KR20020026446A

KR20020026446A - 콜레스테롤 정량용 시료의 전처리 방법 및 이를 이용한특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량법

Info

Publication number: KR20020026446A
Application number: KR1020017015534A
Authority: KR
Inventors: 나카무라미츠히로; 타니구치유리코; 마나베미츠히사; 야마모토미츠아키
Original assignee: 구니요시 이에지; 다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2002-04-10
Also published as: EP1598426B1; US7335483B2; EP1598426A1; PT1197564E; CN1167809C; MY125519A; TW593682B; MXPA02000067A; JP2012191953A; EP1197564A4; JP2010172346A; DE60028776D1; ATE330026T1; BR0012311B1; MY143667A; TW200413535A; ATE360089T1; EP1197564B1; DK1197564T3; DE60028776T2

Abstract

시료중의 특정 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하기에 앞서, 리포단백을 함유하는 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소 및 필요에 따라, 반응촉진물질을 작용시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 정량용 시료의 전처리 방법 및 이를 이용한 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량법 및 이 정량법에 이용되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트가 개시되어 있다.

이 정량법에 의하면, 기본적으로 폴리아니온 등을 필수로 하지 않고, 간편한 조작으로 정확하고, 또한 효율적으로 특정 획분중의 콜레스테롤을 정량할 수 있으며, 각종 자동분석장치에 매우 적합하다.

Description

콜레스테롤 정량용 시료의 전처리 방법 및 이를 이용한 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량법 {METHOD OF PRETREATMENT OF SAMPLE FOR QUANTITATIING CHOLESTEROL AND METHOD FOR QUANTITATING CHOLESTEROL IN SPECIFIC LIPOPROTEINS BY USING THE SAME}

콜레스테롤 등의 지질은 혈중에서 아포단백과 함께 리포단백질을 형성하고 있다. 이 리포단백질은 물리적인 성상의 상이에 따라 카이로미크론, 초저비중 리포단백(VLDL), 저비중 리포단백(LDL), 고비중 리포단백(HDL) 등으로 분류된다. 이들 리포단백 중, LDL은 동맥 경화를 일으키는 원인물질의 하나이며, 또한, HDL은 항동맥 경화작용을 나타내는 것이 알려져 있다.

즉, 역학적으로 말하면, LDL중의 콜레스테롤치는 동맥경화성 질환의 발증 빈도와 정의 상관을 나타내고, 한편, HDL중의 콜레스테롤치는 동맥경화성 질환의 발증 빈도와 역의 상관을 나타낸다는 사실이 알려져 있다. 따라서, 금일에는 허혈성심질환의 예방이나, 진단을 목적으로서 LDL 중이나 HDL중의 콜레스테롤의 측정이 널리 행하여지고 있다.

이 LDL이나 HDL중의 콜레스테롤의 측정법으로서는 예를 들면, 초원심분에 의해 LDL이나 HDL을 다른 리포단백과 분리한 후, 콜레스테롤 측정에 제공하는 방법이나, 전기영동에 의해 분리한 후에 지질의 염색을 행하고, 그의 발색강도를 측정하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이들 방법은 모두 조작이 번잡하거나, 다수의 검체를 처리할 수 없는 것 등의 문제가 있어서 일상적으로 거의 이용되고 있지 않다.

현재, HDL 중의 콜레스테롤의 측정방법으로서, 임상검사의 영역에서 이용되고 있는 방법으로는 검체에 침전제를 가하여 HDL이외의 리포단백을 응집시키고, 이를 원심분리하여 제거하고, 분리된 HDL만을 함유하는 상청중의 콜레스테롤을 측정하는 침전법이 있다. 이방법은 초원심법이나 전기영동법에 비교하여 간편하지만, 침전제를 가하여 분리하는 조작을 포함하기 때문에, 비교적 다량의 검체량을 필요로 하고, 또한, 분석오차가 일어날 가능성도 높으며, 전체 분석공정을 완전하게 자동화할 수 없었다.

