JPH0474000B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物試料例えばヒト血清の濁りを効
果的に透明化するための試薬に関する。さらにく
わしく言うと本発明は、界面活性剤と酵素とから
成る試薬に関する。

生物試料の濁りは重大な問題をひきおこす。濁
りのために読み取れなかつたり、読みが不正確に
なつたりし、そのため非常に疑わしい定量結果が
出る。

血清および血しよう試料の濁りは、臨床上の光
学的分析において常に重大な問題であり、誤つた
データを生み、血清成分の光学的定量をしばしば
誤らせる。濁りの主な原因は、全コレステロール
量が増加しているかまたはしていない、高リポタ
ンパク質症（hyperlipoproteinemia）の患者の血
清中のトリグリセリドの増加であると思われる。
血清中のコレステロールの異常な増加は、非常に
危険なアルテロスクレロシス（artherosclerosis）
と互いに関連があることがわかつている。医師が
高リポタンパク質症の患者を診断し、心臓疾患を
予想する際にはコレステロールおよびトリグリセ
リドの正確な値が役立つため、これらの定量は重
要である。他の試験例えばアスパラギン酸アミノ
基転移酵素（GOT）アラニンアミノ基転移酵素
（GPT）および乳酸脱水素酵素（LDH）等につ
いての試験においても、濁つた試料を試験する場
合は、前記のようなコレステロールまたはトリグ
リセリドの定量における問題と同じ難点がある。

高濃度の界面活性剤例えばポリオキシエチレン
化されたラウリン酸で試料を処理することによ
り、濁つた血清の臨床試験が行なわれている（米
国特許第3853465号および4184848号）。そこでは
界面活性剤だけを使うため、効果的に透明化する
ためにはかなり高濃度の界面活性剤が必要であ
る。高濃度の界面活性剤は他の化学物質または酵
素の反応と相互作用し、分析を複雑にする。

本発明で使う界面活性剤は比較的低濃度であ
る。これは、透明化用試薬に加える酵素（コレス
テロール・エステラーゼまたはリパーゼ）の作用
による。

本発明による透明化の正確な機構はまだ知られ
ていない。しかし患者が高リポタンパク質症の場
合は、血清試料中の濁りはトリグリセリド含量の
増加が主な原因であることが推測できる。トリグ
リセリドは水不溶性であり、通常はリポタンパク
質複合体の中でコレステロールエステルと一緒に
脂肪核の内部に埋まつている。脂質含量試料の透
明化は、まず界面活性剤例えばラウリン酸ジエタ
ノールアミド（DEA）によつてリポタンパク質
を粉砕し、次に酵素塩基によつてトリグリセリド
を加水分解して行なわれる。界面活性剤は、放出
される脂肪酸を溶解する役目も持つ。酵素がなけ
れば透明にならない。

本発明の目的は、生物試料中の濁りを透明にす
る効果のある試薬を提供することであり、とりわ
け、特定の成分、例えばコレステロールについて
光学的に検定または分析する場合の試料を対象と
する。

本発明は、式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基ま
たはアルケニル基であり、ｘとｙとはそれらの合
計が５以下の正の整数である）で表わされる界面
活性剤、およびコレステロールエステラーゼまた
はリパーゼまたはそれらの混合物から成る群から
選んだ酵素から成る、生物試料の濁りを透明にす
る効果のある試薬を要旨とする。

水性緩衝液の形の前記試薬は、全試薬組成物に
対して、界面活性剤約0.05〜約2.5ｇ／dlおよび
酵素（コレステロールエステラーゼ）好ましくは
0.1〜約0.5ｇ／dlそして少なくとも約0.025U／ml
から成るのが好ましい。得られる組成物のPH値は
約5.5〜約7.0の範囲である。

組成物が酵素としてリパーゼを含む場合は、得
られる全試薬組成物に対して界面活性剤約0.05〜
約2.5ｇ／dl、好ましくは0.1〜約0.5ｇ／dlおよび
リパーゼ少なくとも約1.0U／mlから成り、組成
物のPH値は約5.5〜約8.0の範囲である。

