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Die
Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für
eine pflanzliche Adenosin-Nukleosidase kodiert, diese Nukleinsäure
enthaltende rekominante DNA, Chimäre DNA, DNA-Konstrukte,
Expressionsvektoren, transgene Wirtszellen und Pflanzen sowie eine Adenosin-Nukleosidase
und Verwendungen der Nukleinsäure und der Adenosin-Nukleosidase.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch Verfahren zur
Herstellung von Pflanzen mit verändertem Stoffwechsel sowie
von transgenen Pflanzen.
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Purine,
d. h. Verbindungen mit Purin (7H-Imidazol[4,5-d]pyrimidin) als Grundgerüst,
spielen eine zentrale Rolle im Stoffwechsel von Pflanzen. Die Purine
Adenin und Guanin beispielsweise sind wichtige Bestandteile von
Nukleinsäuren sowie von Verbindungen wie ATP, NAD(P), GTP
usw., die für den Energiestoffwechsel und Syntheseleistungen
der Zelle bedeutsam sind. Purinderivate wie z. B. Zytokinine bilden
Pflanzenhormone, die das Wachstum und die Differenzierung von Pflanzen
und Pflanzenteilen wie Spross, Blatt und Wurzel regulieren und auch
den Ertrag wichtiger Kulturpflanzen wie zum Beispiel Reis beeinflussen.
Purinderivate wie S-Adenosyl-Methionin sind beispielsweise an Transmethylierungsreaktionen
beteiligt und spielen so eine bedeutende Rolle bei der Synthese
von Ligninvorstufen, Purinalkaloiden und Pektin. Darüber
hinaus bilden Purinderivate mit den Purinalkaloiden wie Koffein
auch vielfach genutzte Pflanzeninhaltsstoffe.
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Enzyme,
die am Purin- bzw. Zytokininstoffwechsel von Pflanzen beteiligt
sind, sind beispielsweise aus der
US
6.600.091 und der
US
6.229.066 bekannt. Die
US
6.600.091 beschreibt eine Zeatin-O-Glukosyltransferase
aus Phaseolus lunatus und eine Zeatin-O-Xylosyltransferase aus Phaseolus vulagaris.
Die
US 6.229.066 beschreibt
eine Zytokininoxidase aus Zea mays.
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Aus
Mikrorganismen sind darüber hinaus Purin-Nukleosidasen
bekannt. Ein Beispiel hierfür ist die in der
EP 0825261 B1 beschriebene
Purin-Nukleosidase aus Ochrobactrum anthropi. Mikrobielle Purin-Nukleosidasen
werden zur Herstellung von Diät-Bier mit verringertem Puringehalt
eingesetzt. Ein entsprechendes Verfahren ist in der
EP 0753572 B1 beschrieben.
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Eine
Beeinflussung des Purinstoffwechsels von Tieren und Pflanzen, beispielsweise
zur Veränderung des Verhältnisses zwischen einem
Ribosid und dessen jeweiliger Base, ist mit den aus dem Stand der
Technik bekannten Mitteln nur eingeschränkt oder gar nicht
möglich. Es wäre aber wünschenswert,
wenn Mittel zur Verfügung stünden, den Purinstoffwechsel
von Pflanzen an möglichst zentraler Stelle gezielt zu beeinflussen.
Darüber hinaus besteht ein Bedarf an einer pflanzlichen
Purin-Nukleosidase für den Einsatz bei der Herstellung
von Diät-Bier oder anderen Gärungsprodukten mit
einem verringerten Puringehalt.
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Die
Aufgabe wird gelöst durch die Gegenstände der
nebengeordneten Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen
sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Die
in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen
verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe werden,
soweit nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist,
in der üblichen und dem Fachmann geläufigen Bedeutung verwendet.
Einige der hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke werden
im folgenden beispielhaft näher erläutert.
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Unter
dem Begriff "Tiere" werden hier chemoorganoheterotrophe eukaryotische
Lebewesen verstanden. "Chemoorganoheterotroph" sind Lebewesen, deren
Energiequelle Redoxreaktionen zwischen chemischen Verbindungen sind,
und deren Elektronendonator und Kohlenstoffquelle organische Verbindungen
sind.
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Unter
"Pflanzen" werden demgegenüber hier eukaryotische Lebewesen
verstanden, die im Wesentlichen photolithoautotroph sind, deren
Energiequelle somit Licht, deren Elektronendonator und Kohlenstoffquelle
anorganische Verbindungen sind. Lebewesen, die vom Fachmann zu den
Pflanzen gerechnet werden, jedoch nicht photolithoautotroph sind,
wie beispielsweise heterotroph von Pilzen lebende (myko-heterotrophe)
Pflanzen (z. B. einige Orchideen, Corsiaceae, Burmanniaceae) oder
auf anderen Pflanzen parasitierende Pflanzen (z. B. Rafflesiaceae,
einige Orobanchaceae und Convolvulaceae), sollen jedoch von dem
Begriff ebenfalls umfasst sein. Entsprechendes gilt auch für
fleischfressende Pflanzen.
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Unter
einer "Nukleinsäure" wird ein Polymer verstanden, dessen
Monomere Nukleotide sind. Ein Nukleotid ist eine Verbindung aus
einem Zuckerrest, einer stickstoffhaltigen heterozyklischen organischen Base
(Nukleotid- oder Nukleobase) und einer Phosphatgruppe. Der Zuckerrest
ist in der Regel eine Pentose, im Falle von DNA Desoxyribose, im
Falle von RNA Ribose. Die Verknüpfung der Nukleotide erfolgt über
die Phosphatgruppe mittels einer Phosphodiesterbrücke zwischen
dem 3'-C-Atom der Zuckerkomponente eines Nukleosids (Verbindung
aus Nukleobase und Zucker) und dem 5'-C-Atom der Zuckerkompo nente
des nächsten Nukleosids. Bei den Nukleobasen handelt es
sich regelmäßig um Purine (R) und Pyrimidine (Y).
Beispiele für Purine sind Guanin (G) und Adenin (A), Beispiele
für Pyrimidine sind Cytosin (C), Thymin (T) und Uracil
(U). Der hier verwendete Begriff "Nukleinsäure" umfasst
beispielsweise DNA, RNA und DNA/RNA-Mischsequenzen.
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Unter
"Adenosin-Nukleosidase" (abgekürzt: ADN) wird das Enzym
Adenosin-Ribohydrolase (E. C. 3.2.2.7) verstanden. Das Enzym katalysiert
die hydrolytische Spaltung des Nukleosids Adenosin in Adenin und
Ribose: Adenosin + H2 → Adenin
+ Ribose
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Der
Ausdruck "Nukleinsäure, die für eine pflanzliche
Adenosin-Nukleosidase kodiert" soll jede Nukleinsäure umfassen,
die für ein Polypeptid kodiert, das Adenosin-Nukleosidase-Aktivität
aufweist. Der Ausdruck "ein für eine Adenosin-Nukleosidase kodierendes
Fragment einer Nukleinsäure" ist hier so zu verstehen,
dass das Fragment der Nukleinsäure für ein Polypeptid
kodiert, das Adenosin-Nukleosidase-Aktivität aufweist.
Die Adenosin-Nukleosidase-Aktivität kann beispielsweise
wie im Ausführungsbeispiel zu der vorliegenden Erfindung
beschrieben festgestellt werden.