한편, 효소적으로 HDL중의 콜레스테롤을 분별 정량하는 방법도 검토되고 있다. 예를 들면, 담즙산염 및 비이온계 계면활성제의 존재하에 효소 반응을 행하는 방법(일본국 특개소63-126498호)이 알려져 있다. 이 방법은 반응초기의 효소반응은 LDL중의 콜레스테롤 농도에 비례하고, 그 다음의 반응 속도는 HDL중의 콜레스테롤 농도에 비례하는 것을 이용한 것이나, HDL중의 콜레스테롤과 다른 리포단백 중의 콜레스테롤의 반응을 완전히 분별할 수 없고, 정확성에 문제가 있었다.

또한, HDL 이외의 리포단백을 미리 응집시켜 놓고, HDL중의 콜레스테롤만을 효소적으로 반응시킨 후에, 효소를 실활시키면, 동시에 응집을 재용해하여 흡광도를 측정하는 방법(일본국 특개평 6-242110호)이 알려져 있다. 그러나, 이방법은 적어도 3회의 시약을 첨가하는 조작이 필요하기 때문에 한정된 자동분석장치 밖에 적용할 수 없고, 범용성의 점에서 문제가 있었다. 또한, 침전의 재용해시에는 고농도의 염을 사용하는 등, 분석기기에 대한 손상이나 시약 폐기의 점에서도 만족할 수 있는 것은 아니었다.

더욱이 제 1반응중에 특수한 계면활성제 존재하에서 콜레스테롤 옥시다제 및 콜레스테롤 에스테라제를 HDL이외의 리포단백에 작용시키고, 이들에 포함되는 콜레스테롤을 우선적으로 작용시킨 후, HDL 이외의 콜레스테롤에 대한 반응을 억제하면서 HDL중의 콜레스테롤을 측정하는 방법(일본국 특개평 9-299호)도 알려져 있으나, 제 1반응중에서 HDL이외의 리포단백의 유리형 및 에스테르형 콜레스테롤의 양쪽을 반응계 외로 유도하기 위한 특수한 계면활성제와 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제를 동시에 필요로 하는 점 등에서 본 발명과 크게 다르다.

또한, 일복국 특허 제 2600065호에서는 HDL이외의 리포단백을 침전 시키는 침전시약과 콜레스테롤 측정시약을 조합하여 사용하고, 침전하지 않는 HDL중의 콜레스테롤(HDL-C)을 측정하는 방법이 개시되어 있으나, 실제로는 수식한 효소와 황산화 α-시클로덱스트린을 침전제로서 사용하는 경우에 실시 가능성이 있는 방법이며, 또한 침전제의 효과에 의해 생기는 탁도가 측정계에 방해를 부여하는 등, 정밀도의 점에서도 문제가 있는 측정법이었다.

상기의 특허 방법에 관한 논문 발표된 「생물시료분석」, 제 19권, 제 5호의 제 305∼320페이지에서는 수식효소에 의한 HDL-C의 측정에 관하여, 수식효소를 반응계에 도입하는 것만으로는 플러스 오차를 부여(침전법에 비해 높은 값이 나온다)하기 때문에, 고지혈증 환자 혈청중의 HDL-C는 측정할 수 없는 것을 인식하고, 이를 내리기 위하여 폴리아니온의 1종인 황산화 시클로덱스트린과 염화마그네슘을 침전제로서 이용하고, HDL-C를 측정한 것을 보고하고 있다.

상기 특허 방법의 침전제에 의해 생긴 탁함의 영향을 경감시키기 위하여 계면활성제를 공존시키는 기술(일본국 특개평 8-116996호)이나, 항체를 사용하는 기술(일본국 특개평 9-96637호), 당화합물을 사용하는 기술(일본국 특개평 7-301636 호) 등도 있으나, 이것들은 모두 응집 생성을 일으키는 시약이 포함되는 것을 조건으로 하는 것이며, 기본적으로 폴리아니온 등의 침전제의 사용은 피할 수 없는 것이었다.

