KR100682082B1

KR100682082B1 - 생체시료성분의 측정방법

Info

Publication number: KR100682082B1
Application number: KR1020017010563A
Authority: KR
Inventors: 키시코지; 카쿠야마츄토뮤; 오치아이코지; 하세가와유조
Original assignee: 시스멕스 가부시키가이샤
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2007-02-12
Also published as: US7208287B2; KR20010103016A; EP1158299B1; JP4547095B2; US20040161811A1; WO2000052480A1; EP1158299A1; ATE400816T1; DE60039418D1; CA2363570A1; EP1158299A4

Abstract

보통 자동분석장치를 이용하여 원심분리를 하지 아니하고 또 반응액중에 복합체나 응집체에 의한 혼탁을 형성하지 아니하고 생체시료중의 HDL(고비중리포단백), LDL(저비중리포단백), VLDL(초저비중리포단백)등의 리포단백중의 특정성분을 정량하는 방법을 제공하는 것을 혈청중의 특정리포단백중의 특정 성분을 효소반응으로 측정하는 방법에 있어서 특이적으로 상기 성분을 측정하기 위하여 특정리포단백획분의 측정목적의 성분에 대하여만 효소반응을 가능하게 하는 조정수단을 도입하므로서 달성하였다.

리포단백, 효소반응, 생체시료, 자동분석장치

Description

생체시료성분의 측정방법{Method for assaying biological sample component}

본 발명은 혈청중 특정의 리포단백 성분을 효소반응에 의하여 측정하는 수단 및 방법에 관한 것이다.

예전부터 리포단백은 초원심조작에 의거 고비중 리포단백(HDL), 저비중 리포단백(LDL), 초저비중리포단백(VLDL), 카이로미크론(CM)으로 분획되었다. 이 조작은숙련이 필요하며 초원심기를 구비하고 원심을 수일에 걸쳐서 행한다. 그 때문에 다검체를 처리할 수 없었다.

이 것 대신에 폴리에틸렌글리콜, 또는 덱스트란유산등의 폴리아니온(polyanion)에 마그네슘이나 칼슘등의 이가 양이온을 공존시킨다거나 린턴그스텐산에 이가 양이온(cation)을 공존시킨 용액과 혈청을 혼화시켜서 LDL, VLDL, CM을 침전시키고 원심후의 상청에 남는 HDL만을 분획하는 방법이 주류를 이루고 있다.

이 방법은 임상검사분야에서 널리 보급하고 있는 자동분석장치를 이용할 수가 있다. 즉 분획한 HDL중의 콜레스테롤은 이미 확립되어있는 자동분석장치를 이용한 총 콜레스테롤의 효소법에 의한 측정을 응용하여 그 농도를 구할 수가 있다. 그 러나 이 방법도 저속이기는 하지만 원심조작이 필요하며 분획제와 혈청을 혼화시킬 때 인위적인 정량오차나 검체의 실수등이 문제가 되었다.

더구나 자동분석장치도 다른 일반적인 생화학항목과 동시에는 측정할 수가 없었다. 임상검사는 신속한 대응이 요구되며 다른 검사항목과 동시에 측정하여 검사시간을 단축하는 것이 과제가 되어왔다.

한편, 임상적으로 동맥경화 위험요인인 LDL중의 콜레스테롤치를 중시하는 보고[총 콜레스테롤의 기준치와 설정근거: 동맥경화, 24(6), 280 (1996)]도 있다. 현재 LDL중의 콜레스테롤치는 총 콜레스테롤 (T-CHO), 중성지방 (TG) 및 HDL중 콜레스테롤 측정결과에서 경험적인 팩터를 삽입하여 구한다. 그 식[Friedewald W.T., et al., Clin. Chem., 18, 499~502 (1972)]은 아래와 같다.

LDL중 콜레스테롤치 =

총콜레스테롤치 - HDL 콜레스테롤치 - TG치/5

이 방법은 측정하는 3항목이 모두 정확하게 측정되지 않으면 성립하지 않는다. 또한 TG치가 400㎎/dL을 넘거나, LDL중의 콜레스테롤 농도가 100㎎/dL 이하가 되면 계산치가 LDL중의 콜레스테롤 농도를 반영하지 않게 된다고 한다. [Warnick G. R., et al., Clin. Chem., 36(1), 15~19(1990)], [McNamara J. R., et al., Clin. Chem., 36(1), 36~42(1990)].

따라서 이 방법으로는 측정의 목적인 LDL중의 콜레스테롤의 이상치를 검출하는 것이 어려웠다.

또한 전기영동으로 리포단백을 분리하고 단백량을 측정하는 방법이나 HPLC에 의한 리포단백별 콜레스테롤의 측정법도 있지만 어느 것이나 검체 처리능력에 모자라는 방법이며 고가인 전용장치도 필요하게 된다.