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Der
Ausdruck "isoliert" bedeutet hier, dass ein Stoff bzw. Material
aus seiner ursprünglichen bzw. natürlichen Umgebung
im Wesentlichen herausgelöst worden ist.
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Der
Begriff "synthetisch" oder "synthetisiert" bedeutet hier künstlich
hergestellt. Insbesondere wird "synthetisch" oder "synthetisiert"
hier im Sinne von "in der Natur nicht vorkommend" verwendet. Der Begriff
"synthetisch" oder "synthetisiert" kann daher auch beispielsweise
eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz umfassen,
die durch Mutieren einer natürlicherweise vorkommenden
Nukleinsäure erzeugt wurde. Unter "Mutieren" wird dabei
eine künstliche Veränderung der Abfolge bzw. der
Art der Nukleotide einer Nukleinsäure oder der Abfolge
bzw. der Art der Aminosäuren eines Peptids verstanden.
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Unter
einer "Nukleotidsequenz" wird die lineare Abfolge von Nukleotiden
verstanden. Eine solche Sequenz wird üblicherweise und,
sofern dies nicht ausdrücklich anders angegeben oder für
den Fachmann ohne weiteres ersichtlich ist, auch in der vorliegenden
Anmeldung durch eine Sequenz der die Nukleotide repräsentierenden
Einbuchstaben-Abkürzungen in 5'-3'-Richtung wiedergegeben
(z. B. ist ACGT eine lineare Abfolge der Adenin , Cytidin-, Guanin-
und Thymin-Nukleotide).
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Unter
einer "Aminosäuresequenz" wird die lineare Abfolge von
Aminosäuren verstanden. Eine solche Sequenz wird üblicherweise
und, sofern dies nicht ausdrücklich anders angegeben oder
für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich ist, auch in
der vorliegenden Anmeldung durch eine Sequenz der die Aminosäuren
repräsentierenden Dreibuchstaben oder Einbuchstaben-Abkürzungen,
beginnend mit dem N-Terminus, wiedergegeben.
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Die
Begriffe "Peptid", "Polypeptid" und "Protein" werden im Rahmen der
Erfindung austauschbar verwendet und bezeichnen Polymere aus einer
beliebigen Anzahl von Aminosäuren, die durch Peptidbindung
untereinander verknüpft sind.
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Die
Begriffe "Homologie" bezieht sich auf Übereinstimmungen
oder Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz zweier
Peptide bzw. der Nukleotidsequenz zweier Nukleinsäuremoleküle.
Das Vorhandensein einer Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren
oder Peptiden kann festgestellt werden werden, indem man jeweils
eine Position in der einen Sequenz mit der entsprechenden Position
in der anderen Sequenz vergleicht und ermittelt, ob hier identische
oder ähnliche Reste vorhanden sind. Zwei miteinander verglichene
Sequenzen sind homolog, wenn ein bestimmter Mindestanteil identischer
oder ähnlicher Aminosäuren bzw. Nukleotide vorliegt. Identität
heisst, dass beim Vergleich zweier Sequenzen an äquivalenten
Stellen jeweils dieselbe Aminosäure bzw. dasselbe Nukleotid
steht. Dabei kann es gegebenenfalls erforderlich sein, Sequenzlücken
zu berücksichtigen, um eine möglichst gute Alinierung der
Vergleichssequenzen herzustellen. Ähnliche Aminosäuren
bzw. Nukleotide sind dabei Aminosäuren/Nukleotide mit gleichen
oder äquivalenten chemisch-physikalischen Eigenschaften.
Beim Austausch einer Aminosäure bzw. eines Nukleotids durch
eine andere Aminosäure bzw. ein anderes Nukleotid mit gleichen
oder äquivalenten chemisch-physikalischen Eigenschaften
spricht man von einem "konservativen Austausch". Beispiele für
physikalisch-chemische Eigenschaften einer Aminosäure sind
beispielsweise die Hydrophobie oder die Ladung. In Zusammenhang
mit Nukleinsäuren wird hier auch von einem ähnlichen
Nukleotid bzw. einem konservativen Austausch gesprochen, wenn in
einer kodierenden Sequenz ein Nukleotid in einem Kodon durch ein
anderes ersetzt wird, wobei jedoch, z. B. aufgrund der Degeneration
des genetischen Kodes, dieselbe Aminosäure oder eine ähnliche
Aminosäure wie in der Vergleichssequenz von dem vom Austausch
betroffenen Kodon kodiert wird. Dem Fachmann ist bekannt, welcher
Nukleotid- oder Aminosäureaustausch ein konservativer Austausch
ist. Als ähnliche Aminosäuren/Nukleotide werden
insbesondere solche nichtidentischen Aminosäuren/Nukleotide
angesehen, die anhand der von dem Computerprogramm "Basic Local
Alignment Search Tool", abgekürzt BLAST, (S.F.
Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J. Mol.
Biol. 215: 403–410; s. z. B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
verwendeten BLOSUM62-Substitutionsmatrix (Henikoff, S., und
Henikoff, J., Amino acid substitution matrices from Protein blocks.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915–10919, 1992)
als "positiv" ausgegeben werden, d. h. in der BLOSUM62-Substitutionsmatrix
eine positive Punktzahl aufweisen. Für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung wird davon ausgegangen, dass eine Homologie zwischen zwei
Sequenzen vorhanden ist, wenn mindestens 45%, vorzugsweise mindestens
50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens
70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens
90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens
99% der Nukleotide/Aminosäuren identisch oder ähnlich,
vorzugsweise identisch, sind. Insbesondere wird vom Vorhandensein
einer Homologie zwischen zwei Sequenzen ausgegangen, wenn bei Verwendung
des Computerprogramms BLAST (S. F. Altschul et al. (1990),
Basic Local Alignment search tool, J. Mol. Biol. 215: 403–410;
s. z. B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) unter
Verwendung von Standardparametern und der BLOSUM62-Substitutionsmatrix
(Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid substitution
matrices from Protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915–10919,
1992) eine Identität oder Ähnlichkeit ("Positives"),
vorzugsweise Identität, von mindestens 45%, vorzugsweise
mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%,
mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%,
mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens
99% erhalten wird. Vorzugsweise wird dabei im Falle von Nukleinsäuren
von einer Mindestlänge von 60 Nukleotiden bzw. Basenpaaren,
bevorzugt einer Mindestlänge von 70, 80, 90, 100, 110,
120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350 oder 400 Nukleotiden bzw.
Basenpaaren, bei Peptiden von einer Mindestlänge von 20,
bevorzugt einer Mindestlänge von 25, 30, 35, 40, 45, 50,
60, 80 oder 100 Aminosäuren ausgegangen. Besonders bevorzugt wird
von der vollen Länge der jeweiligen Nukleinsäure
bzw. Aminosäure ausgegangen. Dem Fachmann ist anhand seines
Fachwissens ohne Weiteres ersichtlich, welches der verfügbaren
BLAST-Programme (BLASTn, BLASTp, BLASTx, tBLASTn oder tBLASTx) für
die Ermittlung der Homologie in Frage kommt. Darüber hinaus
existieren noch weitere Programme, die der Fachmann kennt, und die
er im Bedarfsfall bei der Beurteilung der Homologie zweier oder
mehrerer zu vergleichender Sequenzen heranziehen kann. Solche Programme
sind beispielsweise auf den Internetseiten des European Bioinformatics Institute
(EMBL) verfügbar (s. z. B. http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html)
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Unter
"Hybridisieren" oder "Hybridisierung" wird ein Vorgang verstanden,
bei dem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül
sich an einen komplementären Nukleinsäurestrang
anlagert, d. h. mit diesem eine Basenpaarung eingeht. Die Möglichkeit einer
solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen
ab. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook
et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 3. Aufl. 2001) beschrieben. Der Begriff "komplementär"
bezieht sich auf die Fähigkeit von Purin- und Pyrimidinnukleotiden, über
Wasserstoffbrückenbindungen miteinander Basenpaare zu bilden.