組成物に含まれる酵素が前記のいずれの場合
も、使える緩衝剤は、マレイン酸のナトリウム塩
またはカリウム塩、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン
酸塩、コハク酸塩、イミダゾール酢酸塩の緩衝
剤、トリス等である。その他でも適当な緩衝剤を
使える。そのような緩衝剤とは、組成物のいずれ
の成分とも相互作用することなく所望の一定のPH
値に保つことができるものである。

マレイン酸塩、例えばカリウムまたはナトリウ
ム塩の緩衝剤を使う場合は、約0.05〜約0.5Mで、
得られる組成物のPH値が約5.0〜約7.0になる量で
加える。

他の緩衝剤についても同様な濃度で使う。

前記の酵素組成物には、前記の成分の他に溶解
促進剤を加えることもできる。そのような溶解促
進剤とは、界面活性剤の可溶化を助ける材料であ
る。例えば胆じゆう酸塩例えばコラン酸ナトリウ
ム、デオキシコラン酸ナトリウム等がとりわけ有
効である。

別の好ましい例においては、界面活性剤はＲが
アルキル基である前記の式で表わされるもの例え
ばラウリン酸ジエタノールアミドまたはオレイン
酸ジエタノールアミドである。

酵素は動物例えば膵臓または微生物を起源とす
る。

本発明による処理に適する試料には、ヒト血清
および血しようを含む。

前記の試薬を生物試料と組み合わせると濁りが
効果的に透明になる。試薬は通常水性緩衝溶液の
形である。

好ましい試薬は、界面活性剤が前記の式におい
てＲがアルキル基好ましくはラウリル基でありｘ
とｙとの合計が５である化合物であり、酵素がリ
パーゼであるものである。この試薬組成物は、好
ましくはポリエチレングリコール−ｐ−イソオク
チルフエニルエーテルまたは他の適当な界面活性
剤を含む。

PH２〜10で濁つた試料を透明にする効果のある
好ましい試薬としてはさらに、２種の界面活性剤
混合物、すなわちラウリン酸ジエタノールアミド
（ｘ＝ｙ＝１）とエポキシ化されたラウリン酸
（ｘ＋ｙ＝５）との混合物を含むものがある。

前記の酵素組成物は、前記の界面活性剤を使つ
て調製する。

前記の組成物中に含まれる適当な界面活性剤と
しては、ラウリン酸ジエタノールアミド、ミリス
チン酸ジエタノールアミド、カプリン酸ジエタノ
ールアミド、オレイン酸ジエタノールアミドおよ
びヤシ油脂肪酸ジエタノールアミドである。

本発明の試薬を生物試料と組み合わせると、試
料の濁りを効果的に透明化することができ、試料
の正確な光学的検定または分析ができる。コレス
テロールについて光学的分析を行なう試料は、こ
のようにして有利に処理される。

本発明はまず第一に、特定の界面活性剤と酵素
を使つて生物試料の濁りを効果的に透明にするた
めの試薬を対象とする。ここで、界面活性剤は式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基ま
たはアルケニル基であり、ｘとｙとはそれぞれ１
である） で表わされる。好ましくは、Ｒがアルキル基であ
る、例えばラウリン酸ジエタノールアミドであ
る。

酵素成分は、コレステロールエステラーゼまた
はリパーゼまたはそれらの混合物である。

得られた組成物は驚くべきことに、生物試料の
濁りを透明にするのに非常に有効であることがわ
かつた。従つて、濁つた生物試料は透明な試料に
変えるのに非常に役立つ。

界面活性剤と酵素との相互作用と、検定用試薬
の作用との間で、抑制や妨害が起きないならば、
前記の本発明の組成物で処理した試料は、どのよ
うな特定の成分についても、比色検定または分析
を行なえる。

前記試薬を利用して行なうことのできる典型的
な検定の例としては、コレステロール、トリグリ
セリドおよびクレアチンホスフエートキナーゼの
定量である。

酵素成分は動物を起源として、例えば膵臓か
ら、または微生物を起源として誘導したものであ
る。

本発明は第二番目に、光学的検定を行なう濁つ
た生物試料を効果的に透明にするための試薬を対
象とする。この試薬は、前記第一の界面活性剤よ
りは広い定義を持つ式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個を持つアルキル
基またはアルケニル基であり、ｘとｙとは、それ
らの合計が５以下の正の整数である） で表わされる界面活性剤少なくとも１種と、コレ
ステロールエステラーゼまたはリパーゼまたはそ
れらの混合物から選んだ酵素とを含む。

