JPS63126498A - Ｈｄｌ−フラクションのコレステリンの特異的測定法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はコレステリンエステラーゼを作用させてコレス
テリンを遊離させ、遊離したコレステリンをコレステリ
ンオキシダーゼとｍ素でＨ２Ｏ２の形成下に酸化し、Ｈ
２Ｏ２形成又は酸累消区 費を動力学的測定することによシ、血清のタンパク質の
ＬＤＬ−フラクションの存在下にＨＤＬ　−フラクショ
ンのコレステリンを特異的に測定するための方法及び試
薬に関する。

従来技術 血清中の全コレステリン並ひに個々のコレステリンを含
有するりビドフラクションの測定は臨床化学実験室にお
いて著しくＮ要である。過コレステリン血症及び過グリ
セリド血症はアテローム性動脈硬化症及び心臓硬基の発
生を容易にする。従つ℃、個々の冠状疾患への危険は血
清中のコレステリン及びトリグリセリドを測定すること
によシ把握することができる。爽に、リポタンパク買パ
ターンにおける病的な変化を知ることができれば、より
ｍ実な証明となる。

全コレステリンに対する個々のりビドフラクションの量
は心臓硬基の危険に関する報告をし、この際１方では非
常に広い臨床的な段階を示し、よシ高い血清コレステリ
ン濃度はよ＃）高い心臓硬塞に導びぎ、他方では血ｆｐ
ｔＨＤＬーコレステリンとアテローム性血管変性の＃，
次との間の逆の関係がなシ立つ。血清のリポタンパク質
は４つのグループに分けることができる：乳麿脂粒、プ
レーβ−リポタンパク質（超低密度リポタンパク質；　
Ｖｅｒｙ　ｌｏｗ　ｄｅｎａｉｚｙ　１ｉｐｏｐｒｏｚ
ｅｉｎ　又はＶＬＤＬとも呼ばれる）、β−リポタンパ
ク質（低密度リポタンパク質；　Ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔ
’／　１ｉｐｏ−ｐｒｏｚｅｉｎ又はＬＤＬとも呼ばれ
る）及びα−リポタンパク質（高密度リポタンパク質；
　Ｈｌｇｈｄｅｎｓｉｚｙ　１ｉｐｏｐｒｏｚｅｉｎ又
はＨＤＬとも呼はれる）。

血清全コレステリンの測定に関しては、約１５年来、簡
単で、しかも非常に正確な完全酵素分析法があυ、この
分析法は手動によっても又それと同様に良好に自動分析
システムによっても各試料の前調製なしに実施可能であ
り、通常次の反応工程： コレステリン＋脂肪酸 Δ４−コレステンー３−オン＋Ｈ２Ｏ２によシ進行する
。生じたＨ２Ｏ２を有利に比色法で、場合によシ動力学
的に測定することができる。

他のコレステリン含有リポタンパク質粒子を分離した後
、血清中のＨＤＬ−コレステリンの測定を行なうことは
すでに公知である。このリポタンパク質の分離は、超遠
心分離、電気泳動又は捌々の沈殿法、例えは免疫沈殿法
、燐タンゲス＋７酸／Ｍｌ”、’ｙ”キストランスルフ
ェート／　Ｍｇ２＋又はヘパリン／　Ｍｇ２＋での沈殿
又はポリエチレングリコールでの沈殿によシ行なうこと
ができる。すべてこれらの方法は費用がかかシ多くの工
程及び比較的長い時間を要する。

西ドイツ国特許公開第３２０８２５３．３号公報力ら、
ＬＤＬ−７２クシヨンのコレスフ−１１’Ｊｌｉｋを直
接測定することが公知である。この測定は一定条件下に
ＬＤＬ−フラクション中のコレステリン分の反応速度は
その濃度に対して直線的に依存し、かつこＯｗ！得られ
た測定値の動力学的測定の際に反応配合物中のＬＤＬ−
コレステリン濃度に対して直接比例するという認識に基
づいている。この方法はＬＤＬの測定のために非常に好
適であるが、ＨＤＬ一部分の測定はこれＫよ）可能では
ない。

