JP2647684B2 - トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 - Google Patents
トリグリセリドの分析用試薬および分析方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、少なくともリパーゼおよびモノグリセリド
リパーゼを用いてなるトリグリセリドの改良分析、特に
血清中のトリグリセリドの迅速な定量分析用の試薬およ
びその分析方法に関する。
リパーゼを用いてなるトリグリセリドの改良分析、特に
血清中のトリグリセリドの迅速な定量分析用の試薬およ
びその分析方法に関する。
＜従来の技術＞ 従来、トリグリセリドを含有する検体、特に生体内体
液試料中に存在するトリグリセリドの分析では、通常リ
パーゼでトリグリセリドをジグリセリド、さらにモノグ
リセリドとなし、最終的にグリセロールと脂肪酸にまで
加水分解し、トリグリセリドから遊離されるグリセロー
ルまたは脂肪酸を酵素的な反応または化学的な反応を利
用して定量することにより行われており、例えば簡便な
手段として、電極を用いる方法や指示薬組成物を用いる
方法が利用されている。
液試料中に存在するトリグリセリドの分析では、通常リ
パーゼでトリグリセリドをジグリセリド、さらにモノグ
リセリドとなし、最終的にグリセロールと脂肪酸にまで
加水分解し、トリグリセリドから遊離されるグリセロー
ルまたは脂肪酸を酵素的な反応または化学的な反応を利
用して定量することにより行われており、例えば簡便な
手段として、電極を用いる方法や指示薬組成物を用いる
方法が利用されている。
このような血清中トリグリセリドを良好に分析するた
めに、プロテアーゼまたはリポプロテインリパーゼ等の
分解酵素を添加してトリグリセリドを結合蛋白から遊離
して分析する方法が行われている。例えば、リパーゼと
プロテアーゼの併用（特公昭54−9518号、特願昭53−11
4493号）が挙げられる。またトリグリセリドからグリセ
ロールへの加水分解反応を促進せしめる手段としては、
各種性質の異なるリパーゼ等を組合せたり、被検液に界
面活性剤を添加したり、化学的薬剤を添加する方法が行
われている。例えば、各種性質の異なるリパーゼの組合
せによる分解（特開昭52−25694号、特公昭56−29、特
公昭57−28276号）、リパーゼとコレステロールエステ
ラーゼとの組合せによる分解（特公昭56−46799号）、
リパーゼと界面活性剤の組合せによる分解（特公昭57−
39158号）、リパーゼと界面活性剤、フェノール誘導体
若しくはアニリン誘導体の組合せによる分解（特公昭58
−5677号）、リパーゼとブタ肝臓由来のカルボキシルエ
ステラーゼおよびアルカリ金属またはアルカリ土類金属
のアルキル硫酸塩の組合せによる分解（特開昭49−6449
5号）、リパーゼと膵リパーゼおよび胆汁酸塩の組合せ
による分解（特開昭52−11987号）等が知られている。
めに、プロテアーゼまたはリポプロテインリパーゼ等の
分解酵素を添加してトリグリセリドを結合蛋白から遊離
して分析する方法が行われている。例えば、リパーゼと
プロテアーゼの併用（特公昭54−9518号、特願昭53−11
4493号）が挙げられる。またトリグリセリドからグリセ
ロールへの加水分解反応を促進せしめる手段としては、
各種性質の異なるリパーゼ等を組合せたり、被検液に界
面活性剤を添加したり、化学的薬剤を添加する方法が行
われている。例えば、各種性質の異なるリパーゼの組合
せによる分解（特開昭52−25694号、特公昭56−29、特
公昭57−28276号）、リパーゼとコレステロールエステ
ラーゼとの組合せによる分解（特公昭56−46799号）、
リパーゼと界面活性剤の組合せによる分解（特公昭57−
39158号）、リパーゼと界面活性剤、フェノール誘導体
若しくはアニリン誘導体の組合せによる分解（特公昭58
−5677号）、リパーゼとブタ肝臓由来のカルボキシルエ
ステラーゼおよびアルカリ金属またはアルカリ土類金属
のアルキル硫酸塩の組合せによる分解（特開昭49−6449
5号）、リパーゼと膵リパーゼおよび胆汁酸塩の組合せ
による分解（特開昭52−11987号）等が知られている。
＜発明が解決しようとする問題点＞ このように、従来から用いられている分析方法は、ト
リグリセリドを他の結合蛋白から分離せしめたり、諸手
段によってトリグリセリドからグリセロールへの加水分
解反応を促進せしめることにより行われてきた。この場
合用いられる殆んどのリパーゼはトリグリセリドをグリ
セロールにまで分解する作用を有するが、しかしながら
これらリパーゼは、トリグリセリドが加水分解されて生
成されるβ位モノグリセリドがに対しては作用が弱く、
従ってまたこのモノグリセリドからグリセロールへの分
解作用が弱く分解速度が緩やかなために、分析に時間を
要していた。そのため、モノグリセリドからグリセロー
ルへの分解反応の促進による分析時間の短縮が望まれて
いた。
リグリセリドを他の結合蛋白から分離せしめたり、諸手
段によってトリグリセリドからグリセロールへの加水分
解反応を促進せしめることにより行われてきた。この場
合用いられる殆んどのリパーゼはトリグリセリドをグリ
セロールにまで分解する作用を有するが、しかしながら
これらリパーゼは、トリグリセリドが加水分解されて生
成されるβ位モノグリセリドがに対しては作用が弱く、
従ってまたこのモノグリセリドからグリセロールへの分
解作用が弱く分解速度が緩やかなために、分析に時間を
要していた。そのため、モノグリセリドからグリセロー
ルへの分解反応の促進による分析時間の短縮が望まれて
いた。
＜問題点を解決するための手段＞ 本発明者らは、先にモノグリセリドからグリセロール
の加水分解反応を触媒するモノグリセリドリパーゼ生産
菌を、鹿児島県霧島温泉の泉源周辺の土壌より分解し、
バチルス属に属する菌と同定したＨ−165株を得、これ
を培養してモノグリセリドリパーゼを得た（特願昭62−
80299号）。このモノグリセリドリパーゼは、従来のリ
パーゼがモノグリセリドに対して弱く作用することに比
較して、α位またはβ位モノグリセリドに非常に強く作
用するモノグリセリドリパーゼであることを知った。か
つ本酵素はpH5付近、至適温度が75℃で最大の活性を示
し、等電点が4.6、分子量が27,000と小さく、さらに熱
安定性が70℃では殆んど失活せず90℃で処理しても20％
活性が残るという耐熱性の優れたモノグリセリドリパー
ゼであることを知った。
の加水分解反応を触媒するモノグリセリドリパーゼ生産
菌を、鹿児島県霧島温泉の泉源周辺の土壌より分解し、
バチルス属に属する菌と同定したＨ−165株を得、これ
を培養してモノグリセリドリパーゼを得た（特願昭62−
80299号）。このモノグリセリドリパーゼは、従来のリ
パーゼがモノグリセリドに対して弱く作用することに比
較して、α位またはβ位モノグリセリドに非常に強く作
用するモノグリセリドリパーゼであることを知った。か
つ本酵素はpH5付近、至適温度が75℃で最大の活性を示
し、等電点が4.6、分子量が27,000と小さく、さらに熱
安定性が70℃では殆んど失活せず90℃で処理しても20％
活性が残るという耐熱性の優れたモノグリセリドリパー
ゼであることを知った。
さらに本発明者らは、鋭意研究の結果、このモノグリ
セリドリパーゼとリパーゼとを併合した試薬を用いるこ
とにより、被検液中のトリグリセリドを分析するに当
り、トリグリセリドがリパーゼによってジグリセリドさ
らにモノグリセリドと加水分解されて生成されるモノグ
リセリドに、このモノグリセリドリパーゼが特異的に強
く作用し反応を促進するため、結果的にトリグリセリド
からグリセロールへの加水分解反応を促進することとな
り、トリグリセリドを含有する検体のトリグリセリドの
分析時間を短縮せしめることを知った。
セリドリパーゼとリパーゼとを併合した試薬を用いるこ
とにより、被検液中のトリグリセリドを分析するに当
り、トリグリセリドがリパーゼによってジグリセリドさ
らにモノグリセリドと加水分解されて生成されるモノグ
リセリドに、このモノグリセリドリパーゼが特異的に強
く作用し反応を促進するため、結果的にトリグリセリド
からグリセロールへの加水分解反応を促進することとな
り、トリグリセリドを含有する検体のトリグリセリドの
分析時間を短縮せしめることを知った。
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、
少なくとも、リパーゼおよびモノグリセリドリパーゼを
含有することを特徴とするトリグリセリド分析用試薬で
あり、また少なくとも、リパーゼ、モノグリセリドリパ
ーゼおよびグリセロールを定量するための試薬を含有す
ることを特徴とするトリグリセリド分析用試薬、および
トリグリセリドを含有する被検液にリパーゼを作用せし
めて遊離するグリセロールまたは脂肪酸を測定する方法
において、少なくともモノグリセリドリパーゼを含有す
る系を作用せしめ、次いでグリセロールまたは脂肪酸を
定量する反応において消費される成分または生成される
成分を測定することを特徴とするトリグリセリドの分析
方法に関するものである。
少なくとも、リパーゼおよびモノグリセリドリパーゼを
含有することを特徴とするトリグリセリド分析用試薬で
あり、また少なくとも、リパーゼ、モノグリセリドリパ
ーゼおよびグリセロールを定量するための試薬を含有す
ることを特徴とするトリグリセリド分析用試薬、および
トリグリセリドを含有する被検液にリパーゼを作用せし
めて遊離するグリセロールまたは脂肪酸を測定する方法
において、少なくともモノグリセリドリパーゼを含有す
る系を作用せしめ、次いでグリセロールまたは脂肪酸を
定量する反応において消費される成分または生成される
成分を測定することを特徴とするトリグリセリドの分析
方法に関するものである。
まず、本発明に用いられるモノグリセリドリパーゼと
しては、少なくともβ位モノグリセリドからグリセロー
ルと脂肪酸を生成する反応を強く触媒し、トリグリセリ
ドやジグリセリドに対しては作用しないかまたは作用し
ても極めて弱い作用を示すものであれば何ら限定される
ものではなく、例えばバチルス ステアロサーモフィラ
スＨ−165株（FERM BP−1673）を培地に培養し、その
目的とするモノグリセリドリパーゼを得ればよい。この
菌株に限らず、モノグリセリドに強く作用するモノグリ
セリドリパーゼを生産する菌はすべて本発明においては
使用することができる。以下、バチルス ステアロサー
モフィラスＨ−165株（FERM BP−1673）を生産菌とし
て使用して得たモノグリセリドリパーゼについて説明す
る。
しては、少なくともβ位モノグリセリドからグリセロー
ルと脂肪酸を生成する反応を強く触媒し、トリグリセリ
ドやジグリセリドに対しては作用しないかまたは作用し
ても極めて弱い作用を示すものであれば何ら限定される
ものではなく、例えばバチルス ステアロサーモフィラ