최근 HDL중의 콜레스테롤 측정에 관하여 전술한 문제를 해결하기 위해 HDL중의 콜레스테롤을 전자동으로 측정하는 키트가 개발되어 보급되고 있다.

특허 제 2600065호 공보, 특개평 8-201393호 공개공보 및 특개평 8-131195호 공개공보에서 볼 수 있는 기술은 분획제를 병용하고 있으며 분획제에 포함되는 이가 양이온으로써 사용되는 금속이 자동분석장치에서 일반적으로 사용되는 세제에 의하여 불용성인 침전물을 형성하고 그 것이 이 장치의 폐액기구내에서 측정되므로써 고장의 원인이 되고 있다.

더우기 측정반응중에 불용성인 응집물을 형성하여 측정결과에 영향을 주는 혼탁이 생겨 측정오차의 원인이 될 뿐만 아니라 그 응집물에 의해 반응셀이 오염되어서 동시에 측정하고 있는 다른 생화학 항목의 측정결과에 적지않게 영향을 미치고 있다.

이 HDL중의 콜레스테롤의 자동측정법에서는 2 포인트엔드법, 레트법, 더블레트법, 픽스타임법등의 공지된 측정법을 선택할 수 있도록 되어 있으므로 탁해진 상태에서도 측정은 가능하다.

그러나 상기 측정법에 의하여도 혼탁할 경우의 측정은 반응중 혼탁의 정도가 변화될 때는 측정치의 정확성에 문제가 발생한다.

또한 반응액이 탁해지면 재현성이 저하된다. 때문에 측정하는 검체에 제한이 있고 폭 넓은 측정파장을 사용할 수가 없으며 다양한 종류의 환자 검체에 대응할 수가 없다.

예를 들면 340㎚ 부근(단파장역)에서는 응집물에 의해 탁해지는 현상이 있어서 흡광도가 2-3 이상이 되며 분석기의 허용범위를 누차 넘어버리는 결점이 있다.

이가 양이온을 사용할 것 없는 특개평 9-96637호 공개공보 기재의 기술은 리포단백과 응집하는 항혈청을 포함시킨 방법이지만 이 것도 혼탁의 원인이 되는 항원항체응집물을 형성하므로 반응셀이 오염된다. 따라서, 동시에 측정하고 있는 다른 생화학 항목의 측정결과에 적지않게 영향을 미친다. 또한 반응액중의 혼탁이 강하게 되므로 특히 단파장역에 의한 HDL중의 콜레스테롤 측정에 대하여도 전술한 바와 같은 원인으로 정확한 측정은 불가능하다.

이 것들의 기술은 복합체나 응집체를 형성하는 것으로서 효소반응을 저해하는 공통의 기술과 측정법을 연구하므로써 성립한 것이며 혼탁 본래가 가지는 측정의 악영향은 해소되지 않는다. 이와같은 혼탁을 최종적으로 소거하는 기술이 혼탁대책의 한가지이다. 특개평 6-242110호 공개공보에서 보듯이 혼탁을 최종적으로 소거하는 조작을 더한다면 정확한 측정치를 얻게 된다. 그러나 이 방법에서는 최저에서도 3-4단계의 시약분주조작이 필요하게 된다. 시판되고 있는 자동분석장치중에는 3-4단계의 시약분주조작에 대응할 수 있는 것도 있지만 일반적으로 보급하고 있는 생화학 항목용의 자동분석장치는 최대 2단계의 시약분주조작에 대응하고 있는 것이 많으므로 이 방법을 응용할 수 없는 것이 있다.

한편 LDL중의 콜레스테롤 측정은 현재도 전술한 바와 같은 계산에 의한 방법을 취할 수 밖에 없는 상황이다.

최근 특개평 07-280812호 공개공보, WO96/29599호 공개공보, 특개평 09-313200호 공개공보기재의 기술에서 보듯이 완전자동화를 목지한 LDL중의 콜레스테롤 측정법의 보고가 있다. 이 것은 응집체나 복합체를 형성하는 기술의 연장선상에 있으므로 측정시의 혼탁조정이 금추의 과제이다.

본 발명이 해결하려고 하는 과제는 혈청중의 특정한 리포단백획분중의 성분을 효소반응에 의하여 측정하는 방법에 있어서 보통 사용하는 자동분석장치을 이용하여 처리공정중에 원심분리조작을 하지 않고 또 반응액중에 복합체나 응집체에 의한 혼탁을 형성하지 않고 생체시료중의 HDL(고비중리포단백), LDL(저비중리포단백), VLDL(초저비중리포단백) 등의 리포단백중의 성분을 정량하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 혈청중의 특정 리포단백획분중의 성분을 효소반응으로 측정하는 방법에 있어서 특이적으로 이 성분을 측정하기 위하여 리포단백획분의 성분에 작용하는 효소의 반응성을 조정하는 수단을 도입하는 것을 특징으로 하는 특정리포단백획분중의 성분 측정방법을 제공한다. 특정의 리포단백획분의 성분에 작용하는 효소의 반응성을 조정하는 수단으로서는 효소반응액의 이온강도를 조정하는 물질을 첨가할 것, 비이온계면활성제를 선택할 것 및 특정리포단백에 대한 반응특이성이 있는 효소를 선택하여 사용할 것을 들 수 있다.

