FI90882B - Menetelmä ja reagenssi HDL-fraktion kolesterolin määrittämiseksi spesifisesti - Google Patents

Description

90882

Menetelmä ja reagenssi HDL-fraktion kolesterolin määrittämiseksi spesifisesti 5 Keksintö koskee menetelmää ja reagenssia HDL-fraktion kolesterolin määrittämiseksi spesifisesti seerumin lipoproteii-nien LDL-fraktion läsnäollessa, jolloin kolesteroli vapautuu kolesteroliesteraasin vaikutuksesta ja vapautunut kolesteroli hapettuu kolesterolioksidaasin ja hapen avulla H202:n 10 muodostuessa ja H202:n muodostus tai hapenkulutus mitataan kineettisesti.

Seerumin kokonaiskolesterolin ja yksittäisten, kolesterolia sisältävien lipidifraktioiden määrittämisellä on kliinis-15 kemiallisessa laboratoriossa suuri merkitys. Kolesterolin ja triglyseridin ylisuuret määrät edistävät ateroskleroosin ja sydäninfarktin muodostumista. Yksilöllinen sairastumisriski voidaan siten saada selville mittaamalla seerumin kolesteroli ja triglyseridit. Vielä parempia kuvauksia voidaan teh-20 dä, jos lisäksi saadaan selville patologiset siirtymät lipo-proteiinimallissa. Yksittäisten lipidifraktioiden osuus kokonaiskolesterolista antaa tietoja infarktiriskistä, jolloin toisaalta laajat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että kohonnut seerumin kokonaiskolesterolitaso johtaa li-25 sääntyneeseen sydäninfarktiriskiin, samalla kun toisaalta vallitsee käänteinen suhde seerumin HDL-kolesterolin ja ate-roskleroottisten verisuonimuutosten riskin välillä. Seerumin lipoproteiinit jakautuvat 4 ryhmään: kylomikronit, pre-β-lipoproteiini, jota kutsutaan myös nimellä very low density 30 lipoprotein eli VLDL (hyvin matalatiheyksinen lipoproteii-ni), β-lipoproteiini, jota kutsutaan myös nimellä low density lipoprotein eli LDL (matalatiheyksinen lipoproteii-ni), ja α-lipoproteiini, jota kutsutaan myös nimellä high density lipoprotein eli HDL (suuritiheyksinen lipoproteii-35 ni). Seerumin kokonaiskolesterolin määrittämiseksi käytössä on ollut noin 15 vuoden ajan yksinkertaisia, mutta kuitenkin hyvin tarkkoja täysentsymaattisia analyysimenetelmiä, jotka ovat toteutettavissa sekä manuaalisesti että samoin hyvin 2 myös automaattisilla analyysijärjestelmillä ilman näytteen esivalmisteluja ja määritys tapahtuu tavanomaisesti seuraa-van reaktiokaavion mukaisesti: 5 Kolesteroliesteraasi 1. Kolesteroliesteri + HjO -> Kolesteroli + Rasvahappo

Kolesterolioksidaasi 10 2. Kolesteroli + 02 -> 4-kolesten-3-oni + H2O2

Muodostunut H20j voidaan.sitten määrittää kyseessä olevassa tapauksessa kineettisesti, mieluummin kolorimetrisesti.

15

On myös jo tunnettua määrittää seerumin HDL-kolesterolin muiden kolesterolipitoisten lipoproteiinihiukkasten erottamisen jälkeen. Näiden lipoproteiinien erottaminen voidaan tehdä käyttäen ultrasentrifugointia, elektroforeesia tai 20 muita saostusmenetelmiä, kuten immuunisaostusta, saostusta fosforiwolframihapolla/Mg2+: 11a, dekstraanisulfaatilla/-Mg2+:lla tai hepariinilla/Mn2+: 11a tai polyetyleeniglykolil-la. Nämä kaikki menetelmät ovat käyttökelpoisia ja vaativat useampia reaktiovaiheita ja suhteellisen suuren ajankäytön.

25

Patentista DE-OS 32 08 253.3 on edelleen tunnettua, että LDL-fraktion kolesteroliosuus on suoraan määritettävissä.

Tämä määritys perustuu tietoon, että määrätyissä olosuhteissa LDL-fraktion kolesteroliosuuden reaktionopeus riippuu 30 lineaarisesti sen konsentraatiosta ja että kineettisessä mittauksessa saatu mittaustulos on suoraan verrannollinen reaktiokaavan LDL-kolesterolin konsentraatioon. Tämä menetelmä soveltuu erittäin hyvin LDL:n määrittämiseen, mutta sillä ei kuitenkaan ole mahdollista määrittää HDL-osuutta.

