JP3824326B2 - ビールの製造法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、プリン化合物の濃度を低減したビールの製造方法に関する。より詳しくは麦汁中のプリンヌクレオシドを酵母が資化することのできるプリン塩基に酵素を作用させて分解することを特徴とするビールの製造法に関する。
背景技術
近年、食生活の欧米化と過栄養化に伴い、血中尿酸値の上昇が認められ、無症候性高尿酸血症を経た痛風発症の増加が懸念される。食餌中のプリン塩基、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドおよび高分子核酸は消化器官中で消化・吸収され、肝臓中のプリン分解系で尿酸に分解される。高尿酸血症や痛風の原因としてはプリン化合物高含有食の摂取が原因とする免疫学知見が集約されており、摂取プリン化合物量を減らすことが最も重要な高尿酸血症あるいは痛風の予防手段である。
プリン化合物高含有食としては、肉、白子、魚卵、肝などが挙げられているが、アルコール飲料、特にビールのプリン化合物含量はかなり高い。実際に金子（金子希代子；日本臨床、49：1108−1115，（1991））は各種アルコール飲料中のプリン化合物含有量を比較し、ビール、清酒、ワインなどの醸造酒がウイスキー、焼酎などの蒸留酒に比べ高いプリン化合物を含むこと、さらに醸造酒のなかでもとりわけビールのプリン化合物含量が高いことを報告している。また、藤森らは、ビール中には、総プリン化合物が５０〜７０ｍｇ／ｌ含まれていることを報告している（藤森新ら、尿酸、第９巻、第２号、１２８〜１３３頁）。
なお、この値はビール中のプリン化合物を過塩素酸でプリン塩基に加水分解し、高速液体クロマトグラフィーで測定したものである。
ビールのプリン化合物含量は上記の肉、卵、肝などに比べれば１／１００〜１／１０であるが、摂取量が多いので蒸溜酒に比べれば高尿酸血症や痛風の罹患リスクは大きいと言わざるを得ない。ToflerとWoodings（O. B. Tofler and T. L. Woodings ; Med. J. Aust. 2, 479-481、（1981））は、ビール摂取量別に調査対象集団をグループ分けして１３年間の追跡調査を実施し、ビール摂取量と痛風発症頻度との間に正の相関があることを指摘した。このように疫学研究上では、現在ビールはアルコール飲料の中で高尿酸血症や痛風の罹患リスクの高い酒類とみなされている。
発明の開示
従って、本発明はプリン化合物含量を低減したビールの製造方法を提供するものである。
本発明者らは、麦汁中のプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解することにより、プリン化合物含量を低減したビールを製造しうるとの知見を得、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼまたはヌクレオシダーゼを作用させて、麦汁中に含まれるプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解することによりヌクレオシド分解麦汁を製造し、当該ヌクレオシド分解麦汁を用いて製造することを特徴とするビールの製造方法を提供する。
本発明はさらに、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼまたはヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とする麦汁の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、７０Ｌスケールのビール試験醸造でのプリン化合物の消長を示す図で、●はプリンヌクレオシドを、○はプリン塩基を示す。
図２は、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼを添加した時の各プリン化合物量を示すグラフである。
図３は、イノシンを基質として、pH5.0で各温度にて10分反応させたときの活性を示す。
図４は、イノシンを基質として、各pHにて70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、70℃で10分間反応させたときの活性を示す。
図５は、50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0中で、70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、70℃で10分間反応させたときの活性を示す。
図６は、50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0中で、70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、40℃で10分間反応させたときの活性を示す。
図７は、還元糖の定量によりpH5.0で、60℃と70℃におけるイノシン、アデノシン、グアノシンに対する基質特異性を示す。
図８は、100℃で各時間インキュベートした後、60℃にてイノシンを基質としたときの活性を示す。
図９は、麦汁製造工程における仕込釜及び仕込槽の時間−温度曲線を示す。
図１０は、酵素を添加して製造した麦汁と酵素を加えずに製造した麦汁中のプリン体分析結果を示す。
図１１Ａ及び１１Ｂは、実施例４で製造したヌクレオシド分解麦汁と通常の麦汁を用いた発酵中のプリン体の消長を示す。
具体的な説明
本発明者らは、ビール中のプリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド、プリン塩基及び高分子核酸量を測定し、これらプリン化合物の濃度を低減させたビールの製造法を提供することを目的とし、種々研究した結果、本発明を完成した。プリン塩基とは、プリン（９Ｈ−イミダゾ〔４，５−ｄ〕ピリミジン）の種々の部分が置換された誘導体の総称であり、アデニン、グアニン、キサンチンがある。
プリンヌクレオシドとは、プリン塩基と糖の還元基とがＮ−グリコシド結合した配糖体化合物の総称であり、アデノシン、グアノシン、イノシン等がある。
プリンヌクレオチドとは、プリンヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルをつくっている化合物の総称であり、アデニル酸、グアニル酸、イノシン酸等がある。
プリン化合物とは、上記プリン塩基、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド等のプリン骨格を含有する化合物の総称である。
本発明者らは、ビール中およびその製造工程中の各プリン化合物量を測定することにより以下の点を明らかにした。
１）各種市販ビール中のプリン化合物は４０〜１００ｍｇ／ｌと変動するが、プリンヌクレオシドがプリン塩基の２〜２５倍存在する。即ち、ビール中のプリン化合物の大半はプリンヌクレオシドとして存在する。
２）発酵工程中に、麦汁中のプリン塩基は酵母によって吸収・代謝されてほぼなくなる。
以上の分析結果を基に、本発明者らはこの問題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、プリン化合物含量を低下せしめるビールの製造法を発明するにいたった。
つまり、通常の酵母は、プリンヌクレオシドを吸収することはできないが、プリン塩基を吸収・代謝することはできる。そこで、本発明においては、麦汁に酵素を使用させ、麦汁中に含まれるプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解せしめ、ヌクレオシド分解麦汁を製造し、このヌクレオシド分解麦汁を用いることによりビール中のプリン化合物含量を低減することができる。なお、ヌクレオシド分解麦汁は、麦汁中のプリンヌクレオシドの一部または全てが酵素によりプリン塩基に分解されたものであり、このヌクレオシド分解麦汁中のプリンヌクレオシド含量は、添加する酵素の量、反応時間、反応温度等により調節することができるが、好ましくはプリンヌクレオシドの全てがプリン塩基に分解され、プリンヌクレオシドを含有していない麦汁がよい。
この酵素は（１）麦汁製造過程、（２）麦汁製造後発酵工程前、又は（３）発酵過程において働かせることができる。麦汁製造過程で酵素を働かせるためには、麦汁製造（糖化）開始時又は麦汁製造の間の適当な時点で酵素を添加することができる。発酵工程前に酵素を働かすためには、麦汁製造過程の麦汁に酵素を添加し、発酵開始前に所定時間置けばよいが、この中で最も望ましいのは麦汁製造工程途中の煮沸以前の添加である。なぜならば、煮沸により酵素を失活させることが出来るので、ビール製品中に活性のある酵素を持ち込み品質になんらかの影響を与える可能性がないためである。
また、発酵の過程で酵素を働かせるためには、発酵開始時又は発酵中に酵素を添加する。但し、酵素の作用によって生成したプリン塩基は酵母により代謝・消滅させる必要があるから、酵素は発酵開始時、又は発酵期間の前半に添加するのが好ましい。
麦汁はその製造工程を通して、酸性（pH5.0-5.5）であり、製造工程の温度が50-80℃であることから酸性域で高温での反応が可能な酵素が好ましい。
このための酵素としては、麦芽由来の酵素でもよく、また他起源の酵素でもよく、例えばヌクレオシド・フォスフォリラーゼ又はヌクレオシダーゼを用いることができる。麦芽以外の酵素源としては、例えば、子牛脾臓由来や細菌由来のヌクレオシド・フォスフォリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）を用いることができる。
