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶具有下述的酶学性质：

(1)作用：催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应，

(2)分子量：不含N型糖链时的分子量为约40kDa(利用SDS-PAGE测得)，

(3)最适温度：50℃～55℃，

(4)温度稳定性：在65℃以下稳定(pH4.5、60分钟)。

[13]根据[12]所述的制造方法，其中，所述核苷酶进一步具有下述的酶学性质：

(5)最适pH：4.5，

(6)pH稳定性：在pH3.5～7.5的范围内稳定(30℃、30分钟)。

[14]根据[8]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶来自多色青霉。

[15]根据[14]所述的制造方法，其中，所述多色青霉为IFO7569株或其突变株。

[16]一种核酸系调味料，其是利用[1]～[15]中任一项所述的制造方法而得到的。

[17]根据[16]所述的核酸系调味料，其中，通过所述核苷酶的作用而使嘌呤碱基的含量增加。

附图说明

图1是来自多色青霉IFO7569株的核苷酶的作用温度范围。在7种嘌呤体存在下，在各温度条件下进行酶反应，求出游离嘌呤碱基比率。

图2是来自多色青霉IFO7569株的核苷酶的作用pH范围。在7种嘌呤体存在下，在各pH条件下进行酶反应，求出游离嘌呤碱基比率。

图3是从多色青霉IFO7569株进行的核苷酶的纯化。表示DEAE HP柱色谱的结果。

图4是各纯化酶(峰1～3)的分子量的测定结果(SDS-PAGE)。左侧是峰1、2的结果。右侧是峰3的结果。对PNGase F处理后的样品(“无糖链”的泳道)和无处理的样品(“有糖链”的泳道)进行电泳并进行CBB染色。左端的泳道是分子量标记(肌球蛋白(200kDa)、β-半乳糖苷酶(116.3kDa)、磷酸化酶B(97.4kDa)、BSA(66.3kDa)、谷氨酸脱氢酶(55.4kDa)、乳酸脱氢酶(36.5kDa)、碳酸脱氢酶(31.0kDa)、胰蛋白酶抑制剂(21.5kDa)、溶菌酶(14.4kDa)、抑肽酶(6.0kDa)、胰岛素B链(3.5kDa)、胰岛素A链(2.5kDa))。

图5是各纯化酶(峰1～3)的分子量。也表示N末端氨基酸分析的结果。

图6是基因克隆中使用的探针的序列。上部：PN1用(序列号18)、下部：PN2用(序列号19)。

图7是基因克隆的结果。表示编码峰3的酶(PN1)的基因组序列(上部。序列号4)和编码峰1、2的酶(PN2)的基因组序列(下部。序列号6)。

图8是基因克隆的结果。表示编码峰3的酶(PN1)的cDNA序列(上部。序列号3)和编码峰1、2的酶(PN2)的cDNA序列(下部。序列号5)。

图9是基因克隆的结果。表示峰3的酶(PN1)的氨基酸序列(上部。序列号1)和峰1、2的酶(PN2)的氨基酸序列(下部。序列号2)。

图10是基因克隆的结果。在峰3的酶(PN1)和峰1、2的酶(PN2)之间比较cDNA碱基数、内含子数、氨基酸长度、分子量和推定pI。

图11是纯化酶(PN1)的最适温度。

图12是纯化酶(PN1)的温度稳定性。

图13是纯化酶(PN1)的最适pH。

图14是纯化酶(PN1)的pH稳定性。

图15是重组生产的酶(PN2)的电泳的结果。

图16是纯化酶(PN2)的最适温度。

图17是纯化酶(PN2)的温度稳定性。

图18是纯化酶(PN2)的最适pH。

图19是纯化酶(PN2)的pH稳定性。

图20是感官评价的结果。

具体实施方式

1.核酸系调味料的制造方法

本发明的第1方面涉及一种核酸系调味料的制造方法。核酸系调味料是指含有作为呈味成分的核酸和/或核苷酸且被用于调味的组合物。此处的调味包含味道的调整、改变、增强。核酸系调味料的原料只要含有核糖核酸和/或核糖核苷酸就没有特别限定，优选使用酵母、卵类(鱼子等)、鱼(鲑鱼、河豚等)的鱼精、鱼介类、大豆等富含核糖核酸的天然物或其加工品。核糖核酸是核糖核苷酸以磷酸二酯键连接而成的聚合物。作为核糖核酸的构成成分的核糖核苷酸是由磷酸基、D-核糖和核酸碱基(嘌呤碱基或嘧啶碱基)构成的物质，具有嘌呤碱基的核糖核苷酸被称为嘌呤核苷酸，具有嘧啶碱基的核糖核苷酸被称为嘧啶核苷酸。嘌呤核苷酸有5’-腺苷酸(AMP)、5’-鸟苷酸(GMP)、5’-肌苷酸(IMP)、5’-黄苷酸(XMP)等。嘧啶核苷酸有5’-胞苷酸(CMP)、5’-尿苷酸(UMP)等。应予说明，呈味成分或呈味性物质是成为感受到味道的原因的物质。

本发明的制造方法中，进行利用核苷酶对含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤。含核糖核苷酸的材料只要含有核糖核苷酸就没有特别限定。可以单独含有核糖核苷酸，也可以除核糖核苷酸以外还含有核糖核酸、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核苷酸等。作为含有的核糖核苷酸，优选嘌呤核苷酸。另外，含核糖核苷酸的材料优选含有呈味性嘌呤核苷酸的GMP和/或IMP。含核糖核苷酸的材料例如可通过将含核糖核酸的材料进行酸·碱分解或酶分解而得到。优选利用核糖核酸酶、AMP-脱氨酶等酶对含核糖核酸的材料进行处理而得到含核糖核苷酸的材料。作为优选的含核糖核酸的材料的例子，可举出酵母溶解物。

本发明中，基于通过在酵母提取物的制造过程中加入核苷酶处理工序，呈味性得到改良或增强这样的令人吃惊的见解，进行利用核苷酶的处理。核苷酶用于生成嘌呤碱基。只要显示以嘌呤核苷酸为底物而生成嘌呤碱基的作用，就可以使用各种核苷酶。优选使用后述的新型核苷酶进行该步骤。该核苷酶可确认到以嘌呤核苷酸为底物而生成嘌呤碱基的作用。应予说明，如过去的报告中所述，在几种核苷酶(具体而言，论文Appl.Environ.Microbiol.67,1783-1787(2001)的实验中使用的来自人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)的核苷酶、论文Can.J.Biochem.56,345-348(1978)的实验中使用的来自黑曲霉(Aspergillus niger)的核苷酶等)中可确认到上述作用。

作为含核糖核苷酸的材料，可以使用对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理而得到的材料或者对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理和AMP-脱氨酶处理而得到的材料。在前者的情况下，例如进行以下的步骤(1)和(2)。

(1)准备含核糖核苷酸的材料的步骤，所述含核糖核苷酸的材料是利用核糖核酸酶对含核糖核酸的材料进行处理而得到的，和

(2)利用AMP-脱氨酶和核苷酶分别或同时对上述含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤。

步骤(1)中，准备含核糖核苷酸的材料，所述含核糖核苷酸的材料是对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理而得到的，但也可以预先获得进行核糖核酸酶处理而成的材料，作为此处的含核糖核苷酸的材料使用，或者也可以在实施本发明时进行核糖核酸酶处理。

作为含核糖核酸的材料，优选使用酵母溶解物。在优选的方式中，以酵母作为原料来制造作为核酸系调味料的酵母提取物。作为原料的酵母只要适于在食品中使用就没有特别限定。例如可以使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)等酵母菌属酵母、产朊假丝酵母(Candida utilis)等念珠菌属酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)等克鲁维酵母属酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属酵母、汉森德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)等德巴利酵母属酵母、蜂蜜接合酵母(Zygosaccharomyces mellis)等接合酵母属酵母等食品工业中使用的酵母。应予说明，也可以使用在酿造啤酒、清酒等后回收的酵母。也可以使用在回收后进行干燥处理而得到的酵母(干燥酵母)。

酵母溶解物可以通过对酵母进行溶解处理而制备。例如可以通过酶分解法、自消化法、碱提取法、热水提取法、酸分解法、超声波破碎法、利用均化器的破碎、冷冻融解法等(也可以并用这些方法中的两种以上)将培养后的酵母进行破碎或溶解，由此能够得到酵母溶解物。酵母的培养只要通过常规方法进行即可。

在优选的一个方式中，对培养后的酵母进行热处理后，用溶解酶进行处理，得到酶溶解物。作为热处理的条件，例如可举出80℃～90℃、5分钟～30分钟。作为酶分解法中使用的溶解酶，只要是能够将酵母的细胞壁溶解的溶解酶，就可以使用各种酶。作为溶解酶的具体例，可举出YL-T“Amano”L(天野酶株式会社)。反应条件只要以最适于或适于使用的溶解酶的方式设定即可，作为具体例，可举出温度50～60℃、pH7.0～8.0。对于反应时间也没有特别限定，例如可以为3小时～5小时。