본 발명은 상기 3가지의 수단을 적의 선택하고 단독 혹은 조합하여 이용하므 로써 HDL중의 성분의 측정법, LDL중의 성분의 측정법 및 VLDL중의 성분의 측정방법을 제공한다.

본 발명의 측정방법은 고비중리포단백(HDL)중의 성분을 측정할 경우 반응액의 이온 강도를 충분히 높일 것, HDL에 우선적으로 작용하는 리포프로테인 리파제 및 콜레스테롤 에스터라제를 작용시킬 것 및 HDL에 반응선택성이 있고 HDL치가 16이상인 비이온 계면활성제를 사용할 것을 도입하는 것을 특징으로한다.

그리고 본 발명의 측정방법은 저비중리포단백(LDL)중의 콜레스테롤을 측정할 경우, 제 1효소반응계에 있어서 먼저 HDL획분중의 콜레스테롤 성분을 선택적으로 효소반응시켜서 측정 또는 소화하고 이어서 제 2효소반응계에 있어서 HLB치가 11-13인 비이온계면활성제를 이용하여 LDL획분중의 콜레스테롤 성분을 효소반응에 의거 측정하는 방법을 제공한다.

그리고 또한 본 발명의 측정방법은 제1효소반응계 및 제2효소반응계를 동시에 또는 각각 행하는 바에 따라 초저비중리포단백(VLDL)중의 콜레스테롤 성분을 잔류시키고 이어서 VLDL획분을 분해하는 수단을 도입하여 VLDL획분중의 콜레스테롤 성분을 효소반응에 의하여 측정하는 방법을 제공한다. 또한 HDL, LDL의 소거를 수반하지 않고 VLDL획분중의 콜레스테롤을 측정하여도 좋다.

또한 본 발명의 측정방법은 상기 본 발명의 측정방법에 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소를 첨가하여 유리의 콜레스테롤을 소화하는 공정을 더한 측정방법도 포함한다.

상기 본 발명의 측정방법은 그 효소반응액의 pH가 리포단백이 응집 또는 백 탁을 일으키지않는 범위에서 리포단백중의 성분을 효소반응시키는 효소의 최적 pH에 의거 선택되는 것을 특징으로 한다.

도1은 리포프로테인 리파제(LPL; chromobacterium viscosum유래)의 첨가효과를 나타낸 것이다. (실험 1) 도면 중 - ●-는 HDL획분, - ○-는 LDL획분, - □-는 VLDL획분의 반응상대량(%)을 나타낸다.

도2는 히드라딘의 첨가효과를 나타내는 것이다. (실험 2) 도면 중 - ●-는 HDL 획분, - ○-는 LDL획분, - □-는 VLDL획분의 반응상대량(%)을 나타낸다.

도3은 HLB치가 17.3인 비이온계면활성제 노니온 K-230의 첨가효과를 나타낸 것이다. (실험 3) 도면 중 - ●-는 HDL획분, - ○-는 LDL획분, - □-는 VLDL획분의 반응상대량(%)를 나타낸다.

도4는 효소반응액의 이온강도조정물질, 비이온계면활성제 노니온 K-230 및 선택된 효소를 첨가한 효과를 나타낸 것이다. (실험 4) 도면 중 - ●-는 HDL획분, - ○-는 LDL획분, - □-는 VLDL획분의 반응상대량(%)를 나타낸다.

본 발명의 효소반응액의 이온강도를 조정하는 물질을 첨가하므로써 특정 리포단백성분에 대한 효소의 반응성을 조정함이란 HDL, LDL, VLDL의 각 리포단백획분이 수용해성에 있어서 차이가 있으므로 이 성질을 이용하여 특정획분만을 용해시키고 선택적으로 특정획분중의 성분에 대하여 효소반응을 일으키는 것을 의미한다.