本発明に用いられる、ヌクレオシダーゼは、プリンヌクレオシドを、プリン塩基とリボースに分解するものをいい、とりわけ至適pH4.5乃至6.5、至適温度50℃〜80℃にあるものが望ましく、酵素その他の一般的性質をあらわす阻害剤の種類、Km値、分子量等によっては、とくに制限をうけない。
ヌクレオシダーゼは、通常、ヌクレオシダーゼを産生する能力を有する微生物菌株を培養して生産される。微生物菌株としては、例えば、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、ストレプトコッカス（Storeptococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エシェリヒア（Escherichia）属、シトロバクター（Citrobacter）属、セラチア（Serratia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バシルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ピヒア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属などが用いられるが、菌株は特に限定されるものではなく、新たに、土壌、乳酸菌、酸敗食品、動物の臓器や排泄物から分離した株であっても、ヌクレオシダーゼを産生する能力を有するものであれば差し支えない。また、それらの菌株に紫外線照射や変異剤処理を施して、人為的に変異を誘起させた株や、当該ヌクレオシダーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的にとり出し、それを組み入れた他の形質転換体であっても本発明の方法に使用できる。
ヌクレオシダーゼを産生できる菌株の具体例としては、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）（FERM BP-5377）、ストレプトコッカス・シトロボラム（Streptococcus citrovorum）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）（IFO 3182）、ロイコノストック・デキストラニカム（Leuconostoc dextranicum）、ラクトバシルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（ラクトバシルス・アラビノサス（Lactobacillus arabinosus））（IFO 3070）、ラクトバシルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（ラクトバシルス・ククメリス（Lactobacillus cucumeris））（IFO 3074）、エシェリヒア・コリＢビオチンレス（Escherichia coli B biotin less）、シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii）（IFO 13546）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）（IFO 3736）、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Flavobacterium meningosepticum）（DSM2800）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）（ATCC13060）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（IFO 3060）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）（アースロバクター・グロビホルミス（Arthrobacter globiformis））（IFO 12140）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）（シュードモナス・ダカンハエ（Pseudomonas dacunhae））（IFO 12048）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、バシルス・アニュリノリティカス（Bacillus aneurinolyticus）、バシルス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）（IFO 3951）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）（サッカロミセス・マキシアヌス（Saccharomyces maxianus））（IFO 0277）、デバリオミセス・シュードポリモルファス（Debaryomyces pseudopolymorphus）（ピヒア・シュードポリモルファ（Pichia pseudopolymorpha））（IFO 1026）、ピヒア・カプスラタ（Pichia capsulata）（ハンゼヌラ・カプスラタ（Hansenula capsulata））（IFO 0721）、スポロボロミセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmonicolor）（IFO 1038）、スポリディオボラス・サルモニカラー（Sporidiobulus salmonicolor）（スポロボロミセス・オドルス（Sporobolomyces odorus））（IFO 1035）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（IFO 4416）、ペニシリウム・スピヌロスム（Penicillium spinulosum）（IAM 7047）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）（IFO 4033）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（IAM 2630）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）（IFO 5839）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（IFO 5445）、アスペルギルス・ソヤ（Aspergillus sojae）（IFO 4386）、アスペルギルス・パラシティクス（Aspergillus parasiticus）（IFO 4082）、ペニシリウム・sp（Penicillium sp.）などが挙げられるが、特に好ましくは、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）（FERM BP-5377）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（IFO 4416）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（IAM 2630）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）（IFO 5839）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（IFO 5445）である。
なお、上記の菌株の内、ATCC番号を付したものはATCCより入手可能であり、IFO番号を付したものは財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２−17−85）より入手可能である。
なお、本発明において新しく分離された細菌株オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）は、次の菌学的性質を有する。
（ａ）形態的性質
▲１▼ 細胞の形態：桿菌
▲２▼ 細胞の多形性の有無：無し
▲３▼ 運動性の有無：有り
▲４▼ 胞子の有無：無し
（ｂ）培養的性質
▲１▼ 肉汁寒天平板培養（30℃、２日間培養）：
コロニーの形状は正円で凸状隆起を呈する。表面は平滑で光沢がある。
（ｃ）生理学的性質
▲１▼ グラム染色体：陰性
▲２▼ 硝酸塩の還元：陰性
▲３▼ 脱窒反応：陰性
▲４▼ インドールの生成：陰性
▲５▼ グルコースからの酸の生成：陰性
▲６▼ ウレアーゼ：陽性
▲７▼ チトクロームオキシダーゼ：陽性
▲８▼ カタラーゼ：陽性
▲９▼ キシロースからの酸の生成：陽性
▲10▼ 生育最適温度：28−37℃
▲11▼ King's B培地での色素の生成：陰性
▲12▼ Ｏ−Ｆテスト（糖：グルコースによる）：酸化
▲13▼ 糖の資化性：
（１）グルコース：＋
（２）アラビノース：＋
（３）マンノース：＋
（４）マンニトール：−
（５）Ｎアセチルグルコサミン：＋
（６）マントース：＋
（７）グルコン酸：−
（８）カプリン酸：＋
（９）アジピン酸：−
（10）リンゴ酸：＋
（11）クエン酸：＋
（12）フェニル酢酸：−
（ｄ）その他の諸性質
▲１▼ エスクリンの加水分解：陰性
▲２▼ βガラクトシダーゼ：陰性
▲３▼ ゼラチンの加水分解：陰性