通过对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理，含核糖核酸的材料中的核糖核酸被分解，生成作为呈味性物质的GMP等核苷酸。使用的核糖核酸酶没有特别限定，例如可以使用Enzyme RP-1G(天野酶株式会社)、核酸酶“Amano”G(天野酶株式会社)等。反应条件只要以最适于或适于使用的核糖核酸酶的方式设定即可，作为具体例，可举出温度65～70℃、pH5.0～5.5。对于反应时间也没有特别限定，例如可以为3小时～16小时。

步骤(1)中准备的含核糖核苷酸的材料供于利用AMP-脱氨酶的处理和利用核苷酶的处理(步骤(2))。在步骤(2)之前，可以将不需要的成分，例如，使用酵母溶解物作为含核糖核酸的材料时的菌体(酵母细胞壁等)的一部分或全部除去。不溶成分的除去例如可以使用固液分离法、离心处理、沉降、过滤、倾析、压榨等。

AMP-脱氨酶用于将通过核糖核酸酶处理而生成的AMP转化为IMP。换而言之，通过AMP-脱氨酶处理，生成有呈味性的IMP。另一方面，通过核苷酶处理由嘌呤核苷酸生成嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤等)。

AMP-脱氨酶是将AMP水解而生成IMP和氨的酶。使用的AMP-脱氨酶没有特别限定，例如可以使用Deamizyme G(天野酶株式会社)等。

利用AMP-脱氨酶和核苷酶的处理可分别或同时进行。即，在一个方式(第1方式)中，在进行利用一种酶的处理后，进行利用另一种酶的处理。在另一个方式(第2方式)中，使这两种酶同时作用。在第1方式的情况下，优选先进行AMP脱氨酶处理，然后，进行核苷酶处理。即，依次进行以下的工序(2-1)和(2-2)。

(2-1)利用AMP-脱氨酶对上述含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤

(2-2)利用核苷酶对步骤(2-1)后的处理物进行处理的步骤

如此，能够避免在AMP-脱氨酶处理之前AMP(AMP-脱氨酶的底物)减少，以底物丰富存在的状态进行AMP-脱氨酶的酶反应，即，AMP向IMP的转化。其结果，能够制造IMP含量多的核酸系调味料。

在第1方式的情况下，各酶反应的条件只要以最适于或适于使用的酶的方式设定即可。如果示出反应条件的例子，则对于AMP-脱氨酶处理，为温度50～55℃、pH5.0～6.0，对于核苷酶处理，为温度50～60℃、pH4.5～5.5。对反应时间也没有特别限定，例如将AMP-脱氨酶处理的时间设为3小时～5小时，将核苷酶处理的时间设为1小时～3小时。

特别是从操作简便的方面考虑，可以说使AMP-脱氨酶和核苷酶同时作用的第2方式是有利的。该方式的反应条件只要能够使两种酶作用就没有特别限定。作为反应条件的例子，可举出温度50～55℃、pH5.0～6.0。另外，反应时间的例子为1小时～5小时。

通过步骤(2)得到的生成物可以直接作为核酸系调味料(例如酵母提取物)应用于各种用途，但也可以追加进行纯化工序(例如过滤、离心分离)、浓缩工序(例如蒸发浓缩、冷冻浓缩、膜浓缩)、干燥工序(例如冷冻干燥、喷雾干燥)等。

应予说明，使用对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理和AMP-脱氨酶处理而得到的材料作为含核糖核苷酸的材料的情况也与上述的情况(使用对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理而得到的材料作为含核糖核苷酸的材料的情况)同样，可以预先获得进行核糖核酸酶处理和AMP-脱氨酶处理而成的材料，作为此处的含核糖核苷酸的材料使用，或者可以在实施本发明时进行核糖核酸酶处理和AMP-脱氨酶处理。

根据本发明的制造方法，能够得到液体或固体(典型而言为粉末状、颗粒状等)的核酸系调味料。通过本发明的制造方法得到的核酸系调味料能够用于各种食品·饮料的呈味增强、呈味调整。如果举出可应用的食品·饮料的例子，则为水产加工品(圆筒状鱼糕、鱼糕、鱼肉山芋丸子、鱿鱼丝、干鱼、腌制食品、鱼肉香肠、甜烹海味、罐头等)、食肉加工品(火腿、咸肉、香肠、肉干、咸牛肉、家常牛排等)、蔬菜加工品(腌渍物、副食等)、面包类(主食面包、点心面包等)、点心(小吃点心、豆点心、烤米粉片、冷冻点心等)、调味料(调料汁、汤汁、调味料、调味汁等)、汤类、黄油炒面(咖喱酱、炖菜酱(stew roux)等)、乳制品、碳酸饮料、无酒精饮料、牛奶饮料、咖啡饮料、果汁饮料、茶系饮料。

此处、核酸系调味料中的代表性的呈味性物质为GMP和IMP。通过本发明的制造方法得到的核酸系调味料中，这两种呈味性物质在规定呈味的方面是重要的，鉴于后述的实施例所示的实验结果，这些以外的物质(具体而言为嘌呤碱基)也有助于整体的呈味。通过本发明的制造方法得到的核酸系调味料在该方面是特征性的，与通过以往的制造方法得到的调味料的构成呈味的成分组成不同。

2.核苷酶及其生产菌

本发明的第2方面提供核苷酶及其生产菌。本发明人等成功地由多色青霉(Penicillium multicolor)获得2种核苷酶(以下，与实施例中的表述对应，称为“PN1”和“PN2”。另外，有时将这两种核苷酶汇总称为“本酶”)，并鉴定了其基因序列和氨基酸序列。基于该成果，本酶具备如下特征：含有序列号1的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列、或者与这些氨基酸序列中的任一者等价的氨基酸序列。应予说明，序列号1的氨基酸序列与PN1对应，序列号2的氨基酸序列与PN2对应。

此处的“等价的氨基酸序列”是指与作为基准的序列(序列号1的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列)一部分不同，但该不同不会对蛋白质的功能(此处为核苷酶活性)造成实质性影响的氨基酸序列。因此，具有由等价的氨基酸序列构成的多肽链的酶显示核苷酶活性。活性的程度只要能够发挥作为核苷酶的功能就没有特别限定。但是，优选与具有由作为基准的序列构成的多肽链的酶同等程度或者比其高。

“氨基酸序列的一部分不同”典型而言是指因构成氨基酸序列的1～几个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的缺失、取代、或者1～几个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的添加、插入或它们的组合而导致氨基酸序列发生突变(变化)。此处的氨基酸序列的不同只要可保持核苷酶活性就被允许(活性可以稍微变动)。只要满足该条件，则氨基酸序列不同的位置没有特别限定，另外，可以在多个位置产生不同。此处的“多个”，对于序列号1的氨基酸序列，是相当于小于全部氨基酸的约15％的数量，优选为相当于小于约10％的数量，进一步优选为相当于小于约5％的数量，更进一步优选为相当于小于约3％的数量，最优选为相当于小于约1％的数量。另一方面，对于序列号2的氨基酸序列，是相当于小于全部氨基酸的约12％的数量，优选为相当于小于约10％的数量，进一步优选为相当于小于约5％的数量，更进一步优选为相当于小于约3％的数量，最优选为相当于小于约1％的数量。即，序列号1的氨基酸序列作为基准时，等价蛋白质具有例如约85％以上、优选约90％以上、进一步优选约95％以上、更进一步优选约98％以上、最优选约99％以上的同源性，序列号2的氨基酸序列作为基准时，具有例如约88％以上，优选约90％以上，进一步优选约95％以上，更进一步优选约98％以上，最优选约99％以上的同源性。应予说明，氨基酸序列的不同可以在多个位置产生。另外，对于序列号1，优选不以推定构成活性中心的331位组氨酸(H)以及推定参与催化反应的11位天冬氨酸(D)、15位天冬氨酸(D)、16位天冬氨酸(D)和332位天冬氨酸(D)作为缺失或取代的对象。

优选通过在对核苷酶活性不必需的氨基酸残基中发生保守性氨基酸取代而得到等价的氨基酸序列。此处的“保守性氨基酸取代”是指将某个氨基酸残基取代为具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而被分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)之类的几个家族。保守性氨基酸取代优选为相同家族内的氨基酸残基间的取代。

然而，两个氨基酸序列或两个核酸序列(以下，作为含有它们的术语，使用“两个序列”)的同源性(％)例如可以通过以下的步骤来确定。首先，以能够进行最佳的比较的方式将两个序列进行排列(例如，可以在第一序列导入空位(gap)而使其与第二序列的比对最佳化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列的对应的位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。两个序列的同源性是指该两个序列共通的相同位置的数量的函数(即，同源性(％)＝相同位置的数量/位置的总数×100)，优选将比对的最佳化所需的空位的数量和尺寸也纳入考虑。

两个序列的比较和同源性的确定可以利用数学算法来实现。作为可利用于序列比较的数学算法的具体例，有在Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于该方法。这样的算法已被编入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)。为了得到等价的核苷酸序列，例如只要在NBLAST程序中以score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索即可。为了得到等价的氨基酸序列，例如只要在XBLAST程序中以score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等(1997)Amino Acids Research25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST和GappedBLAST时，可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细而言，请参照http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。作为可利用于序列比较的其它数学算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。这样的算法例如被编入可在GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序。氨基酸序列的比较利用ALIGN程序时，例如可以使用PAM120残基质量表，使空位长罚分＝12，空位罚分＝4。