최근, 본 발명자들은 특정의 리포단백에만 작용하는 물질을 이용함으로서 침전제를 사용하지 않고도 특정 획분중의 콜레스테롤을 정확하게 정량할 수 있음을 발견하고, 특허출원했었다(일본국 특원평9-244821호). 이 방법은 종래의 침전법과는 극히 상관성이 높은 것이나, 침전법과의 측정치의 관계에서는 상기「생물시료분석」에서 보고된 것과 동일한 경향이 인정되고 있으며, 의료기관 등에서 종래의 침전법과 계속한 데이터를 얻기 위하여 폴리아니온 등이 첨가되고 있다.

그러나, 폴리아니온 등을 가하고, 측정계 중에 침전을 일으키는 것은 셀의 오염 등의 문제나, 측정치의 불규칙함의 관계에서 바람직하지 않으므로, 계중에서침전물의 추방이 강하게 요구되고 있다. 더욱이, 측정 원리상 불필요한 폴리아니온 등을 데이터를 일치시키기 위하여 사용하는 것은 경제적으로도 불합리한 것이어서 그의 해결도 요구되고 있다.

따라서, 본 발명은 기본적으로 폴리아니온 등을 필수로 하지 않고, 간편한 조작으로 정확히, 그리고 효율 좋게 특정 획분중의 콜레스테롤을 정량할 수 있고, 각종 자동분석장치에 적합하게 사용되는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 적은 시료로 간편한 조작에 의해 정확하게, 그리고 효율 좋게 특정 획분에 존재하는 콜레스테롤을 분리 정량하기 위한 전처리 방법 및 이를 이용한 특정 획분중의 콜레스테롤 측정방법에 관한 것이다.

도 1은 실시예 1에서 본 발명과 침전법의 상관관계를 나타내는 도면이다.

도 2는 실시예 2에서 본 발명과 침전법의 상관관계를 나타내는 도면이다.

도 3은 실시예 5에서 반응촉진물질의 효과를 나타내는 도면이다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

본 발명에 있어서는, 시료중의 특정의 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하기에 앞서, 우선 전처리로서 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 작용시켜 유리형 콜레스테롤을 소비한다.

유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소로서는, 예를 들면 콜레스테롤 데히드로게나제, 콜레스테롤 옥시다제 등 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 것이면 어떠한 것이라도 지장 없다. 이들은 미생물 유래, 동물 유래, 식물 유래 등, 어느 것이어도, 또한 유전자 조작에 의해 만들어진 것이어도 좋다. 또한, 화학수식의 유무도 묻지 않는다. 상기 효소는 일반적으로는 0.001단위∼100단위/㎖로, 바람직하기로는 0.1단위∼100단위/㎖로 사용된다.

시료에 상기 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 작용시키기 위한 조건은 특별한 제약은 없고, 당해 효소에 관하여 추천되는 조건으로 좋다. 그러나, 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 작용시키는 단계에 있어서, 에스테르형 콜레스테롤을 유리형 콜레스테롤로 변환하는 반응이 일어나지 않도록 주의할 필요가 있다. 즉, 콜레스테롤 에스테라제의 유무는 문제는 아니나, 이를 실질적으로 작용시키지 않는 조건을 유지할 필요가 있다.

상기 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소는 필요에 따라, 보효소를 사용할 수 있고, 보효소로서는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드 등을 사용할 수 있다. 이들 효소는 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있으며, 또한 그의 사용량은 효소에 따라 다르고, 특히 제한되는 것이 아니나, 0.001단위∼100단위/㎖로, 바람직하기로는 0.1단위∼100단위/㎖로 사용된다.

본 발명에 있어서, 사용되는 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소는 상기와 같이 그의 유래에 대한 제약은 없고, 농도 등은 소망의 성능, 조작성을 만족하도록 적의 선택할 수 있다. 따라서, 예를 들면 일정 시간내에 전처리를 완료하기 위해서는 효소를 증량하면 좋고, 반대로 효소를 절약하고 싶으면, 전처리 시간을 연장하면 좋다.

그러나, 자동 분석기에서 측정을 전제로 한 검사약의 경우에는 양쪽을 동시에 만족하는 것이 요망된다. 즉, 소량의 효소의 이용으로 단시간에 전처리를 완료시키는 것이 요구되는 경우이다. 이와 같은 경우, 이하의 군에서 선택된 반응촉진물질을 공존시킴으로서 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 사용하는 전처리에 있어서, 전처리의 시간을 연장하지 않고, 효소량을 저감하고, 소망의 성능을 얻는 것이 가능하다.