好ましい具体例においては、界面活性剤はＲが
アルキル基であり、ｘとｙとがそれぞれ１である
前記の式で表わされる。例としては、ラウリン酸
ジエタノールアミド、ミリスチン酸ジエタノール
アミドおよびカプリン酸ジエタノールアミドであ
る。好ましい界面活性剤としてはさらに、Ｒがア
ルケニル基であり、ｘとｙとがそれぞれ１である
もの、例えばオレイン酸ジエタノールアミドおよ
びココヤシ酸ジエタノールアミドも挙げられる。
さらに別の好ましい例としては、Ｒがアルキル基
であり、ｘとｙとの合計が５である界面活性剤も
挙げられる。

酵素成分は動物を起源として、例えば膵臓か
ら、または微生物を起源として誘導したものであ
る。

前記の試薬を検定に使う際には、水性緩衝溶液
の形にして生物試料と組み合わせる。濁つていた
試料は透明になり、検定をすることができる。

効果的に透明化され、検定に供される試料には
ヒト血清および血しようが挙げられる。

本発明による試薬は、少なくとも２つの点で独
特である。濁りによる妨害なしに、透明、澄明な
状態での生物試料中の成分定量を可能にしたこ
と、および使用する特定の界面活性剤と酵素との
相互作用によつて、従来のコレステロール定量で
使われていた量より少量の酵素で十分となつたこ
と、である。

生体液のコレステロールの臨床検査で最も一般
的なのは、遊離のコレステロールとコレステロー
ルエステルとを合わせた全コレステロールの定量
である。コレステロールもそのエステルも、血清
の中でリポタンパク質と呼ばれる低分子複合体中
に他の脂質および種種のタンパク質と一緒になつ
て存在し、全コレステロールのうちではコレステ
ロールエステルが通常は主な成分（60〜80％）で
ある。コレステロールは一般的に水不溶性であ
り、通常は複合体内部に埋まつていた酵素は近づ
けない。全コレステロールの定量を全体として酵
素を使つて行なう場合は、自動化された方法でも
手動による方法でも、まず適当な界面活性剤によ
つてコレステロールもコレステロールエステルも
ともに複合体から遊離しなければならない。次に
コレステロールエステルはコレステロールエステ
ラーゼによつて加水分解して遊離コレステロール
とし、これをさらにコレステロールオキシターゼ
によつて酸化してコレステノンと過酸化水素とを
得る。

本発明は、自動分析器を使つた自動化方法に使
うことができ、また手動で行なうこともできる。

本発明による検定に使う組成物の調製において
は、界面活性剤と酵素の他に、当分野で公知であ
つてそのような目的に使われる他の補助成分をも
含む、水性溶液を作る。

たとえば、コレステロール検定においては次に
示す成分を使い、その量は以下のようである。

成 分 コレステロール検定 パーオキシダーゼ 0.8〜2.0U／ コレステロールオキシダーゼ 0.025〜0.3U／ml コレステロールエステラーゼ 0.025〜0.3U／ml 界面活性剤 0.05〜0.5ｇ／dl コラン酸ナトリウム 0.05〜0.5ｇ／dl ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム
2.5〜6g／dl ４−アミノアンチピリン 0.5〜2.0mM マレイン酸 0.1〜0.5M PH 5.5〜7.0 試料／試薬比 100〜400 前記の組成物においては、動物起源、例えば膵
臓を起源とするコレステロールエステラーゼを使
うのが好ましいが、微生物を起源とするコレステ
ロールエステラーゼを使つても同様の結果を得
る。

例 １ コレステロールエステラーゼの作用としての透
明化 マレイン酸カリウム（0.1M）、コラン酸ナトリ
ウム（0.25ｇ／dl）、ラウリン酸ジエタノールア
ミド（0.2ｇ／dl）、コレステロールエステラーゼ
（0.08〜0.8U／ml）を含む、最終的なPHが6.0であ
る透明化用試薬３mlを脂質含有血清（トリグリセ
リド含量約1400mg／dl）0.025mlとを混合する。
45℃で10分以内に、反応混合物は透明になる。透
明化のためのコレステロールエステラーゼは膵臓
から、または微生物から得たものでよい。