可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，以空位权重＝12、10、8、6或4，空位长权重＝2、3或4来确定两个氨基酸序列的同源性。另外，可以使用GCG软件包(可在http：//www.gcg.com中利用)的GAP程序，以空位权重＝50，空位长权重＝3来确定两个核酸序列的相同度。

本酶可以为更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分。作为在融合蛋白质中添加的序列，例如可举出多重组氨酸残基这样的有助于纯化的序列、确保重组生产时的稳定性的添加序列等。

具有上述氨基酸序列的本酶可以通过基因工程学方法而容易地制备。例如，可以通过利用编码本酶的DNA转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)，回收转化体内表达的蛋白质而制备。回收的蛋白质可以根据目的适当纯化。如果如此得到重组蛋白质作为本酶，则可以进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入相同的载体并使用该载体进行重组蛋白质的生产，则能够得到由连接有任意的肽或蛋白质的重组蛋白质构成的本酶。另外，可以实施糖链和/或脂质的添加、或者产生N末端或C末端的加工这样的修饰。通过如上所述的修饰，可以简化重组蛋白质的提取、纯化，或者添加生物学功能等。

本发明人等明确了成功获得的新型核苷酶PN1和PN2的酶学特性。因此，也可以用以下的酶学性质来表征作为本酶的PN1和PN2。

＜PN1的酶学性质＞

(1)作用

PN1为核苷酶，催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应。嘌呤核苷是嘌呤碱基和糖的还原基团利用N-糖苷键键合而成的糖苷。嘌呤核苷的例子为腺苷、鸟苷、肌苷。另外，嘌呤碱基为具有嘌呤骨架的碱基的统称，具体例为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。应予说明，除嘌呤核苷和嘌呤碱基以外，还包含嘌呤核苷酸等，将具有嘌呤骨架的化合物统称为嘌呤体。

PN1即使在腺苷、腺嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤和黄嘌呤的存在下也显示活性。即，不会受到由分解生成物引起的实质性抑制。该特征在食品、饮料的制造中应用本酶的方面特别重要。通过显示该特征的PN1，在食品、饮料的制造过程中，能够将来自原料的嘌呤核苷高效地分解。

(2)分子量

PN1为天然型时含有糖链(即，是糖蛋白)、N型糖链除去前的分子量约为53kDa(利用SDS-PAGE测定的分子量)。通过凝胶过滤色谱进行测定时，为约126kDa，推定形成了2聚体。另一方面，在N型糖链除去后利用SDS-PAGE测定分子量时，显示约49k Da。因此，不含N型糖链时的本酶的分子量为约49kDa(利用SDS-PAGE测定的分子量)。

(3)最适温度

PN1的最适温度为55℃～60℃。如此最适温度高有利于在经过较高温的处理工序的食品、饮料的制造中应用。最适温度可以通过使用乙酸缓冲液(pH4.3)并以鸟苷为底物对作为反应生成物的核糖进行定量来评价。

(4)温度稳定性

PN1在乙酸缓冲液(pH4.5)中处理60分钟时，在45℃以下的温度条件下维持80％以上的活性。因此，例如如果处理时的温度为5℃～45℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

另一方面，将PN1在磷酸缓冲液(pH6.0)中处理30分钟时，在55℃以下的温度条件下维持80％以上的活性。因此，例如如果处理时的温度为5℃～55℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

显示如此优异的温度稳定性的PN1即使在较高温的条件下也能够显示高的活性。

可以利用以下的酶学性质(5)和(6)来进一步表征PN1。

(5)最适pH

PN1的最适pH为3.5。最适pH例如可以基于在pH2.5～3.5的pH范围在柠檬酸缓冲液、在pH3.5～5.5的pH范围在乙酸缓冲液、在pH5.5～6.5的pH范围在磷酸钾缓冲液中测得的结果来判断。

(6)pH稳定性

PN1在宽的pH范围显示稳定的活性。例如，如果供于处理的酶溶液的pH为3.5～7.5的范围内，则在30℃处理30分钟后，显示最大活性的80％以上的活性。另外，在50℃处理60分钟时，如果供于处理的酶溶液的pH为3.5～7.5的范围内，则在处理后显示最大活性的80％以上的活性。应予说明，pH稳定性例如可以基于在pH2.5～3.5的pH范围在柠檬酸缓冲液、在pH3.5～5.5的pH范围在乙酸缓冲液、在pH5.5～6.5的pH范围在磷酸钾缓冲液中测得的结果来判断。

＜PN2的酶学性质＞

(1)作用

PN2为核苷酶，催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应。

PN2即使在腺苷、腺嘌呤、肌苷、次黄嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤和黄嘌呤的存在下也显示活性。即，不会受到由分解生成物引起的实质性抑制。该特征在食品、饮料的制造中应用本酶的方面特别重要。通过显示该特征的PN1，在食品、饮料的制造过程中，能够将来自原料的嘌呤核苷高效地分解。

(2)分子量

PN2为天然型时含有糖链(即，是糖蛋白)，N型糖链除去前的分子量为约51kDa(利用SDS-PAGE测定的分子量)。通过凝胶过滤色谱进行测定时，为约230kDa。另一方面，在N型糖链除去后利用SDS-PAGE测定分子量时，显示约40kDa。因此，不含N型糖链时的本酶的分子量为约40kDa(利用SDS-PAGE测定的分子量)。

(3)最适温度

PN2的最适温度为50℃～55℃。如此最适温度高有利于在经过较高温的处理工序的食品、饮料的制造中应用。最适温度可以通过使用乙酸缓冲液(pH4.3)并以鸟苷作为底物对作为反应生成物的核糖进行定量来评价。

(4)温度稳定性

PN2在乙酸缓冲液(pH4.5)中处理60分钟时，在65℃以下的温度条件下维持80％以上的活性。因此，例如如果处理时的温度为5℃～65℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

另一方面，将PN2在磷酸缓冲液(pH6.0)中处理30分钟时，在55℃以下的温度条件下维持80％以上的活性。因此，例如如果处理时的温度为5℃～55℃的范围，则处理后的残留活性为80％以上。

显示如此优异的温度稳定性的PN2即使在较高温的条件下也能够显示高的活性。

可以利用以下的酶学性质(5)和(6)来进一步表征PN2。

(5)最适pH

PN2的最适pH为4.5。最适pH例如可以基于在pH2.5～3.5的pH范围在柠檬酸缓冲液、在pH3.5～5.5的pH范围在乙酸缓冲液、在pH5.5～6.5的pH范围在磷酸钾缓冲液中测定的结果来判断。

(6)pH稳定性

PN2在宽的pH范围显示稳定的活性。例如，如果供于处理的酶溶液的pH为3.5～7.5的范围内，则在30℃处理30分钟后，显示最大活性的80％以上的活性。另外，在50℃处理60分时，如果供于处理的酶溶液的pH为4.5～7.5的范围内，则在处理后显示最大活性的80％以上的活性。应予说明，pH稳定性例如可以基于在pH2.5～3.5的pH范围在柠檬酸缓冲液、在pH3.5～5.5的pH范围在乙酸缓冲液、在pH5.5～6.5的pH范围在磷酸钾缓冲液中测得的结果来判断。

本酶优选为来自多色青霉(Penicillium multicolor)的核苷酶。此处的“来自多色青霉的核苷酶”是指被分类为多色青霉的微生物(可以为野生株，也可以为突变株)生产的核苷酶、或者利用多色青霉(可以为野生株，也可以为突变株)的核苷酶基因通过基因工程学方法得到的核苷酶。因此，利用导入有由多色青霉获得的核苷酶基因(或改变该基因而得到的基因)的宿主微生物生产的重组体也属于“来自多色青霉的核苷酶”。

为了方便说明，将成为本酶来源的多色青霉称为本酶的生产菌。

如后述的实施例所示，本发明人等成功地从多色青霉IFO7569株分离·纯化了具备上述性质的核苷酶。应予说明，多色青霉IFO7569株为在独立行政法人制品评价技术基础机构(千叶县木更津市上总镰足2-5-8)保存的菌株(作为NBRC7569登载于NBRC Culture目录)，可通过经由规定的手续而获得。

3.编码核苷酶的基因、重组DNA、转化体

本发明的第3方面涉及编码本酶的基因。在一个方式中，本发明的基因含有编码序列号1或2的氨基酸序列的DNA。该方式的具体例为由序列号3的碱基序列构成的DNA(与编码序列号1的氨基酸序列的cDNA对应)、由序列号4的碱基序列构成的DNA(与编码序列号1的氨基酸序列的基因组DNA对应)、由序列号5的碱基序列构成的DNA(与编码序列号2的氨基酸序列的cDNA对应)、由序列号6的碱基序列构成的DNA(与编码序列号2的氨基酸序列的基因组DNA对应)。