Komplementäre Basenpaare sind beispielsweise Guanin und
Cytosin, Adenin und Thymin sowie Adenin und Uracil.
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Der
Begriff "Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen.
Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist,
niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die
Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise
von der Salzkonzentration bzw. Ionenstärke und der Temperatur
ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der
Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht
werden.
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Unter
"stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen
zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung überwiegend
nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet.
Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise in Sambrook
et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 3. Aufl. 2001) beschrieben. Der Begriff
"Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich dabei nicht nur auf die
bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden
Bedingungen, sondern auch auf bei den anschließenden Waschschritten
herrschenden Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen
sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend
nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren,
die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%,
mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Sequenzidentität
aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen können
beispielsweise sein: Hybridisieren in 4 × SSC bei 65°C
und anschliessendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei
65°C für insgesamt etwa 1 Stunde.
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Der
Begriff "Fragment", wenn er hier in Bezug auf ein Polypeptid oder
eine Nukleinsäure verwendet wird, beschreibt, sofern nicht
anders angegeben, zusammenhängende Teile der jeweiligen
Aminosäuresequenz bzw. Nukleinsäuren, vorzugsweise mit
einer Mindestlänge von 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30,
35, 40, 45, 50, 60, 80, oder 100 Einheiten, d. h. Nukleotiden oder
Aminosäuren.
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Der
Begriff "rekombinant" beizeichnet hier ein gentechnologisch durch
Rekombination (genetischen Umbau) hergestelltes Produkt, insbesondere eine
Kombination von genetischem Material aus unterschiedlichen Quellen.
Unter einem "rekombinanten DNA-Molekül" wird ein DNA-Molekül
verstanden, das DNA aus mindestens zwei verschiedenen Quellen (z.
B. zwei verschiedenen Organismen) enthält.
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Der
Begriff "Gen" bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung
auf eine Nukleinsäure, die ein offenes Leseraster enthält,
das für ein Polypeptid kodiert. Dabei werden sowohl Exon-
als auch evtl. Intron-Sequenzen mit eingeschlossen. Der Begriff
"Intron" beschreibt solche DNA-Sequenzen, die transkribiert, dann
aber aus dem Transkript durch sogenanntes "Splicing" entfernt werden,
wobei die angrenzenden Sequenzen (Exons) verknüpft werden.
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Unter
einem "chimären Gen" wird hier ein Gen verstanden, das
die kodierende Sequenz eines Organismus enthält, die jedoch mit
einem Promotor und/oder anderen Sequenzen von einem anderen Organismus
funktionell verbunden ist.
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Unter
einem Selektionsmarker wird eine Nukleotidsequenz, z. B. ein Gen,
verstanden, das die Selektion transformierter Zellen bzw. Organismen
ermöglicht. Unter einem positiven Selektionsmarker wird
dabei ein Marker verstanden, der in den zu selektierenden, also
"erwünschten", Zellen bzw. Organismen selbst enthalten
ist, während ein negativer Selektionsmarker nur in den
Zellen/Organismen enthalten ist, die "unerwünscht" sind
und daher nicht selektiert werden sollen. Durch Verwendung negativer Selektionsmarker
kann eine transformierte Zelle bzw. ein transformierter Organismus
erhalten werden, der frei ist von Selektionsmarkersequenzen.
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Der
Begriff "transgen" bedeutet hier gentechnisch verändert.
Unter einer "transgenen Pflanze" wird hier eine gentechnisch veränderte
Pflanze verstanden, d. h. eine Pflanze, in die mindestens ein Gen
einer anderen Spezies eingeführt ist.
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Der
Begriff "Promotor" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die die Expression
einer bestimmten DNA regulieren, die funktionell mit dem Promotor verknüpft
sind. Der Begriff umfasst auch "gewebsspezifische" Promotoren, d.
h. Promotoren, die die Expression der spezifischen DNA nur in bestimmten Zellen
(z. B. Zellen eines bestimmten Gewebes) steuern. Ebenso umfasst
sind "gewebsunspezifische" Promotoren und Promotoren, die zu einer
konstitutiven Expression führen oder induzierbar sind. Der
hier verwendete Begriff "funktionell verknüpft" bedeutet
eine Anordnung von Elementen, bei dem jedes Element in der Lage
ist, seine angestammte Funktion auszuüben. Eine Kontrollsequenz,
die funktionell mit einer kodierenden Sequenz verknüpft
ist, kann daher die Expression der kodierenden Sequenz beeinflussen.
Eine solche Kontrollsequenz muss zu der kodierenden Sequenz nicht
benachbart sein.
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Unter
einem "Vektor" wird ein Mittel, z. B. ein DNA-Molekül,
verstanden, das als Vehikel zum Einbringen einer exogenen Nukleotidsequenz,
z. B. DNA oder RNA, in eine Wirtszelle verwendet wird. Ein Vektor
enthält meist eine Nukleotidsequenz, die für ein
oder mehrere Polypeptide kodiert. Vorzugsweise ist ein Vektor darüber
hinaus in der Lage, sich zu replizieren, sich selbst in die Wirtszelle
einzuführen und weist selektierbare Marker auf. Vektoren,
die die Expression der Nukleotidsequenz steuern können,
die sie enthalten, werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet.
Vektoren und deren Verwendung sind dem Fachmann gut bekannt. Ein
Beispiel für einen Vektor ist beispielsweise ein Plasmid,
z. B. das Ti-Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens.
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Unter
einem "DNA-Konstrukt" ist eine synthetische Nukleinsäure
zu verstehen, bei der eine DNA-Sequenz mit mindestens einer anderen DNA-Sequenz,
vorzugsweise einer Kontrollsequenz, funktionell verknüpft
worden ist. Bei der Kontrollsequenz kann es sich beispielsweise
um eine Sequenz handeln, die die Expression der DNA reguliert.
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Der
Begriff "modulieren" bzw. "Modulation" bezieht sich sowohl auf eine
Stimulation als auch auf eine Schwächung, Hemmung oder
Unterdrückung eines biochemischen Vorgangs, beispielsweise
der Synthese von Zellinhaltsstoffen wie Alkaloiden.
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"Antisinnrichtung"
bzw. "Antisinnorientierung" einer DNA-Sequenz bedeutet hier beispielsweise,
dass eine Transkription der DNA-Sequenz zu einer mRNA führt,
deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu einer natürlichen
(endogenen) mRNA, so dass deren Translation durch Anlagerung der komplementären
RNA behindert oder verhindert wird. Unter einer "Antisinn-RNA" bzw.