▲４▼ アルギニン ジハイドロラーゼ：陰性
▲５▼ MacConkey培地での生育：陽性
▲６▼ ポリミキシン感受性：陰性
▲７▼ アラニンの利用：陽性
▲８▼ グリシンの利用：陰性
生理生化学的性質はAPI20NE（BIO MERIEUX S.A.）を利用して調べた。さらにこれらの結果から、API20NE用のAnalytical Profile Indexを用いて種名の検索を行ったところ、硝酸塩の還元とグリシンの利用の有無はHolmesらの記載（International Journal of Systematic Bacteriology, Vol.38, No.4, 1988, p.406-416）と異なっていたが、Indexに従って、Ochrobactrum anthropiと同定した。
この株は、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）と同定された。この菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７７として、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８年（1996年）１月２６日にブタペスト条約に基き国際寄託された。
これらの微生物菌株を培養してヌクレオシダーゼを生産させるには、通常の静置培養、振盪培養、通気撹拌培養あるいは固体培養により、連続的あるいは、間歇的に行なうことができる。また、培養後のヌクレオシダーゼは、通常、微生物菌体に含有されており、菌体を通常の酵素の精製手段により、生菌体よりも比活性の向上した粗酵素乃至精製酵素を得て、本発明の方法に用いることができる。また、ヌクレオシダーゼが培養液中に分泌される場合、当該培養液をそのまま用いることも可能である。
実施例
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例１． ビール中のプリン化合物の測定
ビール中のプリン化合物をＥＰ−１０型高速液体クロマトグラフィー（ＥＩＣＯＭ社製）によって分析した。カラムはＧＳ３２０−Ｈ（7.6mm D Ｘ 250mm L、（Asahipak社製））を用い、移動層として、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度は３０℃で分析した。試料をメンブレンろ過して固形分を除いた後、１０μｌを注入し、２６０ｎｍの吸光度でプリン化合物量を定量した。
あらかじめ、基準サンプルとして既知濃度のプリン塩基３種（アデニン、グアニン、キサンチン）とプリンヌクレオシド３種（アデノシン、グアノシン、イノシン）を分析し、各プリン化合物のリテンションタイムとピーク面積を求めておく。実際のサンプル中の各プリン化合物の同定は各ピークのリテンションタイムから、濃度は既知濃度の基準サンプルのピーク面積より求めた検量線から求めた。なお、３種のプリンヌクレオチド（アデニル酸、グアニル酸、イノシン酸）は、この分析の条件ではずっと早く溶出されるので、上記６種のプリン化合物の分析を妨害しない。
各種市販ビール７種類及びワイン２種類の分析結果を表１に示した。プリン塩基とプリン塩基量に換算したプリンヌクレオシドの和で示される総プリン量は、ビールの種類によって変動し、４０〜１００ｍｇ／ｌを示した。また、プリン化合物の大半はヌクレオシドで存在していた。
ビールと同じ醸造酒であるワインでは、赤ワインは６０ｍｇ／ｌと高いものの、白ワインでは２０ｍｇ／ｌと低い。
なお、ビール中及び麦汁中のプリンヌクレオチドをイオン交換カラムで分析したところ、プリンヌクレオチドはビール中にも麦汁中にも存在しなかった。また、ビール及び麦汁を酸加水分解して分析しても酸加水分解前とプリン化合物の総量が変わらなかったことから、ＲＮＡやＤＮＡなどの高分子核酸類はビール及び麦汁中には存在しないと考えられる。
試験例２． ビール製造工程中のプリン化合物の消長
ビール製造工程中でのプリン化合物の消長を、７０Ｌスケールでの試験醸造で調査した。初発エキス濃度は１２．５％、投入酵母量は５ｇ湿重量／ｌ、発酵温度は１１．５℃で、エキス２．５％になった時点（発酵開始後２６０時間）で発酵タンク底部より沈降した酵母を除き、温度を０℃に低下させ、さらに３００時間の貯酒を行った。
その結果を図１に示したが、アデノシンとグアノシンとイノシンの総和をプリンヌクレオシドとして示し、アデニンとグアニンとキサンチンの総和をプリン塩基として示した。プリン塩基は麦汁中に約７０ｍｇ／ｌ存在するが、発酵初期に１０ｍｇ／ｌまで減少し、その後の発酵、貯酒期間の間は増加しない。一方、プリンヌクレオシドは麦汁中に約９０ｍｇ／ｌと多量に存在し、発酵期間中も貯酒期間中も変わらなかった。
この結果は、通常の麦汁に含まれるプリン塩基は酵母によって吸収・代謝されるので発酵初期の酵母増殖期に殆どなくなることを示している。
実施例１． ヌクレオシド・フォスフォリラーゼによるプリン塩基への分解
エキス濃度１２．５％の麦汁に、７unit/mlになるように子牛脾臓由来のヌクレオシド・フォスフォリラーゼ（ベーリンガー社製）を添加、３０℃で３時間反応させた。酵素添加の麦汁と、対照として酵素を添加せずに３０℃で３時間保持した麦汁について、試験例１に記載の方法でプリン化合物量を測定した。
図２に示すように、酵素を添加した麦汁は、酵素無添加の麦汁と比較して、アデノシン、グアノシン、イノシンのいずれのプリンヌクレオシドも減少し、それに対応してアデニン、グアニン、キサンチンのプリン塩基が増加していた。なお、各プリンヌクレオシドの分解率は約６０％であった。
この結果は、子牛脾臓由来のヌクレオシド・フォスフォリラーゼが麦汁中のプリンヌクレオシドの分解に有効であることを示している。試験例２の結果より、プリン塩基は発酵初期の酵母増殖期に酵母によって吸収・代謝されるので、ヌクレオシド・フォスフォリラーゼでプリンヌクレオシドを分解することによって得られたプリン塩基も発酵中に酵母によって吸収・代謝され、本酵素で処理した麦汁を用いてビールを製造すれば、ビール中のプリンヌクレオシド含量を約６０％低減することができることを示している。
さらに、試験例２で示したビールは９０ｍｇ／ｌのプリンヌクレオシドと１０ｍｇ／ｌのプリン塩基を含有しているから、麦汁を本酵素で処理することによりビール中のプリンヌクレオシド含量を約半分にすることができることになる。
実施例２． 麦汁製造工程において使用できるヌクレオシダーゼのスクリーニング
ヌクレオシダーゼを以下のような手順でカビ、バクテリア、酵母の中からスクリーニングした。
それぞれの菌株を以下に示す培地および培養条件にて培養し集菌した。菌体を20mMトリス塩酸バッファーpH7.4に縣濁したのちに超音波により破砕（カビについては海砂と共に乳鉢で破砕）して、遠心にて不要物を取り除き粗酵素液とした。その粗酵素液を5mMのイノシンあるいはアデノシンあるいはグアノシンの基質存在下、100mMの酢酸ナトリウムバッファーpH4.5中で60℃と70℃で反応を行った。その溶液をシリカゲルの薄層プレートにスポットし、ノルマルブタノール：酢酸：水＝３：１：１の展開液にて薄層クロマトグラフィーを行い、ヌクレオシドとそれに対応するプリン塩基のスポットの大きさから、ヌクレオシドの分解程度を調べた。活性の高かった菌について、その結果を表２に示した。
培地組成および培養条件
1）カビ
麦芽エキス5％ 28℃、3-5日
酵母エキス0.3％ 振盪培養
pH5.5
2）バクテリア（乳酸菌を除く）
トリプトン 0.5％ 28℃、2-4日
酵母エキス 0.5％ 振盪培養
グルコース 0.1％
リン酸二カリウム 0.1％
pH7.0
3）乳酸菌
ペプトン 1％ 28℃、4-7日
肉エキス 1％ 静置培養
酵母エキス 0.5％
グルコース 2％
スパン80 0.1％
クエン酸アンモニウム 0.2％
酢酸ナトリウム 0.5％
硫酸マグネシウム七水和物 0.01％
塩化マンガン四水和物 0.005％
リン酸二カリウム 0.2％
pH6.5
4）酵母
酵母エキス 0.2％ 28℃、2-4日
ペプトン 0.5％ 振盪培養
グルコース 5％
リン酸二カリウム 0.4％
リン酸一カリウム 0.2％
硫酸マグネシウム七水和物 0.02％
pH6.0
実施例３． ヌクレオシダーゼの性質
上記で取得した菌のうち、バクテリアであるオクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）は60℃にてイノシン、アデノシン、グアノシンを、70℃にてイノシン、グアノシンを分解できる高活性のヌクレオシダーゼを生産する。オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）の粗酵素液を50mM MESバッファーpH6.0に対して透析し、粗酵素液中の低分子を除いた後、そのヌクレオシダーゼの性質を詳しく調べた。
イノシンによる活性測定方法
25mMの適当なバッファー（酢酸ナトリウムバッファーpH4.5-5.0、トリス塩酸バッファーpH7.0-9.5、MESバッファーpH5.5-6.5）、5mMイノシン溶液195μlをあらかじめ各温度でインキュベートしておき、酵素液5μlを添加し反応を開始する。10分後0.2N塩酸溶液を200μl加えて反応を止め、遠心により変性した蛋白質を取り除く。上澄液100μlと0.1N水酸化ナトリウム溶液100μl、1Mトリス塩酸バッファーpH8.0 50μl、水345μlを混合し293nmにおける吸光度を測定し、コントロールとする。さらにキサンチンオキシダーゼ5μl（5mU）を加えて混合し、293nmの吸光度の増加が止まったところで吸光度を測定する。ヌクレオシダーゼの活性の単位Uは1分間に1μモルのヌクレオシドを加水分解する酵素量として表され、酵素液のヌクレオシダーゼの活性（U/ml）は3.33×ΔA293で求められる。なお、ΔA293はキサンチンオキシダーゼを加えたものの吸光度からコントロールの吸光度を引いた値を示す。