Tämän keksinnön tehtävä on ollut tuottaa menetelmä ja rea-genssi, joka sallii seerumin HDL:n määrittämisen yksinkertaisin keinoin ja yhdessä vaiheessa. Erityisesti piti käyt- 35 90882 3 töön saattaa menetelmä, jonka avulla voidaan määrittää samanaikaisesti myös kokonaiskolesteroli.

Tämä tehtävä ratkaistaan käyttäen menetelmää HDL-fraktion 5 kolesterolin määrittämiseksi spesifisesti seerumin lipopro-teiinien LDL-fraktion läsnäollessa, jolloin kolesteroli vapautuu kolesteroliesteraasin vaikutuksesta ja vapautunut kolesteroli hapettuu kolesterolioksidaasin ja hapen avulla H202:n muodostuessa ja H202:n muodostus tai hapenkulutus mitali) taan kineettisesti, menetelmän ollessa tunnettu siitä, että käytetään haimasta peräisin olevaa kolesteroliesteraasia ja että mittaus suoritetaan 2-15 minuutin kuluessa oksidaasi-reaktion alkamisesta 20-40°C:n lämpötilassa ennalta määrätyllä aikavälillä ja mittauksen aikana reaktioliuoksen ko-15 lesteroliesteraasin konsentraatio on 0,05-30 U/ml, kolesterolioksidaasin konsentraatio 0,1-50 U/ml, sappihapporyhmän •tensidin konsentraatio 1,0-20 mmol/1, ionittoman pinta-ak-tiivisen aineen konsentraatio 0,1-10 g/1 ja pH-arvo 5-9.

20 Yllättäen todettiin, että seerumin lipoproteiinien kolesterolin muuttuminen kolesteroliesteraasin ja kolesterolioksidaasin avulla sopivan pinta-aktiivisen aineyhdistelmän läsnäollessa tapahtuu kahdessa vaiheessa. Reaktio etenee aluksi nopeudella, joka on riippuvainen LDL-kolesterolin konsent-25 raatiosta, mutta riippumaton HDL-kolesterolin konsentraa-tiosta. Myöhemmässä reaktiovaiheessa reaktionopeus tulee riippuvaiseksi HDL-kolesterolin konsentraatiosta jossakin reaktio-olosuhteista riippuvaisessa ajankohdassa. HDL-fraktioiden muuttuminen asettuu siis ajallisen viiveen myötä.

30 Valittaessa sopivasti reaktio-olosuhteet HDL:n muuttumista voidaan seurata ajankohtana, jolloin LDL-kolesteroli on jo suurin piirtein muuttunut. Ekstinktion muutos vastaavasti valitulla aikavälillä on sitten verrannollinen HDL-kolesterolin konsentraatioon. Tällä tavoin on mahdollista yksinker-35 täisen menetelmän avulla määrittää HDL suoraan muiden kolesterolia sisältävien lipidifraktioiden läsnäollessa.

4

Oleellista keksinnön mukaiselle menetelmälle on, että reaktio-olosuhteet säädetään niin, että HDL:n muuttuminen tapahtuu suotuisana ajankohtana.

5 Keksinnön mukaisessa menetelmässä saadaan ensin aikaan kolesterolin vapautuminen lisäämällä kolesteroliesteraasia reaktiolluokseen. Sopivaksi on osoittautunut kolesterolies-teraasi, joka on peräisin haimasta (esim. naudan tai sian haimasta). Kolesteroliesteraasin konsentraatio reaktioliuok-10 sessa on 0,05-30 U/ml. Kolesteroliesteraasin konsentraatio on edullisesti 0,05-10 U/ml, erityisen edullisesti 0,05-1 U/ml.

Kolesteroliesteraasin mittayksikkö U perustuu seuraavaan 15 määritelmään: 1 U on entsyymimäärä, joka muuttaa 37°C:n lämpötilassa 1 μπιοί kolesterylliinioleaattia minuutissa, jolloin reaktioseos sisältää kolesteroliesteraasin ohella seu-raavia aineita: 0,2 mol/1 kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,0 20 0,15 mol/1 natriumkloridia 4 g/1 natriumkolaattia 16 g/1 ThesitR: iä 2 g/1 fenolia 0,3 g/1 4-aminoantipyriiniä 25 20 U/ml piparjuuren peroksidaasia 0,2 U/ml Nocardia erythropoliksen kolesterolioksidaasia 0,45 g/1 kolesterylliinioleaattia.

