JPH0651000B2 - トリグリセライドの測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明は酵素によりトリグリセライドを分解する方法に
関する。さらに詳細には、血清などの生体体液試料に含
まれるトリグリセライドにペニシリウム属由来のリパー
ゼを作用せしめこれを分解する方法に関する。本発明は
血清などのトリグリセライドの測定に用いられる。

従来の技術 血清などの生体体液試料中に存在するトリグリセライド
を酵素リパーゼで分解し、遊離した脂肪酸またはグリセ
ロールを定量することによってトリグリセライドを測定
する方法が知られているが、実用に供されている方法は
ほとんどがグリセロールを定量する方法である。遊離し
たグリセロールは、グリセロールキナーゼ、グリセロー
ルデヒドロゲナーゼまたはグリセロールオキシダーゼに
よりさらに検出可能な生成物に変換されたうえ測定され
る。

血清中のトリグリセライドの分解のため最初に用いられ
たリパーゼは動物の膵臓に由来するリパーゼであった。
しかしこの酵素はトリグリセライドを完全には分解でき
なかった。トリグリセライドを酵素により完全に分解す
るため微生物を起源とするリパーゼの検索、性質の異な
るリパーゼの組み合わせによる分解、リパーゼと化学的
薬剤の組み合わせによる分解が研究された。例えば、リ
ゾープス・アリザス（Rhizopus arrhizus）のリパーゼ
（特公昭59-15638、特開昭52-25693）、シユードモナス
（Pseudomonas）属のリパーゼ（特開昭49-50990、同49-
69186、同49-89596、同49-113695、同57-58898）、リパ
ーゼとプロテアーゼの併用（特公昭54-9518、特開昭53-
114493）、リゾープス・アリザスのリパーゼ、ブタ肝臓
由来のカルボキシルエステラーゼおよびアルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属のアルキル硫酸塩の組み合わせ
（特開昭49-64495）、カンジダ（Candida）属のリパー
ゼ，すい臓リパーゼおよび胆汁酸塩の組み合わせ（特開
昭52-11987）、クロモバクテリウム（Chromobacteriu
m）属のリパーゼ（特開昭51-68297、同51-74692、同57-
58898）、リゾープス・アリザスのリパーゼとカンジダ
・シリンドラツセ（C.cylindracea）のリパーゼの組み
合わせ（特開昭52-25694、特公昭56-29）、カンジダ・
ルゴーサ（C.rugosa）のリパーゼと界面活性剤の組み合
わせ（特公昭57-39158）、リゾープス・アリザスのリパ
ーゼとシユードモナス・フルオレツセンス（P.fluoresc
ens）のリパーゼの組み合わせ（特公昭57-28276）、リ
ゾープス属などのリパーゼとコレステロールエステラー
ゼの組み合わせ（特公昭56-46799）、リパーゼと界面活
性剤，フエノール誘導体若しくはアニリン誘導体の組み
合わせ（特公昭58-5677）が知られている。

またシユードモナス属の生産するある種のリパーゼが、
グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に対する割合が
１％以上であることも知られている（特開昭59-18778
0）。

本発明者らは、血清トリグリセライドの分解のためにペ
ニシリウム属由来のリパーゼが有効であるという報告を
知らないが、ペニシリウム属がリパーゼを産生すること
は公知である。Iwaiらはペニシリウム・サイクロピウム
・ウエストリング（Penicillium cyclopium Westring）
株が、２種のリパーゼを産生することを報告している
（Agr.Biol.Chem.,1063-1070頁，第39巻，1980年）。彼
等は又、ペニシリウム・サイクロピウムＭ１株が、２種
のリパーゼを産生することを報告している（J .Bioche
m.,205-211頁，第87巻，1980年）。

発明が解決しようとする問題点 上述した血清中のトリグリセライドの分解に関する先行
技術において、単独で用いられた微生物由来のリパーゼ
は依然としてトリグリセライドを十分に分解することが
できないか、または分解速度が緩やかであった。あるい
は、これらのリパーゼはトリグリセライド測定用試薬組
成物に含まれる界面活性剤により活性が阻害されるとい
う欠点があった。また、起源の異なる複数のリパーゼを
組み合わせて用いる場合はその製造がやっかいである。