還元糖定量による活性測定法
25mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0，5mMヌクレオシド溶液195μlをあらかじめ各温度でインキュベートしておき、酵素液5μlを添加し反応を開始する。10分後0.1N硫酸亜鉛溶液を200μl加えて反応を止め、さらに0.1N水酸化ナトリウム溶液200μlを加えて遠心して、蛋白質を除く。上澄液200μlと4%炭酸ナトリウム、1.6%グリシン、0.045%硫酸銅5水和物溶液300μlと0.04% 2,9-ジメチル-1,10-フェナンスロリン0.9ml、水200μlを混合し、95℃、８分インキュベートする。450nmの吸光度を測定する。濃度が既知のリボース溶液を用いて同様の処理を行い450nmの吸光度から検量線を作成し、酵素反応液のリボース濃度を算出する。酵素液のヌクレオシダーゼの活性（U/ml）はリボース濃度（μM）×0.004で求められる。
（１）至適温度
至適温度 50℃〜80℃。イノシンを基質として、pH5.0で各温度にて10分反応させたときの活性を図３に示す。活性は60℃にて最も高く70℃では約80%に低下するが、80℃でも活性は変わらない。
（２）至適pH
至適pH pH4.5〜6.5。イノシンを基質として、各pHにて70℃で10分反応させたときの活性を図４に示す。pH5.0とpH6.0にピークがある。
（３）耐熱性
50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0中で、70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、70℃で10分間反応させたときの活性を図５に示す。また、40℃で10分間反応させたときの活性を図６に示す。10分間の熱処理で70℃で反応させた場合、約70%に活性が低下するがその後はほとんど低下しない。10分間の熱処理で40℃で反応させた場合には約25%に活性が低下するがその後はほとんど低下しない。
（１）−（３）の結果から考えて、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）は、少なくとも2種類の至適温度、至適pH、耐熱性が異なるヌクレオシダーゼを持つことが予想される。
（４）基質特異性
還元糖の定量によりpH5.0で、60℃と70℃におけるイノシン、アデノシン、グアノシンに対する基質特異性を調べた。それを図７に示す。70℃におけるアデノシンに対する活性が全くなくなることにより、アデノシンを分解できうるヌクレオシダーゼとアデノシンを分解できないヌクレオシダーゼの少なくとも2種類があることが基質特異性からも予想される。
（５）熱失活
麦汁煮沸により本酵素が失活するかどうか調べるため、100℃で各時間インキュベートした後、60℃にてイノシンを基質としたときの活性を調べた。その結果を図８に示す。100℃、10分のインキュベートにて完全に活性はなくなる。60℃にてイノシンを分解する活性はアデノシンを分解できうるヌクレオシダーゼとアデノシンを分解できないヌクレオシダーゼの両方が持つので、両酵素が煮沸により容易に失活させられる。
以上の結果より本酵素は麦汁のpHである5.0付近で十分活性を持ち、アデノシンは60℃にて、イノシンとグアノシンについてはより高い80℃にても分解する能力があることがわかった。また、煮沸することにより完全に失活するため、通常のビール製造工程における煮沸工程後には活性のある酵素が直接、製品ビールの品質を変えることはない。
実施例４． ヌクレオシド分解麦汁の製造
図９に麦汁製造工程における仕込釜および仕込槽の時間−温度曲線を示す。また、仕込釜及び仕込槽の原料配合の割合を表3に示す。この製造工程において、仕込槽に熱処理、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等で部分精製したオクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）のヌクレオシダーゼ、約20,000u（基質：イノシン、反応温度：60℃）を破砕麦芽と共に加えて麦汁製造を行った。酵素を添加して製造した麦汁と酵素を加えずに製造した麦汁中のプリン体分析結果を図10に示す。酵素を添加した麦汁からはプリンヌクレオシドが検出されず、プリン塩基が増加していた。以下この麦汁をヌクレオシド分解麦汁と呼ぶ。
実施例５． ヌクレオシド分解麦汁を用いたビール醸造
実施例４で製造したヌクレオシド分解麦汁と通常の麦汁を用いてビール醸造を行った。麦汁2リットルにビール酵母を湿重量で10.5g懸濁し、12℃で8日発酵した。その後4℃で5日間貯酒した。その発酵中のプリン体の消長を図11に示す。アデニンは発酵時間内に全て資化された。発酵液中のグアニンの量は時間と共に減少し、発酵終了時には検出されなくなる。
差し引き約90μMに相当するグアニンが酵母により資化された。従って、麦汁中の計260μMに相当するプリン体が発酵過程で消失する。酵素で処理せずに製造した麦汁を用いて醸造したビールのプリン体は計500μMで、酵素処理した麦汁を用いて醸造したビールのプリン体は計180μMであるので、計320μMプリン体を低減したビールを醸造することが出来た。発酵は酵母増殖、エキスの消費共に通常の麦汁を用いたものとほぼ変わらず、味覚の面でも大きな差は見られなかった。
産業上の利用可能性
本発明は、本発明の酵素をビール製造工程において、麦汁に作用させることにより、原料由来のプリン化合物のうち、プリンヌクレオシドをプリン塩基に分解せしめ、プリンヌクレオシドを実質的に存在させない麦汁を得られ、該麦汁からビールを製造することによって該プリン塩基を発酵工程において酵母に代謝させることにより、ビール中のプリン化合物含量を低減させたビールを得ることができる。本発明の方法によって得られたビールは、高尿酸血症あるいは痛風等の罹患リスクを軽減することができる。
本発明の酵素は、ビール製造工程において、その製造工程を変更することなく麦汁に作用させることが出来、特に、麦汁製造過程で本発明の酵素を作用させると、通常の麦汁製造工程（糖化）工程における温度及びpHが酵素の至適範囲であるため有効に作用し、麦汁製造工程に要する時間内で酵素も麦汁に作用させられる。またビール製造工程の１工程である麦汁製造工程直後の麦汁の煮沸工程で、酵素を失活させることができるため、より簡便に作用させられ、経済的に行うことができる。また、発酵直前或は発酵中に酵素を麦汁に作用させる場合は、発酵工程後に加熱処理を行う製造工程があれば、その工程により酵素も失活させることができる。更に、得られたビールは、通常の製品ビールと味覚の面でも大きな差は見られず、嗜好性製品としても好ましいビールを得られることができる。
規則第13規則の２の寄託された微生物への言及および寄託機関通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
受託番号及び寄託した日付
FERM BP-5377 1996年1月26日
本発明は、プリン化合物の濃度を低減したビールの製造方法に関する。より詳しくは麦汁中のプリンヌクレオシドを酵母が資化することのできるプリン塩基に酵素を作用させて分解することを特徴とするビールの製造法に関する。
背景技術
近年、食生活の欧米化と過栄養化に伴い、血中尿酸値の上昇が認められ、無症候性高尿酸血症を経た痛風発症の増加が懸念される。食餌中のプリン塩基、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドおよび高分子核酸は消化器官中で消化・吸収され、肝臓中のプリン分解系で尿酸に分解される。高尿酸血症や痛風の原因としてはプリン化合物高含有食の摂取が原因とする免疫学知見が集約されており、摂取プリン化合物量を減らすことが最も重要な高尿酸血症あるいは痛風の予防手段である。
プリン化合物高含有食としては、肉、白子、魚卵、肝などが挙げられているが、アルコール飲料、特にビールのプリン化合物含量はかなり高い。実際に金子（金子希代子；日本臨床、49：1108−1115，（1991））は各種アルコール飲料中のプリン化合物含有量を比較し、ビール、清酒、ワインなどの醸造酒がウイスキー、焼酎などの蒸留酒に比べ高いプリン化合物を含むこと、さらに醸造酒のなかでもとりわけビールのプリン化合物含量が高いことを報告している。また、藤森らは、ビール中には、総プリン化合物が５０〜７０ｍｇ／ｌ含まれていることを報告している（藤森新ら、尿酸、第９巻、第２号、１２８〜１３３頁）。
なお、この値はビール中のプリン化合物を過塩素酸でプリン塩基に加水分解し、高速液体クロマトグラフィーで測定したものである。
ビールのプリン化合物含量は上記の肉、卵、肝などに比べれば１／１００〜１／１０であるが、摂取量が多いので蒸溜酒に比べれば高尿酸血症や痛風の罹患リスクは大きいと言わざるを得ない。ToflerとWoodings（O. B. Tofler and T. L. Woodings ; Med. J. Aust. 2, 479-481、（1981））は、ビール摂取量別に調査対象集団をグループ分けして１３年間の追跡調査を実施し、ビール摂取量と痛風発症頻度との間に正の相関があることを指摘した。このように疫学研究上では、現在ビールはアルコール飲料の中で高尿酸血症や痛風の罹患リスクの高い酒類とみなされている。