Vapautunut kolesteroli hapetetaan sitten kolesterolioksidaa-30 silla kolestenoniksi ja H202:ksi. Kolesterolioksidaasia voidaan myös saada erilaisista organismeista. Edullisesti käytetään kolesterolioksidaasia, jonka alkulähde on Brevibacte-rium, Nocardia tai Streptomyces. Kolesterolioksidaasin konsentraatio on 0,1-50 U/ml. Mieluummin kolesterolioksidaasin 35 konsentraatio on 1-30 U/ml, erityisen mielellään 5-25 U/ml.

Kolesterolioksidaasin mittayksikkö U perustuu seuraavaan määritelmään: 1 U on entsyymimäärä, joka muuttaa 1 μπιοί ko-

II

90882 5 lesterolia minuutissa 25°C:n lämpötilassa, jolloin reaktio-seos sisältää entsyymin ohella seuraavat aineet: 0,47 mol/1 kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,5 8 g/1 ThesitR:iä 5 2,5 g/1 n-propanolia 0,125 g/1 kolesterolia.

Olennaista keksinnön mukaiselle menetelmälle on edelleen, että reaktioliuoksessa on mukana sappihapporyhmän tensidi.

10 Tämän tensidin konsentraatio on 1,0-20 mmol/1. Mieluummin sappihapporyhmän tensidin konsentraatio on 1,5-8 mmol/1. Sappihapporyhmän tensidit ovat sinänsä tunnettuja. Mieluummin käytetään koolihapon johdannaisia, jolloin natriumko-laatti on erityisen edullinen.

15

Reaktioliuoksessa on edelleen ioniton pinta-aktiivinen aine mukana. Tämän ionittoman pinta-aktiivisen aineen konsentraatio on 0,1-10 g/1, mieluummin 0,4-4 g/1. Ionittomana tensi-dinä käytetään mieluummin pinta-aktiivista ainetta, joka 20 sisältää polyetyleenioksidiryhmiä. Samoin sopivia ovat soke-ripohjaiset pinta-aktiiviset aineet. Esimerkkejä ionittomis-ta pinta-aktiivisista aineista ovat alkyyli- tai alkaryyli-polyetyleenioksidieetterit, kuten n-dodekyylipolyetyleeni-glykolieetteri, iso-tridekanolipolyetyleenioksidieetteri ja 25 iso-oktyylifenolipolyetyleenioksidieetteri.

Suotuisassa suoritusmuodossa ioniton pinta-aktiivinen aine lisätään oksidaasin lisäämisen jälkeen, kuitenkin 1-14 minuuttia ennen mittausta.

30

Reaktioliuoksen pH-arvo on 5-9. Tarvittavan pH-arvoalueen säätämiseksi lisätään kyseessä olevalla alueella vaikuttavia puskuriaineita. Käytetyn puskuriaineen laji ei ole sinänsä kriittinen. Mieluummin käytetään kuitenkin tris/HCl-puskuria 35 ja erityisesti fosfaattipuskuria.

6

Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan lämpötila-alueella, joka on 20-40°C. Mieluummin työskennellään 25-37°C:n lämpötilassa.

5 Otettaessa huomioon kaikki keksinnölle oleelliset parametrit HDL-fraktion kolesterolin mittaus voi tapahtua 2-15 minuutin kuluessa oksidaasireaktion alkamisesta. Mieluummin mittaus suoritetaan 3-10 minuutin kuluessa oksidaasireaktion alkamisesta.

10

Jos H202:n muodostuksen mittauksen täytyy tapahtua vähemmän suotuisissa reaktio- ja mittausolosuhteissa, voi LDL-fraktion jäännösten muuttumista tapahtua vielä mittaukseen valitun aikavälin kuluessa ja se voisi siten häiritä. HDL-frakti-15 on mittaamista. Tämän häiriön välttämiseksi tällainen spesi-fisyyshäviö estetään keksinnön mukaisen menetelmän toisessa suoritusmuodossa lisäämällä anti-LDL-vasta-aineita. Tämä antiseerumi saa LDL:n muuttumisen pysähtymään varhaisessa vaiheessa. Siihen voidaan käyttää sinänsä tunnettuja anti-20 LDL-vasta-aineita tai myös anti-apolipoproteiini-B-vasta- aineita yksinään tai seoksena. Nämä vasta-aineet esiintyvät rasvattomana globuliinina tai IgG-valmisteena konsentraation ollessa 10-6 - 10"4 mmol/1.