本発明はこれらの問題を解決して、単独で用いても十分
にトリグリセライドを分解することができ、且つトリグ
リセライドの測定において脂肪の乳化に用いられる界面
活性剤、例えばポリエチレングリコールアルキルフエニ
ルエーテル系などの界面活性剤による活性の阻害を実質
的に受けることのないリパーゼを用いるトリグリセライ
ドの分解方法を提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

問題点を解決するための手段 本発明によれば、血清などの生体体液試料に含まれるト
リグリセライドをペニシリウム属由来のリパーゼで分解
する方法が提供される。本発明で用いられるリパーゼ
は、トリグリセライドによく作用し、グリセロール生成
活性の脂肪酸生成活性に対する割合が５％以上であり界
面活性剤により活性化され、その濃度が少なくとも５％
以下の範囲において実質的に活性が阻害されないという
優れた性質を有する。

本発明で用いられるリパーゼはペニシリウム属に属する
菌株の培養によって得られる。ペニシリウム属菌株とし
て、特に好ましくはペニシリウム・サイクロピウムATCC
34613（Penicillium cyclopium ATCC 34613）が挙げら
れる。

ペニシリウム・サイクロピウムATCC 34613は少なくとも
３種類の異なる性質のリパーゼを生産することを確認し
た。本発明で用いられるリパーゼはそのうちの一つで前
述した公知の２種とは明らかに異なる新規なリパーゼで
ある。このリパーゼは以下に示す理化学的性質を示す。

（１）作用： トリグリセライドに作用しグリセロール生成活性の脂肪
酸生成活性に対する割合が５％以上である。

（２）基質特異性： 炭素数４〜18の脂肪酸のトリグリセライドをよく分解す
る。

（３）至適pHの範囲：pH５〜７ （４）安定pHの範囲： pH３〜８において、37℃、30分間処理した後残存活性を
測定したところ、約4.5〜６のpHの範囲で安定であっ
た。

（５）作用適温の範囲：35〜40℃ （６）温度安定性： pH7.0において、０〜50℃の各温度で30分間処理した
後、残存活性を測定したところ、約35℃まで安定であっ
た。

（７）阻害、活性化および安定化： 界面活性剤により活性化され、その濃度が少なくとも５
％以下の範囲において実質的に活性が阻害されない。

（８）分子量：約110,000（セフアデツクスＧ−100を用
いたゲルろ過法による） （９）等電点：pH3.84（アンホラインを用いた等電点電
気泳動法による） (10)結晶形：菱形、板状 本発明で用いられるペニシリウム属由来のリパーゼのト
リグリセライドに対する反応性を、公知のシユードモナ
ス属由来のリパーゼ（商標名：リポプロテインリパーゼ
・タイプＡ、東洋紡績社製）およびクロモバクテリウム
属由来のリパーゼ（東洋醸造社製）と対比して第１表に
示す。

本発明で用いられるペニシリウム属由来のリパーゼと前
述の公知のリパーゼは界面活性剤に対する感受性および
脂肪酸とグリセロールの生成速度の点で最も異なる。即
ち、本発明で用いられるリパーゼは約５％という高濃度
の界面活性剤の存在下でも実質的に活性阻害を受けるこ
とがない。この性質はリパーゼにより血清中のトリグリ
セライドを分解する場合に極めて重要である。

本発明に従いトリグリセライドを分解するには、前記ペ
ニシリウム属由来のリパーゼと血清などの生体体液試料
を混合し、適当な温度でインキュベートする。反応混合
物には界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤
としては、ポリエチレングリコールアルキルフエニルエ
ーテル系、ノニルフエノールエトキシレート系、第２級
直鎖アルコールエトキシレート系などの非イオン性界面
活性剤が例示される。界面活性剤の添加量は、リパーゼ
が十分に活性化される濃度でよく、通常0.01〜５％であ
る。リパーゼの使用量は試料１ml当りグリセロール生成
活性で0.1〜５単位、インキュベートの温度は20〜40
℃、反応液のpHは６〜８がそれぞれ好ましい。

本発明法をトリグリセライドの測定に用いる場合は、ト
リグリセライドから遊離したグリセロールを測定するこ
とによってトリグリセライドが定量される。グリセロー
ルの測定は公知の方法が用いられる。

