JPS62240000A - トリグリセライドの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明は酵素によりトリグリセライドを分解する方法に
関する。さらに詳細には、血清などの生体体液試料に含
まれるトリグリセライドにペニシリウム属由来のリパー
ゼを作用せしめこれを分解する方法に関する。本発明は
血清などのトリグリセライドの測定に用いられる。

従来の技術 血清などの生体体液試料中に存在するトリグリセライド
を酵素リパーゼで分解し、遊離した脂肪酸またはグリセ
ロールを定量することによってトリグリセライドを測定
する方法が知られているが、実用に供されている方法は
ほとんどがグリセロールを定量する方法である。遊離し
たグリセロールは、グリセロールキナーゼ、グリセロー
ルデヒドロゲナーゼまたはグリセロールオキシダーゼに
よりさらに検出可能な生成物に変換されたうえ測定され
る。

血清中のトリグリセライドの分解のため最初に用いられ
たリパーゼは動物の膵臓に由来するリパーゼであった。

しかしこの酵素はトリグリセライドを完全には分解でき
なかった。トリグリセライドを酵素により完全に分解す
るため微生物を起源とするリパーゼの検索、性質の異な
るリパーゼの組み合わせによる分解、リパーゼと化学的
薬剤の組み合わせによる分解が研究された。例えば、リ
ゾーブス・アリザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚ
ｕｓ　）のリパーゼ（特公昭５９−１５６３８、特開昭
５２−２５６９３）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　）　Ｈのリパーゼ（特開昭４９−５０９９
０、同４９−６９１８６、同４９−８９５９６、同４９
−１１３６９５、同５７−５８８９８）　、リパーゼと
プロテアーゼの併用（特公昭５４−９５１８、特開昭５
３−１１４４９３　）、リゾープス・アリザスのリパー
ゼ、ブタ肝臓由来のカルボキシルエステラーゼおよびア
ルカリ金属またはアルカリ土類金属のアルキル硫酸塩の
組み合わせ（特開昭４９−６４４９５）　、カンジダ（
Ｃａｎｄｉｄａ　）属のリパーゼ、すい臓リパーゼおよ
び胆汁酸塩の組み合わせ（特開昭５２−１１９８７）　
、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　）属のリパーゼ（特開昭５１−６８２９７、同５１
−７４６９２、同５７−５８８９８）　、リゾーブス・
アリザスのリパーゼとカンジダ・シリンドラツセ（Ｃ，
ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）のリパーゼの組み合わせ（特
開昭５２−２５６９４、特公昭５６−２９　）、カンジ
ダ・ルゴーサ（Ｃ，ｒｕｇｏｓａ　）のリパーゼと界面
活性剤の組み合わせ（特公昭５７−３９１５８）　、リ
ゾープス・アリザスのリパーゼとシュードモナス・フル
オレッセンス（Ｐ、　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のリパ
ーゼの組み合わせ（特公昭５７−２８２７６）　、リゾ
ーブス属などのリパーゼとコレステロールエステラーゼ
の組み合わせ（特公昭５６−４６７９９）　、リパーゼ
と界面活性剤。

フェノール誘導体若しくはアニリン誘導体の組み合わせ
（特公昭５Ｂ−５６７７）が知られている。

またシュードモナス属の生産するある種のリパーゼが、
グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に対する割合が
１％以上であることも知られている（特開昭５９−１８
７７８０　）。

本発明者らは、血清トリグリセライドの分解のためにペ
ニシリウム属由来のリパーゼが有効であるという報告を
知らないが、ペニシリウム属がリパーゼを産生ずること
は公知である。　１ｗａｉらはペニシリウム・サイクロ
ピウム・ウェストリング（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃ
ｙｃｌｏｐｉｕｍ　Ｗｅｓｔｒｉｎｇ）株が、２種のリ
パーゼを産生ずることを報告している（Ａｇｒ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　１０６３−１０７０頁、第
３９巻、　　１９８０年）。

彼Ｗは又、ペニシリウム・サイクロピウムＭ１株が、２
種のリパーゼを産生ずることを報告している（Ｊ　、Ｂ
ｉｏｃｈｅ＋ｗ、、　２０５　２１１頁、第８７巻、　
１９８０年）。