상기 목적을 위해 이용되는 반응촉진물질로서는, 예를 들면 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산(tiglic acid), 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신(monensin), 메비노린 등(반응촉진물질의 염 또는 반응촉진물질의 금속 유도체(알루미늄 유도체 등)이 존재하는 것은 그들도 동일)을 들 수 있다. 이 중, 플루페남산 및 메페남산은 비스테로이드계 항염증제, 후시딘산 및 모넨신은 항생물질로서 알려져 있는 물질이다.

이들 화합물의 반응촉진물질로서 사함용에 있어서는 각각의 물성이나, 측정계의 pH, 이온강도, 혼재물의 종류 등을 고려하여 농도 등을 적의 선택하는 것이 필요하다.

반응 촉진제의 사용농도는 측정계의 조건에 맞춰 실험적으로 결정하는 것이 가능하나, 일반적으로는 플루페남산의 경우는 0.01∼100mM 정도, 후시딘의 경우는 0.01∼10mM 정도, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 베타메타손 아세테이트의 경우는 0.01∼5mM 정도, 모넨신, 메비노린의 경우는 0.0 1∼1mM 정도, 티글린산의 경우는 1∼500mM 정도로 사용하면 좋다.

상기의 반응 촉진제를 이용함으로서 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소의 사용량을 수분의 1 내지 수십분의 1로 하는 것이 가능하다. 또한, 동일 효소량으로 반응시간을 단축하는 것도 가능하다.

상기 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소 (및 필요한 경우는 반응 촉진제)에 의한 전처리에 있어서는, 측정의 특이성을 손상하지 않고, 효소의 작용을 조정할 목적에서, 또한, 특정의 리포단백의 응집을 일으키지 않는 범위에서 다른 효소(리포단백에 실질적으로 영향을 주는 것을 제외)나, 염, pH 조정을 위한 완충제, 계면활성제(리포단백에 실질적으로 영향을 주는 것을 제외), 방부제, 알부민 등의 단백질류, 항체, 항생물질, 사포닌, 렉틴, 폴리아니온 등 특정의 리포단백에 친화성을 갖는 시약을 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명에 있어서, 시료중의 특정의 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하기 위한 전처리제로서, 다음과 같은 구성성분을 함유한 것을 이용할 수 있다.

(필수성분)

예를 들면 콜레스테롤 데히드로게나제, 콜레스테롤 옥시다제,

등의 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소.

(임의 성분)

예를 들면, 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘,

티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신, 메비노린

등의 반응 촉진 물질.

(기타 성분)

예를 들면 NAD 등의 보효소, 퍼옥시다제, 카타라제,

디아포라제, 아스코르브산 산화효소 등 기타 효소, 피루빈산

등의 산, 염, pH 조정을 위한 완충제, 리포단백에 실질적으로

영향을 주지 않는 계면활성제, 방부제, 알부민 등의 단백질류,

항체, 항생물질, 사포닌, 렉틴, 폴리아니온, 4-아미노안티피린

등의 커플러, 톨린다 시약 등의 수소 공여체 등 산화계 발색

시약류, 페나딘메토술페이트 등의 전자 수용체류,

니트로블루테트라졸륨 등의 환원계 발색시약류.

본 발명에 있어서는 상기 전처리에 의해 리포단백 중의 유리형 콜레스테롤을 소비시킨 후, 시료중의 특정의 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정한다.

시료중의 특정의 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하는 방법으로서는 특정의 리포단백에만 작용하는 물질을 이용하여 당해 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정할 수 있는 방법이면 어떠한 방법도 이용할 수 있다.

그의 방법의 일예로서는, 예를 들면, 일본국 특개평11-56395호에 개시된 폴리옥시에틸렌알킬렌페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬렌트리벤질페닐에테르에서 선택된 계면활성제를 특정의 리포단백에만 작용하는 물질로 하고, 그의 존재하, 콜레스테롤 측정용 효소시약을 첨가하고, 리포단백 중, 고비중 리포단백 중의 콜레스테롤이 우선적으로 콜레스테롤 측정용 효소시약과 반응하는 시간내에 그의 콜레스테롤의 반응량을 측정하는 방법을 들 수 있다.