本発明において、リパーゼ活性の表示は、基質オリーブ
オイル乳化液に37℃においてリパーゼを作用させたと
き、１分間に１マイクロ当量のグリセロールを生成する
量を１単位とした。

酵素活性測定法 １）グリセロール生成活性 オリーブ油乳化液を基質に、生成するグリセロールを酵
素法で測定する。

(1)試薬 ａ）基質：オリーブ油（半井化学製）10g、トリトンＸ
−100 10g、精製水30mlを撹拌子を用い30分間撹拌乳化
する。次いでこれに10％牛血清アルブミン（フラクシヨ
ンＶ）を含む50mMリン酸緩衝液（pH6.5）を20mlを添加
混合する。

ｂ）グリセロール測定試薬：100mlのＭＥＳ〔2-（N-モ
ノホリノ）エタン−スルホン酸〕緩衝液（pH6.5）に下
記の試薬を溶解する。

トリトンＸ−100 0.1g，N-エチル−N-（2-ヒドロキシ-3
-スルホプロピル）−m-トルイジン64.6mg，４−アミノ
アンチピリン10.2mg，ＥＤＴＡ・２ナトリウム37.2mg，
アデノシン酸リン酸・２ナトリウム200mg，塩化マグネ
シウム・６水塩40.7mg，グリセロールキナーゼ50単位，
グリセロリン酸オキシダーゼ400単位，ペルオキシダー
ゼ200単位。

(2)操作 基質1.0mlを試験管にとり37℃で予備加温する。これに
希釈酵素液0.1mlを加え反応を開始する。37℃で15分間
反応後、0.2Mトリクロル酢酸液2.0mlを加え反応を停止
する。反応停止液を東洋ろ紙（No.131）を用いてろ過す
る。ろ液0.02mlをグリセロール測定試薬３ml中に加え、
37℃で10分間加温し555nmにおける吸光度を測定する。

(3)活性表示 １分間に１マイクロモルのグリセロールを生成する酵素
量を１単位とした。

２）脂肪酸生成活性 オリーブ油乳化液を基質に、生成する脂肪酸を水酸化ナ
トリウム溶液で滴定し測定する。

(1)操作 上記基質1.0mlを試験管にとり、37℃で予備加温する。
これに希釈酵素液0.1mlを加え反応を開始する。37℃で1
5分間反応後、2.5mlのエタノール−アセトン混液（１：
１）を加え反応を停止する。指示薬としてフエノールフ
タレインを数滴加え１／20Ｍ水酸化ナトリウムで滴定す
る。

(2)活性表示 １分間に１マイクロモルの脂肪酸を生成する酵素量を１
単位とした。

参考例１ リパーゼの調整 米糠２％、コーンスチープリカー1.5％からなる培地（p
H6.0）20の入ったジヤーフアーメンターにペニシリウ
ム・サイクロピウムATCC 34613を接種し、25℃において
24時間培養して種培養液とした。上記と同じ組成の培地
が500入った発酵槽に種培養液を接種し、25℃におい
て40時間培養した。培養液をろ過して菌体を除き、得ら
れたろ液を限外ろ過により濃縮した。濃縮液に硫酸アン
モニウムを75％飽和に加え、生成した沈澱を集め10mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）20に溶解した。

この溶液を限外ろ過により脱塩した後、あらかじめ同緩
衝液で平衝化したＤＥＡＥ−セルロース２kgを加えた。
同緩衝液30を用いてＤＥＡＥ−セルロースを洗浄した
後、0.25Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液を加え、得ら
れた溶出液を限外ろ過により脱塩、濃縮した。この液を
あらかじめ10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衝化したＤ
ＥＡＥ−セフアロース（ファルマシア社製）を充填した
カラムに通した。カラムを0.1Ｍ塩化ナトリウムを含む
同緩衝液で洗浄した後、塩化ナトリウムの濃度を0.1〜
0.25Ｍに上げる直線濃度勾配法により溶出を行った。リ
パーゼ活性は３つのピークに分かれた（第１図に示
す）。第２の活性ピークの画分を集めて硫安塩折に付
し、55％飽和から75％飽和の範囲で生成した沈澱を集め
た。沈澱を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、限外
ろ過により脱塩した後、凍結乾燥を行うことにより精製
リパーゼ標品を得た。この精製標品をハイドロキシアパ
タイトを用いたカラムクロマトグラフイーに付した後、
硫安溶液より結晶化を行った。結晶形は菱形、板状であ
った。