発明が解決しようとする問題点 上述した面清中のトリグリセライドの分解に関する先行
技術において、単独で用いられた微生物由来のリパーゼ
は依然としてトリグリセライドを十分に分解することが
できないか、または分解速度が緩やかであった。あるい
は、これらのリパーゼはトリグリセライド測定用試薬組
成物に含まれる界面活性剤により活性が阻害されるとい
う欠点があった。また、起源の異なる複数のリパーゼを
組み合わせて用いる場合はその製造がやっかいである。

本発明はこれらの問題を解決して、単独で用いても十分
にトリグリセライドを分解することができ、且つトリグ
リセライドの測定において脂肪の乳化に用いられる界面
活性剤、例えばポリエチレングリコールアルキルフェニ
ルエーテル系などの界面活性剤による活性の阻害を実質
的に受けることのないリパーゼを用いるトリグリセライ
ドの分解方法を提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

問題点を解決するための手段 本発明によれば、血清などの生体体液試料に含まれるト
リグリセライドをペニシリウム属由来のリパーゼで分解
する方法が提供される。本発明で用いられるリパーゼは
、トリグリセライドによく作用し、グリセロール生成活
性の脂肪酸生成活性に対する割合が５％以上であり界面
活性剤により活性化され、その濃度が少なくとも５％以
下の範囲において実質的に活性が阻害されないという優
れた性質を有する。

本発明で用いられるリパーゼはペニシリウム属に属する
菌株の培養によって得られる。ペニシリウム属菌株とし
て、特に好ましくはペニシリウム・サイクロピウムＡＴ
ＣＣ３４６１３（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐ
ｉｕｍ　ＡＴＣＣ３４６１３）が挙げられる。

ペニシリウム・サイクロピウムＡＴＣＣ３４６１３は少
なくとも３種類の異なる性質のリパーゼを生産すること
を確認した。本発明で用いられるリパーゼはそのうちの
一つで前述した公知の２種とは明らかに異なる新規なリ
パーゼである。このリパーゼは以下に示す理化学的性質
を示す。

（１）作用ニ トリグリセライドに作用しグリセロール生成活性の脂肪
酸生成活性に対する割合が５％以上である。

（２）基質特異性； 炭素数４〜１８の脂肪酸のトリグリセライドをよく分解
する。

（３）至適ｐＨの範囲：ｐＨ５〜７ （４）安定ｐＨの範囲： ｐ１１３〜８において、３７℃、３０分間処理した後残
存活性を測定したところ、約４．５〜６のｐＨの範囲で
安定であった。

（５）作用適温の範囲＝３５〜４０″Ｃ（６）温度安定
性： ｐｌ＋　７．．０において、０〜５０℃の各温度で３０
分間処理した後、残存活性を測定したところ、約３５℃
まで安定であった。

（７）阻害、活性化および安定化： 界面活性剤により活性化され、その濃度が少なくとも５
％以下の範囲において実質的に活性が阻害されない。

（８）分子量：約１１０，０００　　（セファデックス
Ｇ−１００を用いたゲルろ過性による） （９）等電点：　ｐＨ３，８４（アンホラインを用いた
等重点電気泳動法による） （１０）結晶形：菱形、板状 本発明で用いられるペニシリウム属由来のリパーゼのト
リグリセライドに対する反応性を、公知のシュードモナ
ス属由来のリパーゼ（商標名：リポプロティンリパーゼ
・タイプＡ、東洋紡績社製）およびクロモバクテリウム
属由来のリパーゼ（東洋醸造社ｔ！りと対比して第１表
に示す。

第１表 本発明で用いられるペニシリウム属由来のリパーゼと前
述の公知のリパーゼは界面活性剤に対する感受性および
脂肪酸とグリセロールの生成速度の点で最も異なる。即
ち、本発明で用いられるリパーゼは約５％という高濃度
の界面活性剤の存在下でも実質的に活性阻害を受けるこ
とがない。この性質はリパーゼにより血清中のトリグリ
セライドを分解する場合に極めて重要である。

本発明に従いトリグリセライドを分解するには、前記ペ
ニシリウム属由来のリパーゼと血清などの生体体液試料
を混合し、適当な温度でインキエヘートする。反応混合
物には界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤
としては、ポリエチレングリコールアルキルフェニルエ
ーテル系、ノニルフェノールエトキシレート系、第２ｍ
１ｆ鎖アルコールエトキシレート系などの非イオン性界
面活性剤が例示奎れる。界面活性剤の添加量は、リパー
ゼが十分に活性化される濃度でよく、通常０．０１〜５
％である。リパーゼの使用量は試料１　ｍｇ当りグリセ
ロール生成活性で０．１〜５単位、インキュベートの温
度は２０〜４０℃、反応液のｐｌｌは６〜８がそれぞれ
好ましい。