発明の開示
従って、本発明はプリン化合物含量を低減したビールの製造方法を提供するものである。
本発明者らは、麦汁中のプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解することにより、プリン化合物含量を低減したビールを製造しうるとの知見を得、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼまたはヌクレオシダーゼを作用させて、麦汁中に含まれるプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解することによりヌクレオシド分解麦汁を製造し、当該ヌクレオシド分解麦汁を用いて製造することを特徴とするビールの製造方法を提供する。
本発明はさらに、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼまたはヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とする麦汁の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、７０Ｌスケールのビール試験醸造でのプリン化合物の消長を示す図で、●はプリンヌクレオシドを、○はプリン塩基を示す。
図２は、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼを添加した時の各プリン化合物量を示すグラフである。
図３は、イノシンを基質として、pH5.0で各温度にて10分反応させたときの活性を示す。
図４は、イノシンを基質として、各pHにて70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、70℃で10分間反応させたときの活性を示す。
図５は、50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0中で、70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、70℃で10分間反応させたときの活性を示す。
図６は、50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0中で、70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、40℃で10分間反応させたときの活性を示す。
図７は、還元糖の定量によりpH5.0で、60℃と70℃におけるイノシン、アデノシン、グアノシンに対する基質特異性を示す。
図８は、100℃で各時間インキュベートした後、60℃にてイノシンを基質としたときの活性を示す。
図９は、麦汁製造工程における仕込釜及び仕込槽の時間−温度曲線を示す。
図１０は、酵素を添加して製造した麦汁と酵素を加えずに製造した麦汁中のプリン体分析結果を示す。
図１１Ａ及び１１Ｂは、実施例４で製造したヌクレオシド分解麦汁と通常の麦汁を用いた発酵中のプリン体の消長を示す。
具体的な説明
本発明者らは、ビール中のプリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド、プリン塩基及び高分子核酸量を測定し、これらプリン化合物の濃度を低減させたビールの製造法を提供することを目的とし、種々研究した結果、本発明を完成した。プリン塩基とは、プリン（９Ｈ−イミダゾ〔４，５−ｄ〕ピリミジン）の種々の部分が置換された誘導体の総称であり、アデニン、グアニン、キサンチンがある。
プリンヌクレオシドとは、プリン塩基と糖の還元基とがＮ−グリコシド結合した配糖体化合物の総称であり、アデノシン、グアノシン、イノシン等がある。
プリンヌクレオチドとは、プリンヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルをつくっている化合物の総称であり、アデニル酸、グアニル酸、イノシン酸等がある。
プリン化合物とは、上記プリン塩基、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド等のプリン骨格を含有する化合物の総称である。
本発明者らは、ビール中およびその製造工程中の各プリン化合物量を測定することにより以下の点を明らかにした。
１）各種市販ビール中のプリン化合物は４０〜１００ｍｇ／ｌと変動するが、プリンヌクレオシドがプリン塩基の２〜２５倍存在する。即ち、ビール中のプリン化合物の大半はプリンヌクレオシドとして存在する。
２）発酵工程中に、麦汁中のプリン塩基は酵母によって吸収・代謝されてほぼなくなる。
以上の分析結果を基に、本発明者らはこの問題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、プリン化合物含量を低下せしめるビールの製造法を発明するにいたった。
つまり、通常の酵母は、プリンヌクレオシドを吸収することはできないが、プリン塩基を吸収・代謝することはできる。そこで、本発明においては、麦汁に酵素を使用させ、麦汁中に含まれるプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解せしめ、ヌクレオシド分解麦汁を製造し、このヌクレオシド分解麦汁を用いることによりビール中のプリン化合物含量を低減することができる。なお、ヌクレオシド分解麦汁は、麦汁中のプリンヌクレオシドの一部または全てが酵素によりプリン塩基に分解されたものであり、このヌクレオシド分解麦汁中のプリンヌクレオシド含量は、添加する酵素の量、反応時間、反応温度等により調節することができるが、好ましくはプリンヌクレオシドの全てがプリン塩基に分解され、プリンヌクレオシドを含有していない麦汁がよい。
この酵素は（１）麦汁製造過程、（２）麦汁製造後発酵工程前、又は（３）発酵過程において働かせることができる。麦汁製造過程で酵素を働かせるためには、麦汁製造（糖化）開始時又は麦汁製造の間の適当な時点で酵素を添加することができる。発酵工程前に酵素を働かすためには、麦汁製造過程の麦汁に酵素を添加し、発酵開始前に所定時間置けばよいが、この中で最も望ましいのは麦汁製造工程途中の煮沸以前の添加である。なぜならば、煮沸により酵素を失活させることが出来るので、ビール製品中に活性のある酵素を持ち込み品質になんらかの影響を与える可能性がないためである。
また、発酵の過程で酵素を働かせるためには、発酵開始時又は発酵中に酵素を添加する。但し、酵素の作用によって生成したプリン塩基は酵母により代謝・消滅させる必要があるから、酵素は発酵開始時、又は発酵期間の前半に添加するのが好ましい。
麦汁はその製造工程を通して、酸性（pH5.0-5.5）であり、製造工程の温度が50-80℃であることから酸性域で高温での反応が可能な酵素が好ましい。
このための酵素としては、麦芽由来の酵素でもよく、また他起源の酵素でもよく、例えばヌクレオシド・フォスフォリラーゼ又はヌクレオシダーゼを用いることができる。麦芽以外の酵素源としては、例えば、子牛脾臓由来や細菌由来のヌクレオシド・フォスフォリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）を用いることができる。
本発明に用いられる、ヌクレオシダーゼは、プリンヌクレオシドを、プリン塩基とリボースに分解するものをいい、とりわけ至適pH4.5乃至6.5、至適温度50℃〜80℃にあるものが望ましく、酵素その他の一般的性質をあらわす阻害剤の種類、Km値、分子量等によっては、とくに制限をうけない。
ヌクレオシダーゼは、通常、ヌクレオシダーゼを産生する能力を有する微生物菌株を培養して生産される。微生物菌株としては、例えば、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属、ストレプトコッカス（Storeptococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エシェリヒア（Escherichia）属、シトロバクター（Citrobacter）属、セラチア（Serratia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バシルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ピヒア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属などが用いられるが、菌株は特に限定されるものではなく、新たに、土壌、乳酸菌、酸敗食品、動物の臓器や排泄物から分離した株であっても、ヌクレオシダーゼを産生する能力を有するものであれば差し支えない。また、それらの菌株に紫外線照射や変異剤処理を施して、人為的に変異を誘起させた株や、当該ヌクレオシダーゼ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的にとり出し、それを組み入れた他の形質転換体であっても本発明の方法に使用できる。