上記で得られた精製標品は、比活性が9.2Ｕ／mg蛋白で
あり、培養液から約130倍に精製され、収率は約17％で
あった。

参考例２ 参考例１において、ＤＥＡＥ−セフアロースカラムクロ
マトグラフイーで得られた第１および第３の活性ピーク
の画分をそれぞれさらに精製した。第１の活性ピークか
ら得られた標品は、トリブチリンによく作用し、脂肪酸
のメチルエステルに対する作用は弱いという性質を示
し、第３の活性ピークから得られた標品は、脂肪酸のモ
ノグリセライドにはよく作用するが、トリグリセライド
に対する作用は弱いという性質を示した。これらの性質
は前掲の先行技術に開示されたリパーゼに相当するもの
である。

実施例１ 参考例１で得られたペニシリウム属由来のリパーゼを血
清脂質に作用せしめ、生成したグリセロールを測定する
ことによりリパーゼの脂質への反応性をみた。

即ち、0.5Ｕ／mlグリセロールキナーゼ、４Ｕ／mlα−
グリセロホスフエートオキシダーゼ、２Ｕ／mlペルオキ
シダーゼ、3.3ｍＭアデノシン三リン酸、0.5ｍＭ4-アミ
ノアンチピリン、2.0ｍＭ ＴＯＯＳ〔N-エチル-N-（2-
ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-m-トルイジン〕、２ｍ
Ｍ塩化マグネシウム・６水塩、0.5Ｕ／mlのペニシリウ
ム属由来のリパーゼ、および0.05〜5.0％の範囲の濃度
のポリエチレングリコールｐ−イソオクチルフエニルエ
ーテル（商標名：トリトンＸ−100，Rohm＆Haas社製）
を含む0.1Ｍ−ＰＩＰＥＳ緩衝液（pH6.5）1.0mlと標準
血清試料（商標：リピツドセーラムII”栄研”、栄研化
学社製）0.01mlを混合し、37℃において10分間インキュ
ベートした。反応後の555nmにおける吸光度を測定し、
試料中のトリグリセライド（トリオレイン換算）濃度を
算出した。使用したトリトンＸ−100の濃度と測定値を
第２表に示す。ペニシリウム属由来のリパーゼは、５％
という高濃度の界面活性剤によっても活性が阻害されな
いことが分かる。

実施例２ 0.5Ｕ／mlグリセロールキナーゼ、４Ｕ／mlα−グリセ
ロホスフエートオキシダーゼ、２Ｕ／mlペルオキシダー
ゼ、3.3ｍＭアデノシン三リン酸、0.5ｍＭ4-アミノアン
チピリン、2.0ｍＭ ＴＯＯＳ、２ｍＭ塩化マグネシウ
ム・６水塩、および0.1〜1.0％の濃度のトリトンＸ−10
0を含む0.1Ｍ−ＰＩＰＥＳ緩衝液（pH6.5）1.0mlと25Ｕ
／mlのペニシリウム属由来のリパーゼ0.02mlを混合し、
37℃において５分間インキュベートした。次いで、血清
試料0.01mlを添加し、経時的に555nmにおける吸光度を
測定した。

トリトンＸ−100の濃度とリパーゼの反応性の関係を第
２図に示す。ペニシリウム属由来のリパーゼはトリトン
Ｘ−100によって活性化され、その効果は0.1〜1.0％の
範囲においてほとんど変わらないことが分かる。

比較例１ 各種リパーゼのグリセロール生成活性と脂肪酸生成活性
を測定したところ、本酵素はシユードモナス属（東洋紡
績社、天野製薬社製）、クロモバクテリウム属（東洋醸
造社製）由来の市販リパーゼに比べ、脂肪酸生成活性に
対し、グリセロール生成活性が著しく高い特性を有す
る。