"Antisense-RNA" wird eine zu einer bestimmten mRNA oder zu bestimmten
anderen RNAs komplementäre RNA verstanden. "Antisinnrichtung"
oder "Antisinnorientierung" einer mRNA-Sequenz bedeutet daher, dass
die mRNA eine Sequenz aufweist, die komplementär ist zu
einer mRNA-Sequenz, deren Translation somit durch Anlagerung behindert
oder verhindert werden kann.
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Unter
dem Begriff "Wirtszelle" wird jede Zelle verstanden, in die eine
fremde Nukleinsäure eingebracht wurde. Auch Nachkommen
solcher Zellen, die die fremde Nukleinsäure aufweisen,
werden hier als "Wirtszelle" bezeichnet.
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Unter
einem "Protoplasten" wird hier eine von einer Zytoplasmamembran
umgebene Zelle verstanden, bei der die Zellwand teilweise oder vollständig
entfernt wurde.
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Unter
"Vermehrungsmaterial" wird hier Material von Pflanzen für
deren generative oder vegetative Vermehrung verstanden, z. B. Samen,
Früchte, Pflanzenteile wie Stecklinge, Knollen, Zwiebeln usw.).
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"Purinalkaloide"
sind eine Gruppe von Alkaloiden, die das bicyclische Grundgerüst
des Purins enthalten:
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Beispiele
für Purinalkaloide beinhalten Koffein, Theophyllin und
Theobromin.
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Der
Begriff "Transformation" bzw. "Transformieren", wie hier verwendet,
bedeutet die Einführung von DNA in eine geeignete Wirtszelle
als extrachromosomales Element oder durch Chromosomenintegration,
so dass die DNA replizierbar ist.
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Der
Begriff "Transfektion" oder "Transfizieren", wie hier verwendet,
bezieht sich auf die Aufnahme eines Vektors durch eine geeignete
Wirtszelle, unabhängig davon, ob eine kodierende Sequenz
tatsächlich exprimiert wird oder nicht.
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Im
folgenden werden die verschiedenen Aspekte der Erfindung und bevorzugte
Ausführungsformen davon näher beschrieben.
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In
einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine isolierte
oder synthetisierte Nukleinsäure, die für eine
pflanzliche Adenosin-Nukleosidase kodiert, oder ein für
eine pflanzliche Adenosin-Nukleosidase kodierendes Fragment der
isolierten oder synthetisierten Nukleinsäure.
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Mit
der vorliegenden Erfindung wird erstmals eine Nukleinsäure
bereitgestellt, die für eine nicht-mikrobielle, insbesondere
pflanzliche, Adenosin-Nukleosidase (ADN, E. C. 3.2.2.7) kodiert.
Die Adenosin-Nukleosidase ist ein wichtiges Enzym des Purinmetabolismus.
Für einen Überblick über den Purinmetabolismus
in Pflanzen s. z. B. Stasolla et al. (2003), Purine and
pyrimidine nucleotide metabolism in higher plants, J. Plant Physiol.
160: 1271–1295; Wasternack C. (1982) Metabolism
of pyrimidines and purines. in: B. Parthier, D. Boutler (Hrsg.):
Enzyclopedia of plant physiology, New Series, Band 14B: 263–301,
Springer Verlag, Berlin. Der Adenosin-Nukleosidase kommt
eine Schlüsselstellung insbesondere im pflanzlichen Stoffwechsel
zu, da die Purin-Nukleoside, die Substrate der ADN, nicht nur Bestandteile
und/oder Vorstufen wichtiger Verbindungen wie beispielsweise von
energieliefernden Verbindungen (ATP, GTP, NADH, NADPH etc.), Transmethylierungsverbindungen
wie S-Adenosyl-Methionin und Nukleinsäuren usw. sind, sondern
beispielsweise auch von, Zytokininen und Alkaloiden.
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Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure eröffnet
nunmehr die Möglichkeit, in diesen zentralen Stoffwechsel
der Pflanze einzugreifen und pflanzliche Eigenschaften gezielt zu
verändern bzw. zu modulieren. So können methylierungs-abhängige
Prozesse wie z. B. die Synthese von Purinalkaloiden oder Zytokinin-regulierte
Prozesse beeinflusst werden. Die Nukleinsäure kann selbstverständlich
auch als molekularer Marker, beispielsweise als positiver oder negativer
Selektionsmarker in Selektionsverfahren, z. B. bei Zellkultursystemen,
verwendet werden (s. Schaff, D. A., The adenine phophoribosyltransferase
(APRT) selectable marker system, Plant Science 101: 3–9),
oder beispielsweise als Sonde zur Auffindung und/oder Isolierung
anderer pflanzlicher ADNs. Dabei können selbstverständlich
auch Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäure
eingesetzt werden. Des weiteren kann die pflanzliche Nukleinsäure
gemäß der vorliegenden Erfindung auch dazu dienen,
eine pflanzliche ADN herzustellen, die beispielsweise bei der Herstellung
von Diät-Bier oder anderen Lebensmitteln mit reduziertem
Puringehalt verwendet werden kann.
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Adenosin
ist ein wirkungsvoller Inhibitor der S-Adenosylhomocysteinhydrolase
(SAHN), einem wichtigen Enzym des Methylierungsstoffwechsels, der
der Bereitstellung des Methylgruppendonators S-Adenosylmethionin
(SAM) dient. Ein gesteigerter Abbau von Adenosin in bestimmten Geweben
bzw. Zelltypen kann beispielsweise zu einer höheren Methylierungsrate
führen und damit wichtige zelluläre Prozesse wie
z. B. die Pektinsynthese, die Ligninsynthese oder die DNA-Methylierung
beeinflussen.
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Besondere
Bedeutung haben Methylierungsprozesse für die Biosynthese
von Purinalkaloiden wie Koffein und Theobromin bei Kaffee- und Teepflanzen. Hier
werden die Purine Xanthosin und 7-Methylxanthin nacheinander SAM-abhängig
mittels Methyltransferasen methyliert, wodurch Theobromin resultiert,
das anschließend durch einen weiteren Methylierungsschritt
zu Koffein umgewandelt wird (s. Koshiishi et al., 2001,
A new caffeine biosynthetic pathway in tea leaves: utilisation of
adenosine released from the S-adenosyl-L-methionine cycle, FERS
Lett. 499, 50–54). Die erfindungsgemäße
Nukleinsäure kann nun genutzt werden, um beispielsweise
durch Überexpression den Koffein- bzw. Theobromingehalt von
Kaffee- bzw. Teepflanzen zu erhöhen. So kann die Überexpression
von ADN die Rückgewinnung von SAM begünstigen,
indem Adenosin als Hemmstoff der SAHN effektiver zu Adenin abgebaut
wird und auf diese Weise den Methylierungszyklus (SAM-Zyklus) unterhält.
Möglich ist, gegebenenfalls nach entsprechender Modifikation, auch
eine 7-Methylxanthosin-Nukleosidase-Aktivität der ADN selbst, die
die Koffeinbiosynthese direkt unterstützt.