スＨ−165株（FERM BP−1673）を培地に培養し、その
目的とするモノグリセリドリパーゼを得ればよい。この
菌株に限らず、モノグリセリドに強く作用するモノグリ
セリドリパーゼを生産する菌はすべて本発明においては
使用することができる。以下、バチルス ステアロサー
モフィラスＨ−165株（FERM BP−1673）を生産菌とし
て使用して得たモノグリセリドリパーゼについて説明す
る。
（１）作用； モノグリセリド＋H2O→グリセロール＋脂肪酸 （モノグリセリドはα−またはβ−モノグリセリドのい
づれであってもよい） （２）分子量;27,000±2,700〔ポリビニルゲル（商品
名:TSK3000SW;東洋曹達社製）のカラムを用い、0.2MNaC
lを含む50mMリン酸緩衝液（pH6.5）を移動相とするゲル
濾過法により測定〕 （３）至適pH;後記の酵素活性測定法に従い、緩衝液と
してジメチルグルタル酸緩衝液（pH4〜７、第２図の−
●−）、トリス−塩酸緩衝液（pH7〜9.5、第２図の−△
−）を用いてモノラウリンと酵素とを10分間反応せしめ
た後、２分間煮沸して酵素活性を失活させ、反応を停止
せしめ、37℃に保温し、生成したグリセロールの量を酵
素的に測定した結果は、第２図の通りであって、至適pH
はpH5付近であった。
づれであってもよい） （２）分子量;27,000±2,700〔ポリビニルゲル（商品
名:TSK3000SW;東洋曹達社製）のカラムを用い、0.2MNaC
lを含む50mMリン酸緩衝液（pH6.5）を移動相とするゲル
濾過法により測定〕 （３）至適pH;後記の酵素活性測定法に従い、緩衝液と
してジメチルグルタル酸緩衝液（pH4〜７、第２図の−
●−）、トリス−塩酸緩衝液（pH7〜9.5、第２図の−△
−）を用いてモノラウリンと酵素とを10分間反応せしめ
た後、２分間煮沸して酵素活性を失活させ、反応を停止
せしめ、37℃に保温し、生成したグリセロールの量を酵
素的に測定した結果は、第２図の通りであって、至適pH
はpH5付近であった。
（４）至適温度；ピペス−水酸化ナトリウム（PIPES−N
aOH）緩衝液（pH7.3）を用い、後記の酵素活性測定法に
従い、第３図に示す各温度での反応後、煮沸して反応を
止め、生成したグリセロールの量を酵素的に測定した結
果は、第３図に示す通りであり、75℃の最大の活性を示
した。
aOH）緩衝液（pH7.3）を用い、後記の酵素活性測定法に
従い、第３図に示す各温度での反応後、煮沸して反応を
止め、生成したグリセロールの量を酵素的に測定した結
果は、第３図に示す通りであり、75℃の最大の活性を示
した。
（５）pH安定性；本酵素液（1.0U/ml）を、10mMのジメ
チルグルタル酸−NaOH緩衝液（pH4〜７、第４図の−○
−）、トリス−塩酸緩衝液（pH8〜９、第４図の−●
−）、グリシン−NaOH緩衝液（pH9〜10、第３図の−△
−）の各緩衝液で調製し、75℃で10分間処理した後、そ
の残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定して、
第４図の結果が得られ、酵素活性はpH7〜８の範囲で安
定であった。
チルグルタル酸−NaOH緩衝液（pH4〜７、第４図の−○
−）、トリス−塩酸緩衝液（pH8〜９、第４図の−●
−）、グリシン−NaOH緩衝液（pH9〜10、第３図の−△
−）の各緩衝液で調製し、75℃で10分間処理した後、そ
の残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定して、
第４図の結果が得られ、酵素活性はpH7〜８の範囲で安
定であった。
（６）熱安定性；本酵素液（1.0U/ml）を10mMトリス−
塩酸緩衝液（pH7.5）で調製し、第５図の各温度で10分
間加熱処理後その残存活性を後記の酵素活性測定法に従
って測定したところ、第５図の結果が得られ、酵素活性
は70℃まで安定であった。
塩酸緩衝液（pH7.5）で調製し、第５図の各温度で10分
間加熱処理後その残存活性を後記の酵素活性測定法に従
って測定したところ、第５図の結果が得られ、酵素活性
は70℃まで安定であった。
（７）等電点;pH4.6±0.4（キャリアアンフォライトを
用いる焦点電気泳動法により４℃、700Vの低電圧で40時
間通電した後、各画分の酵素活性を測定した） （８）基質特異性；後述の本酵素モノグリセリドリパー
ゼ酵素活性測定測定法に従った条件下において、本酵素
モノグリセリドリパーゼの基質特異性を調べた結果、第
１表に示す通り、α−モノラウリンに対して最大の活性
を示した。卵黄レシチン由来のジグリセリド、1,2−ジ
リノレイン、1,3−ジリノレインおよびトリオレインを
基質として用いた場合、本酵素モノグリセリドリパーゼ
の存在において該基質から加水分解されたグリセロール
は検出されなかった理由から、本酵素モノグリセリドリ
パーゼは基質としてジグリセリド、トリグリセリドには
作用しないものと判断された。さらに、本酵素モノグリ
セリドリパーゼのβ−モノグリセリドの基質に対する作
用について説明する。
用いる焦点電気泳動法により４℃、700Vの低電圧で40時
間通電した後、各画分の酵素活性を測定した） （８）基質特異性；後述の本酵素モノグリセリドリパー
ゼ酵素活性測定測定法に従った条件下において、本酵素
モノグリセリドリパーゼの基質特異性を調べた結果、第
１表に示す通り、α−モノラウリンに対して最大の活性
を示した。卵黄レシチン由来のジグリセリド、1,2−ジ
リノレイン、1,3−ジリノレインおよびトリオレインを
基質として用いた場合、本酵素モノグリセリドリパーゼ
の存在において該基質から加水分解されたグリセロール
は検出されなかった理由から、本酵素モノグリセリドリ
パーゼは基質としてジグリセリド、トリグリセリドには
作用しないものと判断された。さらに、本酵素モノグリ
セリドリパーゼのβ−モノグリセリドの基質に対する作
用について説明する。
基質としてα−リノレオイル−β−オレオイル−ジグ
リセリドを用い酵素作用によって、遊離される脂肪酸の
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による確認 ｉ）α−リノレオイル−β−オレオイル−ジグリセリド
0.5mg、非イオン性界面活性剤（トリトンＸ−100,シグ
マ社製）1.8mg、デオキシオール酸3.8mg、コリパーゼ20
単位、塩化カルシウム0.15mg、0.1M N−トリ（ヒドロキ
シメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸
（TAPS）−NaOH（pH8.3）200μの組成の反応液1.0ml
に膵由来リパーゼ50μを加え、37℃・10分間反応せし
めその後反応を停止し、この15μをHPLCに注入して下
記の条件にて分析した。
リセリドを用い酵素作用によって、遊離される脂肪酸の
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による確認 ｉ）α−リノレオイル−β−オレオイル−ジグリセリド
0.5mg、非イオン性界面活性剤（トリトンＸ−100,シグ
マ社製）1.8mg、デオキシオール酸3.8mg、コリパーゼ20
単位、塩化カルシウム0.15mg、0.1M N−トリ（ヒドロキ
シメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸
（TAPS）−NaOH（pH8.3）200μの組成の反応液1.0ml
に膵由来リパーゼ50μを加え、37℃・10分間反応せし
めその後反応を停止し、この15μをHPLCに注入して下
記の条件にて分析した。
カラム:Zorbox ODS（4.6mmφ×25cm） 溶媒：アセトニトリル:H2O（96:4） 検出：紫外部吸収 205nm 流速:1.2ml/min その結果、リノレン酸がリテンションタイム23分に検
出され、オレイン酸は検出されなかった。このα位に結
合したリノレン酸の検出結果から、α，β−ジグリセリ
ドの基質に対しては、膵リパーゼはα位にのみ作用し加
水分解するものと判明し、かつβ−オレオイル−モノグ
リセリドが生成されると判断した。
出され、オレイン酸は検出されなかった。このα位に結
合したリノレン酸の検出結果から、α，β−ジグリセリ
ドの基質に対しては、膵リパーゼはα位にのみ作用し加
水分解するものと判明し、かつβ−オレオイル−モノグ
リセリドが生成されると判断した。
ii）上記と同じ組成の反応液に本酵素モノグリセリドリ
パーゼ0.5単位を添加し同様の操作を行ない、遊離され
る脂肪酸をHPLCで検出した。その結果、リテンションタ
イム23分にリノレン酸が、31分にオレイン酸が確認され
た。その結果から、本酵素モノグリセリドリパーゼは、
膵リパーゼによってα，β−ジグリセリドから生成した
β−モノグリセリドに基質として作用し、β位に結合し
たリノレン酸を遊離することが判明した。かつこれによ
りα，β−ジグリセリドから遊離されたグリセロールを
検出した。
パーゼ0.5単位を添加し同様の操作を行ない、遊離され
る脂肪酸をHPLCで検出した。その結果、リテンションタ
イム23分にリノレン酸が、31分にオレイン酸が確認され
た。その結果から、本酵素モノグリセリドリパーゼは、
膵リパーゼによってα，β−ジグリセリドから生成した
β−モノグリセリドに基質として作用し、β位に結合し
たリノレン酸を遊離することが判明した。かつこれによ
りα，β−ジグリセリドから遊離されたグリセロールを
検出した。
基質としてα，β−ジグリセリドを用いる本酵素モノ
グリセリドリパーゼの基質特異性 ｉ）基質として下記のα，β−ジグリセリドについて膵
リパーゼおよび本酵素モノグリセリドリパーゼを用い
て、膵リパーゼによりα位を加水分解せしめ、生成され
たβ−モノグリセリドに本酵素モノグリセリドリパーゼ
を作用せしめて遊離されるグリセロールを分析した結
果、基質α−オレオイル−β−パルミトイル−ジグリセ
リド、α−パルミトイル−β−オレオイル−ジグリセリ
ド、α，β−ジリノレイルグリセリドについてすべてグ
リセロールが検出された。なお、膵リパーゼ単独使用の
場合は、グリセロールは検出されなかった。
グリセリドリパーゼの基質特異性 ｉ）基質として下記のα，β−ジグリセリドについて膵
リパーゼおよび本酵素モノグリセリドリパーゼを用い
て、膵リパーゼによりα位を加水分解せしめ、生成され
たβ−モノグリセリドに本酵素モノグリセリドリパーゼ
を作用せしめて遊離されるグリセロールを分析した結
果、基質α−オレオイル−β−パルミトイル−ジグリセ
リド、α−パルミトイル−β−オレオイル−ジグリセリ
ド、α，β−ジリノレイルグリセリドについてすべてグ
リセロールが検出された。なお、膵リパーゼ単独使用の
場合は、グリセロールは検出されなかった。
（９）界面活性剤、金属イオンの影響；第２表に示す通
り、トリトンＸ−100およびコール酸等の界面活性剤添