이들 중, 전자의 폴리옥시에틸렌알킬렌페닐에테르의 시판품의 예로서는 에말겐 A-60(카오사제) 등이, 후자의 폴리옥시에틸렌알킬렌트리밴질페닐에테르의 시판품의 예로서는 에말겐 B66(카오사제)을 들 수 있다.

또한, 다른 방법으로서는 생물시료분석, 제 19권, 제 5호의 제 305∼320 페이지에 개시된 수식효소를 특정의 리포단백에만 작용하는 물질로서 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 문헌의 방법에서는 HDL 이외의 리포단백획분의 반응을 억제하기 위하여 황산화 α-시클로덱스트린과 염화마그네슘을 이용하고 있으나, 본 발명의 전처리 방법을 이용하면 이들을 사용할 필요는 없게 된다.

특정의 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하는 방법은 특정의 리포단백에만 작용하는 물질을 이용하는 이외는 통상의 콜레스테롤의 측정방법에 이용하는 시약에 의해 실시할 수 있다. 이용되는 시약에 포함되는 성분으로서는 예를 들면, 콜레스테롤 에스테라제, 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 데히드로게나제, 이소시트르산데히드로게나제, 디아포라제, 퍼옥시다제등의 효소류, 발색제, 보효소, 전자 수용체, 단백질(알부민 등), 방부제, 계면활성제, 염, 산, pH 조정을 위한 완충제 등을 들 수 있다.

상기 성분중, 계면활성제로서는, 이온성, 비이온성의 어느 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염, 알킬벤젠술폰산염, 담즙산류 등을 들 수 있다. 이 계면활성제의 사용량은 화합물에 따라 다르고, 특히 제한 되는 것이 아니나, 0.0001%∼5%로, 바람직하기로는 0.001∼5%로 사용된다.

또한, 완충제로서는 특별한 제약은 없고, 굿의 완충제, 인산, 트리스, 프탈산염 등 일반적인 것을 사용할 수 있다. 또한, 그의 사용량도 특히 제한되는 것은아니나, 0.005M∼2M, 바람직하기로는 0.01∼1M으로 사용된다.

본 발명에 의해 특정의 리포단백획분중의 콜레스테롤을 정량하는 방법은 전형적으로는 먼저 측정 시료중에 유리형 콜레스테롤에만 작용하는 전처리제를 첨가하여 작용시킨 후에, 특정의 리포단백에만 작용하는 물질과 통상의 콜레스테롤의 측정방법에 이용하는 시약을 포함하는 콜레스테롤 정량시약(이하,「정량 시약」라고 한다)을 첨가 혼합하여 특정 리포단백획분중의 콜레스테롤 양을 측정하는 방법이다.

그의 구체적인 예로서는, 검체에 콜레스테롤 데히드로게나제와 보효소(NAD)를 혼화하고, 이어서 콜레스테롤 에스테라제, 콜레스테롤옥시다제 등을 함유하는 콜레스테롤 측정시약을 첨가하는 방법, 검체에 콜레스테롤 데히드로게나제와 NAD를 혼화하고, 이어서, 콜레스테롤 에스테라제 등을 함유하는 콜레스테롤 측정시약을 첨가하는 방법, 검체와 콜레스테롤 옥시다제를 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 또는 카타라제 등과 함께 혼합한 후, 콜레스테롤 에스테라제 등을 함유하는 콜레스테롤 측정시약을 첨가하는 방법, 검체와 콜레스테롤 옥시다제를 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 등과 함께 혼합한 후, 콜레스테롤 에스테라제, 콜레스테롤 데히드로게나제, NAD 등을 함유하는 콜레스테롤 측정시약을 첨가하는 방법 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