比較例２ 実施例２において、ペニシリウム属由来のリパーゼに代
えて市販のシュードモナス属由来のリパーゼ（商標名：
ＬＰＬ”Amano”III，天野製薬社製）、クロモバクテリ
ウム属由来のリパーゼ（東洋醸造社製）またはシユード
モナス属由来のリパーゼ（商標名：リポプロテインリパ
ーゼ・タイプＡ，東洋紡績社製）をそれぞれ表示活性で
50Ｕ／ml、100Ｕ／mlおよび0.2Ｕ／ml用いた以外は同様
に操作した。

トリトンＸ−100の濃度と各リパーゼの反応性の関係を
第３図Ａ〜第３図Ｃに示す。第３図ＡはLPL”Amano”II
I、第３図Ｂはクロモバクテリウム属由来のリパーゼ、
第３図Ｃはリポプロテインリパーゼ・タイプＡをそれぞ
れ用いた場合を表す。これら公知のリパーゼは、いずれ
もトリトンＸ−100の濃度が高くなるにしたがい活性が
阻害されることがわかる。

実施例３ 実施例２において、トリトンＸ−100に代えて0.1〜0.5
％のノニルフエノールエトキシレート系界面活性剤（商
標名：アデカトールNP-700、旭電化社製）または0.1〜
0.5％の第２級直鎖アルコールエトキシレート系界面活
性剤（商標名：アデカトールSO-135、旭電化社製）を用
いた以外は同様に操作した。

界面活性剤の濃度とリパーゼの反応性の関係を第４図お
よび第５図に示す。第４図および第５図はそれぞれノニ
ルフエノールエトキシレート系界面活性剤および第２級
直鎖アルコールエトキシレート系界面活性剤を用いた場
合を表す。ペニシリウム属由来のリパーゼはこれらの界
面活性剤によって実質的に阻害されないことが分かる。

〔発明の効果〕

本発明に従えば、ペニシリウム属由来のリパーゼを界面
活性剤の存在下トリグリセライドに作用させたとき、リ
パーゼは界面活性剤による活性阻害を受けることなくト
リグリセライドをほぼ完全に分解することができた。本
発明法は生体体液中のトリグリセライドの測定に用いる
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ペニシリウム・サイクロピウムATCC 34613の
産生する３種のリパーゼのＤＥＡＥ−セフアロースによ
るカラムクロマトグラフイーのパターンを表す図であ
る。 第２図は、トリトンＸ−100の濃度とペニシリウム属由
来のリパーゼの反応性の関係を表す図である。同じく第
３図は各種リパーゼの反応性を表わす図であり、図中Ａ
はシユードモナス属由来のリパーゼ（LPL”Amano”II
I）、Ｂはクロモバクテリウム属由来のリパーゼ、Ｃは
シユードモナス属由来のリパーゼ（リポプロテインリパ
ーゼ・タイプＡ）を示す。 第４図は、ノニルフエノールエトキシレート系界面活性
剤の濃度とペニシリウム属由来のリパーゼの反応性の関
係を表す図であり、同じく第５図は、第２級直鎖アルコ
ールエトキシレート系界面活性剤の濃度と反応性の関係
を表す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生体体液試料中にリパーゼを作用させ、遊
   離したグリセロールを測定することによって試料中のト
   リグリセライドを測定する方法において、グリセロール
   生成活性の脂肪酸生成活性に対する割合が５％以上であ
   り、界面活性剤により活性化され、その濃度が少なくと
   も５％以下の範囲において実質的に活性が阻害されない
   性質を有するリパーゼを作用せしめることを特徴とする
   トリグリセライドの測定方法。
2. 【請求項２】界面活性剤が非イオン性界面活性剤である
   特許請求の範囲第１項記載のトリグリセライドの測定方
   法。
3. 【請求項３】非イオン性界面活性剤がポリエチレングリ
   コールアルキルエーテル系の界面活性剤である特許請求
   の範囲第２項記載のトリグリセライドの測定方法。
4. 【請求項４】リパーゼがペニシリウム属の生産するリパ
   ーゼである特許請求の範囲第１項記載のトリグリセライ
   ドの測定方法。
5. 【請求項５】ペニシリウム属の菌株がペニシリウム・サ
   イクロピウムである特許請求の範囲第１項記載のトリグ
   リセライドの測定方法。