加では高濃度領域において活性阻害が見られる。Caイオ
ン、Mgイオン等の二価金属イオンの添加によっては影響
を受けない。
り、トリトンＸ−100およびコール酸等の界面活性剤添
加では高濃度領域において活性阻害が見られる。Caイオ
ン、Mgイオン等の二価金属イオンの添加によっては影響
を受けない。
＜モノグリセリドリパーゼの酵素活性測定法＞ （＊＊TOOS:N−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−
スルホプロピル）−メタ−トルイジン） 上記組成の反応液0.4mlに、10mMモノラウリン（0.5％
トリトンＸ−100水溶液）50μｌを加え、37℃で２〜３
分間予備加温し50μｌの酵素液を加え、反応を開始す
る。正確に10分後、0.5％SDS（Sodium dodecyl sulfat
e）2.5mlを加え反応を止める。分光分析による比色測定
の波長は550nmで行い、酵素活性は、１分間に１μmole
のグリセロールを生成する活性を１単位（1Unit,1U,）
とする。また、この酵素活性測定法による酵素活性（力
価）の算出は次式に従う。
スルホプロピル）−メタ−トルイジン） 上記組成の反応液0.4mlに、10mMモノラウリン（0.5％
トリトンＸ−100水溶液）50μｌを加え、37℃で２〜３
分間予備加温し50μｌの酵素液を加え、反応を開始す
る。正確に10分後、0.5％SDS（Sodium dodecyl sulfat
e）2.5mlを加え反応を止める。分光分析による比色測定
の波長は550nmで行い、酵素活性は、１分間に１μmole
のグリセロールを生成する活性を１単位（1Unit,1U,）
とする。また、この酵素活性測定法による酵素活性（力
価）の算出は次式に従う。
ΔA550:550nmの波長における吸光度 2.95:発色液総量（ml） 18.0:過酸化水素ミリ分子吸光係数（cm2/μmole） 50:使用酵素液量（μｌ） 10:反応時間（分） 以上の通り、バチルス ステアロサーモフィラスＨ−
165株（FERM BP−1673）の培養により、得られた酵素
はモノグリセリドに基質特異性を有し、 モノグリセリド＋H2O→グリセロール＋脂肪酸 の反応を触媒する新規な酵素と認められるものである。
165株（FERM BP−1673）の培養により、得られた酵素
はモノグリセリドに基質特異性を有し、 モノグリセリド＋H2O→グリセロール＋脂肪酸 の反応を触媒する新規な酵素と認められるものである。
次に、本発明に用いられるモノグリセリドリパーゼ生
産菌の一例であるバチルス ステアロサーモフィラスＨ
−165菌株の菌学的性状および命名の過程を述べる。
産菌の一例であるバチルス ステアロサーモフィラスＨ
−165菌株の菌学的性状および命名の過程を述べる。
A.肉眼的観察 50〜55℃、18〜44時間培養の結果は、次の通りであ
る。
る。
普通寒天斜面培地 黄味を帯びた灰白色を呈し、線状に生育し、生育は良
好であり、可溶性色素は産生しない。
好であり、可溶性色素は産生しない。
普通寒天平面培地 黄味を帯びた灰色を呈し、円形で平らな全縁の集落を
形成するが、可溶性色素は産生しない。
形成するが、可溶性色素は産生しない。
液体培地 生育良好で一様に混濁する。
BCPミルク培地 不変である。
B.形態的特徴 形および配列 まっすぐ又はやや曲がった端の丸い桿菌で、単独、二
連、または短連鎖する。
連、または短連鎖する。
大きさ 0.6〜0.8×2.5〜4.0μｍ。
運動性 なし。
芽胞 細胞の中央または端に近い位置に卵形または長円形に
形状を呈して存在する。大きさは0.8〜1.2×1.5〜2.0μ
ｍで菌体は芽胞により膨張する。
形状を呈して存在する。大きさは0.8〜1.2×1.5〜2.0μ
ｍで菌体は芽胞により膨張する。
多形性 なし。
C.生理的生化学的特徴 グラム染色 ＋ KOH反応 − 抗産性染色 − カプセル形成 − OFテスト（Hugh−Leison培地） 変化なし OFテスト（変法倍地）＊＊＊ ０（酸化） 嫌気下での生育 − 生育温度 60℃ ＋ 50℃ ＋ 47℃ ＋ 生育pH 8.6℃ − 7.7 ＋ 5.6 ＋ 4.4 − 耐塩性 0 ％ ＋ 3 ％ ＋ 5 ％ − ゼラチンの加水分解 − デンプンの加水分解 ＋ カゼインの加水分解 − エスクリンの加水分解 ＋ セルロースの加水分解 − アルギニンの加水分解 ＋ カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ ウレアーゼ産生（SSR培地） − ウレアーゼ産生（Chris.培地） ＋ インドール産生 − 硫化水素産生 − アセトイン産生 − MRテスト − 硝酸塩還元 ＋ 脱窒反応 − ＊＊＊倍地組成 （NH4）2HPO4 1.0 g MgSO4・7H2O 0.2 g グルコース 10.0 g BTB（0.2％水溶液） 10.0 g KCl 0.2 g イースト抽出物 1.0 g 寒天 3.0 g 蒸溜水 1000.0ml （ph 7.0） 利用性テスト（Simons倍地） クエン酸塩 − マレイン酸塩 − リンゴ酸塩 ＋ グルコン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − マロン酸塩 − コハク酸塩 ＋ 利用性テスト（Christensen培地） クエン酸塩 ＋ マレイン酸塩 − リンゴ酸塩 ＋ グルコン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 ＋ マロン酸塩 − コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 糖より酸の産生（Ｎ源として（NH4）2HPO4を使用） アドニトール − Ｌ（＋）−アラビノース − セロビオース ＋ ヅルシトール − メソ−エリスリトール − フラクトース ＋ ガラクトース − グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール − イヌリン − ラクトース − マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース ＋ メリビオース ＋ ラフィノース ＋ Ｌ（＋）−ラムノース − Ｄ−リボース ＋ サリシン ＋ ソルビトール − ソルボース − デンプン ＋ シュクロース ＋ トレハロース ＋ キシロース ＋ 上記の菌学的性質から、本Ｈ−165菌株の菌学的特徴
は、まっすぐ又はやや曲がった端の丸い非運動性桿菌、
グラム陽性、大きさは0.6〜0.8×2.5〜4.0μｍで、芽胞
を形成し芽胞によって菌体が膨張し、ググコースを酸化
的に分解して酸を産生し、カタラーゼおよびオキシダー
ゼ産生能陽性の高温性好気細菌であるといえる。このよ
うに、芽胞を形成するグラム陽性の好気性桿状細菌であ
ること等の諸性状を有することから本菌株をバチルス属
に属するものと判定した。さらに、本菌株のアセトイン
産生能、インドール産生能、グルコースよりガスの産生
能、嫌気下での生育能と同じ性状を示す他の菌種とし
て、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）：（Ａ）、バチルス アルカロフィ
ラス（Bacillus alcalophilus）：（Ｂ）、バチルス
バディウス（Bacillus badius）：（Ｃ）、バチルス
フィルムス（Bacillus firmus）：（Ｄ）が挙げられる
が、これらの菌種と本菌株の菌学的性状を比較すると次
の通りである〔＋：陽性、−：陰性、d:菌株によって異
なる、ND:データなし〕 以上の比較から、本菌株の性状は、バチルス ステア
ロサーモフィラス（Bcillus stearothermophilus）の性
状とゼラチン分解性の点で異なるが、その他の性状につ
いてはよく一致した。よって、本菌株をバチルス ステ
アロサーモフィラスに属するものと同定し、バチルス
ステアロサーモフィラスＨ−165と命名し、本菌株を工
業技術院微生物工業技術研究所に「微工研条寄第1673号
（FERM BP−1673）」として寄託した。本発明において
使用されるモノグリセリドリパーゼ生産菌としては、上
記のバチルス ステアロサーモフィラスＨ−165はその
一例であって、この菌株に限らず、モノグリセリドに強
い基質特異性を示す作用を有するモノグリセリドリパー
ゼを生産する菌はすべて本発明において使用できる。
は、まっすぐ又はやや曲がった端の丸い非運動性桿菌、
グラム陽性、大きさは0.6〜0.8×2.5〜4.0μｍで、芽胞
を形成し芽胞によって菌体が膨張し、ググコースを酸化
的に分解して酸を産生し、カタラーゼおよびオキシダー
ゼ産生能陽性の高温性好気細菌であるといえる。このよ
うに、芽胞を形成するグラム陽性の好気性桿状細菌であ
ること等の諸性状を有することから本菌株をバチルス属
に属するものと判定した。さらに、本菌株のアセトイン
産生能、インドール産生能、グルコースよりガスの産生
能、嫌気下での生育能と同じ性状を示す他の菌種とし
て、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus）：（Ａ）、バチルス アルカロフィ
ラス（Bacillus alcalophilus）：（Ｂ）、バチルス
バディウス（Bacillus badius）：（Ｃ）、バチルス
フィルムス（Bacillus firmus）：（Ｄ）が挙げられる
が、これらの菌種と本菌株の菌学的性状を比較すると次
の通りである〔＋：陽性、−：陰性、d:菌株によって異
なる、ND:データなし〕 以上の比較から、本菌株の性状は、バチルス ステア
ロサーモフィラス（Bcillus stearothermophilus）の性
状とゼラチン分解性の点で異なるが、その他の性状につ
いてはよく一致した。よって、本菌株をバチルス ステ
アロサーモフィラスに属するものと同定し、バチルス
ステアロサーモフィラスＨ−165と命名し、本菌株を工
業技術院微生物工業技術研究所に「微工研条寄第1673号
（FERM BP−1673）」として寄託した。本発明において
使用されるモノグリセリドリパーゼ生産菌としては、上
記のバチルス ステアロサーモフィラスＨ−165はその
一例であって、この菌株に限らず、モノグリセリドに強
い基質特異性を示す作用を有するモノグリセリドリパー
ゼを生産する菌はすべて本発明において使用できる。
これらを培養するに当たっては、モノグリセリドリパ
ーゼ生産菌を抗生物質または酵素等の生産に使用される
通常の方法で培養することができる。培養の形態は液体
培養でも固体培養でもよいが、工業的にはモノグリセリ
ドリパーゼ生産菌の細胞をその生産用培地に接種し、深
部通気撹拌培養を行うのが望ましい。
ーゼ生産菌を抗生物質または酵素等の生産に使用される
通常の方法で培養することができる。培養の形態は液体
培養でも固体培養でもよいが、工業的にはモノグリセリ
ドリパーゼ生産菌の細胞をその生産用培地に接種し、深