本発明法をトリグリセライドの測定に用いる場合は、ト
リグリセライドから遊離したグリセロールを測定するこ
とによってトリグリセライドが定量される。グリセロー
ルの測定は公知の方法が用いられる。

本発明において、リパーゼ活性の表示は、基質オリーブ
オイル乳化液に３７℃においてリパーゼを作用させたと
き、１分間に１マイクロ当量のグリセロールを生成する
量を１単位とした。

酵素活性測定法 １）グリセロール生成活性 オリーブ油乳化液を基質に、生成するグリセロールを酵
素法で測定する。

＋ｌ）試薬 ａ）基質ニオリーブ油（半井化学製）　Ｌｏｇ、トリト
ンＸ　−１００Ｌｏｇ、精製水３０ｍを攪拌子を用い３
０分間攪拌乳化する。次いでこれに１０％生血清アルブ
ミン（フラクション■）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐ）＋　６．５）を２０−を添加混合する。

ｂ）グリセロール測定試薬：１００−のＭＥＳ（２−（
Ｎ−モノホリノ）エタン−スルホン酸〕緩衝液（ｐＨ６
，５）に下記の試薬を熔解する。

トリトンＸ−１０００，１ｇ＋　Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
６４．６■、４−アミノアンチピリン　１０．２■、Ｅ
ＤＴＡ・２ナトリウム　３７．２■、アデノシン酸リン
酸・２ナトリウム２００■、塩化マグネシウム・６水塩
　４０．７■、グリセロールキナーゼ　５０単位、グリ
セロリン酸オキシダーゼ４００単位、ペルオキシダーゼ
２００単位。

（２）操作 基質１．０−を試験管にとり３７℃で予備加温する。こ
れに希釈酵素液０．１−を加え反応を開始する。３７℃
で１５分間反応後、０．２Ｍ　トリクロル酢酸液２．０
ｄを加え反応を停止する。反応停止液を東洋ろ紙（Ｉｋ
　１３１）を用いてろ過する。ろ？＆０．０２−をグリ
セロール測定試薬３−中に加え、３７℃で１０分間加温
し５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。

（３）活性表示 １分間に１マイクロモルのグリセロールを生成する酵素
量を１単位とした。

２）脂肪酸生成活性 オリーブ油乳化液を基質に、生成する脂肪酸を水酸化ナ
トリウム溶液で滴定し測定する。

（１）操作 上記基質１．０−を試験管にとり、３７℃で予備加温す
る。これに希釈酵素液０．１ｍｌ’を加え反応を開始す
る。３７°Ｃで１５分間反応後、２．５−のエタノール
−アセトン混液（１：　１）を加え反応を停止する。指
示薬としてフェノールフタレインを数滴加え１／２０Ｍ
水酸化ナトリウムで滴定する。

（２）活性表示 １　分間ニＬマイクロモルの脂肪酸を生成する酵素量を
１単位とした。

参考例１　リパーゼの開裂 米？ｌｉ　２％、コーンスチープリカ−１，５％からな
る培地（ｐＨ６，０）　２０１の入ったジャーファーメ
ンタ−にペニシリウム・サイクロピウムＡＴＣＣ３４６
１３を接種し、２５℃において２４時間培養して種培養
液とした。上記と同じ組成の培地が５００　＃入った発
酵槽に種培養液を接種し、２５℃において４０時間培養
した。培養液をろ過して菌体を除き、得られたろ液を限
外ろ過により濃縮した。濃縮液に硫酸アンモニウムを７
５％飽和に加え、生成した沈澱を集め１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）　２Ｏｆに溶解した。

この溶液を限外ろ過により脱塩した後、あらかじめ同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース２　ｋｇを加え
た。同緩衝液３０ｊ２を用いてＤＥＡＥ−セルロースを
洗浄した後、０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液
を加え、得られた溶出液を限外ろ過により脱塩、濃縮し
た。この液をあらかじめ１０ｍＭリン酸＠衝液（ｐｔ（
７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（ファル
マシア社製）を充愼したカラムに通した。カラムを０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含む同＠術液で洗浄した後、塩化
ナトリウムの濃度を０．１〜０．２５Ｍに上げる直線濃
度勾配法により溶出を行った。リパーゼ活性は３つのピ
ークに分かれた（第１図に示す）。第２の活性ピークの
両分を集めて硫安堰折に付し、５５％飽和から７５％飽
和の範囲で生成した沈澱を集めた。沈澱を１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、限外ろ過により脱塩
した後、凍結乾燥を行うことにより精製リパーゼ標品を
得た。この精製標品をハイドロキシアパタイトを用いた
カラムクロマトグラフィーに付した後、硫安溶液より結
晶化を行った。結晶形は菱形、板状であった。