ヌクレオシダーゼを産生できる菌株の具体例としては、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）（FERM BP-5377）、ストレプトコッカス・シトロボラム（Streptococcus citrovorum）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）（IFO 3182）、ロイコノストック・デキストラニカム（Leuconostoc dextranicum）、ラクトバシルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（ラクトバシルス・アラビノサス（Lactobacillus arabinosus））（IFO 3070）、ラクトバシルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（ラクトバシルス・ククメリス（Lactobacillus cucumeris））（IFO 3074）、エシェリヒア・コリＢビオチンレス（Escherichia coli B biotin less）、シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii）（IFO 13546）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）（IFO 3736）、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Flavobacterium meningosepticum）（DSM2800）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）（ATCC13060）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（IFO 3060）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）（アースロバクター・グロビホルミス（Arthrobacter globiformis））（IFO 12140）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）（シュードモナス・ダカンハエ（Pseudomonas dacunhae））（IFO 12048）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、バシルス・アニュリノリティカス（Bacillus aneurinolyticus）、バシルス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）（IFO 3951）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）（サッカロミセス・マキシアヌス（Saccharomyces maxianus））（IFO 0277）、デバリオミセス・シュードポリモルファス（Debaryomyces pseudopolymorphus）（ピヒア・シュードポリモルファ（Pichia pseudopolymorpha））（IFO 1026）、ピヒア・カプスラタ（Pichia capsulata）（ハンゼヌラ・カプスラタ（Hansenula capsulata））（IFO 0721）、スポロボロミセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmonicolor）（IFO 1038）、スポリディオボラス・サルモニカラー（Sporidiobulus salmonicolor）（スポロボロミセス・オドルス（Sporobolomyces odorus））（IFO 1035）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（IFO 4416）、ペニシリウム・スピヌロスム（Penicillium spinulosum）（IAM 7047）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）（IFO 4033）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（IAM 2630）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）（IFO 5839）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（IFO 5445）、アスペルギルス・ソヤ（Aspergillus sojae）（IFO 4386）、アスペルギルス・パラシティクス（Aspergillus parasiticus）（IFO 4082）、ペニシリウム・sp（Penicillium sp.）などが挙げられるが、特に好ましくは、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）（FERM BP-5377）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（IFO 4416）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）（IAM 2630）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）（IFO 5839）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（IFO 5445）である。
なお、上記の菌株の内、ATCC番号を付したものはATCCより入手可能であり、IFO番号を付したものは財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２−17−85）より入手可能である。
なお、本発明において新しく分離された細菌株オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）は、次の菌学的性質を有する。
（ａ）形態的性質
▲１▼ 細胞の形態：桿菌
▲２▼ 細胞の多形性の有無：無し
▲３▼ 運動性の有無：有り
▲４▼ 胞子の有無：無し
（ｂ）培養的性質
▲１▼ 肉汁寒天平板培養（30℃、２日間培養）：
コロニーの形状は正円で凸状隆起を呈する。表面は平滑で光沢がある。
（ｃ）生理学的性質
▲１▼ グラム染色体：陰性
▲２▼ 硝酸塩の還元：陰性
▲３▼ 脱窒反応：陰性
▲４▼ インドールの生成：陰性
▲５▼ グルコースからの酸の生成：陰性
▲６▼ ウレアーゼ：陽性
▲７▼ チトクロームオキシダーゼ：陽性
▲８▼ カタラーゼ：陽性
▲９▼ キシロースからの酸の生成：陽性
▲10▼ 生育最適温度：28−37℃
▲11▼ King's B培地での色素の生成：陰性
▲12▼ Ｏ−Ｆテスト（糖：グルコースによる）：酸化
▲13▼ 糖の資化性：
（１）グルコース：＋
（２）アラビノース：＋
（３）マンノース：＋
（４）マンニトール：−
（５）Ｎアセチルグルコサミン：＋
（６）マントース：＋
（７）グルコン酸：−
（８）カプリン酸：＋
（９）アジピン酸：−
（10）リンゴ酸：＋
（11）クエン酸：＋
（12）フェニル酢酸：−
（ｄ）その他の諸性質
▲１▼ エスクリンの加水分解：陰性
▲２▼ βガラクトシダーゼ：陰性
▲３▼ ゼラチンの加水分解：陰性
▲４▼ アルギニン ジハイドロラーゼ：陰性
▲５▼ MacConkey培地での生育：陽性
▲６▼ ポリミキシン感受性：陰性
▲７▼ アラニンの利用：陽性
▲８▼ グリシンの利用：陰性
生理生化学的性質はAPI20NE（BIO MERIEUX S.A.）を利用して調べた。さらにこれらの結果から、API20NE用のAnalytical Profile Indexを用いて種名の検索を行ったところ、硝酸塩の還元とグリシンの利用の有無はHolmesらの記載（International Journal of Systematic Bacteriology, Vol.38, No.4, 1988, p.406-416）と異なっていたが、Indexに従って、Ochrobactrum anthropiと同定した。
この株は、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）と同定された。この菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５３７７として、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８年（1996年）１月２６日にブタペスト条約に基き国際寄託された。
これらの微生物菌株を培養してヌクレオシダーゼを生産させるには、通常の静置培養、振盪培養、通気撹拌培養あるいは固体培養により、連続的あるいは、間歇的に行なうことができる。また、培養後のヌクレオシダーゼは、通常、微生物菌体に含有されており、菌体を通常の酵素の精製手段により、生菌体よりも比活性の向上した粗酵素乃至精製酵素を得て、本発明の方法に用いることができる。また、ヌクレオシダーゼが培養液中に分泌される場合、当該培養液をそのまま用いることも可能である。
実施例
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例１． ビール中のプリン化合物の測定
ビール中のプリン化合物をＥＰ−１０型高速液体クロマトグラフィー（ＥＩＣＯＭ社製）によって分析した。カラムはＧＳ３２０−Ｈ（7.6mm D Ｘ 250mm L、（Asahipak社製））を用い、移動層として、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度は３０℃で分析した。試料をメンブレンろ過して固形分を除いた後、１０μｌを注入し、２６０ｎｍの吸光度でプリン化合物量を定量した。