発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の課超は、血清中のＨＤＩ、を簡単な方
法で、しかも１工程で実施可能な方法及び試薬を見い出
すことである。特に、同時にこの方法を用いて全コレス
テリン鷺を測定することができる方法を提供すべきであ
った。

問題点を解決するための手段 この課粗は、コレステリンエステラーゼを作用させてコ
レステリンを遊離させ、遊離したコレステリンをコレス
テリンオキシダーゼ及び酸素を用いてＨ２Ｏ２の形成下
に酸化し、Ｈ２Ｏ２−形成又は酸素消費の動力学的測定
を行なうことにより、血清のリポタンパク質■ＬＤＬ−
フジクションの存在においてＨＤＬ−フラクションの；
レステリンを特異的に測定する方法において、該測定を
温度２０〜４０℃で酸化反応の開始後２分〜１５分の範
囲内に所定の時間域で実施し、反応溶液中での測定の間
コレステリンエステラーゼ濃度０．０５〜６０Ｕ／ゴ、
コレステリンエステラーゼ濃度０．１〜５０Ｕ／１Ｉｔ
ｌ、胆汁酸群の界面活性剤濃度１．０〜２０　ｍｍｏｌ
／ｌ　、非イオン系界面活性剤濃度０．１〜１０９／ｌ
及びＰ）ｌ値５〜９を保持することによ）解決する。

好適な界面活性剤の組合わせの存在において、コレステ
リンエステラーゼ及びコレステリンオキシダーゼを用い
る血清リポタンパク質のコレステリンＯ反応は２相で経
過するということが意外にも確認された。この反応は、
まずＬＤＬ　−コレステリン濃度（依存するが、ＨＤＬ
−コレステリン濃度に依存しない速度でＭ過する。その
先の反応の経過において、反応条件に依存する時点から
、反応速度はＨＤＬ−コレステリン磯度に依存する。す
なわち、ＨＤＬ−フラクショ／の反応は時間的に遅れて
開始する。反応条件の好適な選択において、ＨＤＬ−反
応金、ＬＤＬ−コレステリンがすでに十分に反応し℃し
まった時点に観察することができる。こうして、相応し
て選択した時間域内での吸光変化はＨＤＬ−コレステリ
ン濃度に比例する。こうして、簡単な方法を用いて、他
のコレステリン含有リビドフラクションの存在において
、ＨＤＬを直接測定することが可能となった。

本発明方法にとってに＊なことは、ＨＤＬ−反応が有利
な時点に行なわれるように反応条件を調節することであ
る。

不発明方法におい℃は、まずコレステリンエステラーゼ
を反応浴液に添加することによりコレステリンの遊離に
作用させる。コレステリンエステラーゼは種々の生物、
例えは微生物又は動物の組織から得られる。微生物由来
コレステリンは、例えばシンイドモナス属薗又はカンジ
ダＭｉｄから得られる。しかし、特に好適であるのは膵
臓（例えば牛又は豚の膵臓）から■コレステリンエステ
ラーゼである。反応浴液中のコレステリンエステラーゼ
Ｃ）＠Ｒは０．０５〜６０Ｕ／Ｉ！Ｌｔである。０．０
５〜１０υ／１のコレステリンエステラーゼ濃度が有利
であり、０．０５〜１１Ｊ／ＩＬＩが特に有利である。