이 목적을 달성하는 하나의 수단으로서 시료중의 이온강도를 상승시킨다. HDL을 선택적으로 용해시키기 위한 이온강도는 가령 히드라진 농도에 있어서 약 30mM, 보다 바람직하게는 60mM이상을 첨가함으로써 얻을 수 있다. 히드라진으로서는 히드라진류, 이의 염, 이의 수화물 및 이의 용매화물에서 HDL의 선택용해성을 지표로 하여 선택된 것을 사용할 수 있다. 마찬가지로 NaCl, 요소, 구아니딘류, 세미칼바지드류도 사용할 수 있다. 이온강도를 상승시키는 이들의 화합물은 단독 또는 여러개를 조합하여 사용하여도 좋다. 이 것들의 사용농도는 HDL의 선택용해성을 지표로 하여 실험적 반복에 따라서 결정할 수 있다.

본 발명의 효소의 특정리포단백에 대한 반응특이성을 이용하여 특정리포단백획분의 성분에 대하여 직접적 또는 우선적으로 반응액중에서 효소반응을 가능케 하는 수단은 HDL획분에 우선적으로 작용하는 리포프로테인리파제(LPL) 또는 콜레스테롤 에스터라제(CE)를 선택하여 수행한다. 상기 효소로서는 시판되는 Chromobacterium viscosum 유래의 LPL, CE가 예시된다. 더욱 LDL획분을 대상으로 할 경우에는 Pseudomonas속 유래의 효소등을 적절하게 선택할 수 있다. 효소에 대하여 각종 수식화는 효소활성과 특정리포단백획분으로의 선택성이 유지되고 있다면 효소의 첨가량은 자체공지의 기질량에 따라서 증감조정된다.

본 발명의 선택된 비이온계면활성제의 특정리포단백에 대한 반응 선택성을 이용하여 특정리포단백획분의 성분에 대하여 직접적 또는 우선적으로 반응액중 효소반응을 가능케하는 수단은 비이온계면활성제의 HLB치에 의하여 특정된다.

HLD획분을 대상으로 할 경우 HLB치가 16이상의 것이 선택되고 바람직하게는 17이상이 선택된다. 보다 바람직하게는 HLB치가 17이상의 폴리옥시에틸렌에테르류가 선택된다. 이 선택된 계면활성제는 LDL획분 및 VLDL획분에 대한 LPL, CE, 콜레스테롤 탈수소효소(CDH) 등의 효소작용을 저해한다. 구체적인 예를 이하에 열거하지만 본 발명에 이용하는 비이온계면활성제는 HLB치를 지표로하여 수시로 선택가능하며 하기의 예에 한정하지 않는다.; 세틸에테르(C16)(헥사데실에테르)(상품명: 일광 케미칼 주식회사: BC-25TX, BC-30TX, BC-40TX), 라우릴에테르(C12)(도데실에테르)(상품명: 일광 케미칼 주식회사: BL-21, BL-25), 올레일에테르(상품명: 일광 케미칼 주식회사: BB-50), 베헤닐에테르(C22)(상품명: 일광 케미칼 주식회사: BB-30), 폴리옥시에틸렌라우릴에테르(상품명: 일본유지주식회사: 노니온 K-230), 폴리옥시에틸렌모노라우레이트(상품명: 일본유지주식회사: 노니온 S-40), 폴리옥시에틸렌에테르류(상품명: 시그마: Brij98, Brij721, Brij78, Brij99)등.

LDL획분 또는 VLDL획분을 대상으로 하는 경우 특히 적극적으로 LDL획분의 성분 효소반응을 대상으로 할 경우에는 HLB치가 11~13의 비이온계면활성제가 선택된다. 예를 들면 트리톤X-100, 노니온HS210, 노니온 A-10R(일본유지주식회사)을 들 수 있다. 그러나 LDL획분의 성분을 측정하기 위하여 사용하는 계면활성제도 HLB치를 지표로하여 수시로 선택할 수 있으며 상기 예로 한정하지 않는다.

상기 계면활성제의 첨가량은 측정하는 리포단백량에 따라 변화하지만 HDL 및 LDL을 대상으로 한 사례에 있어서 나타낸 것은 검체 약 5μL에 대하여 계면활성제 농도 0.01~10%의 시약 약 180μL이다. 이에 따라 HDL 또는 LDL이 선택적으로 분해되고 이 것에 포함되는 성분의 효소반응이 가능케 된다. VLDL을 대상으로 할 경우 에는 계면활성제 농도를 0.05~20%로 조정하여 사용된다. 이에 따라 VLDL이 선택적으로 분해되고 이 것에 포함되는 성분의 효소반응이 가능케 된다.

효소 반응이 이루어지는 반응액의 pH는 리포단백이 응집 또는 백탁을 일으키지 않는 범위로서 리포단백중의 성분에 작용하는 효소의 최적 pH를 고려하여 선택된다. 바람직하게는 pH 약 6~9이다. pH가 약 6이하이면 리포단백이 백탁을 일으킨다. 리포단백이 비교적 안정한 pH 7부근을 선택하여 측정조건을 조정한다면 좋지만 COD(콜레스테롤 산화효소), CDH(콜레스테롤 탈수소효소), LPL 및 CE등의 효소의 최적 pH도 고려한다. 바람직하게는 CDH, LPL 및 CE의 반응은 pH 약 7~9가 바람직하며 COD의 반응은 pH 약 6~8이 바람직하다.