部通気撹拌培養を行うのが望ましい。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられ
るものを広く使用することができる。炭素源としては同
化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコー
ス、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、マルト
ース、マンニトール、ソルビトール、デキストリン、澱
粉等の炭水化物類、各種有機酸類、大豆油、オリーブ油
等の植物性油脂、ラード、鶏油等の動物性油脂などを使
用できる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えば、ペプトン、粉末酵母エキス、肉エキ
ス、大豆粉、カゼイン、脱脂綿実粉等を使用できる。そ
の他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウ
ム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲン等の種
々の塩類またはコーンスチブリカー、各種ビタミン類等
が必要に応じて使用される。
るものを広く使用することができる。炭素源としては同
化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコー
ス、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、マルト
ース、マンニトール、ソルビトール、デキストリン、澱
粉等の炭水化物類、各種有機酸類、大豆油、オリーブ油
等の植物性油脂、ラード、鶏油等の動物性油脂などを使
用できる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えば、ペプトン、粉末酵母エキス、肉エキ
ス、大豆粉、カゼイン、脱脂綿実粉等を使用できる。そ
の他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウ
ム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲン等の種
々の塩類またはコーンスチブリカー、各種ビタミン類等
が必要に応じて使用される。
培養温度は、モノグリセリドリパーゼ生産菌が発育
し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、40〜
65℃、特に45〜50℃が好ましい。培養時間は、培養条件
によって異なるが、本酵素が最高力価に達する時期を見
計らって適当な時期に培養を終了すればよく、10〜22時
間が好ましい。
し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、40〜
65℃、特に45〜50℃が好ましい。培養時間は、培養条件
によって異なるが、本酵素が最高力価に達する時期を見
計らって適当な時期に培養を終了すればよく、10〜22時
間が好ましい。
かくして得られたモノグリセリドリパーゼ生産菌の培
養物から本酵素モノグリセリドリパーゼを採取するので
あるが、本酵素はその菌体内に含有されるので、得られ
た培養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌
し、この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラ
スビーズ処理等の機械的破壊手段やリゾチーム等の酵素
的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜選択組み合わ
せて、粗製のモノグリセリドリパーゼ含有液が得られ
る。また、必要に応じて、トリトンＸ−100（商品名）
等の界面活性剤を添加してもよい。
養物から本酵素モノグリセリドリパーゼを採取するので
あるが、本酵素はその菌体内に含有されるので、得られ
た培養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌
し、この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラ
スビーズ処理等の機械的破壊手段やリゾチーム等の酵素
的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜選択組み合わ
せて、粗製のモノグリセリドリパーゼ含有液が得られ
る。また、必要に応じて、トリトンＸ−100（商品名）
等の界面活性剤を添加してもよい。
次いで、この粗製のモノグリセリドリパーゼ含有液か
ら公知の、蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いるこ
とによりさらに精製されたモノグリセリドリパーゼを得
ることができる。例えば、粗製のモノグリセリドリパー
ゼ含有液に、アセトン、メタノール、エタノール、イソ
プロパノール等の有機溶媒を添加する分別沈澱法、硫
安、食塩、硫酸ナトリウム等を添加する塩析沈澱法等に
より本酵素を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分
子篩、各種のクロマトグラフィー法、電気泳動法あるい
は超遠心分析法等を適宜組合せ用いて単一のピークを示
すまでに精製すればよく、その精製手段としては、目的
とするモノグリセリドリパーゼの性質を利用した手段を
用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に
溶解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにDE
AE−セルロース、DEAE−セファセル、DEAE−セファロー
ス、DEAE−セファデックスＡ−50、DEAE−トヨパール等
のイオン交換樹脂や、セファデックスＧ−100,G−75,セ
ファクリルＳ−200等のゲル濾過剤による分子篩クロマ
トを行えばよく、またこれらの手段を適宜組み合わせて
電気泳動法または超遠心分析法等により単一のピークを
示すまで精製すればよく、その後必要に応じて糖類、例
えばマンニトール、ショ糖、ソルビトール等、アミノ
酸、例えばグルタミン酸、グリシン等、ペプタイドまた
は蛋白質として牛血清アルブミン等の安定化剤を添加
し、凍結乾燥等の処理により精製された本酵素の粉体を
得ることができる。
ら公知の、蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いるこ
とによりさらに精製されたモノグリセリドリパーゼを得
ることができる。例えば、粗製のモノグリセリドリパー
ゼ含有液に、アセトン、メタノール、エタノール、イソ
プロパノール等の有機溶媒を添加する分別沈澱法、硫
安、食塩、硫酸ナトリウム等を添加する塩析沈澱法等に
より本酵素を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分
子篩、各種のクロマトグラフィー法、電気泳動法あるい
は超遠心分析法等を適宜組合せ用いて単一のピークを示
すまでに精製すればよく、その精製手段としては、目的
とするモノグリセリドリパーゼの性質を利用した手段を
用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に
溶解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにDE
AE−セルロース、DEAE−セファセル、DEAE−セファロー
ス、DEAE−セファデックスＡ−50、DEAE−トヨパール等
のイオン交換樹脂や、セファデックスＧ−100,G−75,セ
ファクリルＳ−200等のゲル濾過剤による分子篩クロマ
トを行えばよく、またこれらの手段を適宜組み合わせて
電気泳動法または超遠心分析法等により単一のピークを
示すまで精製すればよく、その後必要に応じて糖類、例
えばマンニトール、ショ糖、ソルビトール等、アミノ
酸、例えばグルタミン酸、グリシン等、ペプタイドまた
は蛋白質として牛血清アルブミン等の安定化剤を添加
し、凍結乾燥等の処理により精製された本酵素の粉体を
得ることができる。
以上の理化学的性質を有するモノグリセリドリパーゼ
が例示されるもので、その理化学的性質やその生産菌の
菌学的性状、その同定、命名の詳細な理由については特
願昭62−80299号明細書に詳記されている通りである。
が例示されるもので、その理化学的性質やその生産菌の
菌学的性状、その同定、命名の詳細な理由については特
願昭62−80299号明細書に詳記されている通りである。
次に、本発明トリグリセリド分析用試薬に上述モノグ
リセリドリパーゼと併用して用いるリパーゼについて説
明する。本発明において使用するリパーゼは、従来のト
リグリセリドの定量分析に用いられているリパーゼが挙
げられ、少なくともトリグリセリドを加水分解し、ジグ
リセリドと脂肪酸を生成し、またさらにジグリセリドを
加水分解しモノグリセリドと脂肪酸を生成する反応を触
媒するものであればよい。例えばリゾプス・デレマー
（Rhizopus delemar）（ATCC4858,ATCC9374,ATCC20134,
ATCC24864）、リゾプス・アルヒズス（Rhizopus arrhiz
us）（ATCC10260,ATCC24563,ATCC24865）、クロモバク
テリウム・ビスコスム（Chromobacterium viscosum）
（ATCC12472,ATCC6918,NRRL B−3673、微工研菌寄第137
号）、黒色麹菌クロカビ（Aspergillus niger）（ATCC1
0864,ATCC1004,ATCC1018）、黄色麹菌（Aspergillus fl
avus oryzae）（ATCC9376,ATCC11495,ATCC12891）、カ
ンジダ・リポリチカ（Candida lipolytica）（ATCC866
1,ATCC20287,ATCC20363）、カンジダ・シリンドラセア
（Candida cylindracea）（ATCC14830）、ムコール・ミ
エヘイ（Mucor miehei）（ATCC16457,ATCC26282）また
はムコール・プシルス（Mucor pusillus）（ATCC16458,
ATCC16459）等の微生物由来、または例えば牛の膵臓の
ような動物源から得ることもできる。さらにその他、従
来知られているリパーゼ生産菌としては、シュードモナ
ス属〔Y.Kosugi,ジャーナル・オブ・ファーメンテーシ
ョン・テクロノジー（J.Ferment.Technol.）,49巻,968
〜980頁（1971）〕、コリネバクテリウム属〔K.Weaber,
アブライド・マイクロバイオロジー（Appl.Microb.）,2
1巻,639〜642頁（1971）〕、スタフィロコッカス属〔J.