编码本酶的基因典型而言被利用于本酶的制备。根据使用了编码本酶的基因的基因工程学制备法，能够得到更均质状态的本酶。另外，该方法在制备大量本酶时也可以说是适当的方法。应予说明，编码本酶的基因的用途并不限于本酶的制备。例如，也可以利用该基因作为以阐明本酶的作用机制等为目的的实验用工具、或者用于设计或制作本酶的突变体(改变体)的工具。

本说明书中，“编码本酶的基因”是指使其表达时可得到本酶的核酸，当然包括具有与本酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，还包括在这样的核酸中添加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，也考虑密码子的简并。

本发明的基因可以通过参考本说明书或添加的序列表公开的序列信息，利用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法、化学合成、PCR法(例如重叠PCR)或它们的组合而制备成分离的状态。

一般而言，对编码某种蛋白质的DNA的一部分实施改变时，有时改变后的DNA编码的蛋白质具有与改变前的DNA编码的蛋白质同等的功能。即，有时DNA序列的改变不对编码的蛋白质的功能造成实质性影响，编码的蛋白质的功能在改变前后得以维持。因此，本发明作为其它方式提供具有与作为基准的碱基序列(序列号3～6中的任一序列)等价的碱基序列且编码具有核苷酶活性的蛋白质的DNA(以下，也称为“等价DNA”)。此处的“等价的碱基序列”是指与作为基准的碱基序列所示的核酸部分不同，但其编码的蛋白质的功能(此处为核苷酶活性)不会因该不同而受到实质性影响的碱基序列。

等价DNA的具体例是在严格条件下对与作为基准的碱基序列互补的碱基序列进行杂交的DNA。此处的“严格条件”是指形成所谓特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照Molecular Cloning(ThirdEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)、Current protocols inmolecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.,1987)进行设定。作为严格条件，例如可以举出使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约50℃进行温育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃进行清洗的条件。作为进一步优选的严格条件，例如可以举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。

作为等价DNA的其它具体例，可举出由相对于作为基准的碱基序列包含1个或多个(优选为1～几个)碱基的取代、缺失、插入、添加或者倒位的碱基序列构成且编码具有核苷酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位产生。此处的“多个”也根据该DNA编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40个碱基，优选为2～20个碱基，更优选为2～10个碱基。

等价DNA相对于作为基准的碱基序列(序列号3～6中的任一序列)，例如具有70％以上，优选80％以上，进一步优选约90％以上，更进一步优选95％以上，最优选99％以上的同源性。

以上这样的等价DNA例如可以通过利用限制性内切酶处理、利用核酸外切酶、DNA连接酶等的处理、基于定位突变导入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter13,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)、随机突变导入法(MolecularCloning,Third Edition,Chapter13,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)的突变导入等，以包含碱基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的方式对具有作为基准的碱基序列的DNA进行改变从而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其它方法得到等价DNA。作为等价DNA的又一个例子，可举出由于SNP(单核苷酸多态性)所代表的多态性而确认到如上所述的碱基的不同的DNA。

本发明的其它方式涉及具有与本发明的编码本酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的又一方式提供相对于本发明的编码本酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％相同的碱基序列的核酸。

本发明的又一方面涉及含有本发明的基因(编码本酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。本说明书中术语“载体”是指能够将插入该载体的核酸输送至细胞等靶内的核酸性分子。

可以根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，并且考虑宿主细胞的种类来选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其改变体、λ噬菌体或其改变体、pBR322或其改变体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可例示pYepSec1、pMFa、pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可例示pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可例示pCDM8、pMT2PC等。

本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入其中的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内且能够在该细胞内使其表达的载体。表达载体通常含有插入的核酸的表达所需要的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用含有选择标记的表达载体。使用上述表达载体时，可以利用选择标记来确认有无导入表达载体(及其程度)。

DNA向载体的插入、选择标记基因的插入(在需要的情况下)、启动子的插入(在需要的情况下)等可以使用标准的重组DNA技术(例如，可以参照Molecular Cloning,ThirdEdition,1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，使用限制性内切酶和DNA连接酶的众所周知的方法)进行。

本发明进一步涉及导入有本发明的重组DNA(含有本发明的基因)的宿主细胞(转化体)。在本发明的转化体中，本发明的重组DNA作为外源性分子存在。本发明的转化体优选通过使用上述本发明的载体的转染或转化而制备。转染、转化可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、脂质转染(Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))、显微注射(Graessmann,M.&Graessmann,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73,366-370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.166,557-580(1983))、乙酸锂法(Schiestl,R.H.et al.,Curr.Genet.16,339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton,M.M.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.81,1470-1474(1984))等来实施。

宿主细胞只要表达本酶就没有特别限定，例如可以从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌，乳球菌(Lactococcus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等乳酸菌，埃希杆菌(Escherichia)、链霉菌(Streptomyces)等其它细菌，酵母菌(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、假丝酵母(Candida)、圆酵母(Torula)、球拟酵母(Torulopsis)等酵母，米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉菌(Aspergillus)属，青霉(Penicillium)属，木霉(Trichoderma)属，镰刀菌(Fusarium)属等丝状菌(真菌)等中选择。

4.核苷酶的制造方法

本发明的第4方面提供核苷酶的制造方法。在本发明的制造方法的一个方式中，进行对产生本酶的微生物进行培养的步骤(步骤(1))和从培养后的培养液和/或菌体回收核苷酶的步骤(步骤(2))。产生本酶的微生物例如为多色青霉，优选为多色青霉IFO7569株或其突变株。突变株可以通过紫外线、X射线、γ射线等的照射、利用亚硝酸、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等的处理等而得到。突变株只要产生本酶就没有限定。作为突变株，可举出本酶的产率提高了的菌株、夹杂物的产率降低了的菌株、培养变得容易的均株、从培养液的回收变得容易的菌株等。

培养条件、培养法只要可生产本酶就没有特别限定。即，可以将可产生本酶作为条件而适当设定适于使用的微生物的培养的方法、培养条件。作为培养法，可以为液体培养、固体培养中的任一者，优选利用液体培养。以液体培养为例，对其培养条件进行说明。

作为培养基，只要为使用的微生物可生长的培养基就没有特别限定。例如，可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，进一步添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵，或者蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉提取物等氮源，进一步添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进使用的转化体的生长，可以在培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调整为约3～8，优选调整为约4～7左右，培养温度通常为约20～40℃，优选为约25～35℃左右，在需氧条件下培养1～20天、优选3～10天左右。作为培养法，例如可利用振荡培养法、使用发酵罐的需氧深层培养法。

在以上的条件下培养后，从培养液或菌体回收目标酶(步骤(2))。从培养液回收时，例如通过对培养上清液进行过滤、离心处理等而除去不溶物后，适当地组合利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种层析等进行分离、纯化，从而能够得到本酶。另一方面，从菌体内回收时，例如通过加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上述同样地进行分离、纯化，从而能够得到目标蛋白质。应予说明，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。

在本发明的其它方式中，使用上述转化体制造核苷酶。在该方式的制造法中，首先，在产生由导入其中的基因所编码的蛋白质的条件下培养上述转化体(步骤(i))。关于各种载体宿主体系，转化体的培养条件是公知的，只要是本领域技术人员就能够容易地设定适当的培养条件。与培养步骤相继，将产生的蛋白质(即，核苷酶)回收(步骤(ii))。对于回收和其后的纯化，只要与上述方式的情况同样地进行即可。

核苷酶的纯化度没有特别限定。最终的形态可以为液态，也可以为固态(包含粉体状)。

也可以将以上述方式得到的纯化酶例如通过冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等进行粉末化而提供。此时，可以预先将纯化酶溶解于乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、GOOD的缓冲液。优选使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，此处，作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。

5.酶组合物

本酶例如可以以酶组合物的形态提供。酶组合物含有本酶作为有效成分。酶组合物的纯化度没有特别限定，只要是不对本发明的效果造成影响的范围，则也可以含有其它成分。作为其它成分，可举出来自培养基的成分、夹杂蛋白质等。酶组合物的形态没有特别限定，例如可举出液体、粉末、颗粒等。

在本酶组合物的一个方式中，为了以简便的操作得到酶组合物，通过包括以下的步骤(I)和(II)的制造方法制造酶组合物。

(I)培养产生本酶的微生物的步骤

(II)培养后除去菌体的步骤

步骤(I)与本酶的制造法中的上述步骤(1)相同，因此，省略其说明。在与步骤(I)相继的步骤(II)中，利用离心分离、过滤、过滤器处理等除去菌体。如此得到的不含菌体的培养液直接或者经过进一步的处理(即，将菌体除去后的培养液进行纯化的步骤(步骤(III))后，可作为酶组合物使用。作为此处的进一步的处理，例如可举出利用超滤膜的浓缩。可以将上述步骤(II)或步骤(III)中得到的液状的酶组合物供于干燥的步骤(步骤(IV))，制成粉末、颗粒等酶组合物。作为此处的干燥处理，例如可举出冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等。

6.酶剂(核苷酶剂)

本酶例如可以以酶剂(核苷酶剂)的形态提供。本酶剂除有效成分(即，本酶)以外，还可以含有其它酶、赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为有效成分的本酶的纯化度没有特别限制。即，可以为粗酶，也可以为纯化酶。作为其它酶，例如可举出本酶以外的核苷酶、淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶)、葡萄糖苷酶(α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶)、半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)、蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、肽酶(亮氨酸肽酶、氨基肽酶)、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、核酸酶、脱氨酶、氧化酶、脱氢酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质脱氨酶、支链淀粉酶等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、麦芽糊精、白糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