반응액은 완충액으로 조정하는 것이 바람직하며 통상 생화학반응에 사용되는 각종 완충액을 이용할 수 있다. 예를 들자면 HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-1peperazinyl]ethanesulfonic acid)완충액, PIPES(Piperazine-1, 4'-bis(2-ethanesulfonic acid)완충액, TAPS(N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-3-aminopropanesulfonic acid)완충액, BES-BisTris완충액, Tris-염산완충액, 3-몰호리노부로반슬혼산(MOPS)완충액, 인산완충액을 첨가물과의 적합성에 맞게 선택하여 이용한다. 또 본 발명의 실시예 및 실험예에서는 pH조건에 맞추어서 각각 PIPES완충액 및 TAPS완충액을 이용하였다.

또한 원하는 바에 따라 LDL, VLDL 및 카이로미크론 중의 유리형 콜레스테롤이 HDL중의 콜레스테롤 측정시의 반응에 관여하여 가끔 오차의 원인이 되므로 미리 COD나 CDH에서 이들의 유리형 콜레스테롤을 반응시켜서 히드라딘 존재하에서 콜레 스테롤 히드라딘으로 변환하고 HDL중의 콜레스테롤 측정시를 위하여 비기질화하여 두는 방법도 있다. 비기질화하는 기술은 공지되어있고 예를 들면 특개평 5-176797호 공개공보를 참조하면 좋다.

본 발명에 있어서는 상기 3가지의 수단, 이온강도의 선택, 효소의 선택, 계면활성제의 선택을 단독 또는 적절하게 선택하여 조합하여 도입한다. 보다 바람직하게는 이 것들 모두의 수단을 동시에 도입하지만 반드시 모두를 동시에 도입할 필요는 없다. HDL중의 콜레스테롤 성분을 측정하는 경우 제1의 조건은 수용성이 높은 고비중리포단백(HDL)중의 성분을 용액중에 용해하기 쉽게 하기 위하여 이온강도를 충분한 정도로 높게 조정하는 것에 있으며 제2의 요건은 HDL획분에 우선적으로 작용하는 리포프로테인리파제(LPL) 또는 콜레스테롤 에스터라제(CE)를 선택하여 작용시키는 것에 있고 제 3의 요건을 HDL획분에 대하여 반응선택성이 있는 HBL치가 16이상인 비이온계면활성제를 이용하여 HDL획분중의 성분에 대하여 직접적 또는 우선적으로 반응액중에서 효소반응을 일으키는 것에 있다.

리포단백중의 성분인 콜레스테롤을 효소측정법으로 측정할 경우 효소로서 CDH를 사용할 때는 보효소로써 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드 산화형(NAD) 티오니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드 산화형(NADP), 티오니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산 산화형(t-NADP)등을 사용한다. 또 COD를 사용할 때는 퍼옥시다제(POD)와 공지인 과산화수소정량법을 조합하여 측정을 행한다. 총 콜레스테롤의 측정에 필요하게 되는 효소의 활성화제인 코올산류나 계면활성제는 그 조건을 적절하게 선택하고 실험적 반복에 의거 농도를 조정하면 된다.

LDL중의 콜레스테롤 성분을 측정하는 경우는 먼저 상기의 HDL획분중의 콜레스테롤 성분을 제 1효소반응계에 있어서 선택적으로 효소반응시키고 이어서 제 2효소반응계에 있어서 LDL획분에 대하여 작용하는 LPL 및 또는 CE와 LDL을 적극적으로 분해하는 계면활성제를 더하여 CDH에 의한 반응생산물을 검출한다.

효소반응생산물의 측정은 CE, LPL등의 효소작용에 의하여 생성된 화합물인 콜레스테롤을 정량하는 자체 공지의 방법에서 적의하게 이하에 나타내는 바와 같은 측정계를 선택하여 행한다. 예를 들면, CDH-NAD계를 이용하는 경우는 340nm의 흡광도에서 측정하고 COD계를 이용하는 경우 500nm이상(색원체의 종류에 의존한다)의 홉광도에서 측정한다. 측정법은 기존의 레트법, 2포인트엔드법등을 원하는대로 이용할 수 있다.

실시예 1

이하의 시약을 조제하였다. 검체는 일반인의 혈청 10예를 이용하였다. 측정은 일립 7170형 자동분석장치에서 실시하였다. 조각법은 우선 각 검체 5μL에 시약 1-A 또는 B 또는 C 180μL을 각각 더하고 37℃에서 5분간 항온하고 이 시점에서 주파장 340nm 및 부파장 570nm에서 흡광도 1을 측정하였다.