測定単位Ｕはコレステリンエステラーゼに関して次の定
義を基礎にしている＝１Ｕとは３７℃で、１分あたシコ
レステリルリル−ト１μｍｏｌが反応する酵素量であシ
、この際反応混合物はコレステリンエステラーゼの他に
次の物質を含有している： 燐酸カリウム塩緩衝剤ｐ）１７．０　０．２　ｍｏｌ／
Ａ’塩化ナトリウ＝　　　　　　　　０．１５ｍｏｌ／
ｌコール醸ナトリウム　　　　　　４　／ｌ／１ナツト
（Ｔｈｅｓｉｓ）ｏ１６　Ｉ！／１フェノール　　　　
　　　　　　２　ｇ／１４−アミノアンチぎり７　　０
．３　Ｖｌ西洋わさびからのペルオキシダーゼ ２０Ｕ／紅 ノカルジア・エリスロポリス （Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｅｒｙｚｈｒｏｐｏｌｉｓ）から
のコレステリンオキシダーゼ　　　［１，２Ｕ／１１コ
レステリルリル−）　　　　０．４５９７１遊離したコ
レステリンを次いでコレステリンオキシダーゼで酸化し
、コレステノン及ヒＨ２Ｏ２にする。コレステリンオキ
シダーゼは同様に種種の生物から得られる。プレビパク
テリクム属（Ｂｒｅｖｉｖａｃｚｅｒｉｕｍ　）、　ノ
カルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ　）　　又はストレゾト
マイセス属（Ｓｔ、ｒｅｐｚｏｍｙｃｅｓ　）　　の菌
から得られるコレステリンオキシダーゼが有利である。

コレステリンオキシダーゼの濃度は０．１〜５０Ｕ／ｆ
ｆ１４である。

１〜３０Ｕ／Ｎｏ＠度でコレステリンオキシダーゼを使
用するのが有利であシ、特に５〜２５Ｕ／ｄで使用する
のが有利である。

コレステリンオキシダーゼに関する測定単位υは矢のよ
うな定義を基礎としている；１Ｕは１分あ庭９２５℃で
コレステリン１μｍｏｌが反応する＃木葉であシ、この
際反応混合物は＃素の他に次の物／ｌ［を含有する： 燐酸カリ＋７ム塩ａＨ１ｌＥｉ剤ｐ）１７．５　０．４
７　ｍｏｌ／ｊ！テゾト■　　　　　　　　　　３　ｉ
／１ｎ−プロパツール　　　　　　２．５９／１コレス
テリン　　　　　　　　０．１２５１１７１本発明方法
において重要であるのは更に、反応治液中に胆汁酸群か
らの界面活性剤が存在することである。この界面活性剤
は１．０〜２０ｍｍｏｌ　／　ｌの濃度で存在する。有
利には、胆汁酸群の界面活性剤の濃度は１．５〜８ｍｍ
ｏｌ／ｌ？である。胆汁酸群Ｏ界面活性剤は公知である
。コール酸の誘導体を使用するのが有利であシ、この際
コール酸ナトリウムが特に有利である。

反応溶液中には更に非イオン系界面活性剤が存在する。

この非イオン系界面活性剤の濃度は０．１〜１０９／ｌ
、有利に０．４〜４ｇ／！である。非イオン系界面活性
剤としては、有利にポリエチレンオキシド基を含有する
界面活性剤を使用する。同様に糖ペースの界面活性剤が
好適である。非イオン系界面活性剤の例はアルキル−又
はアルアルキル−ポリエチレンオキシドエーテル、例え
ｄｒｓ−ドデシルポリエチレングリコールエーテル、イ
ソートリデカノールポリエチレンオヤシドエーテル及び
インーオクチルフエノールポリエチレンオキシドエーテ
ルである。