あらかじめ、基準サンプルとして既知濃度のプリン塩基３種（アデニン、グアニン、キサンチン）とプリンヌクレオシド３種（アデノシン、グアノシン、イノシン）を分析し、各プリン化合物のリテンションタイムとピーク面積を求めておく。実際のサンプル中の各プリン化合物の同定は各ピークのリテンションタイムから、濃度は既知濃度の基準サンプルのピーク面積より求めた検量線から求めた。なお、３種のプリンヌクレオチド（アデニル酸、グアニル酸、イノシン酸）は、この分析の条件ではずっと早く溶出されるので、上記６種のプリン化合物の分析を妨害しない。
各種市販ビール７種類及びワイン２種類の分析結果を表１に示した。プリン塩基とプリン塩基量に換算したプリンヌクレオシドの和で示される総プリン量は、ビールの種類によって変動し、４０〜１００ｍｇ／ｌを示した。また、プリン化合物の大半はヌクレオシドで存在していた。
ビールと同じ醸造酒であるワインでは、赤ワインは６０ｍｇ／ｌと高いものの、白ワインでは２０ｍｇ／ｌと低い。
試験例２． ビール製造工程中のプリン化合物の消長
ビール製造工程中でのプリン化合物の消長を、７０Ｌスケールでの試験醸造で調査した。初発エキス濃度は１２．５％、投入酵母量は５ｇ湿重量／ｌ、発酵温度は１１．５℃で、エキス２．５％になった時点（発酵開始後２６０時間）で発酵タンク底部より沈降した酵母を除き、温度を０℃に低下させ、さらに３００時間の貯酒を行った。
その結果を図１に示したが、アデノシンとグアノシンとイノシンの総和をプリンヌクレオシドとして示し、アデニンとグアニンとキサンチンの総和をプリン塩基として示した。プリン塩基は麦汁中に約７０ｍｇ／ｌ存在するが、発酵初期に１０ｍｇ／ｌまで減少し、その後の発酵、貯酒期間の間は増加しない。一方、プリンヌクレオシドは麦汁中に約９０ｍｇ／ｌと多量に存在し、発酵期間中も貯酒期間中も変わらなかった。
この結果は、通常の麦汁に含まれるプリン塩基は酵母によって吸収・代謝されるので発酵初期の酵母増殖期に殆どなくなることを示している。
実施例１． ヌクレオシド・フォスフォリラーゼによるプリン塩基への分解
エキス濃度１２．５％の麦汁に、７unit/mlになるように子牛脾臓由来のヌクレオシド・フォスフォリラーゼ（ベーリンガー社製）を添加、３０℃で３時間反応させた。酵素添加の麦汁と、対照として酵素を添加せずに３０℃で３時間保持した麦汁について、試験例１に記載の方法でプリン化合物量を測定した。
図２に示すように、酵素を添加した麦汁は、酵素無添加の麦汁と比較して、アデノシン、グアノシン、イノシンのいずれのプリンヌクレオシドも減少し、それに対応してアデニン、グアニン、キサンチンのプリン塩基が増加していた。なお、各プリンヌクレオシドの分解率は約６０％であった。
この結果は、子牛脾臓由来のヌクレオシド・フォスフォリラーゼが麦汁中のプリンヌクレオシドの分解に有効であることを示している。試験例２の結果より、プリン塩基は発酵初期の酵母増殖期に酵母によって吸収・代謝されるので、ヌクレオシド・フォスフォリラーゼでプリンヌクレオシドを分解することによって得られたプリン塩基も発酵中に酵母によって吸収・代謝され、本酵素で処理した麦汁を用いてビールを製造すれば、ビール中のプリンヌクレオシド含量を約６０％低減することができることを示している。
さらに、試験例２で示したビールは９０ｍｇ／ｌのプリンヌクレオシドと１０ｍｇ／ｌのプリン塩基を含有しているから、麦汁を本酵素で処理することによりビール中のプリンヌクレオシド含量を約半分にすることができることになる。
実施例２． 麦汁製造工程において使用できるヌクレオシダーゼのスクリーニング
ヌクレオシダーゼを以下のような手順でカビ、バクテリア、酵母の中からスクリーニングした。
それぞれの菌株を以下に示す培地および培養条件にて培養し集菌した。菌体を20mMトリス塩酸バッファーpH7.4に縣濁したのちに超音波により破砕（カビについては海砂と共に乳鉢で破砕）して、遠心にて不要物を取り除き粗酵素液とした。その粗酵素液を5mMのイノシンあるいはアデノシンあるいはグアノシンの基質存在下、100mMの酢酸ナトリウムバッファーpH4.5中で60℃と70℃で反応を行った。その溶液をシリカゲルの薄層プレートにスポットし、ノルマルブタノール：酢酸：水＝３：１：１の展開液にて薄層クロマトグラフィーを行い、ヌクレオシドとそれに対応するプリン塩基のスポットの大きさから、ヌクレオシドの分解程度を調べた。活性の高かった菌について、その結果を表２に示した。
培地組成および培養条件
1）カビ
麦芽エキス5％ 28℃、3-5日
酵母エキス0.3％ 振盪培養
pH5.5
2）バクテリア（乳酸菌を除く）
トリプトン 0.5％ 28℃、2-4日
酵母エキス 0.5％ 振盪培養
グルコース 0.1％
リン酸二カリウム 0.1％
pH7.0
3）乳酸菌
ペプトン 1％ 28℃、4-7日
肉エキス 1％ 静置培養
酵母エキス 0.5％
グルコース 2％
スパン80 0.1％
クエン酸アンモニウム 0.2％
酢酸ナトリウム 0.5％
硫酸マグネシウム七水和物 0.01％
塩化マンガン四水和物 0.005％
リン酸二カリウム 0.2％
pH6.5
4）酵母
酵母エキス 0.2％ 28℃、2-4日
ペプトン 0.5％ 振盪培養
グルコース 5％
リン酸二カリウム 0.4％
リン酸一カリウム 0.2％
硫酸マグネシウム七水和物 0.02％
pH6.0
上記で取得した菌のうち、バクテリアであるオクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）は60℃にてイノシン、アデノシン、グアノシンを、70℃にてイノシン、グアノシンを分解できる高活性のヌクレオシダーゼを生産する。オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）の粗酵素液を50mM MESバッファーpH6.0に対して透析し、粗酵素液中の低分子を除いた後、そのヌクレオシダーゼの性質を詳しく調べた。
イノシンによる活性測定方法
25mMの適当なバッファー（酢酸ナトリウムバッファーpH4.5-5.0、トリス塩酸バッファーpH7.0-9.5、MESバッファーpH5.5-6.5）、5mMイノシン溶液195μlをあらかじめ各温度でインキュベートしておき、酵素液5μlを添加し反応を開始する。10分後0.2N塩酸溶液を200μl加えて反応を止め、遠心により変性した蛋白質を取り除く。上澄液100μlと0.1N水酸化ナトリウム溶液100μl、1Mトリス塩酸バッファーpH8.0 50μl、水345μlを混合し293nmにおける吸光度を測定し、コントロールとする。さらにキサンチンオキシダーゼ5μl（5mU）を加えて混合し、293nmの吸光度の増加が止まったところで吸光度を測定する。ヌクレオシダーゼの活性の単位Uは1分間に1μモルのヌクレオシドを加水分解する酵素量として表され、酵素液のヌクレオシダーゼの活性（U/ml）は3.33×ΔA293で求められる。なお、ΔA293はキサンチンオキシダーゼを加えたものの吸光度からコントロールの吸光度を引いた値を示す。
還元糖定量による活性測定法
25mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0，5mMヌクレオシド溶液195μlをあらかじめ各温度でインキュベートしておき、酵素液5μlを添加し反応を開始する。10分後0.1N硫酸亜鉛溶液を200μl加えて反応を止め、さらに0.1N水酸化ナトリウム溶液200μlを加えて遠心して、蛋白質を除く。上澄液200μlと4%炭酸ナトリウム、1.6%グリシン、0.045%硫酸銅5水和物溶液300μlと0.04% 2,9-ジメチル-1,10-フェナンスロリン0.9ml、水200μlを混合し、95℃、８分インキュベートする。450nmの吸光度を測定する。濃度が既知のリボース溶液を用いて同様の処理を行い450nmの吸光度から検量線を作成し、酵素反応液のリボース濃度を算出する。酵素液のヌクレオシダーゼの活性（U/ml）はリボース濃度（μM）×0.004で求められる。
（１）至適温度
至適温度 50℃〜80℃。イノシンを基質として、pH5.0で各温度にて10分反応させたときの活性を図３に示す。活性は60℃にて最も高く70℃では約80%に低下するが、80℃でも活性は変わらない。
（２）至適pH
至適pH pH4.5〜6.5。イノシンを基質として、各pHにて70℃で10分反応させたときの活性を図４に示す。pH5.0とpH6.0にピークがある。
（３）耐熱性
50mM酢酸ナトリウムバッファーpH5.0中で、70℃で各時間インキュベートした後、同量の10mMイノシン溶液を加えて、70℃で10分間反応させたときの活性を図５に示す。また、40℃で10分間反応させたときの活性を図６に示す。10分間の熱処理で70℃で反応させた場合、約70%に活性が低下するがその後はほとんど低下しない。10分間の熱処理で40℃で反応させた場合には約25%に活性が低下するがその後はほとんど低下しない。
（１）−（３）の結果から考えて、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）は、少なくとも2種類の至適温度、至適pH、耐熱性が異なるヌクレオシダーゼを持つことが予想される。
（４）基質特異性