A.Troller,アブライド・マイクロバイオロジー（Appl.M
icrob.）,20巻。480〜484頁（1970）〕プロピオニオバ
クテリウム属〔A.Oterholm,アブライド・マイクロバイ
オロジー（Appl.Microb.）,20巻,16〜22頁（1970）〕、
アルカリゲネス属〔Y.Kokusho,アグリカルチャル・バイ
オロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）,46巻
５号,1159〜1164頁（1982）〕等が挙げられ、これらに
属するリパーゼ生産菌よりのリパーゼ等であってもよ
い。特にシュードモナス属のリパーゼ生産菌を利用した
リパーゼに関しては多くが知られている。（特公昭41−
7836号、同56−28516号、同56−28517号、同57−42312
号、同57−42313号、同57−52835号、同57−59753
号）。また、上記のリパーゼの代わりにコレステロール
エステラーゼと称されるリパーゼと同一作用を示す酵素
を用いてもよい。
リセリドリパーゼと併用して用いるリパーゼについて説
明する。本発明において使用するリパーゼは、従来のト
リグリセリドの定量分析に用いられているリパーゼが挙
げられ、少なくともトリグリセリドを加水分解し、ジグ
リセリドと脂肪酸を生成し、またさらにジグリセリドを
加水分解しモノグリセリドと脂肪酸を生成する反応を触
媒するものであればよい。例えばリゾプス・デレマー
（Rhizopus delemar）（ATCC4858,ATCC9374,ATCC20134,
ATCC24864）、リゾプス・アルヒズス（Rhizopus arrhiz
us）（ATCC10260,ATCC24563,ATCC24865）、クロモバク
テリウム・ビスコスム（Chromobacterium viscosum）
（ATCC12472,ATCC6918,NRRL B−3673、微工研菌寄第137
号）、黒色麹菌クロカビ（Aspergillus niger）（ATCC1
0864,ATCC1004,ATCC1018）、黄色麹菌（Aspergillus fl
avus oryzae）（ATCC9376,ATCC11495,ATCC12891）、カ
ンジダ・リポリチカ（Candida lipolytica）（ATCC866
1,ATCC20287,ATCC20363）、カンジダ・シリンドラセア
（Candida cylindracea）（ATCC14830）、ムコール・ミ
エヘイ（Mucor miehei）（ATCC16457,ATCC26282）また
はムコール・プシルス（Mucor pusillus）（ATCC16458,
ATCC16459）等の微生物由来、または例えば牛の膵臓の
ような動物源から得ることもできる。さらにその他、従
来知られているリパーゼ生産菌としては、シュードモナ
ス属〔Y.Kosugi,ジャーナル・オブ・ファーメンテーシ
ョン・テクロノジー（J.Ferment.Technol.）,49巻,968
〜980頁（1971）〕、コリネバクテリウム属〔K.Weaber,
アブライド・マイクロバイオロジー（Appl.Microb.）,2
1巻,639〜642頁（1971）〕、スタフィロコッカス属〔J.
A.Troller,アブライド・マイクロバイオロジー（Appl.M
icrob.）,20巻。480〜484頁（1970）〕プロピオニオバ
クテリウム属〔A.Oterholm,アブライド・マイクロバイ
オロジー（Appl.Microb.）,20巻,16〜22頁（1970）〕、
アルカリゲネス属〔Y.Kokusho,アグリカルチャル・バイ
オロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）,46巻
５号,1159〜1164頁（1982）〕等が挙げられ、これらに
属するリパーゼ生産菌よりのリパーゼ等であってもよ
い。特にシュードモナス属のリパーゼ生産菌を利用した
リパーゼに関しては多くが知られている。（特公昭41−
7836号、同56−28516号、同56−28517号、同57−42312
号、同57−42313号、同57−52835号、同57−59753
号）。また、上記のリパーゼの代わりにコレステロール
エステラーゼと称されるリパーゼと同一作用を示す酵素
を用いてもよい。
これに限らず、従来知られている公知の種々のリパー
ゼおよび遺伝子操作技術を用いることにより得られたリ
パーゼも、本発明において用いることができる。尚、用
いられるリパーゼの活性測定法は次の通りである。
ゼおよび遺伝子操作技術を用いることにより得られたリ
パーゼも、本発明において用いることができる。尚、用
いられるリパーゼの活性測定法は次の通りである。
上記組成の反応液0.5mlを試験管に分取し、37℃、２
〜３分予備加温した後、酵素液50μｌ（10mMPIPES−NaO
H緩衝液,pH7.3,0.1％牛血清アルブミン加）を加えて37
℃、10分間反応を行い、次いで10mM N−エチルマレイミ
ド0.5mlおよび下記組成の試薬（Ｒ−２）0.5mlを加えて
37℃、５分間反応させる。次に1.5mlの0.5％ドデシル硫
酸ナトリウムを加えて反応停止させた後、550nmの波長
にて比色定量する。１分間に１μmoleのリノール酸を遊
離する活性を１単位（1U）とする。
〜３分予備加温した後、酵素液50μｌ（10mMPIPES−NaO
H緩衝液,pH7.3,0.1％牛血清アルブミン加）を加えて37
℃、10分間反応を行い、次いで10mM N−エチルマレイミ
ド0.5mlおよび下記組成の試薬（Ｒ−２）0.5mlを加えて
37℃、５分間反応させる。次に1.5mlの0.5％ドデシル硫
酸ナトリウムを加えて反応停止させた後、550nmの波長
にて比色定量する。１分間に１μmoleのリノール酸を遊
離する活性を１単位（1U）とする。
さらに、本発明トリグリセリド分析用試薬を調製する
に当り用いるモノグリセリドリパーゼおよびリパーゼの
使用量は、各々反応を充分に行なわせしめる量でもあれ
ばよく、特に分析しようとするトリグリセリドの量に比
べて使用量を決定せればよい。モノグリセリドリパーゼ
の使用量としては、通常１テスト当り0.05U/ml以上、好
ましくは0.1〜0.5U/mlであり、またリパーゼの使用量と
しては50〜1000U/ml、好ましくは100〜500U/mlである。
さらに各酵素とも、単独または緩衝液液に溶解したもの
でもよく、さらにこれを凍結乾燥せしめたものでもよ
い。
に当り用いるモノグリセリドリパーゼおよびリパーゼの
使用量は、各々反応を充分に行なわせしめる量でもあれ
ばよく、特に分析しようとするトリグリセリドの量に比
べて使用量を決定せればよい。モノグリセリドリパーゼ
の使用量としては、通常１テスト当り0.05U/ml以上、好
ましくは0.1〜0.5U/mlであり、またリパーゼの使用量と
しては50〜1000U/ml、好ましくは100〜500U/mlである。
さらに各酵素とも、単独または緩衝液液に溶解したもの
でもよく、さらにこれを凍結乾燥せしめたものでもよ
い。
次に、用いるグリセロール定量試薬について述べる。
グリセロール定量試薬としては、生成されるグリセロー
ルに作用する酵素を用いる公知のグリセロール定量系に
使用される試薬が用いられる。グリセロール定量系とし
て、例えばATPの存在下グリセロキナーゼを用いてグリ
セロールから生成されるグリセロ−３−リン酸をグリセ
ロリン酸オキシダーゼで酸化させるグリセロキナーゼ、
グリセロリン酸オキシダーゼ法を用いる系、またはグリ
セロールオキシダーゼ法を用いる系が好ましい試薬とし
て挙げられる。いづれの系を用いる場合も、グリセロー
ル定量系における最終生成物である過酸化水素を測定、
またはこれらの系の反応によって消費される酸素または
生成されるジヒドロキシアセトンリン酸、ジヒドロキシ
アセトンのいづれを測定してもよい。例えば、グリセロ
キナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法を用いる場
合、トリグリセリドから生成したグリセロールに、グリ
セロキナーゼ0.1〜2U/ml、グリセロリン酸オキシダーゼ
３〜30U/ml、ATP1〜10mM、またグリセロキナーゼの酵素
活性を高めるための添加剤としてマグネシウムイオンを
放出するイオン放出性塩類、例えば塩化マグネシウム１
〜10mMを各々作用させることにより、酸素を消費して過
酸化水素およびジヒドロキシアセトンリン酸が生成され
るもので、この消費される酸素を酸素電極または溶存酸
素計を用いて測定するか、または生成されるジヒドロキ
シアセトンリン酸を公知の方法〔Method of Enzymatic
Analysis,3巻,1314〜1319頁〕等に基づいて測定しても
よい。さらに、過酸化水素を測定する方法としては、過
酸化水素電極を用いる電気化学的手段の他、生成される
過酸化水素にパーオキダーゼおよび４−アミノアンチピ
リンと下記一般式（Ｉ）で表されるフェノール性化合
物、または下記一般式（II）で表されるアリニン誘導体
の呈色薬組成物を作用させ、生じた発色体を測定する方
法を用いてもよい（特公昭60−3480号）。
グリセロール定量試薬としては、生成されるグリセロー
ルに作用する酵素を用いる公知のグリセロール定量系に
使用される試薬が用いられる。グリセロール定量系とし
て、例えばATPの存在下グリセロキナーゼを用いてグリ
セロールから生成されるグリセロ−３−リン酸をグリセ
ロリン酸オキシダーゼで酸化させるグリセロキナーゼ、
グリセロリン酸オキシダーゼ法を用いる系、またはグリ
セロールオキシダーゼ法を用いる系が好ましい試薬とし
て挙げられる。いづれの系を用いる場合も、グリセロー
ル定量系における最終生成物である過酸化水素を測定、
またはこれらの系の反応によって消費される酸素または
生成されるジヒドロキシアセトンリン酸、ジヒドロキシ
アセトンのいづれを測定してもよい。例えば、グリセロ
キナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法を用いる場
合、トリグリセリドから生成したグリセロールに、グリ
セロキナーゼ0.1〜2U/ml、グリセロリン酸オキシダーゼ
３〜30U/ml、ATP1〜10mM、またグリセロキナーゼの酵素
活性を高めるための添加剤としてマグネシウムイオンを
放出するイオン放出性塩類、例えば塩化マグネシウム１
〜10mMを各々作用させることにより、酸素を消費して過
酸化水素およびジヒドロキシアセトンリン酸が生成され
るもので、この消費される酸素を酸素電極または溶存酸
素計を用いて測定するか、または生成されるジヒドロキ