在本酶剂的一个方式中，为了以简便的操作得到液状的酶剂，利用包括以下的步骤(I)和(II)的制造方法制造酶剂。

(I)培养产生本酶的微生物的步骤

(II)培养后除去菌体的步骤

步骤(I)与本酶的制造法中的上述步骤(1)同样，因此，省略其说明。在与步骤(I)相继的步骤(II)中，利用离心分离、过滤、过滤器处理等除去菌体。如此得到的不含菌体的培养液直接或者经过进一步的处理(即，将菌体除去后的培养液进行纯化的步骤(步骤(III))后，作为酶组合物使用。作为此处的进一步的处理，例如可举出利用超滤膜的浓缩。可以将上述步骤(II)或步骤(III)中得到的液状的酶组合物供于干燥的步骤(步骤(IV))，制成粉末、颗粒等酶组合物。作为此处的干燥处理，例如可举出冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等。

实施例

1.新型核苷酶的取得

为了发现新型核苷酶，以超过一万种的微生物作为对象实施了筛选。其结果，鉴定有4株微生物，即，多色青霉(Penicillium multicolor)IFO7569株、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)IFO15304株、亚麻短杆菌(Brevibacillus linens)IFO12141株、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)4068株被鉴定为有希望的候补。对这些微生物产生的核苷酶评价其作用·效果。

(1)多色青霉IFO7569株的培养方法

将多色青霉IFO7569株接种于下述的培养培养基B100mL，在500mL容量坂口烧瓶中在27℃振荡培养48～72小时。将该前培养液转移到下述培养培养基B2L在27℃通气搅拌培养120～188小时。将该培养液进行硅藻土过滤而除去菌体，利用超滤膜将得到的培养上清液进行浓缩，得到冷冻干燥粉末。

＜培养培养基A＞

1％Lustergen FK(日淀化学)

1％酵母提取物(Difco)

0.5％NaCl

pH7.0

＜培养培养基B＞

1％Lustergen FK(日澱化学)

1％酵母提取物(Difco)

2％玉米粉(Matsumoto Nosan K.K.)

0.5％NaCl

pH6.5

(2)短芽孢杆菌IFO15304株、亚麻短杆菌IFO12141株、爪哇毛霉4068株的培养方法

将短芽孢杆菌IFO15304株和亚麻短杆菌IFO12141株接种于上述培养培养基A10mL，在试管中在30℃振荡培养48小时。另一方面，将爪哇毛霉IFO4068株接种于上述培养培养基B10mL，在相同条件下进行培养。将培养液分别转移到相同组成的主培养培养基50mL，在30℃振荡培养120小时。将该培养液通过离心分离除去菌体，由得到的上清液得到冷冻干燥粉末。

(3)核苷酶活性的测定

通过定量由以鸟苷为底物的反应而生成的核糖来定义核苷酶活性。反应液1mL中含有0.1M乙酸缓冲液(pH4.3)、8mM鸟苷和适当量的酶。添加鸟苷开始反应，在55℃反应30分钟。添加1.5mL的0.5％二硝基水杨酸溶液停止反应后，进行10分钟煮沸处理。测定冷却后的反应溶液的540nm的吸光度，由减去未添加酶的反应溶液的吸光度而得到的值算出活性值。将在30分钟生成1μmol的核糖的酶量定义为酶活性1U。

(4)来自多色青霉IFO7569株的核苷酶(多色青霉核苷酶)的特性的研究

为了调查多色青霉核苷酶的特性，使用以下组成的嘌呤体溶液研究作用温度范围和作用pH范围。

腺苷 0.08mmol/L

腺嘌呤 0.43mmol/L

肌苷 0.49mmol/L

次黄嘌呤 0.08mmol/L

鸟苷 0.67mmol/L

鸟嘌呤 1.45mmol/L

黄苷 0.00mmol/L

黄嘌呤 0.08mmol/L

(4-1)作用温度范围

在嘌呤体溶液2mL中添加9U多色青霉核苷酶，以各温度在pH5.5下进行1小时反应后，利用HPLC的流动相150mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)稀释10倍，利用高效液相色谱进行定量分析。由以下的计算式算出游离嘌呤碱基比率。在50℃～60℃的反应温度下，游离嘌呤碱基比率为90％以上(图1)。

游离嘌呤碱基比率(％)＝{嘌呤碱基/(嘌呤核苷+嘌呤碱基)}×100

(4-2)作用pH范围

在嘌呤体溶液2mL中添加9U多色青霉核苷酶，以各pH在55℃反应1小时后，利用HPLC的流动相150mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)稀释10倍，利用高效液相色谱进行定量分析。pH4.5～pH6.0使用柠檬酸缓冲液，pH6.0～6.5使用MES缓冲液。与作用温度范围的研究的情况同样地算出游离嘌呤碱基比率。在柠檬酸缓冲液中，pH4.5～pH5.5时游离嘌呤体比率为80％以上。在MES缓冲液中，pH6.0～pH6.5时，游离嘌呤体比率为80％以上(图2)。

(5)来自多色青霉IFO7569株的核苷酶的纯化

通过羟基磷灰石柱、阴离子交换柱、疏水柱、凝胶过滤柱色谱对核苷酶进行纯化。以下示出一系列纯化工序。首先，利用5mL的缓冲液(5mM磷酸钾缓冲液(pH6)+0.3M NaCl)将由多色青霉IFO7569株的培养液制备的冷冻干燥粉末0.1g溶解，供于利用相同缓冲液进行了平衡化的羟基磷灰石柱(BioRad)。利用5mM～300mM的磷酸梯度洗脱吸附的蛋白质，回收活性馏分。利用缓冲液(20mM磷酸钾缓冲液(pH5.5))将得到的活性馏分透析，供于利用相同缓冲液进行了平衡化的DEAE HP柱(GE Healthcare)。利用0mM～500mM的NaCl梯度洗脱吸附的蛋白质，确认到3个峰(图3)。将Fr.2确定为峰1，将Fr.8、9确定为峰2，将Fr.14、15确定为峰3。

利用缓冲液(20mM乙酸缓冲液(pH4.5)+30％饱和硫酸铵)将回收的峰3透析，供于利用相同缓冲液进行了平衡化的Phenyl HP柱(GE Healthcare)。利用30％饱和～0％的硫酸铵梯度洗脱吸附的蛋白质，回收活性馏分。利用缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液(pH6))将得到的活性馏分透析后，使用超滤膜浓缩至0.5mL。将浓缩的活性馏分供于利用相同缓冲液进行了平衡化的HiLoad16/60 Superdex200(GE Healthcare)，回收活性馏分。得到的纯化酶通过SDS-PAGE确认为单一条带(图4)。分子量通过SDS-PAGE推定为约53kDa，通过凝胶过滤色谱推定为约126kDa(图5)。利用PNGaseF(New England BioLabs)将得到的纯化酶的糖链除去。处理方法依照添附方案进行。根据处理后的SDS-PAGE，显示通过除去N型糖链除去使分子量从约53k Da变为约49k Da(图4、5)。对回收的峰1、2也同样地进行纯化，通过SDS-PAGE和凝胶过滤色谱来确定分子量。分子量通过SDS-PAGE推定为约51kDa，通过凝胶过滤色谱推定为约230kDa(图5)。利用PNGaseF(New England BioLabs)将得到的纯化酶的糖链除去。根据处理后的SDS-PAGE，显示通过除去N型糖链使分子量从约51kDa变为约40kDa(图4、5)。

利用蛋白质测序仪(岛津制作所)对各纯化酶(峰1～3)的N末端氨基酸序列进行分析，结果推定为以下所示的序列。

峰1的N末端氨基酸序列：ADKHYAIMDNDWYTA(序列号7)

峰2的N末端氨基酸序列：ADKHYAIMDNDWYTA(序列号8)

峰3的N末端氨基酸序列：VETKLIFLT(序列号9)

峰1和峰2的分子量和N末端氨基酸序列一致，推定为相同的酶(图5)。在以下的研究中，将该酶称为PN2，将峰3的酶称为PN1。

2.基因克隆

根据确定的N末端氨基酸序列和核苷酶保存序列设计以下的简并引物，以多色青霉基因组DNA为模板实施PCR。

＜PN1用简并引物＞

FW：ACIAARTAYMGNTTYYTIAC(序列号10)

RV：CATNCCNCKNGTCCAYTGNCC(序列号11)

＜PN2用简并引物＞

FW：GCNATHATGGAYAAYGAYTGGTAYAC(序列号12)

RV：GCNGCNGTYTCRTCCCARAANGG(序列号13)

将得到的扩增片段亚克隆至pMD20-T(TaKaRa)并进行测序，使用图6所示的探针实施Southern印迹和菌落杂交。对得到的片段进行测序，鉴定PN1和PN2的基因组中的碱基序列(图7)。