有利な実施形においては、非イオン系界面活性剤を、オ
キシダーゼの添加後、但し測定よシ１〜１４分曲に添加
する。

反応溶液の一値は５〜９の範囲にある。必要な一値範囲
の調節のためＫはこの範囲で有効な緩衝剤を添加する。

使用する緩衡剤の種類は重要ではない。トリス／Ｈロー
緩衝剤及び特に燐酸塩緩衝剤を使用するのが有利である
。

本発明による方法は２０〜４０℃の温度範囲で実施され
る。２５〜３７°Ｃｏ温度で作業するのが有利である。

本発明にｘｉなパラメーターのすべて全保持することに
よ、９、）（ＤＬ−フラクションのコレステリンの測定
を、酸化反応開始後２分〜１５分の時間範囲で行なう。

この測定をオキシダーゼ反応の開始後６〜１０分の時間
範囲で行なうのが有利である。

Ｈ２Ｏ２形成の測定をあまシ有利でない反応条件及び測
定条件で行なわなければならない場合、測定のために選
択した時間域内でなおＬＤＬ−フラクションの残シの反
応が行なわれ、こうしてＨＤＬ　−７２クシヨンの測定
は妨害される。この妨害を回避するために、本発明によ
る方法の更なる実施形において、抗−ＬＤＬ−抗体の添
加によシこの種の特異性の損失を阻止する。この抗血清
はＬＤＬの反応を早期の時点で停止する。このためには
自体公知の抗−ＬＤＬ−抗体又は抗−アポリボプロチイ
ン（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｚｅｉｎ　）　−Ｂ　−の 抗体単独で、又は混合物ち形で使用することができる。

この抗体は有利に１０−６〜１０−’ｍｍｏ１／ｌ（Ｑ
濃度で脱脂ｒ−グロブリン又はＩｇＧ−調剤として存在
する。

すでに上記のように、本発明方法においてはＬＤＬ　−
７ラクシヨン中に含有されるコレステリンの遊離が先ず
行なわれ、こうして測定シグナルははじめＬＤＬ−フラ
クションのコレステリン含量に比例する。従つ℃、本発
明による方法を用い一’Ｃ１１つの試料配合物からＬＤ
Ｌ−コレステリンもＨＤＬ−コレステリンも測定するこ
とが可能である。反応速度は先ずＬＤＬ−依存性であり
、かつ後にＨＤＬ−依存性であるので、各々の反応相の
中でＬＤＬ−もしくはＨＤＬ−依存性吸光度変化のため
のそれぞれ適当な時間域を選択することができる。この
ためには、オキシダーゼ反応の開始後はじめの１分間以
内に、血清■ＬＤＬ　−フラクション中に結合するコレ
ステリ／のだめの尺度として、　Ｈ２Ｏ２形成を動力学
的に測定する。引き続き、オキシダーゼ反応の開始後２
〜１５分の時間域において、血清のＨＤＬ−フラクショ
ン中に結合しているコレステリンのための尺度としてＨ
２Ｏ２形成を動力学的に測定する。

史に、本発明による方法の有利な実施形によれば、ＨＤ
Ｌ−コレステリンの測定ｖｋ第２の反応溶液を添加する
ことによりコレステリンエステラーゼの濃度を高めて、
全コレステリン量の反応を短時間内に完全に行なうこと
が可能である。

こうして試料中のコレステリン全ｉｔを測定することが
できる。このためにはＨＤＬ−測定が終了するとすぐに
、付加的に、すなわち）（ＤＬ−コレステリン測定のた
めに前記した量を越えて、コレステリンエステラーゼ及
び場合によシコレステリンオヤシダーゼ及び／又は界面
活性剤を高濃度で添加することで十分である。

全コレステリンの迅速で完全な反応のために好適な試薬
の十分量の添加も公知技術によシ容易に行なうことがで
きる。

こうして、本発明方法を用いて、試料中でＬＤＬ−フラ
クション、ＨＤＬ−フラクション並びに全コレステリン
の量を平行して測定することも可能である。

Ｈ２Ｏ２及びコレステノンが生じるコレステリンオキシ
ダーゼを用いる遊離コレステノン■測定及びこの酸化反
応の反応成分の変化の動力学的測定は、例えば西独特許
公告第２５５８５５６号公報から公知である。この除虫
じたＨ、１０２　ｋ、専門家がしばしば行なうＨ２Ｏ２
−測定のための比色法を適用して検出するのが有利であ
る。本発明方法に非常に好適である典型的なＨ２Ｏ２−
測定は、ペルオキシダーゼの存在下にフェノール又はフ
ェノール誘導体と４−アミノアンチざリン又はその誘導
体との呈色反応に基づく。この測定法は専門家にとって
は公知なことであプ、より詳細な記載は必要ない。