25 Kuten jo edellä esitetään, seuraa keksinnön mukaisessa menetelmässä ensin LDL-fraktion sisältämän kolesterolin vapautuminen, siten että mittasignaali on ensin verrannollinen LDL-fraktion kolesterolipitoisuuteen. Sen vuoksi on mahdollista määrittää keksinnön mukaisen menetelmän avulla koean-30 noksesta sekä LDL-kolesteroli että HDL-kolesteroli. Koska reaktionopeus on aluksi riippuvainen LDL:stä ja myöhemmin HDL:stä, voidaan jokaisen reaktiovaiheen kuluessa valita kulloinkin suotuisin aikaväli LDL:stä tai HDL:stä riippuvaisten ekstinktiomuutosten mittaamiseksi. Tällöin määrite-35 tään kineettisesti ensimmäisen minuutin kuluessa oksidaasireaktion alkamisesta H202:n muodostus seerumin LDL-fraktioon sitoutuneen kolesterolin mittana. Seuraavaksi mitataan kineettisesti 2-15 minuutin aikavälillä oksidaasireaktion ai- 90882 7 kamisesta H202:n muodostus seerumin HDL-fraktioon sitoutuneen kolesterolin mittana.

Edelleen on mahdollista keksinnön mukaisen menetelmän suo-5 tuisan suoritusmuodon mukaisesti HDL-kolesterolin mittauksen jälkeen kohottaa kolesteroliesteraasin konsentraatiota lisäämällä toista reagenssiliuosta siten, että kolesterolin kokonaismäärän muuttuminen tapahtuu lyhyen ajan kuluessa täydellisesti. Sitten voidaan määrittää näytteen kolesteroli) Iin kokonaismäärä. Siihen riittää ylimääräisen, so. HDL-ko-lesterolin määritykseen määrättyä määrää suuremman määrän lisääminen kolesteroliesteraasia ja mahdollisesti -oksidaa-sia ja/tai tensidiä suurina konsentraatioina, heti kun HDL:n määritys on päättynyt.

15

Samoin voidaan lisätä yksinkertaisesti riittävä määrä sopivaa reagenssia tekniikan tason mukaan kokonaiskolesterolin muuttamiseksi nopeasti ja täydellisesti.

20 Keksinnön mukaisen menetelmän avulla on siten mahdollista määrittää näytteestä rinnakkain LDL-fraktion osuus, HDL-fraktion osuus sekä kokonaiskolesteroli.

Vapaan kolesterolin määrittäminen kolesterolioksidaasin 25 avulla H202:n ja kolestenonin muodostuessa ja tämän hapetus-reaktion reaktiopartnerin muutoksen kineettinen määrittäminen on tunnettu esimerkiksi saksalaisesta patenttijulkaisusta 25 58 536. Edullisesti tällöin muodostunut H202 mitataan käyttäen ammattilaiselle tavanomaisia kolorimetrisia H202:n 30 määritysmenetelmiä. Tyypillinen H202:n määritysmenetelmä, joka soveltuu erittäin hyvin tämän keksinnön menetelmään, perustuu fenolin tai fenolijohdannaisen ja 4-aminoantipyrii-nin tai sen johdannaisen värireaktioon peroksidaasin läsnäollessa. Nämä määritykset ovat ammattilaiselle tavanomaisia 35 eikä niitä tarvitse tässä kuvata lähemmin.

Toinen keksinnön aihe on reagenssi HDL-fraktion kolesterolin määrittämiseksi spesifisesti seerumin lipoproteiinien LDL- θ fraktion läsnäollessa reagenssin sisältäessä kolesterolies-teraasia, kolesterolioksidaasia, sappihapporyhmän tensidiä, ionitonta pinta-aktiivista ainetta, pH-puskuria 5-9 ja järjestelmän H202:n määrittämiseksi kolorimetrisesti, jolloin 5 reagenssi on tunnettu siitä, että sen sisältämän haiman ko-lesteroliesteraasin konsentraatio on 0,05-30 U/ml, koleste-rolioksidaasin 0,1-50 U/ml, sappihapporyhmän tensidin 1,0-20 mmol/1 ja ionittoman pinta-aktiivisen aineen 0,1-10 g/1, kulloinkin suhteessa kokeessa käytettyyn laimennokseen.

10

Keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi automaattisella analysointilaitteella voivat yksittäiset reaktiokomponen-tit olla imeytyneinä myös kantaja-aineen pinnalle tai kantaja-aineeseen. Kantaja-aineena voidaan käyttää imukykyistä, 15 paisuvaa tai kalvon muodostavaa kantaja-ainetta, kuten esimerkiksi koenauhoista tunnettua kantaja-ainetta, kuten paperia ja vastaavia kuitumateriaaleja, esim. teepussipaperia. Tällöin reaktiokomponentit voivat olla jakautuneina useammille, toistensa kanssa kosketuksessa oleville kantajille.

20

Edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukainen reagenssi sisältää lisäksi vielä LDL:n ja/tai apolipoproteiini B:n vasta-aineita.