還元糖の定量によりpH5.0で、60℃と70℃におけるイノシン、アデノシン、グアノシンに対する基質特異性を調べた。それを図７に示す。70℃におけるアデノシンに対する活性が全くなくなることにより、アデノシンを分解できうるヌクレオシダーゼとアデノシンを分解できないヌクレオシダーゼの少なくとも2種類があることが基質特異性からも予想される。
（５）熱失活
麦汁煮沸により本酵素が失活するかどうか調べるため、100℃で各時間インキュベートした後、60℃にてイノシンを基質としたときの活性を調べた。その結果を図８に示す。100℃、10分のインキュベートにて完全に活性はなくなる。60℃にてイノシンを分解する活性はアデノシンを分解できうるヌクレオシダーゼとアデノシンを分解できないヌクレオシダーゼの両方が持つので、両酵素が煮沸により容易に失活させられる。
以上の結果より本酵素は麦汁のpHである5.0付近で十分活性を持ち、アデノシンは60℃にて、イノシンとグアノシンについてはより高い80℃にても分解する能力があることがわかった。また、煮沸することにより完全に失活するため、通常のビール製造工程における煮沸工程後には活性のある酵素が直接、製品ビールの品質を変えることはない。
実施例４． ヌクレオシド分解麦汁の製造
図９に麦汁製造工程における仕込釜および仕込槽の時間−温度曲線を示す。また、仕込釜及び仕込槽の原料配合の割合を表3に示す。この製造工程において、仕込槽に熱処理、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等で部分精製したオクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）のヌクレオシダーゼ、約20,000u（基質：イノシン、反応温度：60℃）を破砕麦芽と共に加えて麦汁製造を行った。酵素を添加して製造した麦汁と酵素を加えずに製造した麦汁中のプリン体分析結果を図10に示す。酵素を添加した麦汁からはプリンヌクレオシドが検出されず、プリン塩基が増加していた。以下この麦汁をヌクレオシド分解麦汁と呼ぶ。
実施例４で製造したヌクレオシド分解麦汁と通常の麦汁を用いてビール醸造を行った。麦汁2リットルにビール酵母を湿重量で10.5g懸濁し、12℃で8日発酵した。その後4℃で5日間貯酒した。その発酵中のプリン体の消長を図11に示す。アデニンは発酵時間内に全て資化された。発酵液中のグアニンの量は時間と共に減少し、発酵終了時には検出されなくなる。
差し引き約90μMに相当するグアニンが酵母により資化された。従って、麦汁中の計260μMに相当するプリン体が発酵過程で消失する。酵素で処理せずに製造した麦汁を用いて醸造したビールのプリン体は計500μMで、酵素処理した麦汁を用いて醸造したビールのプリン体は計180μMであるので、計320μMプリン体を低減したビールを醸造することが出来た。発酵は酵母増殖、エキスの消費共に通常の麦汁を用いたものとほぼ変わらず、味覚の面でも大きな差は見られなかった。
産業上の利用可能性
本発明は、本発明の酵素をビール製造工程において、麦汁に作用させることにより、原料由来のプリン化合物のうち、プリンヌクレオシドをプリン塩基に分解せしめ、プリンヌクレオシドを実質的に存在させない麦汁を得られ、該麦汁からビールを製造することによって該プリン塩基を発酵工程において酵母に代謝させることにより、ビール中のプリン化合物含量を低減させたビールを得ることができる。本発明の方法によって得られたビールは、高尿酸血症あるいは痛風等の罹患リスクを軽減することができる。
本発明の酵素は、ビール製造工程において、その製造工程を変更することなく麦汁に作用させることが出来、特に、麦汁製造過程で本発明の酵素を作用させると、通常の麦汁製造工程（糖化）工程における温度及びpHが酵素の至適範囲であるため有効に作用し、麦汁製造工程に要する時間内で酵素も麦汁に作用させられる。またビール製造工程の１工程である麦汁製造工程直後の麦汁の煮沸工程で、酵素を失活させることができるため、より簡便に作用させられ、経済的に行うことができる。また、発酵直前或は発酵中に酵素を麦汁に作用させる場合は、発酵工程後に加熱処理を行う製造工程があれば、その工程により酵素も失活させることができる。更に、得られたビールは、通常の製品ビールと味覚の面でも大きな差は見られず、嗜好性製品としても好ましいビールを得られることができる。
規則第13規則の２の寄託された微生物への言及および寄託機関通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
受託番号及び寄託した日付
FERM BP-5377 1996年1月26日
Claims (13)
- 麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼ及び／またはヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とするビールの製造方法。
- 麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼ及び／またはヌクレオシダーゼを作用させ、麦汁中に含まれるプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解することにより得られたヌクレオシド分解麦汁を用いて製造することを特徴とするビールの製造方法。
- 前記ヌクレオシド分解麦汁がプリンヌクレオシドを含有していないことを特徴とする請求項２記載の方法。
- 前記ヌクレオシダーゼがオクロバクトラム（Ochrobactrum）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エシェリヒア（Escherichia）属、シトロバクター（Citrobacter）属、セラチア（Serratia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バシルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）属、デバリオミセス（Debaryomyces）、ピヒア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）、アスペルギルス（Aspergillus）属、及びペニシリウム（Penicillium）属からなる群より選ばれたヌクレオシダーゼ産生能を有する微生物由来のヌクレオシダーゼである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- ヌクレオシド・フォスフォリラーゼまたはヌクレオシダーゼの至適pH域が4.5〜6.5でかつ至適温度域が50℃〜80℃である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
- 発酵前または発酵中に、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼ及び／またはヌクレオシダーゼを添加することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
- 麦汁製造工程中に、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼ及び／またはヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
- 麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼ及び／またはヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とする麦汁の製造方法。
- 麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼ及び／またはヌクレオシダーゼを作用させ、麦汁中に含まれるプリンヌクレオシドをプリン塩基に分解することによりヌクレオシド分解麦汁を得る麦汁の製造方法。
- 前記ヌクレオシド分解麦汁がプリンヌクレオシドを含有していないことを特徴とする請求項９記載の方法。
- 前記ヌクレオシダーゼがオクロバクトラム（Ochrobactrum）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、エシェリヒア（Escherichia）属、シトロバクター（Citrobacter）属、セラチア（Serratia）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バシルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、コマモナス（Comamonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属、ピヒア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、及びペニシリウム（Penicillium）属からなる群より選ばれたヌクレオシダーゼ産生能を有する微生物由来のヌクレオシダーゼである請求項８〜10のいずれか１項記載の方法。
- ヌクレオシド・フォスフォリラーゼまたはヌクレオシダーゼの至適pH域が4.5〜6.5でかつ至適温度域が50℃〜80℃である請求項８〜11のいずれか１項記載の方法。
- 麦汁製造工程中に、麦汁にヌクレオシド・フォスフォリラーゼ及び／またはヌクレオシダーゼを作用させることを特徴とする請求項８〜12のいずれか１項記載の方法。
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