上記で得られた精製標品は、比活性が９．２Ｕ／■蛋白
であり、培養液から約１３０倍に精製され、収率は約１
７％であった。

参考例２ 参考例１において、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロ
マトグラフィーで得られた第１および第３の活性ピーク
の両分をそれぞれさらに精製した。

第１の活性ピークから得られた標品は、トリブチリンに
よ（作用し、脂肪酸のメチルエステルに対する作用は弱
いという性質を示し、第３の活性ピークから得られた標
品は、脂肪酸のモノグリセライドにはよく作用するが、
トリグリセライドに対する作用は弱いという性質を示し
た。これらの性質は前掲の先行技術に開示されたリパー
ゼに相当するものである。

実施例１ 参考例１で得られたペニシリウム属由来のリパーゼを血
清脂質に作用せしめ、生成したグリセロールを測定する
ことによりリパーゼの脂質への反応性をみた。

即ち、０．５０／ｍｅグリセロールキナーゼ、４Ｕ／ｒ
！Ｉｌα−グリセロホスフェートオキシダーゼ、２Ｕ／
−ペルオキシダーゼ、３．３　ｍＭアデノシン三リン酸
、０．５ｍＭ４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭ　　
ＴＯＯ３（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）　−ｍ−トルイジン）、２ｍＭ塩化マグ
ネシウム・６水塩、０．５Ｕ／ｒｎ！のペニシリウム属
由来のリパーゼ、およびＯ，ＯＳ〜５．０％の範囲の濃
度のポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフェニル
エーテル（商標名ニトリトンＸ　−１００゜Ｒｏｈｍ　
＆　Ｈａａｓ社製）を含む０．１Ｍ−Ｐ　Ｉ　ＦＥＳ緩
衝液（ｐＨ６，５）　１．０−と標準血清試料（商標：
リピツドセーラム■”栄研”、栄研化学社製）０．０１
−を混合し、３７℃において１０分間インキュベートし
た。反応液の５５５　ｎｍにおける吸光度を測定し、試
料中のトリグリセライド（トリオレイン換算）濃度を算
出した。使用したトリトンＸ　−１００の濃度と測定値
を第２表に示す。ペニシリウム属由来のリパーゼは、５
％という高濃度の界面活性剤によっても活性が阻害され
ないことが分かる。

第２表 実施例２ ０．５Ｕ／ｍｆ！グリセロールキナーゼ、４Ｕ／ｍα−
グリセロホスフェートオキシダーゼ、２Ｕ／ｍ！ペルオ
キシダーゼ、３．３ｍＭアデノシン三リン酸、０．５　
ｍＭ　４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭＴＯＯ３，
２ｍＭ塩化マグネシウム・６水塩、および０．１〜１．
０％の濃度のトリトンＸ　−１００を含む０．１Ｍ−Ｐ
　Ｉ　Ｐ　Ｅ　５ｉｆｉ液（ｐＨ６，５）　１．Ｏｒｎ
ｆ！と２５Ｕ／−のペニシリウム属由来のリパーゼ０．
０２１ｎ！を混合し、３７℃において５分間インキュベ
ートした。次いで、血清試料０．０１−を添加し、経時
的に５５５　ｎｍにおける吸光度を測定した。

トリトンＸ　−１００の濃度とリパーゼの反応性の関係
を第２図に示す。ペニシリウム属由来のリパーゼはトリ
トンＸ　−１００によって活性化され、その効果は０．
１〜１．０％の範囲においてほとんど変わらないことが
分かる。

比較例１ 各種リパーゼのグリセロール生成活性と脂肪酸生成活性
を測定したところ、本酵素はシュードモナス属（東洋紡
績社、大野製薬社製）、クロモバクテリウム属（東洋醸
造社製）由来の市、販リパーゼに比べ、脂肪酸生成活性
に対し、グリセロール生成活性が著しく高い特性を有す
る。