25 Keksintö tekee mahdolliseksi HDL:n sisältämän kolesterolin määrittämisen suoraan ilman muiden lipoproteiinifraktioiden erottamista etukäteen. Edelleen on mahdollista määrittää samanaikaisesti myös LDL-fraktioon sisältyvä kolesteroli ja seerumin sisältämä kokonaiskolesteroli. Menetelmä on yksin-30 kertainen suorittaa ja se on automatisoitavissa.

Keksintöä valaistaan edelleen seuraavien esimerkkien ja kuvien avulla.

35 Kuvat esittävät:

Kuva 1: Reaktion eteneminen näytteissä, joissa on erilaiset HDL-kolesterolikonsentraatiot LDL-kolesterolikon-sentraation ollessa vakio 84 mg/dl. HDL-kolesteroli 90882 9 käyrällä 1 65,6 mg/dl, käyrällä 2 56,5 mg/dl, käyrällä 3 47,4 mg/dl, käyrällä 4 38,3 mg/dl ja käyrällä 5 29,2 mg/dl.

Kuva 2: Kuvan 1 analysointi aikavälillä t = 0 - 1 min.

5 Kuva 3: Kuvan 1 analysointi aikavälillä t - 5 - 6 min.

Kuva 4: HDL-kolesterolin määritys keksinnön mukaisesti (li säämättä anti-apo-6-vasta-aineita) käyttäen fosfo-wolframisaostusmenetelmää (PWS).

Kuva 5: HDL-kolesterolin määritys keksinnön mukaisesti (li- 10 säämällä 8 x 10"6 mol/1 anti-apo-S-vasta-ainetta) käyttäen PWS-menetelmää.

Esimerkki l

Kahta ihmisen seerumia, joissa on sama LDL-koles.terolipitoi-15 suus, mutta eri HDL-kolesterolipitoisuus, sekoitetaan eri suhteissa siten, että saadaan sarja näytteitä, jotka sisältävät lisääntyviä määriä HDL-kolesterolia LDL-kolesterolin määrän pysyessä vakiona. Jokainen 0,02 ml:n erä näytettä inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa 2,0 ml:n kanssa reagenssia, 20 jonka koostumus on seuraava: 0,1 M kaliumfosfaattipuskuria, pH 6,7 8.6 mM tribromihydroksibentsoehappoa 1.6 mM 4-aminoantipyriiniä 3 mM natriumkolaattia 25 0,1 % Polyetylenglycol 6000:tta 0,1 % Thesit*:iä 1 U/ml sian haiman kolesteroliesteraasia 1 U/ml Nocardian kolesterolioksidaasia 2,5 U/ml peroksidaasia.

30

Kuva 1 osoittaa, että ekstinktion lisäys aallonpituuden ollessa 546 nm on aluksi pääasiassa riippumaton HDL-kolesterolin konsentraatiosta, mutta tulee kuitenkin siitä selvästi riippuvaiseksi reaktion edetessä. Vastaavasti ekstinktion 35 lisäys ei mittaa ensimmäisen minuutin aikana HDL-kolesterolin konsentraatiota (Kuva 2), kun taas ekstinktion lisäys kuudennen minuutin aikana on suhteessa HDL-kolesterolin kon-sentraatioon (Kuva 3).

10

Esimerkki 2

Kaksi ihmisen seerumia, joissa on sama LDL-kolesterolipitoi-suus, mutta eri HDL-kolesterolipitoisuus, sekoitetaan eri suhteissa siten, että saadaan sarja näytteitä, jotka sisäl-5 tävät lisääntyviä määriä HDL-kolesterolia LDL-kolesterolin pysyessä vakiona. Jokainen 0,02 ml erä näytettä inkuboidaan 30°C:n lämpötilassa 2,0 ml:n kanssa reagenssia, jolla on seuraava koostumus: 0,1 M kaliumfosfaattipuskuria, pH 6,7 10 8,6 mM tribromihydroksibentsoehappoa 1,6 mM 4-aminoant ipyriiniä 3 mM natriumkolaattia 0,1 % Polyetylenglycol 6000:tta 0,1 % ThesitR:iä 15 1 U/ml sian haiman kolesteroliesteraasia 1 U/ml Brevibacteriumin kolesterolioksidaasia 2,5 U/ml peroksidaasia.

Kuten esimerkissä 1, myös tässä ekstinktion lisäys 546 nm:n 20 aallonpituudella on ensin pääasiassa riippumaton HDL-kolesterolin konsentraatiosta ja on suhteessa HDL-kolesterolin konsentraatioon 6. minuutilla.