接着，使用SMARTER RACE5’/3’(TaKaRa)由mRNAc制备DNA，其中，上述mRNAc由多色青霉的基因组DNA制备。然后，使用以下的引物进行PCR，对扩增片段进行测序，确定cDNA中的PN1和PN2的碱基序列(图8)。另外，由确定的碱基序列鉴定PN1和PN2的氨基酸序列(图9)。应予说明，图10中对PN1和PN2进行比较。

＜PN1用PCR引物＞

FW：ATGGCACCTAAGAAAATCATCATTG(序列号14)

RV：TTAGTGGAAGATTCTATCGATGAGG(序列号15)

＜PN2用PCR引物＞

FW：ATGCATTTCCCTGTTTCATTGCCGC(序列号16)

RV：TCAACGCTCATTTCTCAGGTCGG(序列号17)

3.酶PN1的各性质的研究

(1)最适温度

对从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶(PN1)的最适温度进行分析。将各温度下的结果示于图11。该条件下的最适温度为55℃～60℃。

(2)温度稳定性

对从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶的温度稳定性进行分析。在各温度下以pH4.5处理60分钟时，到45℃为止显示残留活性80％，以pH6.0处理30分钟处理时，到55℃为止显示残留活性80％(图12)。

(3)最适pH

对从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶的最适pH进行分析。pH2.5和pH3.5使用柠檬酸缓冲液，pH3.5、pH4.5和pH5.5使用乙酸缓冲液，pH5.5和pH6.5使用磷酸钾缓冲液。最适pH为pH3.5(图13)。

(4)pH稳定性

对将从DEAE HP柱回收的峰3的核苷酶以各pH在30℃处理30分钟时和在50℃处理60分钟时的pH稳定性进行分析。缓冲液使用与最适pH的研究的情况相同的缓冲液，对于pH7.5，使用磷酸钾缓冲液。在30℃处理30分钟时，在pH3.5～7.5显示80％以上的残留活性，在50℃处理60分钟时，在pH3.5～7.5显示80％以上的残留活性(图14)。

4.酶PN2的重组生产

将PN2的cDNA片段插入表达用载体的克隆位点，构建PN2表达载体。利用该表达载体转化米曲霉(A.oryzae(pyrG-))。将得到的转化体液体培养4天(30℃，300rpm)。回收培养上清液，测定核苷酶活性。其结果，得到显示活性的转化体。另外，对培养上清液进行糖链除去处理，进行电泳，结果确认到与所推定的分子量一致大小的条带(图15)。

5.酶PN2的各性质的研究

使用重组生产的PN2研究各性质。实验方法、条件等与PN1的研究的情况相同。

(1)最适温度

最适温度为50℃～55℃(图16)。

(2)温度稳定性

在各温度以pH4.5处理60分钟时，到65℃为止显示残留活性80％，以pH6.0处理30分钟时，到55℃为止显示残留活性80％(图17)。

(3)最适pH

pH2.5和pH3.5使用柠檬酸缓冲液，pH3.5、pH4.5和pH5.5使用乙酸缓冲液，pH5.5和pH6.5使用磷酸钾缓冲液。最适pH为pH4.5(图18)。

(4)pH稳定性

对以各pH在30℃处理30分钟时和在50℃处理60分钟时的pH稳定性进行分析。缓冲液使用与最适pH的研究的情况相同的缓冲液。在30℃处理30分钟时，在pH3.5～7.5显示80％以上的残留活性，在50℃处理60分钟时，在pH4.5～7.5显示80％以上的残留活性(图19)。

6.由核苷酶带来的呈味性的变化

通过利用核苷酶来研究是否能够增强酵母提取物的呈味性或赋予新的呈味性。

(1)方法

制备1.5％核糖核酸(和光纯药)溶液(pH5.5)，升温至70℃后，相对于核糖核酸重量添加2％的核酸酶“Amano”G(天野酶)，在70℃反应3小时。接下来，将反应液调整为pH6.0，相对于核糖核酸重量添加0.4％的Deamizyme G(天野酶)，在50℃反应3小时。然后，进行20分钟煮沸处理使酶失活。在该反应液中相对于反应液量添加0.4％的上述核苷酶(PN1和PN2的混合物)(4000U/g)，在50℃反应1小时。为了使核苷酶失活，对反应液进行10分钟煮沸处理。将添加有热失活的核苷酶的反应液作为对照。对通过以上的方法制备的样品的味道进行评价。应予说明，将以鸟苷为底物并在30分钟生成1μmol的核糖的酶量定义为核苷酶活性1U。

(2)结果

由8名小组成员(paneler)实施感官评价，结果与对照区相比，核苷酶添加区得到鲜味强的结果(图20)。

另外，HPLC解析的结果，能够确认通过核苷酶处理将嘌呤核苷酸(GMP、AMP、IMP)分解成嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤)。该结果证实了使用的核苷酶也催化将嘌呤核苷酸水解成嘌呤碱基和D-核糖-5-磷酸的反应。

根据以上的结果，启示了如果在酵母提取物的制造过程追加核苷酶处理，则可得到呈味性得到改良或鲜味得到增强的酵母提取物。

产业上的可利用性

根据本发明的制造法方法，能够得到具有特征性的呈味性的核酸系调味料。通过本发明的制造方法得到的核酸系调味料可利用于各种食品·饮料的呈味增强、呈味调整。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限定。在不脱离权利要求书的记载、本领域技术人员能够容易想到的范围内的各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等内容通过援引而引用其全部内容。

序列表

<110> 天野酶制品株式会社

<120> 核酸系调味料的制造方法

<130> AE16001P

<150> JP P2016-199543

<151> 2016-10-07

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 1

Met Ala Pro Lys Lys Ile Ile Ile Asp Thr Asp Pro Gly Ile Asp Asp

1 5 10 15

Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Ser Lys Pro Glu Asp Val Glu

20 25 30

Ile Leu Leu Ile Ser Leu Thr Phe Gly Asn Ile Glu Val Lys Asn Cys

35 40 45

Leu Arg Asn Val Val Ser Met Phe His Ile Leu Glu Arg Glu Ile Gln

50 55 60

Trp Arg Arg Gly Asn Gly Lys Ser Glu Gly Tyr Gly Thr Met Arg Ala

65 70 75 80

Phe Arg Pro Val Val Ala Val Gly Ala Glu Asp Pro Leu Glu Asp Gln

85 90 95

Lys Met Leu Ala Asp Tyr Phe His Gly Thr Asp Gly Leu Gly Gly Ile

100 105 110

His Ala Ser His Pro His Leu Thr Pro Ser Lys Ala Trp Glu His Leu

115 120 125

Phe Thr Pro Ala Val Asp Pro Gln Gly Ile Glu Pro Val Gln Thr Gly

130 135 140

Ala Gly Pro Gly Asp His Ser Phe Ile Pro Ser Arg Leu Pro Ala His

145 150 155 160

Lys Glu Ile Leu Arg Ala Leu Arg Gln Asn Glu Pro Asp Thr Val Thr

165 170 175

Leu Val Ala Val Gly Pro Leu Thr Asn Leu Ala Leu Ala Ala Ala Glu

180 185 190

Asp Pro Glu Thr Phe Leu Arg Val Lys Glu Val Val Val Met Gly Gly

195 200 205

Ala Ile Asn Gln Pro Gly Asn Val Thr Pro Val Gly Glu Phe Asn Ala

210 215 220

Tyr Ala Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Val Phe Ala Leu Thr Ser Pro

225 230 235 240

Asn Pro Asn Ser Thr Leu Pro Pro Thr Thr Ser Pro Leu Leu Gly Leu

245 250 255

Tyr Pro Ala Lys Leu Ser Arg Gln Leu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Leu

260 265 270

Asp Ile Thr Leu Arg His Asn Leu Ser Arg Gly Gln Phe Arg Gln Ala

275 280 285

Val Glu Pro Leu Leu Ala Thr Gly Ser Pro Leu Ala Glu Trp Val Thr

290 295 300

Ala Phe Met Gly His Thr Phe Arg Thr Leu Glu Arg Leu His Pro Gly

305 310 315 320

His Glu Gly Asp Glu Ala Gln Leu Ser Leu His Asp Pro Val Cys Val

325 330 335

Trp Tyr Ala Leu Thr Ala Glu Asp Ser His Trp Thr Pro Ser Ala Asn

340 345 350

Ser Pro Glu Asp Ile Arg Val Glu Thr Leu Gly Gln Trp Thr Arg Gly

355 360 365

Met Cys Val Ile Asp Gly Arg Asn Arg His Lys Ile Asp Gly Asp Glu

370 375 380

Glu Ser Ser Ser Asp His Gly Leu Trp Leu Ser Ala Arg Ala Gly Asn

385 390 395 400

Arg Ile Leu Arg Met Asp Gly Ser Pro Ala Glu His Thr Phe Gly Lys

405 410 415

Ile Leu Ile Asp Arg Ile Phe His

420

<210> 2

<211> 380

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 2

Met His Phe Pro Val Ser Leu Pro Leu Leu Cys Gly Ser Leu Leu Pro

1 5 10 15

Leu Ile Thr Gly Thr Leu Ala Val Pro Lys Ala Ser Arg Ala Asp Lys

20 25 30

His Tyr Ala Ile Met Asp Asn Asp Trp Tyr Thr Ala Gly Phe Val Pro

35 40 45

Tyr Leu Ile Ala Leu Asp Gly Asp Val Glu Val Leu Gly Leu Ala Ser

50 55 60

Asp Thr Ala Asn Thr Trp Gln Pro Gln Val Ala Leu His Ala Val Ala

65 70 75 80

Thr Leu Glu Ala Gly Asn Leu Ser Cys Ile Pro Val Tyr Pro Gly Ser

85 90 95

Thr Trp Pro Leu Ile Asn Thr Pro Asn Arg Phe Gln Ala Trp Glu Met

100 105 110

Val His Gly Lys Leu Pro Trp Glu Gly Ala Phe Ala Pro Glu Asn Lys

115 120 125

Thr Leu Glu Ala Glu Gly Asn Asp Pro Thr Ser Gly Asn Pro Asn Arg

130 135 140

Ile Val Lys Ala Ala Phe Lys Glu Gly Phe Pro Lys Gly Lys Pro Glu

145 150 155 160

Asn Arg Thr Ser Ala Ala Asn Phe Met Val Glu Met Val His Lys Tyr

165 170 175

Pro Gly Gln Val Ser Ile Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Thr Asn Val Ala