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Die
als Reaktionsprodukt der ADN resultierenden Zytokininbasen sind
hormonell aktiver als die Zytokininriboside und zeigen darüber
hinaus andere Transport- und Abbaueigenschaften. Durch Einsatz der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann daher beispielsweise
die endogene Zytokininaktivität durch Deribosylierung von
Zytokininnukleosiden gesteigert werden. Darüber hinaus
kann die Zytokininaktivität auch durch gezielte Hemmung
der ADN-Expression, beispielsweise mittels Antisinn-Nukleinsäuren und/oder
RNA-Interferenz, vermindert werden. Bei auf solche Art und Weise
im Stoffwechsel modulierten Pflanzen werden auch veränderte
morphologische Eigenschaften erwartet, beispielsweise eine verminderte
Wurzelbildung bei gleichzeitig vermehrter Sprossbildung im Falle
gesteigerter Zytokininaktivität (d. h. erhöhter
ADN-Expression) oder vermehrte Wurzelbildung bei vermindertem Sprosswachstum im
Falle erniedrigter Zytokininaktivität. Auch eine Beeinflussung
des Ertrags von Kulturpflanzen wie beispielsweise Reis wird dadurch
möglich (s. z. B. Ashikari et al., 2005, Cytokinin
oxidase regulates rice grain production, Science 309: 741–745).
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Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ADN
kann selbstverständlich auch dazu eingesetzt werden, als
Ausgangsmaterial zur Herstellung bzw. zum "Moleküldesign"
von weiteren ADN-kodierenden Nukleinsäuren bzw. von weiteren
ADNs zu dienen. Dadurch ist es beispielsweise auch möglich,
ADNs mit einem anderem Substratspektrum und/oder anderen physikalisch-chemischen
Eigenschaften, wie beispielsweise hinsichtlich Hitzeresistenz, pH-Optimum,
km-Wert, Umsatzrate etc., herzustellen. Dem Fachmann sind die hierfür
geeigneten Verfahren bekannt.
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Des
weiteren kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure
bzw. ADN, oder eine entsprechend modifizierte Nukleinsäure/ADN,
auch vorteilhaft bei Tieren und beim Menschen eingesetzt werden,
etwa entsprechend der Weise, wie dies für eine Purinnukleosidphosphorylase
(PNP) in der
EP 0715523
B1 sowie in
Gennett et al. (2003), Designer Gene
Therapy Using an Escherichia coli Purine Nucleoside Phosphorylase/Prodrug
System, Chemistry & Biology
10: 1173–1181, deren jeweilige Offenbarung hier durch
Inbezugnahme vollständig aufgenommen wird, beschrieben
ist. Die PNP wird dort für ein Gentherapieverfahren eingesetzt.
Dabei wird beispielsweise ein Nukleosid-Propharmakon ("Prodrug"),
z. B. ein modifiziertes Nukleosid mit einer Base, die bei Freisetzung
aus dem Nukleosid toxisch wirkt, eingesetzt, das von der menschlichen
PNP nicht umgesetzt wird, während die in menschliche Tumorzellen
eingeführte E.-coli-PNP das Nukleosid spaltet und das Toxin
freisetzt. Entsprechend kann auch die erfindungsgemäße
ADN, oder eine beispielsweise im Wege des Moleküldesigns
bzw. "Redesigns" modifizierte ADN, eingesetzt werden, um gezielt
ein Toxin aus einem Nukleosid-Propharmakon, beispielsweise in Tumorzellen,
freizusetzen und entsprechende Zusammensetzungen und Medikamente
herzustellen.
-
In
einem weiteren Aspekt handelt es sich bei der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure um eine isolierte oder synthetisierte Nukleinsäure,
die für eine pflanzliche Adenosin-Nukleosidase kodiert,
und
- a) für ein Polypeptid kodiert,
das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 15 umfasst, oder
- b) für ein Polypeptid kodiert, das ein Polypeptid umfasst,
das zu dem Polypeptid mit der SEQ ID NO: 15 homolog ist, oder
- c) eine Nukleotidsequenz umfaßt, die unter stringenten
Bedingungen mit einer Nukleotidsequenz hybridisiert, die komplementär
ist zu der Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert,
das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 15 umfasst.
-
Bevorzugt
handelt es sich dabei um eine isolierte oder synthetisierte Nukleinsäure,
die für eine pflanzliche Adenosin-Nukleosidase kodiert,
und
- a) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ
ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 oder ein Fragment davon umfaßt,
oder
- b) für ein Polypeptid mit der SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,
10, 12 oder 14 kodiert, oder
- c) für ein zu dem Polypeptid mit der SEQ ID NO: 2,
4, 6, 8, 10, 12 oder 14 homologes Polypeptid kodiert, oder
- d) eine Nukleotidsequenz umfaßt, die mit einer zu der
Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7,
9, 11 oder 13 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten
Bedingungen hybridisiert.
-
In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte oder
synthetisierte Nukleinsäure, die eine erfindungsgemäße
Nukleinsäure enthält, wobei die Nukleotidsequenz
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure jedoch
von mindestens einer nichtkodierenden Nukleotidsequenz unterbrochen
ist, die in einer lebenden Pflanzenzelle aus der isolierten oder synthetisierten
Nukleinsäure herausgeschnitten würde. Bei einer
solchen nichtkodierenden Nukleotidsequenz kann es sich beispielsweise
um ein Intron handeln.
-
In
einer bevorzugten Ausführungform kodiert die isolierte
oder synthetisierte Nukleinsäure für eine Adenosin-Nukleosidase
aus dem Laubmoos Physcomitrella patens, Arabidopsis thalina, Oryza
sativa oder Zea mays.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße
isolierte oder synthetisierte Nukleinsäure zu mindestens
45%, bevorzugt mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens
70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens
90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens
99% identisch zur Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13.
-
In
einer weiteren Ausführungsform enthält die isolierte
oder synthetisierte Nukleinsäure die erfindungsgemäße
isolierte oder synthetisierte Nukleinsäure in Antisinnrichtung.
Es kann sich hierbei um DNA und/oder RNA bzw. eine Hybridsequenz
handeln und die Nukleinsäure kann einzelsträngig
oder doppelsträngig vorliegen. Mit Hilfe dieser Ausführungsform
der Erfindung ist beispielsweise die gezielte Verminderung bzw.
Ausschaltung einer endogenen Adenosin-Nukleosidase-Aktivität
möglich.
-
In
einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine
isolierte oder synthetisierte Adenosin-Nukleosidase, wobei die Adenosin-Nukleosidase
- a) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ
ID NO: 15 oder ein Fragment davon mit Adenosin-Nukleosidase-Aktivität
umfaßt, oder
- b) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ
ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14 oder ein Fragment davon mit Adenosin-Nukleosidase-Aktivität
umfaßt, oder
- c) eine zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 15 oder zu dem Fragment davon mit
Adenosin-Nukleosidase-Aktivität homologe Aminosäuresequenz
umfaßt.
-
Die
erfindungsgemäße Adenosin-Nukleosidase kann beispielsweise
als Zusatz bei der Herstellung von Lebens- oder Genussmitteln verwendet werden,
die gegenüber Lebens- oder Genussmitteln, die ohne Einsatz
einer Adenosin-Nukleosidase hergestellt wurden, einen niedrigeren
Puringehalt aufweisen. Solch ein Lebens- bzw. Genussmittel ist beispielsweise
Bier. Zur Bierproduktion verwendete Maische enthält oft
hohe Mengen von Purin-Nukleosiden, was beispielsweise aus ernährungs-physiologischer
Sicht unerwünscht ist. Durch Zugabe der erfindungsgemäßen
ADN erfolgt eine Umwandlung zu Purinbasen, die beim Gärungsprozess
durch die anwesenden Bierhefen leichter metabolisiert werden können.