シアセトンリン酸を公知の方法〔Method of Enzymatic
Analysis,3巻,1314〜1319頁〕等に基づいて測定しても
よい。さらに、過酸化水素を測定する方法としては、過
酸化水素電極を用いる電気化学的手段の他、生成される
過酸化水素にパーオキダーゼおよび４−アミノアンチピ
リンと下記一般式（Ｉ）で表されるフェノール性化合
物、または下記一般式（II）で表されるアリニン誘導体
の呈色薬組成物を作用させ、生じた発色体を測定する方
法を用いてもよい（特公昭60−3480号）。
一般式（Ｉ）： （ただし式中、Ｘはハロゲン基、Ｙは水素原子、ハロゲ
ン基、低級アルキル基、または低級アルコキシ基、Ｚは
水素原子、スルホン酸基またはカルボキシル基を示
す。） 一般式（II）： （ただし式中、R1は水素原子、低級アルキル基、低級ア
ルコキシ基、R2,R3は低級アルキル基、低級アルコキシ
基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基またはスル
ホン酸基を含む低級アルキル基を示す。） 上記の呈色薬組成物において、一般式（Ｉ）で表され
るフェノール化合物としては、例えば、ｐ−クロルフェ
ノール、ｐ−ブロムフェノール、2,4−ジクロルフェノ
ール、2,4−ジブロムフェノール、2,4−ジクロルフェノ
ールスルホネート等が挙げられる。
ン基、低級アルキル基、または低級アルコキシ基、Ｚは
水素原子、スルホン酸基またはカルボキシル基を示
す。） 一般式（II）： （ただし式中、R1は水素原子、低級アルキル基、低級ア
ルコキシ基、R2,R3は低級アルキル基、低級アルコキシ
基、アセチルアミド基を含む低級アルキル基またはスル
ホン酸基を含む低級アルキル基を示す。） 上記の呈色薬組成物において、一般式（Ｉ）で表され
るフェノール化合物としては、例えば、ｐ−クロルフェ
ノール、ｐ−ブロムフェノール、2,4−ジクロルフェノ
ール、2,4−ジブロムフェノール、2,4−ジクロルフェノ
ールスルホネート等が挙げられる。
また、一般式（II）で表されるアニリン誘導体として
は、例えばジエチルアニリン、N,N−ジメチル−ｍ−ト
ルイジン、ｍ−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−アセチル
エチレンジアミン、ソジウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
スルホプロピル）メタトルイジン、ソジウム−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,
5−ジメトキシアニリン等が挙げらる。
は、例えばジエチルアニリン、N,N−ジメチル−ｍ−ト
ルイジン、ｍ−メトキシ−N,N−ジメチルアニリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−アセチル
エチレンジアミン、ソジウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
スルホプロピル）メタトルイジン、ソジウム−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−3,
5−ジメトキシアニリン等が挙げらる。
上記過酸化水素の測定方法は例示であり、通常として
は過酸化水素と反応して検出できる生成物に変化する指
示薬組成物を用いて定量すればよく、この指示薬組成物
として、過酸化水素の存在下で色調変化を受ける１種ま
たは２種以上の呈色薬組成物、蛍光薬組成物または発光
薬組成物からなる組合せを使用すればよい。呈色薬組成
物としては、通常色調の変化を可視にて生ずるもので、
パーオキシダーゼ作用を有する物質と呈色前駆体との含
有物を用いる。このパーオキシダーゼ作用を有する物質
としては、西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼが通常よ
く用いられ、呈色前駆体としては、４−アミノアンチピ
リンと一般式（Ｉ）で表されるフェノール系化合物の組
合せによる方法が通常よく用いられる。また、呈色前駆
体として、４−アミノアンチピリンと一般式（II）で表
されるアニリン誘導体の組合せによる方法でもよく、例
えば４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼと
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−メタ−トルイジン（TOOS）との反応によって、
生成する発色体の量をその呈色の強さによって測定する
方法が挙げらる。さらに、ジエチルアニリンまたはジメ
チルアニリンと３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾンを作用させ生じた発色体を呈色の強さによって
測定する方法もあり、また生成する過酸化水素と反応し
て安定な赤色体を形成する４価チタン化合物とキシレノ
ールオレンジによって生成する発色体の量をその呈色の
強さによって測定する方法もあり、さらに2,6−ジクロ
ルフェノールインドフェノールとパーオキシダーゼとの
組合せ、グアヤク脂とパーオシダーゼとの組合せ等によ
るパーオキシダーゼを用いる種々の組成、方法が挙げら
れる。さらにこれらの指示薬組成物においては溶液とし
て予めその目的に応じて混合使用して調製してもよい。
使用量としては、例えばこのフェノール誘導体またはア
ニリン誘導体、４−アミノアンチピリンおよびパーオキ
シダーゼによる反応においては、フェノールあるいはTO
OSは全液量に対し0.01〜0.1％程度使用すればよく、４
−アミノアンチピリンは全液量に対して、0.01〜0.05
％、好ましくは0.03％、さらにパーオキシダーゼは３〜
30U/ml、好ましくは４〜6U/ml使用すればよい。さらに
上記の呈色薬組成物の代りに、紫外線照射により蛍光を
発する蛍光薬組成物としてホモバニリン酸などを用いて
行ってもよく、さらに発色する発光薬組成物を用いて行
う等、分光光学的手段によりその変化を定量し得る組成
物が用いられる。
は過酸化水素と反応して検出できる生成物に変化する指
示薬組成物を用いて定量すればよく、この指示薬組成物
として、過酸化水素の存在下で色調変化を受ける１種ま
たは２種以上の呈色薬組成物、蛍光薬組成物または発光
薬組成物からなる組合せを使用すればよい。呈色薬組成
物としては、通常色調の変化を可視にて生ずるもので、
パーオキシダーゼ作用を有する物質と呈色前駆体との含
有物を用いる。このパーオキシダーゼ作用を有する物質
としては、西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼが通常よ
く用いられ、呈色前駆体としては、４−アミノアンチピ
リンと一般式（Ｉ）で表されるフェノール系化合物の組
合せによる方法が通常よく用いられる。また、呈色前駆
体として、４−アミノアンチピリンと一般式（II）で表
されるアニリン誘導体の組合せによる方法でもよく、例
えば４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼと
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−メタ−トルイジン（TOOS）との反応によって、
生成する発色体の量をその呈色の強さによって測定する
方法が挙げらる。さらに、ジエチルアニリンまたはジメ
チルアニリンと３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾンを作用させ生じた発色体を呈色の強さによって
測定する方法もあり、また生成する過酸化水素と反応し
て安定な赤色体を形成する４価チタン化合物とキシレノ
ールオレンジによって生成する発色体の量をその呈色の
強さによって測定する方法もあり、さらに2,6−ジクロ
ルフェノールインドフェノールとパーオキシダーゼとの
組合せ、グアヤク脂とパーオシダーゼとの組合せ等によ
るパーオキシダーゼを用いる種々の組成、方法が挙げら
れる。さらにこれらの指示薬組成物においては溶液とし
て予めその目的に応じて混合使用して調製してもよい。
使用量としては、例えばこのフェノール誘導体またはア
ニリン誘導体、４−アミノアンチピリンおよびパーオキ
シダーゼによる反応においては、フェノールあるいはTO
OSは全液量に対し0.01〜0.1％程度使用すればよく、４
−アミノアンチピリンは全液量に対して、0.01〜0.05
％、好ましくは0.03％、さらにパーオキシダーゼは３〜
30U/ml、好ましくは４〜6U/ml使用すればよい。さらに
上記の呈色薬組成物の代りに、紫外線照射により蛍光を
発する蛍光薬組成物としてホモバニリン酸などを用いて
行ってもよく、さらに発色する発光薬組成物を用いて行
う等、分光光学的手段によりその変化を定量し得る組成
物が用いられる。
同様に、グリセロールオキシダーゼ法を用いる系とし
ては、上記の通り、トリグリセリドから生成されたグリ
セロールにグリセロールオキシダーゼ５〜50U/ml作用さ
せることにより酸素を消費してジヒドロキシアセトンお
よび過酸化水素を生成するもので、この消費された酸素
を測定するか、または生成されるジヒドロキシアセトン
または過酸化水素を測定する。好ましくは生成された過
酸化水素を測定するものであるが、その場合はグリセロ
キナーゼ・グリセロリン酸オキサシダーゼ法における過
酸化水素の定量試薬を同様にして用いればよい。消費さ
れる酸素の測定においては上記した通り酸素電極または
溶存酸素計を使用すればよく、さらに生成されるジヒド
ロキシアセトンを公知の方法〔Method of Enzymatic An
alysis,3巻,1442〜1445頁〕等に基づいて行えばよい。
ては、上記の通り、トリグリセリドから生成されたグリ
セロールにグリセロールオキシダーゼ５〜50U/ml作用さ
せることにより酸素を消費してジヒドロキシアセトンお
よび過酸化水素を生成するもので、この消費された酸素
を測定するか、または生成されるジヒドロキシアセトン
または過酸化水素を測定する。好ましくは生成された過
酸化水素を測定するものであるが、その場合はグリセロ
キナーゼ・グリセロリン酸オキサシダーゼ法における過
酸化水素の定量試薬を同様にして用いればよい。消費さ
れる酸素の測定においては上記した通り酸素電極または
溶存酸素計を使用すればよく、さらに生成されるジヒド
ロキシアセトンを公知の方法〔Method of Enzymatic An
alysis,3巻,1442〜1445頁〕等に基づいて行えばよい。