180 185 190

Leu Ala Val Arg Met Asp Pro Gln Phe Ala Ser Leu Ala Lys Glu Leu

195 200 205

Val Ile Met Gly Gly Tyr Val Asp Leu Asn Met Leu Gln Ala Thr Gly

210 215 220

Ser Val Leu Leu Ala Asp Leu Gln Ser Asp Ile Asn Leu Met Ile Asp

225 230 235 240

Pro Glu Ala Ser Lys Ile Ala Leu Thr Ala Glu Phe Pro Asn Ile Thr

245 250 255

Ile Ala Gly Asn Val Ala Asn Gln Val Phe Pro Thr Lys Glu Phe Val

260 265 270

Asp Glu Ile Ala Ser Val Pro Asn Pro Tyr Ser Lys Leu Phe His Asp

275 280 285

Tyr Tyr Asp Leu Ser Phe Pro Phe Trp Asp Glu Thr Ala Ala Ala Leu

290 295 300

Met Val Asp Pro Thr Leu Ala Thr Asn Gln Thr Ser Val Phe Leu Asp

305 310 315 320

Val Asp Thr Ala Tyr Gly Ser Pro Asn Tyr Gly Asn Ile His Val Tyr

325 330 335

Gln Lys Ala Leu Ala Pro Val Gly Ile Arg Glu Val Asn Phe Val Phe

340 345 350

Gln Val Asp Gly Asp Arg Leu Lys Gln Arg Ile Lys His Ser Leu Gln

355 360 365

Tyr Pro Lys Ser Cys Ala Asp Leu Arg Asn Glu Arg

370 375 380

<210> 3

<211> 1275

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 3

atggcaccta agaaaatcat cattgacact gacccgggta tcgatgacat cctggcactg 60

ctgctggctc tgtcatctaa gccagaggat gttgagattc tacttatctc tttaacattt 120

ggaaacattg aggtgaagaa ctgtcttcga aatgtggtct ccatgtttca tatcctcgag 180

cgcgagatcc agtggcgtcg tggtaacggc aagtccgaag gctatggcac tatgcgtgct 240

ttccgcccag tagtagccgt gggagcggaa gatcccttgg aagaccagaa gatgctcgct 300

gattatttcc atggaaccga tggccttggt ggcatccatg ctagtcaccc acatctcact 360

ccaagcaagg cctgggagca tctattcacc ccggccgtgg atccccaggg gatcgagcct 420

gtgcaaacgg gagctggtcc cggcgaccat tcctttatcc catcaagact acctgcacac 480

aaggagattc ttcgtgcact gcgccagaat gagcctgaca ccgtgactct cgtggcggtt 540

ggtccactga ccaacttggc cttggcagca gcagaggatc ccgaaacctt cctacgtgtc 600

aaggaggtcg ttgtgatggg tggagcaatc aaccagcctg gaaatgtcac ccccgttgga 660

gaattcaacg cctacgcaga cgccgttgca gctgcgcgag tctttgcgct gacatcacct 720

aatcccaact cgactctacc accgaccacg agtccactac ttggcctgta ccctgcaaag 780

ctcagccgac aattgactct gcgtctcttc ccgctggaca tcaccctgcg ccataacctg 840

tcccgcggcc aattccgcca agcagttgag cctctcctcg caacaggctc acccctcgct 900

gaatgggtga cagcattcat gggacacacg ttccgaaccc tggaacgcct gcaccccggc 960

catgagggcg atgaagccca gctgagtctc cacgaccctg tctgtgtgtg gtatgccctt 1020

acagcagagg attcgcactg gactccctcc gccaattccc cagaggacat tcgtgttgag 1080

acattgggcc agtggacgcg tggtatgtgc gtaatcgatg gccgaaaccg ccataagatt 1140

gatggcgacg aggaaagctc gagtgatcat ggtctgtggt tgagtgctcg tgcaggaaac 1200

cgcattttgc gaatggatgg atcgccagcc gaacacacgt tcggcaagat cctcatcgat 1260

agaatcttcc actaa 1275

<210> 4

<211> 1016

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 4

gtacccattt tctaacacta tctggacagc acccacatct cactccaagc aaggcctggg 60

agcatctatt caccccggcc gtggatcccc aggggatcga gcctgtgcaa acgggagctg 120

gtcccggcga ccattccttt atcccatcaa gactacctgc acacaaggag attcttcgtg 180

cactgcgcca gaatgagcct gacaccgtga ctctcgtggc ggttggtcca ctgaccaact 240

tggccttggc agcagcagag gatcccgaaa ccttcctacg tgtcaaggag gtcgttgtga 300

tgggtggagc aatcaaccag cctggaaatg tatgaacccc gtcgaaacac ccatttgata 360

ataagtcatt aaccgcgatt gactaggtca cccccgttgg agaattcaac gcctacgcag 420

acgccgttgc agctgcgcga gtctttgcgc tgacatcacc taatcccaac tcgactctac 480

caccgaccac gagtccacta cttggcctgt accctgcaaa gctcagccga caattgactc 540

tgcgtctctt cccgctggac atcaccctgc gccataacct gtcccgcggc caattccgcc 600

aagcagttga gcctctcctc gcaacaggct cacccctcgc tgaatgggtg acagcattca 660

tgggacacac gttccgaacc ctggaacgcc tgcaccccgg ccatgagggc gatgaagccc 720

agctgagtct ccacgaccct gtctgtgtgt ggtatgccct tacagcagag gattcgcact 780

ggactccctc cgccaattcc ccagaggaca ttcgtgttga gacattgggc cagtggacgc 840

gtggtatgtg cgtaatcgat ggccgaaacc gccataagat tgatggcgac gaggaaagct 900

cgagtgatca tggtctgtgg ttgagtgctc gtgcaggaaa ccgcattttg cgaatggatg 960

gatcgccagc cgaacacacg ttcggcaaga tcctcatcga tagaatcttc cactaa 1016

<210> 5

<211> 1143

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 5

atgcatttcc ctgtttcatt gccgctgttg tgcggctctt tgctgcctct catcaccggc 60

accctggcag tgcccaaggc ctcgcgtgcc gacaagcact atgccatcat ggacaatgat 120

tggtacacag cgggtttcgt gccttacctg atcgccctcg atggcgatgt ggaggttctg 180

ggcctagcct ctgacaccgc aaacacctgg cagcctcagg tcgctctgca cgctgtcgca 240

actctggaag ctggcaactt gagctgtatc cccgtttacc caggctcgac atggccgctc 300

atcaacaccc ccaaccgctt ccaggcgtgg gaaatggttc atggcaagct gccatgggag 360

ggtgcttttg cgccggagaa caagactctc gaggccgagg gtaacgatcc tacctctggc 420

aaccccaacc gtatcgtcaa ggccgctttc aaggaagggt tccccaaggg caagcccgag 480

aacagaacat ctgctgccaa cttcatggtc gagatggtgc acaagtaccc cggccaggtc 540

tcgatctact ctgctggagc cctgaccaat gttgcgctgg ctgtgcgcat ggatccccag 600

tttgcatctc tggctaagga gttggttatc atgggtggat acgtcgattt gaatatgctc 660

caggccactg gaagtgtctt gctggctgat cttcaatctg atatcaactt gatgattgat 720

cccgaggcct ccaagatcgc attgactgcc gaattcccca atatcaccat cgccggtaac 780

gtcgccaacc aggtctttcc taccaaggag ttcgtcgacg agatcgcctc cgttccaaac 840

ccctacagca agctcttcca cgactactac gatctgtcct tccccttctg ggatgagacg 900

gctgccgcgc tgatggttga ccctactctt gctaccaacc agacctctgt cttcctcgac 960

gtggataccg cttatggtag ccccaactat ggtaacattc acgtttacca gaaggctctt 1020

gcccctgttg gtatccggga ggtcaacttt gtcttccagg ttgatgggga tagacttaag 1080

cagcgcatca agcactctct gcagtacccc aagtcatgcg ccgacctgag aaatgagcgt 1140

tga 1143

<210> 6

<211> 847

<212> DNA

<213> 多色青霉

<400> 6

acgatcctac ctctggcaac cccaaccgta tcgtcaaggc cgctttcaag gaagggttcc 60

ccaagggcaa gcccgagaac agaacatctg ctgccaactt catggtcgag atggtgcaca 120

agtaccccgg ccaggtctcg atctactctg ctggagccct gaccaatgtt gcgctggctg 180

tgcgcatgga tccccagttt gcatctctgg ctaaggagtt ggttatcatg ggtggatacg 240

tcgatttgaa tatgctccag gccactggaa gtgtcttgct ggctgatctt caatctgatg 300

tatgtttcat tcccggcttc tatcagctgt gttcatctgc taacttctct ttagatcaac 360

ttgatgattg atcccgaggc ctccaagatc gcattgactg ccgaattccc caatatcacc 420

atcgccggta acgtcgccaa ccaggtcttt cctaccaagg agttcgtcga cgagatcgcc 480

tccgttccaa acccctacag caagctcttc cacgactact acgatctgtc cttccccttc 540

tgggatgaga cggctgccgc gctgatggtt gaccctactc ttgctaccaa ccagacctct 600