특정 리포단백 획분중의 콜레스테롤을 측정하는 방법으로서는, 공지의 효소적 측정법의 어느 것이라도 이용할 수 있으나, 예를 들면 효소시약으로서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 조합하여 이용하는 방법, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제를 조합하여 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서는, 전처리 반응인 제 1반응에 사용되는 효소와 정량방법인 제 2반응의 콜레스테롤 측정에 사용되는 효소는 동일하여도, 또는 달라도 지장이 없다. 또한, 제 1반응에서, 과잉량의 효소를 사용하고, 이것을 제 2반응에 사용하여도 지장이 없다. 요컨대, 리포단백 표면에 존재하는 소량의 유리형 콜레스테롤을 소비하고(제 1반응/전처리 반응), 이어서 측정해야 하는 특정의 리포단백에만 효소가 작용하는 상태로서 당해 리포단백을 구성하는 대부분의 콜레스테롤(유리형 콜레스테롤＋ 에스테르형 콜레스테롤)을 정량할 수 있도록 하면 좋다.

또한, 이들 콜레스테롤 측정용 효소시약을 첨가한 후, 최종적으로 콜레스테롤을 검출하는 방법은 특히 제한되지 않으며, 예를 들면 퍼옥시다제와 색원체(色原體)나 디아포라제 또는 전자 수용체와 환원계 발색시약을 다시 조합하여 행하는 흡광도 분석, 보효소나 과산화수소를 직접 검출하는 방법 등도 이용할 수 있다. 보효소는 보효소 사이클링계에 의해 증폭해도 좋다.

본 발명 방법을 용이하게 실시하기 위해서는, 이에 적합한 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤을 측정하기 위한 정량용 킷트를 이용하는 것이 바람직하다.

이와 같은 킷트는 위에서의 설명에 기초로 하여 용이하게 설계할 수 있으나, 그의 예를 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소의 대표로서 콜레스테롤 옥시다제를 이용하는 경우와 콜레스테롤 데히드로게나제를 이용하는 경우에 나누어 나타내면 다음과 같다.

[콜레스테롤 옥시다제의 경우의 킷트]

(가) 다음 시약 (1) 및 (2)

(1) 콜레스테롤 옥시다제 및 과산화수소 소비물질(경우에 따라, 다시

반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 에스테라제 및

발색제를 포함하는 제 2시약

으로 되는 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(나) 다음 시약 (1) 및 (2)

(1) 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제 및 과산화수소 소비

물질(경우에 따라, 다시 반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 발색제를 포함하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(다) 다음 시약 (1), (2) 및 (3)

(1)콜레스테롤 옥시다제 및 과산화수소 소비물질(경우에 따라, 다시

반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정의 리포단백에만 작용하는 물질을 포함하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 에스테라제 및 발색제를 포함하는 제 3시약

으로 되는 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

상기 킷트에 있어서, 과산화수소 소비물질이란 콜레스테롤 옥시다제와 콜레스테롤의 반응에 의해 생성되는 과산화수소를 소비하고, 소실시키는 물질을 말하며, 그의 예로서는, 카타라제, 4-아미노안티피린 등의 커플러, 톨린더 시약 등의 수소공여체를 포함하는 산화 환원계 발색시약 등을 들 수 있다.

이들 중, 4-아미노안티피린 등의 커플러 및 톨린더 시약 등의 수소 공여체는 이들과 조합하여 과산화수소와 반응시킴으로서 발색하는 것이며, 상기 (2) 또는 (3)의 발색제로서 이용되는 것이다.

그러나, 본 발명의 전처리 공정으로 이용하는 시약(1)으로서는, 커플러 또는 수소공여체의 한쪽만을 이용하고, 비발색 반응에서 과산화수소를 소비시키는 것이 바람직하다. 물론, 발색반응시키고, 측정치의 쪽에서 조정하는 것도 가능하다(시약(1)에서의 발색치를 시약(2) 또는 시약(3)의 발색치에서 빼어 조정할 수 있다).