本発明のもう１つ０１１題はコレステリンエステラーゼ
、コレステリンオキシダーゼ、胆汁酸詳の界面活性剤、
非イオン系界面活性剤、ｎｍ剤−５〜９及びＨ２Ｏ，の
光度定量用システムを含有する、血清のリポタンパク質
のＬＤＬ−フラクションの存在においてＨＤＬ−７２ク
シヨンのコレステリンを特異的に測定するための試薬に
おいて、コレステリンエステラーゼをＯ，ＯＳ〜３０Ｕ
／１ＪｏＩＩ＆で、コレステリンオキシダーゼを０．１
〜５　Ｑ　Ｕ　／ＩＪＩＺ）濃度で、胆汁酸群０界面活
性剤を１．０〜２０　ｍ　ｍａｌ　ｌ’Ｐ’！Ｆ’、か
つ非イオン系界面活性剤を０．１〜１０．９／ｌの績度
で、それぞれ試験に使用する希釈に関して含有するＨＤ
Ｌ　−７２クシヨンのコレステリンの％異的測定試薬で
ある。

本発明による方法を自動分析装置で行なうためには個々
の反応成分が担持材料上又は担持材料中に含浸されてい
るのがよい。担持材料としては吸収性、膨潤性又は膜形
成性担持材料、例えば試験片のために公知の担持材料、
例えば紙及び類似の７リース材料、例えばティーバック
紙を使用することができる。この際、反応成分は多くの
、接触している担体上に分配され℃いてもよい。

有利な実施形において、本発明による試薬は付加的にＬ
ＤＬ及び／又はアポリボプロティンＢに対する抗体を含
有する。

ＨＤＬ中に含有されるコレステリンを、他のリポタンパ
ク質７ラクシヨンをあらかじめ分離することなく直接測
定することも可能である。史に、ＬＤＬ−フラクション
中に含有されるコレステリン及び血清中に含有される全
コレステリンを測定することも可能である。該方法は簡
単に実施することができ、かつ自動化可能である。

実施例 次に実施例及び添付図面につき本発明を更に詳細に説明
する。

例１ ＬＤＬ−コレステリン含量が同じであｆｉ、ＨＤＬ−コ
レステリン含量が異なる２種の人血清を異なる割合いで
混合し、一定のＬＤＬ−コレステリン含量で、ＨＤＬ−
コレステリンを上昇量で含有する一連の試料を作る。該
試料名０．０２ｍを次の組成の試薬各２．０紅と共に約
３０℃で恒温保持する； 燐酸カリクム緩衝剤、−６，７０，１Ｍトリブロムヒド
ロキシ安息香酸 ８．６　ｍＭ ４−アミ、ｔアンチｔリン１．６ＩｎＭコール酸ナトリ
ウム　　　　　３ｍＭ ？　ＩＪエチレンｆ　ＩＪ　”　−ル６０００　０．１
％テジト［Ｆ］　　　　　　　　　　０．１％豚膵臓か
らのコレステリンエステ ラーゼ　　　　　　　　　　　　１Ｕ／酎ノカルゾア属
菌からのコレステリ ンオキシダーゼ　　　　　　　１Ｕ／Ｉｄペルオキシダ
ーゼ　　　　　　２．５０／ｄ第１図は、５４６　ｎｍ
における吸光増加は先ずＨＤＬ−コレステリン濃度にほ
とんど依存せず、しかしながらその後の経過においては
明らかにＨＤＬ−コレステリン濃度に依存するというこ
とを示している。こうして最初の１分の間は、吸光度の
上昇はＨＤＬ−コレステリン濃度の尺度ではなく（第２
図）、１方第６番目の１分間における吸光度の上昇はＨ
ＤＬ−コレステリン濃度に比例する（第６図）。