Esimerkki 3 25 Lähtien esimerkissä l selostetusta reaktioseoksesta seuraa-vien komponenttien konsentraatiot vaihtelevat: ThesitR, nat-riumkolaatti, kolesteroliesteraasi ja kolesterolioksidaasi. Näiden vaihtoehtojen avulla suoritetaan esimerkissä 1 kuvatut tutkimukset. Havaitut riippuvuussuhteet HDL:n konsent-30 raatiosta on esitetty seuraavassa taulukossa eri aikavälien analysointituloksista saatujen regressioarvojen muodossa.

li 90882 11

Muuttuva Suotuisa Korrelaatio- Regressiosuora aine mittausväli kerroin (x: teor. arvo, mg/dl)

Thesit* 5 0,4 g/1 8-10 min 0,998 y = 0,91 + 2,9 1 g/1 4-5 min 0,996 y = l,22x - 5,6 4 g/1 2-3 min 0,999 y = 0,68x + 9,4

Natrium-10 kolaatti 1 mmol/1 6-10 min 0,988 y = l,08x + 0,2 3 mmol/1 4-5 min 0,996 y = l,22x - 5,6 5 mmol/1 4-5 min 0,997 y = 0,89x + 4,9 15 Kolesteroli-esteraasi 0,3 U/ml 6-7 min 0,999 y = 0,94x + 1,9 1 U/ml 4-5 min 0,996 y = l,22x - 5,6 3 U/ml 4-5 min 0,998 y = 0,98x - 2,2 20

Kolesteroli- oksidaasi 0,3 U/ml 5-6 min 0,979 y = 0,93x + 3,4 1 U/ml 4-5 min 0,996 y = l,22x - 5,6 25 3 U/ml 5-6 min 0,996 y = l,03x +1,7

Esimerkki 4

Reaktioseos sisältää 0,5 U/ml kolesteroliesteraasia, joka on peräisin Pseudomonaksesta ja 2 U/ml kolesterolioksidaasia, 30 joka on peräisin Streptomycesistä; muuten koostumus vastaa esimerkin 1 koostumusta. Myös tässä tarkastellaan vastaavasti valituilla aikaväleillä selvää riippuvuutta HDL-koleste-rolin konsentraatiosta; 4. inkubaatiominuutilla 37°C:n lämpötilassa saadaan esimerkiksi analysoitaessa kuvaa 2 tai 3 35 vastaavasti regressiosuora y = l,02x +1,5 mg/dl. Samanlaisen tuloksen ahtaa myös yhdistelmä, jossa on 1,5 U/ml Candida cylindraceasta peräisin olevaa kolesteroliesteraasia ja 2 12 U/ml Streptomycesistä peräisin olevaa kolesterolioksidaasia (y = 1,13x - 0,9).

Esimerkki 5 5 Menetellään esimerkin 1 tavalla, kuitenkin ThesitR:n asemesta käytetään muita ionittomia pinta-aktiivisia aineita. Tarkastellut riippuvuussuhteet HDL-kolesterolin konsentraatiosta on esitetty seuraavassa taulukossa eri aikavälein tapahtuneissa analysoinneissa saatujen regressioarvojen muodossa.

10

Pinta-aktiivinen Mittaus- Korrelaatio- Regressiosuora aine väli kerroin (x: teor. arvo, mg/dl)

Triton* X 100 15 1 g/1 5-6 min 0,991 y = 0,78x + 11,2 2 g/1 4-5 min 0,993 y = 0,81x + 8,9

Genapol* X 80 0,6 g/1 6-8 min 0,987 y = 0,95x - 2,2 20 1,5 g/1 4-5 min 0,995 y = 0,86x - 3,6

Esimerkki 6

Fotometrisellä automaattisella analysointilaitteella voidaan määrittää ihmisen seerumin HDL-kolesterolipitoisuus ekstink-25 tioerojen avulla suotuisasti valituin aikavälein. Kalibrointi tapahtuu käyttäen ihmisen seerumia, jonka HDL-kolesterolipitoisuus tunnetaan. Reagenssi vastaa periaatteessa esimerkin 1 reagenssia, jolloin ammattilainen pystyy suunnittelemaan kokeen vaihtelemalla kolesteroliesteraasin ja/tai 30 kolesterolioksidaasin aktiivisuutta, natriumkolaatin ja The-sitin konsentraatiota ja aikavälejä sekä lisäämällä kaupallista anti-B-antiseerumia kyseessä olevan automaattisen analysointilaitteen mukaan. Kuva 4 osoittaa, että esimerkiksi samanlaisia tuloksia kuin käytettäessä HDL-kolesterolin fos-35 fovrolframaattisaostumenetelmiä voidaan saada, jos lasketaan kolesterolioksidaasin aktiivisuutta suhteessa esimerkkiin 1 0,36 U/ml:aan ja mitataan ekstinktion lisäys 30°C:n lämpötilassa seitsemännen inkubaatiominuutin aikana. Kuva 5 osoit- 90882 13 taa, että näissä olosuhteissa 8 x ΙΟ-* mol/l:n lisäys rasvatonta LDL:n vasta-ainetta vielä parantaa menetelmien yhdenmukaisuutta.