例 ２ コレステロール検定への使用 本実施例に説明するように、検定の終点を決め
るために、コレステロール検定用成分を透明化試
薬に含有させる。

コレステロールエステラーゼ（0.125U／ml）、
コレステロールオキシダーゼ（0.125U／ml）、パ
ーオキシダーゼ（1.6U／ml）、４−アミノアンチ
ピリン（0.6mM）、ヒドロキシ安息香酸ナトリウ
ム（25mM）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ／
dl）、ラウリン酸ジエタノールアミド（0.2ｇ／
dl）およびマレイン酸カリウム（0.1M）を含み、
PH6.0の組成物３ml。この試薬全部を脂質含有血
清試料0.025mlと混合する。次にこの混合物を45
℃で４〜５分間インキユベートした後、520nmで
色濃度の測定をして全コレステロールを定量す
る。ラウリン酸ジエタノールアミドとコレステロ
ールエステラーゼの透明化作用がないと、濁つた
試料中でのコレステロールの定量結果は常に誤つ
たものになる。

例 ３ カンジダリパーゼ（カンジダ・シリンドラシ
アcylindracea）による透明化 ラウリン酸ジエタノールアミド（0.2ｇ／dl）、
コラン酸ナトリウム（0.25ｇ／dl）およびリパー
ゼ（25U／ml）およびマレイン酸塩緩衝剤
（0.1M）を含む、PH6.0の透明化試薬３mlを、脂
質含有血清0.025mlと混合する。45℃で５分間イ
ンキユベートすると、濁つた試料が透明になる。

ラウリン酸ジエタノールアミドとエポキシ化さ
れたラウリン酸（ｘ＋ｙ＝５）との混合物を含む
透明化試薬を、前記と同量使用しても、同様の透
明化効果を得る。

例 ４ 式 （式中、ｘとｙとの合計は５である） で表わされる界面活性剤（0.2ｇ／dl）、Triton
Ｘ−100（0.4ｇ／dl）、マレイン酸カリウム
（0.2M）およびリパーゼ（25U／ml）を含むPH6.0
の透明化試薬３mlを、脂質含有試料0.05mlと混合
し、45℃でインキユベートする。３分後には、濁
つていた試料が透明になる。緩衝剤の濃度を高め
ると、透明化の速度が増す。

Triton Ｘ−100の添加なしに、エポキシ化さ
れたラウリン酸（ｘ＋ｙ＝５）をさらに高濃度で
使うと、同様の結果を得る。

例 ５ Ａ 組成 次の成分を使つて診断用試薬組成物を１の水
溶液として調製する。

成 分 濃 度 リンゴ酸 11.6ｇ KOH 10.0ｇ EDTA（K₂） 2.7mM コラン酸ナトリウム 5.8mM ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム
25.0mM ４−アミノアンチピリン 0.6mM ラウリン酸ジエタノールアミド 2.0ｇ コレステロールエステラーゼ 125ユニツト コレステロールオキシダーゼ 125ユニツト セイヨウワサビ・パーオキシダーゼ
800ユニツト PHは6.0に調節する。

この試薬組成物は、水溶液の形で保存および使
用することができ、またその溶液は通常の方法で
凍結乾燥し、使用時に水で再生させることもでき
る。

Ｂ 検定−全コレステロールの定量 前記の試薬３mlと、血清または再生させたコレ
ステロール含量500mg／dlまでの血清標準試料
0.025mlとを混合する。45℃で４〜５分間反応さ
せる。試薬をブランクとし、525nmにおける試料
の吸光度を測定する。

例 ６ 脂質含有血清のクレアチンホスフエートキナー
ゼ（CPK）活性の定量における透明化 ラウリン酸ジエタノールアミド（0.4％）、膵臓
を起源とするコレステロールエステラーゼ
（25U／dl）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ％）お
よびチオールグリセロール（20mM）を含む、PH
6.7のイミダゾール−酢酸緩衝溶液（0.1M）２ml
を脂質含有血清0.05mlと混合する。37℃で15分間
インキユベートすると、340nmにおける濁度は
2.3 O.D.から0.02 O.D.に低下する。透明になつ
た試料を次にCPK試薬１mlと混合する。この試
薬は、クレアチンホスフエート（116.7mM）、
ADP（6.7mM）、AMP（16.7mM）、EDTA
（6.7mM）、NADP（6.7mM）、ヘキソキナーゼ
（125U／dl）、グリコース−６−ホスフエートデ
ヒドロゲナーゼ（G6PDH）（100U／dl）を含み、
PH6.7の0.1Mイミダゾール−酢酸緩衝液として調
製したものである。通常の方法で、340nm、37℃
におけるCPK活性を測定する。