例２ ＬＤＬ−コレステリン含量が同じであｆｉ、ＨＤＬ−コ
レステリン含量が異なる２ｍＣ１人血＆を異なる割合い
で混合し、一定のＬＤＬ−コレステリン含量で、１（Ｄ
Ｌ−コレステリンを上昇量で含有する一連の試料を作る
。該試料名０．０２１１１Ｊを次の組成の試薬各２．Ｑ
ｒｎｌと共に約６０℃で恒温保持する： 燐酸カリクム駿衝剤、ｐｋｉ６．７　０．１Ｍトリブロ
ムヒドロキシ安息香酸　　８．６　ｍＭ４−アミノアン
チピリン　　　　１．６ｍＭコール酸ナトリウム　　　
　　　　３　ｍＭポポリチレングリコール６０００　　
０．１％テジトｏ　　　　　　　　　　　０．１％豚膵
臓からのコレステリンエステ ラーゼ　　　　　　　　　　　　　ＩＵ／瓜！ブレビバ
クテリウム属菌からのコ レステリンオキシダーゼ　　　　１Ｕ／ｍＡペルオキシ
ダーゼ　　　　　　　２．５Ｕ／獣例１におけるように
、ここでも５４６　ｎｌＨにおける吸光度上昇はほとん
どＨＤＬ−コレステリン濃度に依存せず、第６番目の１
分間においてはＨＤＬ−コレステリン濃度に比例する。

例３ 例１に記載した反応混合物から出発し、次の成分の濃度
を変化させる： テジト［Ｆ］、コール酸ナトリウム、コレステリンエス
テラーゼ、コレステリンオキシダーゼ。

例１に記載した実皺を、このように変化させて実施する
。観察されたＨＤＬ　碗度に対する依存性を異なる時間
域内に得られる回帰線データの形で次の表中に示す。

例４ 反応温合物はシンイドモナス属菌からのコレステリンエ
ステラーゼＱ、５Ｕ／ＷＬｔ及びストレゾトーｒイセｘ
ｌｊ４菌からのコレステリンオキシｒ　−ゼ２Ｕ／ｍｌ
を含有しておシ；それ以外は組成は例１と同じである。

ここでも相応して選択した時間域内でのＨＤＬ−コレス
テリン濃度への著しい依存性が観察された；３７℃にお
ける恒温保持第４番目の１分間に、例えば第２図もしく
は第３図に相応する評価において回帰直線Ｙ；１．０２
　ｘ　＋　１．５■／ｄＪが得られる。同様な結果はカ
ンシダ・シリンドラセ−（Ｃｏｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄ
ｒａｃｅａ　）からのコレステリンエステラーゼ１．５
Ｕ／ａｉＡ及びストレプトマイセスからのコレステリン
−オキシダーゼ２Ｕ／ＩＬＩｊの組合わせからも得られ
る（ｙ＝１．１３８−０．９）。

例５ 例１に記載したように行なうが、ナツト［Ｆ］のかわシ
に他の非イオン系界面活性剤を使用する。

観察されたＨＤＬ−コレステリン濃度への依存性を、種
々の時間域の評価において得られた回帰線データの形で
表にあられした。

例６ 光度測定自動分析装置で、適切に選択した時間域内での
吸光度差を介して人血清中Ｃ）　ＨＤＬ　−コレステリ
ン含量を調べた。検量線の作成は公知！（ＤＬ−コレス
テリン含量の人血清を用いて行なう。試薬は基本的に例
１の試薬に相当するがこの際専門家はコレステリンエス
テラーゼ及び／又はコレステリンオキシダーゼの活性、
コール酸ナトリウム及びナツトの濃度、時間域を変える
ことによシ、もしくは市販の抗−Ｂ−抗血清を添加する
ことにより、使用する自動分析装置にテストを合わせる
。例１に対してコレステリンオキシダーゼＱ活性ｅＯ，
３６Ｕ／ｌｌｌ１に低下させ、３０℃で吸光度上昇を恒
温保持の第７番目の１分間以内に測定する時、例えばす
でに確立Ｌ　？、：　Ｉ（ＤＬ−コレステリンのための
燐タングステン酸塩−沈殿法を用いた時と同様な値を達
成することができることを第４図は示している。