5 Regressiosuorat (pääkomponenttien standardianalyysi):

Kuva 4: y = 0,771x + 3,551 (mg/dl)

Kuva 5: y = 0,981x + 0,034 (mg/dl)

Esimerkki 7 10 Meneteltiin, kuten esimerkissä 6 on kuvattu. Rinnakkaisissa kokeissa vaihdeltiin toisistaan riippumatta fotometrisen mittauksen aikaväliä ja rasvattoman anti-LDL-antiseerumin lisäystä. Ihmisen seerumeista saatujen arvojen ryhmän vertailu yhdessä fosfowolframihapposaostusmenetelmän (PWS) tu-15 losten kanssa on esitetty seuraavassa taulukossa regressio-arvojen muodossa.

Anti-apo-B-IgG:n Mittaus- Korrelaatio- Regressio konsentraatio väli kerroin (x: PWS-saostus, 20 mg/dl) 4 x 10·6 3-4 min 0,709 y = 0,44x + 11,4 4- 5 min 0,829 y = 0,57x + 7,9 5- 6 min 0,906 y = 0,67x + 3,8 25 6-7 min 0,973 y = 0,77x + 3,6 9-10 min 0,826 y = 0,54x + 11,3 8 x 10"6 3-4 min 0,684 y = 0,58x + 9,8 4- 5 min 0,786 y = 0,69x + 4,6 30 5-6 min 0,873 y = 0,84x + 0,4 6- 7 min 0,968 y = 0,98x + 0,03 9-10 min 0,785 y = 0,66x + 6,3 1,6 x 10s 3-4 min 0,679 y = 0,55x + 10,8 35 4-5 min 0,770 y « 0,62x + 8,3 5- 6 min 0,866 y = 0,71x + 5,0 6- 7 min 0,901 y = l,04x - 8,8 9-10 min 0,757 y = 0,64x + 8,8 14

Esimerkki 8

Sopivalla mittausvälin valinnalla voidaan saavuttaa kaikissa kliinisessä kemiassa tavanomaisissa lämpötiloissa hyvä tulosten yhdenmukaisuus käytettäessä fosfowolframaattisaostus-5 menetelmää (PWS) HDL-kolesterolin määrittämiseksi. Seuraa-valle regressioarvojen muodossa esitetylle 27 ihmisen seerumin ryhmän menetelmävertailun sarjalle valittiin seuraava keksinnön mukaisen menetelmän suoritusmuoto: 10 Laite: Hitachi 705

Mittausaallonpituus: 505 nm

Vertailuaallonpituus: 600 nm

Kalibrointi: Ihmisen seerumi, jossa tunnettu HDL- kolesterolipitoisuus 15 Näytteen tilavuus: 10 μΐ

Reagenssin tilavuus: 0,5 ml . Reagenssin koostumus: 0,1 M kaliumfosfaattipuskuria, pH 6,7 8,6 mM tribromihydroksibentsoehappoa 20 . 1,6 mM 4-aminoantipyriiniä 5 mM natriumkolaattia 0,1 % Polyetylenglycol MG 6000:tta 1.5 g/1 ThesitR:iä (ionitonta pinta-aktiivista ainetta) 0,25 U/ml sian haiman kolesteroliesteraasia 25 kolesterolioksidaasia, kuten myöhemmin esitetään 2.5 U/ml peroksidaasia 90882 15

Sarja a: 25 U/ml Nocardian kolesterolioksidaasia Lämpötila Mittaus- Korrelaatio- Regressiosuora (n = 27, väli kerroin x: PWS-saostus, mg/dl) 5 25°C 8-9 min 0,954 y - 0,93 + 4,0 9-10 min 0,966 y = 0,99 + 0,9 30°C 4-5 min 0,966 y = 0,97x + 0,9 10 5-6 min 0,969 y = l,06x - 2,1 37°C 3-4 min 0,961 y = l,02x - 1,3 4-5 min 0,896 y = l,03x - 1,1 15 Sarja b: 10 U/ml Brevibaoteriumin kolesterolioksidaasia Lämpötila Mittaus- Korrelaatio- Regressiosuora (n = 27, väli kerroin x: PWS-saostus, mg/dl) 20 25°C 8-9 min 0,807 y « 0,45x + 14,6 9-10 min 0,858 y = 0,52x + 13,2 30°C 7-8 min 0,937 y = 0,93x + 4,1 8-9 min 0,938 y = 0,88x + 4,0 25 37°C 3-4 min 0,929 y = 0,87x + 6,4 4-5 min 0,914 y = 0,74x +9,5