더욱이 시약 2를 60μL 더하여 37℃에서 5분간 항온하고 이 시점에서 주파장 340nm 및 부파장 570nm에서 흡광도 2를 측정하였다. 흡광도 1과 흡광도 2의 차를 구하고 HDL-콜레스테롤 농도가 기지의 콘트롤을 표준액으로 검체의 수치를 환산하였다. 대조법으로서 폴리에틸렌를리콜(PG)법을 이용하였다.

PG법은 국제 시약주식회사제 PG법을 이용하였다. 또 원심후의 상청의 콜레스테롤 농도는 국제시약주식회사제 T-CHO시약 A를 이용하여 구하였다.

측정 결과로서 대조법과의 비교를 표 1에 나타내었다. 시약 1-A, 1-B, 1-C를 이용한 측정은 대조법에 일치한 양호한 결과가 되었다.

시약 1-A

완충액 pH 7.0

이염화히드라지늄 100mmol/L

β-NAD 6.0mmol/L

코올산나트륨 0.1%

노니온K-230(HLB치 17.3) 0.6%

시약 1-B

완충액 pH 7.0

이염화히드라지늄 100mmol/L

β-NAD 6.0mmol/L

Briji97(HLB치 19) 0.24%

코올산나트륨 0.1%

시약 1-C

완충액 pH 7.0

이염화히드라지늄 100mmol/L

β-NAD 6.0mmol/L

노니온K-230(HLB치 17.3) 0.2%

콜레스테롤 산화효소 (COD) 1.0U/mL

코올산나트륨 0.1%

시약 2

완충액 pH 6.5

콜레스테롤 산화효소 (COD) 20.0U/mL

LDL(Chromobacterium viscosum 유래) 6.0U/mL

코올산나트륨 0.2%

단위: mg/dL

검체	대조법	시약 1-A	시약 1-B	시약 1-C
1	31.6	33.1	22.6	34.0
2	71.6	71.3	70.8	70.3
3	53.8	58.8	56.3	58.2
4	42.4	46.3	39.8	45.2
5	52.6	54.8	49.2	56.2
6	35.9	43.3	39.5	42.4
7	41.1	44.0	41.2	44.9
8	26.0	28.2	27.6	27.3
9	60.0	67.9	66.9	61.0
10	112.0	119.6	121.1	119.7
상관관계		0.995	0.989	0.995
회소식의 기울기		1.039	1.123	1.031
회소식의 절편		1.968	-5.695	1.569

실시예 2

이하의 시약을 조제하였다. 검체는 일반인의 혈청 10예를 이용하였다. 측정은 일립 7170형 자동분석장치에서 실시하였다. 조작법은 우선 각 검체 3μL에 시약 A-1 210μL 더하고 37℃에서 5분간 항온하고 이 시점에서 주파장 340nm 및 부파장 570nm에서 흡광도 1을 측정하였다.

또 시약 A-2를 70μL 더하여 37℃에서 5분각 항온하고 이 시점에서 주파장 340nm 및 부파장 570nm에서 흡광도 2를 측정하였다. 흡광도 1과 흡광도 2의 차를 구하고 LDL-콜레스테롤 농도가 기지의 콘트롤을 표준액으로 검체의 수치를 환산하였다. 시약 B-1과 시약 B-2도 전술과 같이 조작한다. 대조법의 수치는 후리-데왈드식에 의거 구하였다. HLD 콜레스테롤 수치는 국제시약주식회사제 PG법을 사용하였다. 총 콜레스테롤 수치는 국제시약주식회사제 T-CHO시약 A를 이용하여 구하였다.

TG 수치는 국제 시약주식회사제 TG시약 A를 사용하여 구하였다. 측정결과를 표 2에 나타냈다. 본 법은 대조법과 비교하여 양호한 결과를 얻었다.