Durch die vorliegende Erfindung steht eine pflanzliche ADN zur Verfügung,
so dass auf den Einsatz von ADNs mikrobiellen Ursprungs verzichtet werden
kann.
-
Bevorzugt
ist die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen
isolierten oder synthetisierten Adenosin-Nukleosidase zu mindestens
45%, bevorzugt mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens
70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens
90%, mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens
99% identisch zur Aminosäuresequenz gemäß SEQ
ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 15.
-
Die
Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt auch Fragmente einer
erfindungsgemäßen Nukleinsäure, wobei
das Fragment mindestens 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25 oder 30, 35,
40, 45, 50, 60, 80, oder 100 Nukleotide umfasst.
-
In
weiteren Aspekten betrifft die Erfindung auch ein rekombinantes
DNA-Molekül, ein chimäres Gen, ein DNA-Konstrukt
und einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor, das/der
eine erfindungsgemäße isolierte oder synthetisierte
Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes
Fragment davon enthält.
-
Des
weiteren betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung,
die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure,
eine erfindungsgemäße isolierte oder synthetisierte
Adenosin-Nukleosidase, ein erfindungsgemäßes Fragment,
ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül,
ein erfindungsgemäßes chimäres Gen, ein
erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt und/oder einen
erfindungsgemäßen Vektor umfasst. In einer bevorzugten
Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ferner ein Nukleosid,
das von der erfindungsgemäßen Adenosin-Nukleosidase
gespalten wird, wobei das Nukleosid eine Base enthält,
die bei Freisetzung zytotoxisch wirkt. Diese Zusammensetzung kann
beispielsweise zur Tötung von Säugetierzellen,
z. B. menschlichen Tumorzellen, verwendet werden, indem die Zusammensetzung
in einer solchen Menge in eine Zielzelle eingebracht wird, dass
die Zielzelle bei Freisetzung der zytotoxischen Base durch die erfindungsgemäße Adenosin-Nukleosidase
abgetötet wird.
-
Darüber
hinaus betrifft die Erfindung auch eine transgene Wirtszelle oder
einen transgenen Protoplasten, die/der eine erfindungsgemäße
isolierte oder synthetisierte Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes
Fragment umfasst.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform ist die transgene Wirtszelle
eine Pflanzenzelle oder der transgene Protoplast stammt von einer
Pflanzenzelle, d. h. ist von einer Pflanzenzelle erhalten worden.
-
In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch eine transgene
Pflanze, die eine erfindungsgemäße isolierte oder
synthetisierte Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes
Fragment umfasst. Darüber hinaus betrifft die Erfindung
auch Nachkommen sowie Vermehrungsmaterial, insbesondere Samen, und
Teile einer transgenen Pflanze, die eine erfindungsgemäße
isolierte oder synthetisierte Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Fragment
enthalten.
-
In
noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die
Schritte des Einführens einer erfindungsgemäßen
isolierten oder synthetisierten Nukleinsäure oder eines
erfindungsgemäßen Fragments in eine Pflanzenzelle oder
einen Protoplasten und des Heranziehens einer Pflanze daraus. Dem
Fachmann sind zahlreiche Möglichkeiten bekannt, wie eine
Nukleinsäure bzw. Fragmente davon in eine Pflanzenzelle
eingeführt werden kann. Beispielsweise kann hierzu ein
erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt bzw. ein erfindungsgemäßer
Vektor eingesetzt werden. Auch das Heranziehen einer Pflanze aus
einer Pflanzenzelle ist dem Fachmann ohne Weiteres geläufig.
-
In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Veränderung
des Stoffwechsels einer Pflanze, wobei eine Pflanzenzelle oder ein Pflanzenprotoplast
mit einer erfindungsgemäßen isolierten oder synthetisierten
Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen
Fragment transfiziert wird und eine transgene Pflanze aus der Pflanzenzelle
oder dem Pflanzenprotoplasten herangezogen wird. Verfahren der Transfektion
einer Pflanzenzelle sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise das
Einführen von Fremd-DNA mit Hilfe des Ti-Plasmids von Agrobacterium
tumefaciens.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die
Pflanzenzelle oder der Pflanzenprotoplast mit einer erfindungsgemäßen
isolierten oder synthetisierten Nukleinsäure oder einem
erfindungsgemäßen Fragment transfiziert und es
wird eine transgene Pflanze aus der Pflanzenzelle oder dem Pflanzenprotoplast
herangezogen, die gegenüber einer/einem aus einer ansonsten
gleichen, aber nicht transfizierten Pflanzenzelle oder Protoplasten herangezogenen
Pflanze einen erhöhten Gehalt an Purinen wie beispielsweise
Purinbasen und Purinalkaloiden aufweist. Die Nukleinsäure
wird hierzu bevorzugt in normaler Orientierung, d. h. nicht in Antisinn-Orientierung,
in die Pflanzenzelle eingebracht, um die Expression der Nukleinsäure
in der Pflanzenzelle zu steigern. Besonders bevorzugt weist die
auf diese Weise hergestellte transgene Pflanze einen erhöhten
Gehalt an Koffein oder Theobromin auf. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform des Verfahrens weist die so hergestellte
transgene Pflanze gegenüber einer/einem aus einer ansonsten
gleichen, aber nicht transfizierten Pflanzenzelle oder Protoplasten herangezogenen
Pflanze zusätzlich oder alternativ einen erhöhten
Gehalt an Zytokininen, z. B. Zytokininbasen, auf.
-
In
einem weiteren Aspekt wird die Pflanzenzelle oder der Pflanzenprotoplast
mit einer in Antisinnrichtung orientierten erfindungsgemäßen
isolierten oder synthetisierten Nukleinsäure oder einem
in Antisinnrichtung orientierten erfindungsgemäßen Fragment
davon transfiziert, und eine transgene Pflanze aus der Pflanzenzelle
oder dem Pflanzenprotoplast herangezogen, die gegenüber
einer aus einer/einem ansonsten gleichen, aber nicht transfizierten
Pflanzenzelle oder Protoplasten herangezogenen Pflanze einen verminderten
Gehalt an Purinen, beispielsweise Purinbasen und/oder Purinalkaloiden, aufweist.
Bevorzugt weist die transgene Pflanze einen verminderten Gehalt
an Koffein oder Theobromin auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des
Verfahrens weist die so hergestellte transgene Pflanze gegenüber
einer/einem aus einer ansonsten gleichen, aber nicht transfizierten
Pflanzenzelle oder Protoplasten herangezogenen Pflanze zusätzlich oder
alternativ einen verminderten Gehalt an Zytokininen, z. B. Zytokininbasen,
auf.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch verschiedene Verwendungen der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines
Fragments davon. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure
oder ein Fragment davon kann z. B. als Sonde zur Auffindung und/oder Isolierung
von weiteren für pflanzliche Adenosin-Nukleosidasen kodierende
Nukleinsäuren, als positiver oder negativer Selektionsmarker
oder zur Herstellung einer Adenosin-Nukleosidase verwendet werden.
Eine mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure
hergestellte Adenosin-Nukleosidase oder die erfindungsgemäße
Adenosin-Nukleosidase können wiederum zur Herstellung von
Bier oder anderen Lebens- und/oder Genussmitteln mit vermindertem
Puringehalt verwendet werden.