当業者には明らかなように、前記特許請求の範
囲に規定され本明細書に記載された本発明の意図
と範囲から逸脱することなく、本発明には変化変
形が可能であり、それらもすべて本発明の範囲内
に含まれるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基ま
   たはアルケニル基であり、ｘとｙとはそれらの合
   計が５以下の正の整数である） で表わされる界面活性剤少なくとも１種と、コレ
   ステロールエステラーゼまたはリパーゼまたはそ
   れらの混合物から選んだ酵素とを含んで成る、光
   学的に検定または分析する血清又は血しよう試料
   の濁りを透明にするための試薬。 ２ 前記界面活性剤が約0.05〜約2.5g／dlであ
   り、前記酵素としてのコレステロールエステラー
   ゼが少なくとも約0.025U／mlであり、PH約5.5〜
   約8.0の水性緩衝溶液の形である、前項１に記載
   の試薬。 ３ 前記界面活性剤が約0.05〜約0.5g／dlであ
   り、前記酵素としてのリパーゼが少なくとも約
   1.0U／mlであり、PH約2.0〜約10.0の水性緩衝溶
   液の形である、前項１に記載の試薬。 ４ 前記界面活性剤が、Ｒがアルキル基であり、
   ｘとｙとの合計が５である前記式で表わされるも
   のであり、前記酵素がリパーゼである、前項１に
   記載の試薬。 ５ ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチル
   フエニルエーテルを含む、前項４に記載の試薬。 ６ 前記界面活性剤が、ラウリン酸ジエタノール
   アミドとエポキシ化されたラウリン酸との混合物
   であり、この混合物が得られる組成物全体におい
   て約0.05〜約2.0g／dlであり、得られるこの組成
   物がPH約2.0〜約10.0の水性緩衝溶液の形である、
   前項１に記載の試薬。 ７ 前記界面活性剤が、ｘおよびｙがそれぞれ１
   である前記式で表わされるものである、前項１に
   記載の試薬。 ８ 前記界面活性剤が約0.05〜約2.5g／dlであ
   り、前記酵素としてのコレステロールエステラー
   ゼが少なくとも約0.025U／mlであり、PH約5.5〜
   約7.0の水性緩衝溶液の形である、前項７に記載
   の試薬。 ９ 前記界面活性剤が約0.05〜約2.5g／dlであ
   り、前記酵素としてのリパーゼが少なくとも約
   1.0U／mlであり、PH約5.5〜約8.0の水性緩衝溶液
   の形である、前項７に記載の試薬。 １０ 緩衝剤としてマレイン酸塩を約0.05〜約
   0.5Mの濃度で含み、PHが約5.0〜約7.0である、前
   項２，８または９に記載の試薬。 １１ 溶解促進剤を含む、前項８または９に記載
   の試薬。 １２ 前記溶解促進剤として、コラン酸ナトリウ
   ムまたはデオキシコラン酸ナトリウムを、約
   0.25g／dl含む、前項１１に記載の試薬。 １３ 前記界面活性剤が、Ｒがアルキル基である
   前記式で表わされるものである、前項７に記載の
   試薬。 １４ 前記界面活性剤が、Ｒがアルケニル基であ
   る前記式で表わされるものである、前項７に記載
   の試薬。 １５ 前記界面活性剤が、オレイン酸ジエタノー
   ルアミドである、前項１４に記載の試薬。 １６ 前記界面活性剤が、ラウリン酸ジエタノー
   ルアミドである、前項１３に記載の試薬。 １７ 前記酵素が、動物または微生物を起源とし
   て誘導されたものである、前項１または７に記載
   の試薬。 １８ 前記酵素が、動物の膵臓から誘導されたコ
   レステロールエステラーゼである、前項１７に記
   載の試薬。 １９ 前記界面活性剤が、得られる試薬全体にお
   いて約0.1〜約0.5g／dlである、前項８または９
   に記載の試薬。