[콜레스테롤 데히드로게나제의 경우의 킷트]

(라) 다음 시약 (1) 및 (2)

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제 및 보효소(경우에 따라, 다시

반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정의 리포단백에만 작용하는 물질 및 콜레스테롤 에스테라제를

포함하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(마) 다음 시약 (1) 및 (2)

반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정의 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 옥시다제,

콜레스테롤 에스테라제, 퍼옥시다제 및 발색제를 포함하는 제 2

시약

으로 되는 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(바) 다음 시약 (1) 및 (2)

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제, 보효소 및 콜레스테롤 에스테라제

(경우에 따라, 다시 반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 포함하는 제 2시약

으로 되는 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(사) 다음 시약 (1) 및 (2)

(경우에 따라, 다시 반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 옥시다제,

퍼옥시다제 및 발색제를 포함하는 제 2시약

으로 되는 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(아) 다음 시약 (1), (2) 및 (3)

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제 및보효소 (경우에 따라, 다시

반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 포함하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 에스테라제를 포함하는 제 3시약

으로 되는 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(자) 다음 시약 (1), (2) 및 (3)

반응촉진물질)을 포함하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 포함하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제, 퍼옥시다제 및

발색제를 포함하는 제 3시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(차) 다음 시약 (1) 및 (2)

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제, 보효소 및 보효소 반응 생성물 소비

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 및 콜레스테롤 에스테라제를

포함하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

(카) 다음 시약 (1) 및 (2)

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제, 보효소 및보효소 반응 생성물 소비

발색제를 포함하는 제 2시약

으로 되는 특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.

상기 콜레스테롤 데히드로게나제를 이용하는 킷트에 있어서, 보효소 반응생성물 소비물질이란 콜레스테롤, 콜레스테롤 데히드로게나제 및 보효소(예를 들면 NAD)의 반응에 의해 생기는 환원형 보효소(예를 들면, NADH)를 다시 원래의 보효소에 되돌리는 물질을 말하며, 그의 예로서는, 젖산탈수소효소와 피루빈산(기질)을 들 수 있다. 상기 킷트에서는 어느 것도 시약(1)의 첨가에 의해 보효소의 반응생성물이 생기나, 이 중, (라), (바), (아) 및 (차)에 있어서, 반응생성물을 소비하지 않고, 그대로, 측정단게에 있어서 시약(1) 첨가에 의한 발색과 동일 파장의 광을측정하는 경우에는 시약(2) 또는 시약(3)에 의한 발색치에서 시약(1)을 첨가한 전처리의 단계에서의 발색치를 뺌으로서 특정 리포단백 중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다. 또한 시약 (1)에 미리 반응생성물을 소비하는 물질을 첨가해 놓고, 이를 소비하고 나서 시약(2) 또는 시약(3)을 첨가하여 발색시켜도 좋다. 이 때, 시약(2) 또는 시약(3)에는 반응생성물을 소비하는 물질의 작용을 줄이는 물질을 배합한 쪽이 좋다. 한편, 킷트 (마), (사), (자) 및 (카)에서는 전처리의 발색과는 다른 파장의 발색을 측정하는 것으로 되기 때문에, 반드시 측정치에서 전처리의 발색치를 빼지 않아도 좋다.

또한, 전술한 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신,메비노린 등의 반응촉진물질의 용도는 본 발명의 전처리 방법(전처리제) 및 이를 이용하는 본 발명의 특정 리포단백 중의 콜레스테롤의 정량방법(킷트)에 한정되는 것은 아니다.

유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 사용하는 콜레스테롤의 정량방법, 예를 들면, 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제, 발색제 등을 사용하여 조립되는 유리형 콜레스테롤의 정량방법 또는 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제, 퍼옥시다제, 발색제 등을 사용하야 조립되는 총콜레스테롤의 정량방법에 플루페남산등 의 반응촉진물질을 공존시키면, 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소(여기에서는 콜레스테롤옥시다제)의 사용량을 저감하는 것, 효소반응의 반응 시간의 단축 등의 효과를 얻는 것이 당연히 가능하다.

그리고, 콜레스테롤 정량방법에 관한 본 명세서 등의 기재(예를 들면, 계면활성제를 선택하여 특정의 리포단백을 측정대상으로 하는 것 등)을 참조하면, 보다 구체적으로 소망의 정량방법을 조립할 수 있다.

실시예

다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 설명하나, 본 발명은 이들에 하등 제약되는 것은 아니다.

실시예 1

하기에 나타낸 본 발명 방법 및 침전법에 의해 리포단백을 포함하는 30예의 혈청 검체에 대하여, 하기와 같이 HDL중의 콜레스테롤을 정량하고, 이들의 측정치를 비교했다.