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen
isolierten oder synthetisierten Nukleinsäure und/oder eines
erfindungsgemäßen Fragments davon und/oder einer
erfindungsgemäßen isolierten oder synthetisierten
Adenosin-Nukleosidase und/oder einer erfindungsgemäßen
Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels, z. B. eines
Antikrebsmittels.
-
Die
Erfindung wird im Folgenden anhand der 1 und eines
Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Es zeigt:
-
1 Umsatz
von Tritium-markiertem [2-3H]Adenosin in
Protein-Rohextrakten von E. coli SØ312, dargestellt anhand
von Radio-HPLC-Profilen. A) Kontroll-Ansatz ohne Protein. B) Proteinextrakt
aus pPCRBlunt-TOPO-Kontrollfragment exprimierenden Bakterien. Adenosin
wird durch endogene Adenosindeaminase (ADA) zu Inosin umgesetzt.
C) Proteinextrakt aus pPCRBlunt-TOPO-PpADN1 exprimierenden Bakterien.
Zusätzlich zur ADA-Aktivität ist auch ADN-Aktivität
feststellbar. Ade = Adenin, Ado = Adenosin, Ino = Inosin.
-
Es
wurde eine cDNA aus dem Laubmoos Physcomitrella Patents isoliert,
die für eine Adenosin-Nukleosidase (ADN) kodiert. Nach
Expression der Nukleinsäuresequenz in einer E.-coli-Mutante wurde
rekombinantes Protein gewonnen und die Funktionalität des
ADN-Genproduktes durch In-vitro-Enzymtests unter Verwendung radioaktiver
Substrate untersucht.
-
1. ADN-Enzymaktivität
-
1.1 Nachweis von In-vivo-Aktivität
in Physcomitrella und Arabidopsis thaliana
-
Unter
Standardbedingungen kultivierte Physcomitrella- und Arabidopsis-Pflanzen
wurden für die In-vivo-Markierungsexperimente verwendet
(vgl. Schwartzenberg et al. 2003, Cytokinin metabolism in Physcomitrella
patens – differences and similarities to higher plants.
Plant Growth Regulation 39: 99–106; Koncz
et al. 1992, Methods in Arabidopsis research. World Scientific
Publishing, Singapur). Die Fütterungsversuche wurden in
Anlehnung an Schwartzenberg et al. (2003), s. o.,
durchgeführt. Als Substrat wurde den Versuchsansätzen
Tritium-markiertes Isopentenyladenosin (Cytokininribosid) zugeführt.
Anhand der Konversion des Ribosids zur Base Isopentenyladenin wurde
ADN-Aktivität in beiden Pflanzen nachgewiesen.
-
1.2 In-vitro-Nachweis von ADN-Aktivität
in Gesamtproteinextrakten von Physcomitrella
-
Die
Methoden zur Extraktion und zum Nachweis von Adenosin-Nukleosidase
im Extrakt aus Physcomitrella wurden in Anlehnung an Rolle
und Chism (1989), Kinetic comparison of cytokinin nucleosidase activity
isolated from normally ripening and mutant tomato varieties, Plant
Physiol. 91: 148–150, durchgeführt. Pflanzengewebe
wurde mit flüssigem Stickstoff zermörsert und
in Extraktionspuffer aufgenommen (200 mM Tris/HCl, pH 7.5; 20 mM
MgCl2; 2 mM Dithiothreitol). Nach einer
15-minütigen Inkubation auf Eis wurde der Extrakt zentrifugiert
(15000 g, 20 min, 4°C) und der Überstand über
Glasfaserfilter filtriert. Mittels Ammoniumsulfatzugabe bis zur
Sättigung erfolgte die Fällung der Proteine im
gereinigten Überstand. Die durch eine Zentrifugation (15000
g, 30 min, 4°C) pelletierten Proteine wurden in Reaktionspuffer
aufgenommen (50 mM Tris/HCl; 100 mM KCl; 0,5 mM Dithiothreitol)
und anschließend über NAP5-Säulen (Amersham)
entsalzt. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die Methode
von Bradford (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation
of microgram quantities of Protein utilizing the principle of Protein-dye
binding, Analytical Biochemistry 72: 248–254,
verwand. Im Enzymassay wurden ca. 5 μg Proteinextrakt in
einem Inkubationsvolumen von 200 μl Reaktionspuffer eingesetzt.
Alle Inkubationen erfolgten bei 30°C über einen
Zeitraum von 24 Stunden. Als Substrat wurde Tritium-markiertes Adenosin
in einer Konzentration von 0,4 nM eingesetzt. Die Enzymassays wurden
im Anschluß mittels HPLC-Online-LSC analysiert (Laufmittel:
Acetonitril/Wasser-Gradient). Im Extrakt aus Physcomitrella wurde
anhand der Konversion von Adenosin zu Adenin eindeutig ADN-Aktivität
nachgewiesen.
-
2. In silico Recherchen
-
Unter
Verwendung der Aminosäuresequenz der Inosin-Uridin-Nukleosid-Hydrolase
aus Crithidia fasciculata (Zugriffsnummer Q27546) wurde eine Physcomitrella-cDNA-Datenbank (http://moss.nibb.ac.jp/)
durchsucht. Der EST mit der Bezeichnung "Contig3539" – bestehend
aus 1449 Basenpaaren – wurde als möglicher Kandidat
eines ADN-Gens selektiert. Ein offener Leserahmen (ORF) aus 333
Aminosäuren wurde identifiziert.
-
3. Identifizierung und funktionelle Überprüfung
eines ADN-Gens aus Physcomitrella
-
Zum
Erhalt des Volllängen-cDNA-Klons wurde eine pBlueskriptcDNA-Bank
(Schwartzenberg et al. 1998, Cloning and characterisation
of an adenosine kinase from Physcomitrella involved in cytokinin metabolism,
The Plant Journal 13: 249–257) verwendet, die
aus einer λZAPII-cDNA-Bank hergestellt wurde. Primer wurden
konstruiert, die der Amplifikation zweier überlappender
Teilfragmente dienten und den gesamten ORF des Contigs3539 umfassten:
- Primer für erstes Teilfragment:
Vorwärts: 5'_TATAGCGGCCGCATGGCGGTGCCTGAG_3'
Rückwärts: 5'_CTTCCCAGATCTTCCAAATCCTTCCC_3'
- Primer für zweites Teilfragment:
Vorwärts: 5'_ATCCGCCGGCGCGATCAGGTTTACAG_3'
Rückwärts:
5'_ATATATGGCGACCCTGAAGC-3'
-
Im
Anschluss an die PCR mit Pfu-DNA-Polymerase (Fermentas) erfolgte
ein Restriktionsverdau der Teilfragmente mit BglII, da diese im Überlappungsbereich
eine BglII-Schnittstelle besitzen. Durch die Ligation der verdauten
Fragmente mittels T4-DNA-Ligase (Fermentas) wurde der gesamte Volllängen-Klon
erhalten, der anschließend via PCR reamplifiziert wurde.
Zur Überprüfung des erhaltenen Fragmentes wurde
ein Verdau mit den Restriktionsenzymen PvuI und ScaI bzw. EcoRI
und SalI vorgenommen. Die Klonierung in den Vektor pCR4Blunt-TOPO
sowie die Transformation in E. coli erfolgte mit dem ZeroBluntTOPO-PCR-Cloning
Kit (Invitrogen). Positive Klone wurden über PCR und Restriktionsverdau
mit EcoRI und SalI/NotI identifiziert und anschließend
sequenziert (DNA Cloning Service, Hamburg). Der weiter untersuchte
cDNA-Klon erhielt die Bezeichnung PpADN1.