第３表 比較例２ 実施例２において、ペニシリウム属由来のリパーゼに代
えて市販のシュードモナス属由来のリパーゼ（商標名：
　Ｌ　Ｐ　Ｌ　”　Ａｍａｎｏ　”　ＩＩＩ　、大野製
薬社製）、クロモバクテリウム属由来のリパーゼ（東洋
醸造社製）またはシュードモナス属由来のりバーゼ（商
標名：リボプロティンリパーゼ・タイプＡ、東洋紡績社
製）をそれぞれ表示活性で５０Ｕ　／−１１００Ｕ／ｄ
および０．２Ｕ／艷用いた以外は同様に操作した。

トリトンＸ　−１００の濃度と各リパーゼの反応性の関
係を第３図Ａ〜第３図Ｃに示す。第３図ＡはＬＰＬ″Ａ
ｍａｎｏ″■、第３図Ｂはクロモバクテリウム属由来の
リパーゼ、第３図Ｃはリボプロティンリパーゼ・タイプ
Ａをそれぞれ用いた場合を表す。

これら公知のリパーゼは、いずれもトリトンＸ−１００
の濃度が高くなるにしたがい活性が阻害されることがわ
かる。

実施例３ 実施例２において、トリトンＸ　−１００に代えて０．
１〜０．５％のノニルフェノールエトキシレート系界面
活性剤（商標名ニアデカトールＮＰ−７００、旭電化社
製）または０．１〜０．５％の第２級直鎖アルコールエ
トキシレート系界面活性剤（商標名ニアデカトール５Ｏ
−１３５、旭電化社製）を用いた以外は同様に操作した
。

界面活性剤の濃度とリパーゼの反応性の関係を第４図お
よび第５図に示す。第４図および第５図はそれぞれノニ
ルフェノールエトキシレート系界面活性剤および第２級
直鎖アルコールエトキシレート系界面活性剤を用いた場
合を表す。ペニシリウム属由来のリパーゼはこれらの界
面活性剤によって実質的に阻害されないことが分かる。

〔発明の効果〕

本発明に従えば、ペニシリウム属由来のリパーゼを界面
活性剤の存在下トリグリセライドに作用させたとき、リ
パーゼは界面活性剤による活性阻害を受けることなくト
リグリセライドをほぼ完全に分解することができた。本
発明法は生体体液中のトリグリセライドの測定に用いる
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ペニシリウム・サイクロピウムΔＴＣＣ３４
６１３の産生する３種のリパーゼのＤＥＡＥ−セファロ
ースによるカラムクロマトグラフィーのパターンを表す
図である。 第２図は、トリトンＸ　−１００の濃度とペニシリウム
属由来のリパーゼの反応性の関係を表す図である。同じ
く第３図Ａはシュードモナス属由来のリパーゼ（ＬＰＬ
”Ａｍａｎｏ　”　ｎＩ）　、第３図Ｂはクロモバクテ
リウム属由来のリパーゼ、第３図Ｃはシュードモナス属
由来のリパーゼ（リポプロティンリパーゼ・タイプＡ）
の反応性を表す図である。 第４図は、ノニルフェノールエトキシレート系界面活性
剤の濃度とペニシリウム属由来のリパーゼの反応性の関
係を表す図であり、同じく第５図は、第２級直鎖アルコ
ールエトキシレート系界面活性剤の濃度と反応性の関係
を表す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　生体体液試料に含まれるトリグリセライドによく作
   用し、グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に対する
   割合が５％以上であり界面活性剤により活性化され、そ
   の濃度が少なくとも５％以下の範囲において実質的に活
   性が阻害されない性質を有するリパーゼを作用せしめる
   ことを特徴とするトリグリセライドの測定方法。 ２　界面活性剤が非イオン性界面活性剤である特許請求
   の範囲第１項記載のトリグリセライドの測定方法。 ３　非イオン性界面活性剤がポリエチレングリコールア
   ルキルエーテル系の界面活性剤である特許請求の範囲第
   ２項記載のトリグリセライドの測定方法。 ４　リパーゼがペニシリウム属の生産するリパーゼであ
   る特許請求の範囲第１項記載のトリグリセライドの測定
   方法。 ５　ペニシリウム属の菌株がペニシリウム・サイクロピ
   ウムである特許請求の範囲第１項記載のトリグリセライ
   ドの測定方法。