시약 A-1

완충액 pH 7.8

이염화히드라지늄 100mmol/L

콜레스테롤 탈수수효소 (CDH) 20.0U/m/L

β-NAD 6.0mmol/L

LDL(Chromobacterium viscosum 유래) 6.0U/mL

노니온K-230(HLB치 17.3) 0.15%

코올산나트륨 0.1%

시약 A-2

완충액 pH 8.5

CE(Pseudomonas 유래) 3.0U/mL

노니온K-230(HLB치 17.3) 0.5%

디옥시코올산나트륨 8.0mmol/L

시약 B-1

완충액 pH 7.8

이염화히드라지늄 100mmol/L

β-NAD 5.0mmol/L

콜레스테롤 탈수수효소 (CDH) 0.3U/m/L

LPL(Chromobacterium viscosum 유래) 6.0U/mL

노니온K-230(HLB치 17.3) 0.15%

코올산나트륨 0.1%

시약 B-2

완충액 pH 8.5

콜레스테롤 산화효소 (CDH) 20.0U/mL

CE(Pseudomonas 유래) 3.0U/mL

노니온A-10R 0.5%

디옥시코올산나트륨 8.0mmol/L

단위:mg/dL

검체	대조법	시약A	시약B
1	151	155	147
2	173	188	168
3	236	234	220
4	79	79	66
5	173	167	157
6	170	173	163
7	118	123	111
8	87	93	81
9	92	95	90
10	64	72	64
상관관계		0.995	0.996
회소식의 기울기		0.973	0.943
회소식의 절편		7.235	0.083

실험예

이하의 시약을 조제하고 각 펙터 효과를 실험 1-4에서 검토하였다.

검체는 일반인의 혈청 10예를 풀-한후 초원심조작을 하여 얻는 HDL, LDL, 및 VLDL 획분을 사용하였다. 측정은 일립 7170형 자동분석장치에서 실시하였다. 조작법은 먼저 각 검체 5μL에 각각 180μL의 시약 1-D~G를 더하고 37℃에서 5분간 항온하고 이 시점에서 주파장 340nm 및 부파장 570nm에서 흡광도 1을 측정하였다.

또 시약 1 D~G에 각각 상응하는 시약 2-D~G를 각 60μL 더하여 37℃에서 5분각 항온하고 이 시점에서 주파장 340nm 및 부파장 570nm에서 흡광도 2를 측정하였다. 흡광도 1과 흡광도 2의 차를 검정하였다.

실험 1을 위한 시약 1 D와 시약 2-D

시약 1-D

완충액 pH 7.0

β-NAD 6.0mmol/L

코올산나트륨 0.1%

시약 2-D

완충액 pH 8.5

콜레스테롤 탈수효소(CDH) 20.0U/mL

LPL(Chromobacterium viscos 유래) 0-15U/mL

코올산 나트륨 0.2%

실험 2를 위한 시약 1-E 와 시약 2-E

시약 1-E

완충액 pH 7.0

이염화히드라지늄 0-100mmol/L

β-NAD 6.0 mmol/L

코올산 나트륨 0.1%

시약 2-E

완충액 pH 8.5

콜레스테롤 탈수소효소(CDH) 20.0U/mL

LPL(Chromobacterium viscosim 유래) 6.0U/mL

코올산 나트륨 0.2%

실험3을 위한 시약 1-F 와 시약 2-F

시약 1-F

완충액 pH 7.0

β- NAD 6.0mmol/L

노니온 K-230(HLB치 17.3) 0-0.1%

코올산나트륨 0.1%

시약 2-F

완충액 pH 8.5

콜레스테롤 탈수소효소(CDH) 20.0U/mL

LPL(Chromobacterium viscosim 유래) 6.0U/mL

코올산나트륨 0.2%

실험4를 위한 시약 1-G와 시약 2-G

시약 1-G

완충액 pH 7.0

이염화히드라지늄 100mmol/L

β- NAD 6.0mmol/L

노니온 K-230(HLB치 17.3) 0-1.0%

코올산나트륨 0.1%

시약 2-G

완충액 pH 8.5

콜레스테롤(CDH) 20.0U/mL

LPL(Chromobacterium viscosim 유래) 6.0U/mL

코올산나트륨 0.2%

실험 1에 대한 고찰(도1)

Chromobacterium viscosim 유래의 LPL의 리포단백획분에 대한 특이성을 조사한 결과 HDL 및 VLDL 획분에 대하여 매우 강하게 작용하며 LDL 획분에 대하여 약한 반응성을 나타내었다. 이 효소를 사용하여 이하의 실험을 진행하였다. 또 각 시약 중에 6U/mL 첨가하기로 하였다.

실험 2에 대한 고찰(도2)

히드라진의 첨가 효과를 확인하였다. 히드라진의 첨가는 LPL의 HDL 획분에 대한 특이적 반응성을 더 강하게 했다. LPL획분에 대한 반응성을 거의 변동이 보이지 않았다.

이 결과를 근거로 시약 1-D에 100mmol/L의 히드라진을 첨가하였다.

실험3에 대한 고찰(도3)

HLB 17.3의 비이온계면활성제의 노니온 K-230/일본유지주식회사를 사용하여 HDL 획분에 대한 첨가효과를 확인하였다.

비이온계면활성제의 첨가는 LPL의 VLDL에 대한 반응성을 극단히 내리고 HDL 획분에 대한 특이적 반응성을 더 강하게 했다.

LDL 획분에 대한 LPL의 반응성도 저하시키는 효과를 확인하였다. 이 결과를 근거로 시약 1-D에 0.6%의 노니온 K-230을 첨가하였다.