さらにグリセロールの定量手段としては上述のグリセ
ロリン酸オキシダーゼの代りにグリセロリン酸デヒロゲ
ナーゼおよびNADを用いて生成する還元型NADを公知の定
量試薬を用いて分析してもよく、さらに生成されるグリ
セロールにATPおよびグリセロキナーゼを作用させた場
合においてATPから生成するADPを公知方法〔Method of
Enzymatic Analysis,4巻,2127〜2129頁〕等に基づく試
薬を用いて測定してもよく、公知の種々のグリセロール
定量系に用いられる試薬等が使用可能である。
ロリン酸オキシダーゼの代りにグリセロリン酸デヒロゲ
ナーゼおよびNADを用いて生成する還元型NADを公知の定
量試薬を用いて分析してもよく、さらに生成されるグリ
セロールにATPおよびグリセロキナーゼを作用させた場
合においてATPから生成するADPを公知方法〔Method of
Enzymatic Analysis,4巻,2127〜2129頁〕等に基づく試
薬を用いて測定してもよく、公知の種々のグリセロール
定量系に用いられる試薬等が使用可能である。
さらに、トリグリセリドの分析を良好に行うために必
要に応じて添加される試薬として、非イオン性界面活性
剤、モノグリセリドからグリセロールおよび脂肪酸が生
成される作用を高める添加剤、生成されたグリセロール
を測定するための各酵素の作用を高める添加剤を適宜選
択添加してもよく、例を挙げれば、非イオン性界面活性
剤としては、例えばトリトンＸ−100（ローム・アンド
・ハス社製）等を0.05〜１％、グリセロールを測定する
ための各酵素の作用を高める添加剤としては、例えばグ
リセロキナーゼの作用を高める添加剤としては塩化マグ
ネシウム等を１〜10mM、また反応のpHを一定に保つため
に例えば、PIPES−NaOH緩衝液またはその他のグッドバ
ッファーを20〜500mM（pH6〜８、好ましくはpH7.3）を
適宜選択して用いればよい。これらの添加剤、生成され
たグリセロールを定量するための各酵素、および必要に
応じ生成した過酸化水素の測定のための指示薬組成物等
一定量を、適宜選択し用いて、例えばリパーゼおよびモ
ノグリセリドリパーゼとともにトリグリセリド分析用試
薬として調製すればよく、さらにこの組成物は一体型検
出用として固形フィルムに塗布したキットとなしてもよ
く、以上の様にして本発明のトリグリセリド分析用試薬
を得ることができる。
要に応じて添加される試薬として、非イオン性界面活性
剤、モノグリセリドからグリセロールおよび脂肪酸が生
成される作用を高める添加剤、生成されたグリセロール
を測定するための各酵素の作用を高める添加剤を適宜選
択添加してもよく、例を挙げれば、非イオン性界面活性
剤としては、例えばトリトンＸ−100（ローム・アンド
・ハス社製）等を0.05〜１％、グリセロールを測定する
ための各酵素の作用を高める添加剤としては、例えばグ
リセロキナーゼの作用を高める添加剤としては塩化マグ
ネシウム等を１〜10mM、また反応のpHを一定に保つため
に例えば、PIPES−NaOH緩衝液またはその他のグッドバ
ッファーを20〜500mM（pH6〜８、好ましくはpH7.3）を
適宜選択して用いればよい。これらの添加剤、生成され
たグリセロールを定量するための各酵素、および必要に
応じ生成した過酸化水素の測定のための指示薬組成物等
一定量を、適宜選択し用いて、例えばリパーゼおよびモ
ノグリセリドリパーゼとともにトリグリセリド分析用試
薬として調製すればよく、さらにこの組成物は一体型検
出用として固形フィルムに塗布したキットとなしてもよ
く、以上の様にして本発明のトリグリセリド分析用試薬
を得ることができる。
また、被検液中のトリグリセリド分析において、モノ
グリセリドの成分である上述のグリセロールの定量手段
の他に、同時に生成される脂肪酸を定量することにより
トリグリセリドの分析を行なってもよく、その場合はグ
リセロール定量試薬の代わりに脂肪酸定量のための試薬
を用いればよい（特開昭57−8797号）。
グリセリドの成分である上述のグリセロールの定量手段
の他に、同時に生成される脂肪酸を定量することにより
トリグリセリドの分析を行なってもよく、その場合はグ
リセロール定量試薬の代わりに脂肪酸定量のための試薬
を用いればよい（特開昭57−8797号）。
被検液としては、リパーゼの基質となるトリグリセリ
ドを含有する検体であれば何でもよく、特に生体内体液
試料、または血清などが挙げられ、分析に当り、一般に
0.01〜5mlの被検液を用いればよい。このような、トリ
グリセリドを含有する系を使用してそのトリグリセリド
を分析するもので、またこのトリグリセリドを本発明の
反応に従って分析する反応式を例示すれば次の通りであ
る（グリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法
を用いる系の場合）。
ドを含有する検体であれば何でもよく、特に生体内体液
試料、または血清などが挙げられ、分析に当り、一般に
0.01〜5mlの被検液を用いればよい。このような、トリ
グリセリドを含有する系を使用してそのトリグリセリド
を分析するもので、またこのトリグリセリドを本発明の
反応に従って分析する反応式を例示すれば次の通りであ
る（グリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法
を用いる系の場合）。
上記反応に基づいて、トリグリセリドを含有する被検
液と一定量の上述のトリグリセリド分析用試薬とをイン
キュベートせしめ、対応して消費される成分または生成
される成分を測定するものである。この測定する成分に
おいて、消費される成分として酸素の量を測定する場
合、上記した通り酸素電極または溶存酸素計を使用すれ
ばよく、この場合においては酸素の測定であるため上記
の反応系における過酸化水素の指示薬組成物の存在は必
要としないものであり、生成されるジヒドロキシアセト
ンリン酸を上記した通り測定する場合も同様である。反
応によって生成される成分の測定のうち、好ましくは過
酸化水素の量の測定であるが、この生成される過酸化水
素の量の測定においては上記した通りの過酸化水素の指
示薬組成物を用いて比色定量または蛍光定量もしくは発
光定量を行う他、過酸化水素電極計、例えばYSI社製−
オキシダーゼメーター等を用いてもよい。
液と一定量の上述のトリグリセリド分析用試薬とをイン
キュベートせしめ、対応して消費される成分または生成
される成分を測定するものである。この測定する成分に
おいて、消費される成分として酸素の量を測定する場
合、上記した通り酸素電極または溶存酸素計を使用すれ
ばよく、この場合においては酸素の測定であるため上記
の反応系における過酸化水素の指示薬組成物の存在は必
要としないものであり、生成されるジヒドロキシアセト
ンリン酸を上記した通り測定する場合も同様である。反
応によって生成される成分の測定のうち、好ましくは過
酸化水素の量の測定であるが、この生成される過酸化水
素の量の測定においては上記した通りの過酸化水素の指
示薬組成物を用いて比色定量または蛍光定量もしくは発
光定量を行う他、過酸化水素電極計、例えばYSI社製−
オキシダーゼメーター等を用いてもよい。
このように反応せしめるに当たっては反応系およびト
リグリセリドを含有する被検液を一定時間、一定温度、
好ましくは25〜40℃にて反応せしめればよく、その結
果、上記の如く反応系からなる消費される成分または生
成される成分を測定するものである。
リグリセリドを含有する被検液を一定時間、一定温度、
好ましくは25〜40℃にて反応せしめればよく、その結
果、上記の如く反応系からなる消費される成分または生
成される成分を測定するものである。
さらに、この測定において、消費される酸素の量、生
成される過酸化水素等の量を上記の種々の手段を用いて
求め、次いで対応するトリグリセリドの量をそれぞれ対
応する検量線より算出すればよく、さらに指示薬組成物
による過酸化水素の量の測定においてはその指示薬組成
物による比色に適する波長、例えば600nmまたは蛍光に
適する波長にて吸光度測定を行えばよい。
成される過酸化水素等の量を上記の種々の手段を用いて
求め、次いで対応するトリグリセリドの量をそれぞれ対
応する検量線より算出すればよく、さらに指示薬組成物
による過酸化水素の量の測定においてはその指示薬組成
物による比色に適する波長、例えば600nmまたは蛍光に
適する波長にて吸光度測定を行えばよい。
以上の如くして行うことにより、リパーゼ、モノグリ
セリドリパーゼを含有する系からなるトリグリセリドの
分析用試薬組成物、およびこれを用いてなる種々の分析
法を良好になし得るものであって、例えばトリグリセリ
ドの分析を自動分析機によって行っている臨床検査分野
においては、本発明によって短時間に反応が終了するこ
とにより、高濃度のトリグリセリドを含有する検体であ
っても精度良く分析をすることを可能ならしめるもので
ある。
セリドリパーゼを含有する系からなるトリグリセリドの
分析用試薬組成物、およびこれを用いてなる種々の分析
法を良好になし得るものであって、例えばトリグリセリ
ドの分析を自動分析機によって行っている臨床検査分野
においては、本発明によって短時間に反応が終了するこ
とにより、高濃度のトリグリセリドを含有する検体であ
っても精度良く分析をすることを可能ならしめるもので
ある。
次に、本発明の実施例を挙げるが、本発明は何らこれ
によって限定されるものではない。
によって限定されるものではない。
実施例１ 血清中トリグリセリドの分析用試薬組成 DAOS＊ 3,5−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハ
イドロキシ−３−スルホプロピル）−アニリン 上記組成のトリグリセリド分析用試薬（リパーゼは30
0U/ml含有する）において、モノグリセリドリパーゼの
添加量を無添加の場合と、モノグリセリドリパーゼを0.
2U/mlを添加した場合のトリグリセリド分析用試薬各々
3.0mlに、被検液として血清20μを各々加え、37℃で
反応を行い、600nmの吸光度を経時的に測定した。第１
図に示すように、モノグリセリドリパーゼ無添加の場合
（−○−）には反応の終了が不明確であり、ほぼ3.5分
以降に反応を終了すると判断できるのに対し、モノグリ
セリドリパーゼ0.2U/ml添加した場合（−●−）におい
ては２分で反応が平衡に達し明確に終了した。
イドロキシ−３−スルホプロピル）−アニリン 上記組成のトリグリセリド分析用試薬（リパーゼは30
0U/ml含有する）において、モノグリセリドリパーゼの
添加量を無添加の場合と、モノグリセリドリパーゼを0.