Claims (17)

1. Menetelmä HDL-fraktion kolesterolin määrittämiseksi spesifisesti seerumin lipoproteiinien LDL-fraktion läsnäollessa, jolloin kolesteroli vapautuu kolesteroliesteraasin 5 vaikutuksesta ja vapautunut kolesteroli hapettuu kolestero-lioksidaasin ja hapen vaikutuksesta I^Ojin muodostuessa, jolloin H202:n muodostus tai hapenkulutus mitataan kineettises-ti, tunnettu siitä, että käytetään haimasta peräisin olevaa kolesteroliesteraasia ja mittaus suoritetaan 2-15 minuutin 10 kuluessa oksidaasireaktion alkamisesta 20-40°C:n lämpötilassa ennalta määrätyllä aikavälillä ja mittauksen aikana reak-tioliuoksessa kolesteroliesteraasin konsentraatio on täsmälleen 0,05-30 U/ml, kolesterolioksidaasin konsentraatio 0,1-50 U/ml, sappihapporyhmän tensidin konsentraatio 1,0-20 15 mmol/1, ionittoman pinta-aktiivisen aineen konsentraatio 0,1-10 g/1 ja pH-arvo 5-9.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ioniton pinta-aktiivinen aine lisätään oksidaasin 20 lisäämisen jälkeen, kuitenkin 1-14 minuuttia ennen mittausta.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mittaus suoritetaan 3-10 minuutin kuluessa 25 oksidaasireaktion alkamisesta.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-tu siitä, että kolesteroliesteraasin konsentraatio on täsmälleen 0,05-10 U/ml. 30

5 U/ml, sappihapporyhmän pinta-aktiivisen aineen konsentraatio 1,0-20 mmol/1 ja ionittoman pinta-aktiivisen aineen konsentraatio 0,1-10 g/1 kulloinkin suhteessa kokeessa käytettyyn laimennokseen.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolesterolioksidaasin konsentraatio on täsmälleen 1-30 U/ml.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet tu siitä, että sappihapporyhmän tensidin konsentraatio on täsmälleen 1,5-8 mmol/1. 90882

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ionittoman tensidin konsentraatio on täsmälleen 0,4-4 g/1.

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että mittaus suoritetaan 25-37°C:n lämpötilassa.

9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen mene-10 telmä, tunnettu siitä, että sappihapporyhmän tensidinä käytetään natriumkolaattia.

10. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ionittomana tensidinä käytetään 15 polyetyleenioksidiryhmiä sisältävää tensidiä.

11. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan anti-LDL-vasta-aineiden ja/tai anti-apolipoproteiini B:n vasta-ainei- 20 den läsnäollessa.

12. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi H202:n muodostus mitataan kineettisesti ensimmäisen minuutin aikana oksidaasireaktion 25 alkamisesta seerumin LDL-fraktioon sitoutuneen kolesterolin mittana.

13. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että HDL-kolesterolin mittauksen jäl- 30 keen lisätään pinta-aktiivista ainetta ja/tai kolesterolies-teraasia siinä määrin, että kaikki näytteen sisältämä kolesteroli hapettuu H202:n muodostuksen aikana ja värireaktion loppuarvo mitataan kolesterolin kokonaispitoisuuden mittana.

14. Reagenssi HDL-fraktion kolesterolin määrittämiseksi spesifisesti seerumin lipoproteiinien LDL·-fraktion läsnäollessa reagenssin sisältäessä kolesteroliesteraasin, koles-terolioksidaasin, sappihapporyhmän tensidin, ionittoman pin- ta-aktiivisen aineen, pH-puskurin 5-9 ja järjestelmän H202:n määrittämiseksi fotometrisesti, tunnettu siitä, että sen sisältämän haiman kolesteroliesteraasin konsentraatio on 0. 05-30 U/ml, kolesterolioksidaasin konsentraatio 0,1-50

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää LDL:n ja/tai apolipoproteiini B:n vasta-aineita.

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen reagenssi, tun-15 nettu siitä, että se on imeytetty lehtimäisen kantaja-aineen pinnalle tai lehtinaiseen kantaja-aineeseen.·

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että kantaja-aine on imukykyistä, paisuvaa tai kal- 20 vonmuodostavaa ainetta.