ggtgagttta atctcgcatt gacacttgta tgaacaaatc taacagctta tagtcttcct 660

cgacgtggat accgcttatg gtagccccaa ctatggtaac attcacgttt accagaacgc 720

tcttgcccct gttggtatcc gggaggtcaa ctttgtcttc caggttgatg gggatagact 780

taagcagcgc atcaagcact ctctgcagta ccccaagtca tgcgccgacc tgagaaatga 840

gcgttga 847

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 7

Ala Asp Lys His Tyr Ala Ile Met Asp Asn Asp Trp Tyr Thr Ala

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 8

Ala Asp Lys His Tyr Ala Ile Met Asp Asn Asp Trp Tyr Thr Ala

1 5 10 15

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 多色青霉

<400> 9

Val Glu Thr Lys Leu Ile Phe Leu Thr

1 5

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 混杂特征

<222> (3)..(3)

<223> 肌苷

<220>

<221> 混杂特征

<222> (6)..(6)

<223> g或a

<220>

<221> 混杂特征

<222> (9)..(9)

<223> t 或c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (10)..(10)

<223> a 或 c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (12)..(12)

<223> a, g, c, 或 t中的任意一个

<220>

<221> 混杂特征

<222> (15)..(15)

<223> t或c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (16)..(16)

<223> t 或c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (18)..(18)

<223> 肌苷

<400> 10

acnaartaym gnttyytnac 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 混杂特征

<222> (4)..(4)

<223> a, g, c, 或 t中的任意一个

<220>

<221> 混杂特征

<222> (7)..(7)

<223> a, g, c,或t中的任意一个

<220>

<221> 混杂特征

<222> (9)..(9)

<223> g 或 t

<220>

<221> 混杂特征

<222> (10)..(10)

<223> a, g, c, 或t中的任意一个

<220>

<221> 混杂特征

<222> (16)..(16)

<223> t 或 c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (19)..(19)

<223> a, g, c,或 t中的任意一个

<400> 11

catnccnckn gtccaytgnc c 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 混杂特征

<222> (3)..(3)

<223> a, g, c,或 t中的任意一个

<220>

<221> 混杂特征

<222> (6)..(6)

<223> a, c,或t

<220>

<221> 混杂特征

<222> (12)..(12)

<223> t或 c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (15)..(15)

<223> t或 c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (18)..(18)

<223> t或 c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (24)..(24)

<223> t 或c

<400> 12

gcnathatgg ayaaygaytg gtayac 26

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 混杂特征

<222> (3)..(3)

<223> a, g, c, 或 t中的任意一个

<220>

<221> 混杂特征

<222> (6)..(6)

<223> a, g, c, 或 t中的任意一个

<220>

<221> 混杂特征

<222> (9)..(9)

<223> t或c

<220>

<221> 混杂特征

<222> (12)..(12)

<223> g或a

<220>

<221> 混杂特征

<222> (18)..(18)

<223> g或 a

<220>

<221> 混杂特征

<222> (21)..(21)

<223> a, g, c,或t中的任意一个

<400> 13

gcngcngtyt crtcccaraa ngg 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

atggcaccta agaaaatcat cattg 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ttagtggaag attctatcga tgagg 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

atgcatttcc ctgtttcatt gccgc 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

tcaacgctca tttctcaggt cgg 23

<210> 18

<211> 574

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 18

gaggatcccg aaaccttcct acgtgtcaag gaggtcgttg tgatgggtgg agcaatcaac 60

cagcctggaa atgtatgaac cccgtcgaaa cacccatttg ataataagtc attaaccgcg 120

attgactagg tcacccccgt tggagaattc aacgcctacg cagacgccgt tgcagctgcg 180

cgagtctttg cgctgacatc acctaatccc aactcgactc taccaccgac cacgagtcca 240

ctacttggcc tgtaccctgc aaagctcagc cgacaattga ctctgcgtct cttcccgctg 300

gacatcaccc tgcgccataa cctgtcccgc ggccaattcc gccaagcagt tgagcctctc 360

ctcgcaacag gctcacccct cgctgaatgg gtgacagcat tcatgggaca cacgttccga 420

accctggaac gcctgcaccc cggccatgag ggcgatgaag cccagctgag tctccacgac 480

cctgtctgtg tgtggtatgc ccttacagca gaggattcgc actggactcc ctccgccaat 540

tccccagagg acattcgtgt tgagacattg ggcc 574

<210> 19

<211> 509

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 19

agacaccgca aacacctggc agcctcaggt cgctctgcac gctgtcgcaa ctctggaagc 60

tggcaacttg agctgtatcc ccgtttaccc aggctcgaca tggccgctca tcaacacccc 120

caaccgcttc caggcgtggg aaatggttca tggcaagctg ccatgggagg gtgcttttgc 180

gccggagaac aagactctcg aggccgaggg taacgatcct acctctggca accccaaccg 240

tatcgtcaag gccgctttca aggaagggtt ccccaagggc aagcccgaga acagaacatc 300

tgctgccaac ttcatggtcg agatggtgca caagtacccc ggccaggtct cgatctactc 360

tgctggagcc ctgaccaatg ttgcgctggc tgtgcgcatg gatccccagt ttgcatctct 420

ggctaaggag ttggttatca tgggtggata cgtcgatttg aatatgctcc aggccactgg 480

aagtgtcttg ctggctgatc ttcaatctg 509

Claims

1.一种核酸系调味料的制造方法，其中，包括利用核苷酶对含核糖核苷酸的材料进行处理的步骤。

2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述含核糖核苷酸的材料是对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理而得到的。

3.根据权利要求2所述的制造方法，其中，包含以下的步骤(1)和(2)：

4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，步骤(2)由以下的步骤(2-1)和(2-2)构成：

(2-2)利用核苷酶对步骤(2-1)后的处理物进行处理的步骤。

5.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述含核糖核苷酸的材料是对含核糖核酸的材料进行核糖核酸酶处理和AMP-脱氨酶处理而得到的。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，含核糖核苷酸的材料含有嘌呤核苷酸。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，所述含核糖核酸的材料为酵母溶解物。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶含有序列号1的氨基酸序列或与该氨基酸序列85％以上相同的氨基酸序列，或者序列号2的氨基酸序列或与该氨基酸序列88％以上相同的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，所述核苷酶的氨基酸序列为与序列号1的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列90％以上相同的氨基酸序列。

10.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶具有下述的酶学性质：

(1)作用：催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应，

(2)分子量：不含N型糖链时的分子量为约49kDa，所述分子量是利用SDS-PAGE得到的分子量，

(3)最适温度：55℃～60℃，

(4)温度稳定性：在55℃以下稳定，条件为pH6.0、30分钟。

11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，所述核苷酶进一步具有下述的酶学性质：

(5)最适pH：3.5，

(6)pH稳定性：在pH3.5～7.5的范围内稳定，条件为30℃、30分钟。

12.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶具有下述的酶学性质：

(1)作用：催化将嘌呤核苷水解成D-核糖和嘌呤碱基的反应，

(2)分子量：不含N型糖链时的分子量为约40kDa，所述分子量是利用SDS-PAGE测得的分子量，

(3)最适温度：50℃～55℃，

(4)温度稳定性：在65℃以下稳定，条件为pH4.5、60分钟。

13.根据权利要求12所述的制造方法，其中，所述核苷酶进一步具有下述的酶学性质：

(5)最适pH：4.5，

14.根据权利要求8～13中任一项所述的制造方法，其中，所述核苷酶来自多色青霉。

15.根据权利要求14所述的制造方法，其中，所述多色青霉为IFO7569株或其突变株。

16.一种核酸系调味料，其是利用权利要求1～15中任一项所述的制造方法而得到的。

17.根据权利要求16所述的核酸系调味料，其中，通过所述核苷酶的作用而使嘌呤碱基的含量增加。