第５図は、この条件下に、ＬＤＬに対する脱脂抗体８　
ｘ　１０”−６ｍｏｌ　／　ｌの添加が方法の一致を更
に改良することを示している。

回帰直ｍ（標準主要成分分析）： 第４図　Ｙ＝０．７７１　！＋３．５５１　（＃／ａｎ
）第５図　Ｙ＝’０．９８１　　＋０．０３４　（ＴＲ
９／ｄｌ）例７ 例６に記載されたと同じように実施する。平行実験にお
いて、光反測定のための時間域と脱脂抗−ＬＤＬ−抗血
清の添加を相互に独立して変化させた。人血清の集合物
に関して得られたデータを燐タングステン酸（ｐｗｓ）
沈殿法の結果との比較を次の表中に回帰線データの形で
示す。

例８ 測定域の好適な選択により、すべての臨床化学におい℃
しばしば使用される測定温度におい”（、ＨＤＬ−コレ
ステリンのための確立された燐タングステン酸塩沈殿法
の結果との良好な一致が達せられる。回帰線データの形
で次に示した、２７人血清の集合物についての一連の方
法比較に関して、本発明による方法の次の実施形を選択
した： 装　　置：日立７０５ 測定波長：　５０５　ｎｍ 比較波長：　６００　ｎｍ 罰飾硼Ｍ　：　ＨＤＬ−コレステリン含量公知の人血清 試料容ｆｆｉ：１０μ） 試薬容ｔ：０．５Ｎ 試薬組成： 燐酸カリクム緩ＷＪ剤ｐ）１６．７　　０．１Ｍトリフ
ロムヒドロキシ安息香酸　　８．６凸４−アミノアンチ
ビリ／１．６鹿 コール酸ナトリウム　　　　　５　ｍＭポポリチレング
リコールＭＧ６０００　０．１％ナツト［Ｆ］（非イオ
ン系界面活性剤）１．５　ｇ／１１ 豚膵臓からのコレステリン−ニス テ２−ゼ　　　　　　　　　　　　０．２５Ｕ／ｄコレ
ステリンオキシダーゼ　　　　下記ペルオキシダーゼ　
　　　　　　　２．５０／！ｕ