2U/mlを添加した場合のトリグリセリド分析用試薬各々
3.0mlに、被検液として血清20μを各々加え、37℃で
反応を行い、600nmの吸光度を経時的に測定した。第１
図に示すように、モノグリセリドリパーゼ無添加の場合
（−○−）には反応の終了が不明確であり、ほぼ3.5分
以降に反応を終了すると判断できるのに対し、モノグリ
セリドリパーゼ0.2U/ml添加した場合（−●−）におい
ては２分で反応が平衡に達し明確に終了した。
実施例２ 上記組成のトリグリセリド分析用試薬（233U/mlのリ
パーゼを含有する）において、モノグリセリドリパーゼ
の添加量を０〜0.2U/mlと変化させたトリグリセリド分
析用試薬各々3.0mlに、被検液として血清20μを各々
加え、37℃で反応を行い、発色反応が終点に達する時間
を測定した。第８図（−○−）に示すように、0.05U/ml
以上、好ましくは0.1U/ml以上のモノグリセリドリパー
ゼ添加で反応時間の短縮効果は飽和した。
パーゼを含有する）において、モノグリセリドリパーゼ
の添加量を０〜0.2U/mlと変化させたトリグリセリド分
析用試薬各々3.0mlに、被検液として血清20μを各々
加え、37℃で反応を行い、発色反応が終点に達する時間
を測定した。第８図（−○−）に示すように、0.05U/ml
以上、好ましくは0.1U/ml以上のモノグリセリドリパー
ゼ添加で反応時間の短縮効果は飽和した。
実施例３ 上記組成のトリグリセリド分析用試薬（リパーゼは30
0U/ml含有する）において、モノグリセリドリパーゼの
添加量を無添加の場合（第９図の−○−）と、モノグリ
セリドリパーゼを0.2U/ml添加した場合（第９図の−●
−）のトリグリセリド分析用試薬各々3.0mlに、被検液
として適宜した希釈高中性脂肪血清20μを加え、37℃
で３分間反応を行い、600nmの吸光度を測定した。その
結果、第９図に示すようにトリグリセリドはモノグリセ
リドリパーゼを0.2U/ml添加した場合においては1500mg/
dlまで直接的に測定できた。
0U/ml含有する）において、モノグリセリドリパーゼの
添加量を無添加の場合（第９図の−○−）と、モノグリ
セリドリパーゼを0.2U/ml添加した場合（第９図の−●
−）のトリグリセリド分析用試薬各々3.0mlに、被検液
として適宜した希釈高中性脂肪血清20μを加え、37℃
で３分間反応を行い、600nmの吸光度を測定した。その
結果、第９図に示すようにトリグリセリドはモノグリセ
リドリパーゼを0.2U/ml添加した場合においては1500mg/
dlまで直接的に測定できた。
＜発明の効果＞ 以上の如くして行うことにより、リパーゼ、モノグリ
セリドリパーゼを含有する系からなるトリグリセリドの
分析用試薬、およびこれを用いてなる種々の分析法を良
好になし得るものであって、例えばトリグリセリドの分
析を自動分析機によって行っている臨床検査分野におい
ては、本発明によって短時間に反応が終了することによ
り、高濃度のトリグリセリドを含有する検体であっても
精度良く分析することを可能ならしめるという有用なト
リグリセリドの分析用試薬および分析方法を提供し得る
ものである。
セリドリパーゼを含有する系からなるトリグリセリドの
分析用試薬、およびこれを用いてなる種々の分析法を良
好になし得るものであって、例えばトリグリセリドの分
析を自動分析機によって行っている臨床検査分野におい
ては、本発明によって短時間に反応が終了することによ
り、高濃度のトリグリセリドを含有する検体であっても
精度良く分析することを可能ならしめるという有用なト
リグリセリドの分析用試薬および分析方法を提供し得る
ものである。
第１図はモノグリセリドリパーゼを無添加の場合と0.2U
/ml添加した場合の、反応が終了する時間を示す。第２
図は本発明に用いるモノグリセリドリパーゼの至適pH曲
線、第３図は同酵素の至適温度曲線、第４図は同酵素の
pH安定性曲線、第５図は同酵素の熱安定性曲線、第６図
は同酵素の精製工程の溶出曲線、第７図はモノグリセリ
ドの検量線を示すものである。また第８図は血中トリグ
リセリド測定に及ぼすモノグリセリドリパーゼ添加の反
応時間短縮効果を示し、第９図はモノグリセリドリパー
ゼ無添加の場合と0.2U/ml添加した場合のトリグリセリ
ドの検量の直線性を示す。
/ml添加した場合の、反応が終了する時間を示す。第２
図は本発明に用いるモノグリセリドリパーゼの至適pH曲
線、第３図は同酵素の至適温度曲線、第４図は同酵素の
pH安定性曲線、第５図は同酵素の熱安定性曲線、第６図
は同酵素の精製工程の溶出曲線、第７図はモノグリセリ
ドの検量線を示すものである。また第８図は血中トリグ
リセリド測定に及ぼすモノグリセリドリパーゼ添加の反
応時間短縮効果を示し、第９図はモノグリセリドリパー
ゼ無添加の場合と0.2U/ml添加した場合のトリグリセリ
ドの検量の直線性を示す。
Claims (13)
- 【請求項１】少なくとも、リパーゼおよびモノグリセリ
ドリパーゼを含有することを特徴とするトリグリセリド
分析用試薬。 - 【請求項２】モノグリセリドリパーゼが、少なくとも下
記の式の酵素反応を触媒し、基質特異性としてモノグリ
セリドに作用するモノグリセリドリパーゼである特許請
求の範囲第１項記載のトリグリセリド分析用試薬。 モノグリセリド＋H2O→グリセロール＋脂肪酸 - 【請求項３】モノグリセリドリパーゼが、バチルス属に
属するモノグリセリドリパーゼ生産菌より得られた酵素
である特許請求の範囲第１項記載のトリグリセリド分析
用試薬。 - 【請求項４】少なくとも、リパーゼ、モノグリセリドリ
パーゼおよびグリセロール定量試薬を含有することを特
徴とするトリグリセリド分析用試薬。 - 【請求項５】グリセロール定量試薬が、少なくともグリ
セロールオキシダーゼまたは、グリセロキナーゼ、グリ
セロリン酸オキシダーゼおよびアデノシントリフォスフ
ェート（ATP）を含有する試薬である特許請求の範囲第
４項記載のトリグリセリド分析用試薬。 - 【請求項６】グリセロール定量試薬が、グリセロールを
定量する系における最終生成物である過酸化水素の存在
下で色調変化を受けることができる１種または２種以上
の指示薬組成物を含有する特許請求の範囲第４項記載の
トリグリセリド分析用試薬。 - 【請求項７】指示薬組成物が、呈色薬組成物、蛍光薬組
成物または発光薬組成物である特許請求の範囲第６項記
載のトリグリセリド分析用試薬。 - 【請求項８】呈色薬組成物が、少なくとも４−アミノア
ンチピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３
−スルホプロピル）メタ−トルイジン、フェノール、パ
ーオキシダーゼを含有してなる呈色薬組成物である特許
請求の範囲第７項記載のトリグリセリドの分析用試薬。 - 【請求項９】トリグリセリドを含有する被検液にリパー
ゼを作用せしめて遊離するグリセロールまたは脂肪酸を
測定する方法において、少なくともモノグリセリドリパ
ーゼを含有する系を作用せしめ、次いでグリセロールま
たは脂肪酸を測定する反応において消費される成分また
は生成される成分を測定することを特徴とするトリグリ
セリドの分析方法。 - 【請求項１０】モノグリセリドリパーゼを含有する系
が、少なくとも下記の式の酵素反応を触媒し、基質特異
性としてモノグリセリドに使用するモノグリセリドリパ
ーゼを含有する特許請求の範囲第９項記載のトリグリセ
リドの分析方法。 モノグリセリド＋H2O→グリセロール＋脂肪酸 - 【請求項１１】モノグリセリドリパーゼを含有する系
が、バチルス属に属するモノグリセリドリパーゼ生産菌
より得られたモノグリセリドリパーゼを含有する特許請
求の範囲第９項記載のトリグリセリドの分析方法。 - 【請求項１２】モノグリセリドリパーゼを含有する系
が、少なくともモノグリセリドリパーゼおよびリパーゼ
を含有する特許請求の範囲第９項記載のトリグリセリド
の分析方法。 - 【請求項１３】少なくとも、モノグリセリドリパーゼお
よびリパーゼを含有する系が、モノグリセリドリパー
ゼ、リパーゼおよびグリセロール定量試薬を含有する特
許請求の範囲第12項記載のトリグリセリドの分析方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63092912A JP2647684B2 (ja) | 1988-04-15 | 1988-04-15 | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 |
| IT8912472A IT1232776B (it) | 1988-04-15 | 1989-04-12 | Reagente per analisi dei trigliceridi ed analisi che utilizzano lo stesso |
| FR8904903A FR2630129A1 (fr) | 1988-04-15 | 1989-04-13 | Reactif pour l'analyse des triglycerides et procede d'analyse le mettant en oeuvre |
| DE3912226A DE3912226C2 (de) | 1988-04-15 | 1989-04-13 | Reagens für die Analyse von Triglyceriden und Analysenmethode für Triglyceride |
| US07/435,003 US5126246A (en) | 1988-04-15 | 1989-11-09 | Reagent for analysis of triglycerides and analysis using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63092912A JP2647684B2 (ja) | 1988-04-15 | 1988-04-15 | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01265899A JPH01265899A (ja) | 1989-10-23 |
| JP2647684B2 true JP2647684B2 (ja) | 1997-08-27 |
Family
ID=14067695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63092912A Expired - Lifetime JP2647684B2 (ja) | 1988-04-15 | 1988-04-15 | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 |
Country Status (5)
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| JP (1) | JP2647684B2 (ja) |
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| FR (1) | FR2630129A1 (ja) |
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| EP1474692B1 (en) * | 2001-12-28 | 2014-12-17 | Polymer Technology Systems, Inc. | Test strip for determining concentration of multiple analytes in a single fluid sample |
| US20050074828A1 (en) * | 2003-07-16 | 2005-04-07 | Dimagno Theodore John | Uae of lipase for high-density lipoprotein cholesterol detection |
| JP5711089B2 (ja) * | 2011-09-27 | 2015-04-30 | 築野食品工業株式会社 | 近赤外分光法を用いた玄米中のトリアシルグリセロールの定量方法 |
| CN103160484A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-06-19 | 甘肃农业大学 | 麸皮液体发酵制备米黑毛霉凝乳酶的方法 |
Family Cites Families (13)
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|---|---|---|---|---|
| US4056442A (en) * | 1976-06-01 | 1977-11-01 | The Dow Chemical Company | Lipase composition for glycerol ester determination |
| JPS5542532A (en) * | 1978-09-19 | 1980-03-25 | Maruho Kk | Novel monoglyceride-lipase |
| US4259440A (en) * | 1979-05-21 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Hydrolysis and assay of triglycerides |
| JPS5628516A (en) * | 1979-08-15 | 1981-03-20 | Nec Corp | Waveform equalizer |
| JPS5628517A (en) * | 1979-08-16 | 1981-03-20 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Tuning indicating unit |
| JPS5742312A (en) * | 1980-08-29 | 1982-03-09 | Inoue Japax Res Inc | Rotary thin plate type filtering device |
| JPS5752835A (en) * | 1980-09-16 | 1982-03-29 | Tamura Electric Works Ltd | Temperature sensor element |
| JPS5759753A (en) * | 1980-09-27 | 1982-04-10 | Matsushita Electric Works Ltd | Manufacture of aggregate wood |
| JPS578797A (en) * | 1981-03-24 | 1982-01-18 | Nippon Shoji Kk | Method and reagent for quantitative determination of free fatty acid |
| CA1182725A (en) * | 1982-08-11 | 1985-02-19 | John C. Mauck | Methods, compositions and elements for the determination of lipase |
| US4999289A (en) * | 1986-04-10 | 1991-03-12 | Amano Pharmaceutical Co. Ltd., | Lipase, its production and use for assay of triglycerides |
| JPS63245672A (ja) * | 1987-04-01 | 1988-10-12 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規なモノグリセリドリパ−ゼ、その製法およびそれを用いる分析法 |
| JP2995252B2 (ja) * | 1993-03-25 | 1999-12-27 | 新明和工業株式会社 | 下水用ポンプシステム |
-
1988
- 1988-04-15 JP JP63092912A patent/JP2647684B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-12 IT IT8912472A patent/IT1232776B/it active
- 1989-04-13 FR FR8904903A patent/FR2630129A1/fr active Granted
- 1989-04-13 DE DE3912226A patent/DE3912226C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-09 US US07/435,003 patent/US5126246A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3912226A1 (de) | 1989-11-09 |
| IT8912472A0 (it) | 1989-04-12 |
| US5126246A (en) | 1992-06-30 |
| FR2630129B1 (ja) | 1994-07-13 |
| FR2630129A1 (fr) | 1989-10-20 |
| DE3912226C2 (de) | 1996-05-09 |
| IT1232776B (it) | 1992-03-05 |
| JPH01265899A (ja) | 1989-10-23 |
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|---|---|---|---|
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