실험 4에 대한 고찰(도4)

각 수단 즉 노니온 K-230, 히드라진 및 LPL을 조합하여 사용한 결과 보다 완벽한 HDL 획분의 선택적 반응계를 확립하였다.

본 발명의 수단을 적절하게 선택하고 단독 혹은 조합하여 도입한 특정 리포단백획분 중의 성분의 측정방법에서는 반응액 중에 형성된 복합체나 응집체에 의한 혼탁이 발생하지 아니하고 목적하는 특정의 리포단백 중 콜레스테롤의 측정정도를 상승시킬 수가 있다.

또 본 발명의 측정방법을 이용하면 생화학적 검사항목을 동시에 측정하여도 그 측정결과에 영향이 없기 때문에 리포단백 중 콜레스테롤의 측정과 생화학적 검사항목의 측정을 동시에 행하 수가 있다.

또 본 발명의 측정방법은 원심분리를 할 필요없이 시약분주조작도 2 단계가 있으므로 보통 사용하고 있는 대부분의 자동분석장치에 적용할 수 있고 측정의 간이화를 달성할 수 있다.

더욱, 본 발명은 리포단백 중의 콜레스테롤 뿐 아니라 다른 지질성분(중성지방, 린 지질 등)의 측정에도 응용가능하다.

Claims

생체시료, 히드라진류 및 HLB 치가 16 이상인 비이온 계면 활성제를 포함하는 제1의 반응액을 혼합하는 단계;

상기 혼합 단계에서 제조된 혼합물을, 생체시료 내의 고비중리포단백 중의 콜레스테롤과 반응하는 리포프로테인 리파제 및 콜레스테롤 에스터라제로부터 선택되는 1종의 제1효소와 콜레스테롤 탈수소효소 및 콜레스테롤 산화효소로부터 선택되는 1종의 제2효소를 포함하는 제2의 반응액과 혼합하는 단계; 및

상기 단계에서 얻은 혼합액의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 생체시료 내의 고비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정방법.
생체시료, 히드라진류, HLB 치가 16 이상인 제1의 비이온 계면 활성제, 생체시료 내의 고비중리포단백 중의 콜레스테롤과 반응하는 리포프로테인 리파제 및 콜레스테롤 에스터라제로부터 선택되는 1종의 제1효소, 및 콜레스테롤 탈수소효소 및 콜레스테롤 산화효소로부터 선택되는 1종의 제2효소를 포함하는 제1의 반응액을 혼합하는 단계;

상기 혼합 단계에서 제조된 혼합물을, HLB 치가 11 내지 13인 제2의 비이온 계면 활성제를 포함하는 제2의 반응액과 혼합하는 단계; 및

상기 단계에서 얻은 혼합액의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 생체시료 내의 저비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정방법.
히드라진류 및 HLB 치가 16 이상인 비이온 계면 활성제를 포함하는 제1의 반응액; 및

고비중리포단백 중의 콜레스테롤과 반응하는 리포프로테인 리파제 및 콜레스테롤 에스터라제로부터 선택되는 1종의 제1효소와, 콜레스테롤 탈수소효소 및 콜레스테롤 산화효소로부터 선택되는 1종의 제2효소를 포함하는 제2의 반응액을 포함하는 것을 특징으로 하는 고비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정용 반응액 키트.
히드라진류, HLB 치가 16 이상인 제1의 비이온 계면 활성제, 고비중리포단백 중의 콜레스테롤과 반응하는 리포프로테인 리파제 및 콜레스테롤 에스터라제로부터 선택되는 1종의 제1효소, 및 콜레스테롤 탈수소효소 및 콜레스테롤 산화효소로부터 선택되는 1종의 제2효소를 포함하는 제1의 반응액; 및

HLB 치가 11 내지 13인 제2의 비이온 계면 활성제를 포함하는 제2의 반응액을 포함하는 것을 특징으로 하는 저비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정용 반응액 키트.
제3항에 있어서, 상기 히드라진류는 히드라진류의 염, 히드라진류의 수화물, 히드라진류의 용매화물에서 선택됨을 특징으로 하는 고비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정용 반응액 키트.
제4항에 있어서, 상기 히드라진류는 히드라진류의 염, 히드라진류의 수화물, 히드라진류의 용매화물에서 선택됨을 특징으로 하는 저비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정용 반응액 키트.
제5항에 있어서, 상기 히드라진류는 반응액 중 30mM 이상의 농도로 포함됨을 특징으로 하는 고비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정용 반응액 키트.
제6항에 있어서, 상기 히드라진류는 반응액 중 30mM 이상의 농도로 포함됨을 특징으로 하는 저비중리포단백분획 중의 콜레스테롤 측정용 반응액 키트.
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