【図面の簡単な説明】

第１図は一定のＬＤＬ−コレステリン濃度８４■／ｄｌ
において異なるＨＤＬ−コレステリン濃度を有する試料
の反応経過を示すグラフ図であり、曲＃１におけるＨＤ
Ｌ−コレステリン濃度は６５．６　ｗ／ａｌ　、曲ｉ！
ｊ１２、曲線３、曲線４、曲線５のＨＤＬ−コレステリ
ン濃度はそれぞれ５６．５■／ｄＪ　、　４７．４ダ／
ｄＡ！　、　３８．３　’１１９／ｄｌ、２９．２■／
ｄｌである。 第２図は時間域Δｔ、＝Ｑ〜１分における第１図を評価
したグラフ図である。 第６図は時間域Δｚ＝５〜６分における第１図を評価し
たグラフ図である。 第４図は本発明によるＨＤＬ−コレステリン測定（抗−
Ａｐｏ−β−抗体の株加なし）と燐タングステン酸沈殿
法（ＰＷＳ）とを比較したグラフ図である。 第５図は本発明によるＨＤＬ−コレステリン鉤定（抗−
Ａｐｏ−β−抗体８　・１０−’　ｍｏｌ／ｌの添加）
とＰｗＳとの比較グラフ図である。 ＦＪＧ、２ ＦＩＧ、３ 理論値ΣＩＤＬ−コレステリン量ｉｍｇ／ｄｌｌＦＩＧ
、４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、コレステリンエステラーゼを作用させてコレステリ
   ンを遊離させ、遊離したコレステリンをコレステリンオ
   キシダーゼ及び酸素を用いてＨ＿２Ｏ＿２の形成下に酸
   化し、Ｈ＿２Ｏ＿２−形成又は酸素消費の動力学的測定
   を行なうことにより、血清のリポタンパク質のＬＤＬ−
   フラクションの存在においてＨＤＬ−フラクションのコ
   レステリンを特異的に測定する方法において、該測定を
   温度２０〜４０℃で酸化反応の開始後２分〜１５分の範
   囲内で所定の時間域で実施し、反応溶液中での測定の間
   コレステリンエステラーゼ濃度０．０５〜３０Ｕ／ｍｌ
   、コレステリンオキシダーゼ濃度０．１〜５０Ｕ／ｍｌ
   、胆汁酸群の界面活性剤濃度１．０〜２０ｍｍｏｌ／ｌ
   、非イオン系界面活性剤濃度０．１〜１０ｇ／ｌ及びｐ
   Ｈ値５〜９を保持することを特徴とするＨＤＬ−フラク
   ションのコレステリンの特異的測定法。 ２、非イオン系界面活性剤をオキシダーゼの添加後で、
   かつ測定の１〜１４分前に添加する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３、測定をオキシダーゼ反応の開始後３〜１０分の範囲
   内に実施する特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
   方法。 ４、コレステリンエステラーゼ濃度を０．０５〜１０Ｕ
   ／ｍｌに保持する特許請求の範囲第１項又は第２項に記
   載の方法。 ５、コレステリンオキシダーゼ濃度を１〜３０Ｕ／ｍｌ
   に保持する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
   。 ６、胆汁酸群の界面活性剤濃度を１．５〜８ｍｍｏｌ／
   ｌに保持する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
   法。 ７、非イオン系界面活性剤濃度を０．４〜４ｇ／ｌに保
   持する特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ８、温度２５〜３７℃で測定を行なう特許請求の範囲第
   １項から第７項までのいずれか１項記載の方法。 ９、胆汁酸群の界面活性剤としてコール酸ナトリウムを
   使用する特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
   か１項記載の方法。 １０、非イオン系界面活性剤として、ポリエチレンオキ
   シド基を有する界面活性剤を使用する特許請求の範囲第
   １項から第９項までのいずれか１項記載の方法。 １１、膵臓からのコレステリンエステラーゼを使用する
   特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２、抗−ＬＤＬ−抗体及び／又は抗−アポリポプロテ
   インＢ−抗体の存在下に反応を実施する特許請求の範囲
   第１項から第１１項までのいずれか１項記載の方法。 １３、オキシダーゼ反応の開始後、最初の２分間の範囲
   内に付加的にＨ＿２Ｏ＿２−形成を、血清のＬＤＬ−フ
   ラクション中で結合するコレステリンに関する尺度とし
   て動力学的に測定する特許請求の範囲第１項から第１２
   項までのいずれか１項記載の方法。 １４、ＨＤＬ−コレステリンの測定後、界面活性剤及び
   ／又はコレステリンエステラーゼを、試料中に含有され
   る全コレステリンがＨ＿２Ｏ＿２形成下に酸化され、か
   つコレステリン全含有量の尺度としての呈色反応の終値
   が測定されるような量で添加する特許請求の範囲第１項
   から第１３項までのいずれか１項記載の方法。 １５、コレステリンエステラーゼ、コレステリンオキシ
   ダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、非イオン系界面活性剤
   、緩衝剤ｐＨ５〜９及びＨ＿２Ｏ＿２の光度定量用シス
   テムを含有する、血清のリポタンパク質のＬＤＬ−フラ
   クションの存在においてＨＤＬ−フラクションのコレス
   テリンを特異的に測定するための試薬において、コレス
   テリンエステラーゼを０．０５〜３０Ｕ／ｍｌの濃度で
   、コレステリンオキシダーゼを０．１〜５０Ｕ／ｍｌの
   濃度で、胆汁酸群の界面活性剤を１．０〜２０ｍｍｏｌ
   ／ｌの濃度で、かつ非イオン系界面活性剤を０．１〜１
   ０ｇ／ｌの濃度で、それぞれ試験に使用する希釈に関し
   て含有するＨＤＬ−フラクションのコレステリンの特異
   的測定試薬。 １６、ＬＤＬに対する抗体及び／又はアポリポプロテイ
   ンＢを含有する特許請求の範囲第１５項記載の試薬。 １７、薄片状担持材料上又は中に含浸されて存在する特
   許請求の範囲第１５項又は第１６項記載の試薬。 １８、担持材料が吸収性、膨潤性又は膜形成性材料であ
   る特許請求の範囲第１７項記載の試薬。