-
Zur Überprüfung
der Funktionalität des von PpADN1 kodierten Genproduktes
wurde die Purin-auxotrophe E.-coli-Mutante SØ312 (Jochimsen
et al. 1975, Location an the chromosome of Escherichia coli of genes
governing purine metabolism, Mol. Gen. Gene. 143: 85–91)
ausgewählt. Dieser Stamm weist eine Mutation im für
die Purinnukleosidphosphorylase kodierenden Gen (deoD) auf. Auf
Minimalmedium mit Adenosin als einziger Purinquelle und zugesetztem
Deoxycoformycin (DCF) zur Hemmung der Adenosin-Deaminase (Agarwal
R. P., 1985, Adenosine Deaminase – Measurement of activity
and use of inhibitors. in: Paton D. M. (ed.) Methods in pharmacology – Bd.
6: Methods used in adenosine research: 109–125)
kann dieser Stamm nicht wachsen. Das Konstrukt pCR4Blunt-TOPO_PpADN1
wurde in den Stamm SØ312 transformiert und sowohl in vivo
als auch in vitro auf ADN-Aktivität untersucht.
-
Wachstumstest (in vivo):
-
Kultivierung
von SØ312 transformiert mit pCR4Blunt-TOPO_PpADN1 bzw. pCR4Blunt-TOPO_Kontrollfragment
auf M9-Minimalmedium (Sambrook et al. 1989, Molecular cloning – a laboratory
manual. Cold Spring Habour Press, New York) mit Adenosin
als einziger Purinquelle und Deoxycoformycin zur Hemmung der Deaminase.
Lediglich der PpADN1 exprimierende Stamm zeigte ein eindeutig positives
Wachstumsverhalten.
-
In-vitro-Enzymassay mit den Substraten
Adenosin und Isopentenyladenosin:
-
Die
Gewinnung des Gesamtproteinrohextraktes aus pCR4Blunt-TOPO_PpADN1
exprimierenden SØ312-Bakterien erfolgte mittels Ammoniumsulfatfällung
und anschließender Entsalzung (NAP5-Säulen). Der
anschließende Enzymassay wurde wie in 1.2 beschrieben durchgeführt.
Tritium-markiertes Adenosin und Isopentenyladenosin wurden als Substrate
eingesetzt. Versuchsansätze mit PpADN1 zeigten eindeutig
eine Umsetzung von Adenosin zu Adenin bzw. Isopentenyladenosin zu Isopentenyladenin
(s. 1). Innerhalb von 4 Std. Inkubation bei 30°C
wurden durch rekombinante ADN beispielsweise 50% des zugefügten
Tritium-markierten Adenosins zu Adenin umgesetzt. Das Tritium-markierte
Zytokininribosid Isopentenyladenosin wurde zu 23% durch die ADN
hydrolysiert und in physiologisch aktive Zytokininbasen überführt.
Die ADN weist somit auch Zytokininribosid-Nukleosidase-Aktivität
auf.
-
4. Identifikation weiterer
pflanzlicher ADNs
-
Mit
Hilfe der aus Physcomitrella stammenden ADN-Aminosäuresequenz
(PpADN1, s. SEQ ID NO: 2) war es möglich, weitere ADN-Sequenzen
in Nukleinsäuredatenbanken für Samenpflanzen (Arabidopsis
thaliana, Oryza sativa und Zea mays) zu identifizieren. Entsprechende
Nukleotidsequenzen sind in den Sequenzen mit den Sequenznummern SEQ
ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 und 13, die entsprechenden Aminosäuresequenzen
in den Sequenzen mit den Sequenznummern SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10,
12 und 14 angegeben. Eine Konsensussequenz für die Sequenzen
mit der SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 14 ist in SEQ ID NO: 15
angegeben. Xaa bedeutet hier eine beliebige Aminosäure.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 6600091 [0003, 0003]
- - US 6229066 [0003, 0003]
- - EP 0825261 B1 [0004]
- - EP 0753572 B1 [0004]
- - EP 0715523 B1 [0048]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - S.F. Altschul
et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J. Mol. Biol.
215: 403–410 [0018]
- - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ [0018]
- - Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid substitution matrices
from Protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915–10919,
1992 [0018]
- - S. F. Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search
tool, J. Mol. Biol. 215: 403–410 [0018]
- - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ [0018]
- - Henikoff, S., und Henikoff, J., Amino acid substitution matrices
from Protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915–10919,
1992 [0018]
- - http://www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html [0018]
- - Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl. 2001) [0019]
- - Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl. 2001) [0021]
- - Stasolla et al. (2003), Purine and pyrimidine nucleotide metabolism
in higher plants, J. Plant Physiol. 160: 1271–1295 [0042]
- - Wasternack C. (1982) Metabolism of pyrimidines and purines.
in: B. Parthier, D. Boutler (Hrsg.): Enzyclopedia of plant physiology,
New Series, Band 14B: 263–301, Springer Verlag, Berlin [0042]
- - Schaff, D. A., The adenine phophoribosyltransferase (APRT)
selectable marker system, Plant Science 101: 3–9 [0043]
- - Koshiishi et al., 2001, A new caffeine biosynthetic pathway
in tea leaves: utilisation of adenosine released from the S-adenosyl-L-methionine
cycle, FERS Lett. 499, 50–54 [0045]
- - Ashikari et al., 2005, Cytokinin oxidase regulates rice grain
production, Science 309: 741–745 [0046]
- - Gennett et al. (2003), Designer Gene Therapy Using an Escherichia
coli Purine Nucleoside Phosphorylase/Prodrug System, Chemistry & Biology 10: 1173–1181 [0048]
- - Schwartzenberg et al. 2003, Cytokinin metabolism in Physcomitrella
patens – differences and similarities to higher plants.
Plant Growth Regulation 39: 99–106 [0073]
- - Koncz et al. 1992, Methods in Arabidopsis research [0073]
- - Schwartzenberg et al. (2003) [0073]
- - Rolle und Chism (1989), Kinetic comparison of cytokinin nucleosidase
activity isolated from normally ripening and mutant tomato varieties,
Plant Physiol. 91: 148–150 [0074]
- - Bradford (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation
of microgram quantities of Protein utilizing the principle of Protein-dye
binding, Analytical Biochemistry 72: 248–254 [0074]
- - http://moss.nibb.ac.jp/ [0075]
- - Schwartzenberg et al. 1998, Cloning and characterisation of
an adenosine kinase from Physcomitrella involved in cytokinin metabolism,
The Plant Journal 13: 249–257 [0076]
- - Jochimsen et al. 1975, Location an the chromosome of Escherichia
coli of genes governing purine metabolism, Mol. Gen. Gene. 143:
85–91 [0078]
- - Agarwal R. P., 1985, Adenosine Deaminase – Measurement
of activity and use of inhibitors. in: Paton D. M. (ed.) Methods
in pharmacology – Bd. 6: Methods used in adenosine research:
109–125 [0078]
- - Sambrook et al. 1989, Molecular cloning – a laboratory
manual. Cold Spring Habour Press, New York [0079]