(본 발명법)

검체 3㎕에 0.1단위/㎖의 콜레스테롤 데히드로게나제(아마노세이야쿠제), 2.5mM의 NAD 및 4-아미노안티피린 0.03%를 포함하는 10mM의 인산완충액(제 1시약; pH 8.5) 300㎕를 첨가했었다(전처리).

약 5분후, 에말겐 B-66 1%, 콜레스테롤 에스테라제(아사히 가세이) 1.3단위/㎖, 콜레스테롤 옥시다제(아사히 가세이) 2단위/㎖, 퍼옥시다제(토요보) 5단위/㎖ 및 디술포부틸메타톨루이딘 0.04%를 포함하는 100mM의 MES 완충액(pH 6)으로 되는 콜레스테롤 측정시약(제 2시약) 100㎕를 가했다.

제 2시약 첨가 직전과 첨가 5분후에 600nm에서 흡광도를 측정하고, 그의 차로부터 혈청 검체중의 HDL 콜레스테롤 농도를 구했다(2 포인트법). 또한, 교정용 물질로서 농도 기지의 콘트롤 혈청을 이용했다. 또한, 이상의 조작은 히타찌 7150형 자동분석장치를 이용하여 행했다.

(침전법)

HDLC2「제 1」분획 시약(다이이치카가쿠야쿠힝가부시키가이샤제) 200㎕를 검체 200㎕과 혼화하고, 3000 rpm에서 10분간 원심분리했다. 이 상청 50㎕를 채취하고, Triton X-100 1%, 콜레스테롤 에스테라제 1단위/㎖, 콜레스테롤 옥시다제 1단위/㎖, 퍼옥시다제 5단위/㎖ 및 디술포부틸메타톨루이딘 0.04%, 4-아미노안티피린 0.04%을 포함하는 100mM의 MES 완충액(pH 6.5)으로 되는 콜레스테롤 측정시약 3㎖와 혼합하고, 37℃으로 10분간 인큐베이트한 후, 600nm에서 흡광도를 측정하고, HDL중의 콜레스테롤 농도를 구했다.

(결과)

결과를 표 1 및 도 1에 나타낸다.

이 결과로부터 명백한 바와 같이, 본 발명 방법은 폴리아니온 등을 사용하지 않은 것임에도 불구하고, 종래의 침전법과 극히 양호한 상관을 나타내고 있다.

실시예 2

실시예 1의 제 1시약의 콜레스테롤 데히드로게나제, NAD 및 인산완충액을 5단위/㎖의 콜레스테롤 옥시다제(도요보), 5단위/㎖의 퍼옥시다제(도요보제) 및 100mM MES(pH 6)로 대체하여 측정치를 비교했다.

(결과)

결과를 표 2 및 도 2에 나타낸다.

실시예 3

실시예 1 및 실시예 2의 시약을 사용하고, 중성지방 레벨이 다른 혈청 5검체를 측정하고, 종래법과 측정치를 비교했다. 이 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의하면 중성 지방 레벨이 높은 검체에 대해서도 종래법과 같은 레벨의 측정치가 얻어졌다.

실시예 4

실시예 2의 제 1시약의 5단위/㎖의 콜레스테롤옥시다제를, 하기 표 4의 농도, 조합으로 된 조성으로 바꾸고, 실시예 1과 동일하게 측정하고, 그의 측정치를 침전법 및 실시예 2의 방법(기준시험계)와 비교했다. 또한, 제 2시약은 실시예 1과 동일한 것을 사용했다. 이 결과를 표 5에 나타낸다.

(시험용 시약조성)

(결과)

이 결과로부터 기준시험계(실시예 2)에 비하여 콜레스테롤 옥시다제를 1/5에 줄인 경우(시험계 A), 상관 계수는 약간 낮아지고, 절편 값도 약간증가하였으나, 반응촉진물질을 사용한 경우는 콜레스테롤옥시다제가 1/5이었어도 기준 시험계와 거의 동일한 결과가 얻어지고, 반응촉진물질을 사용함으로서 콜레스테롤 옥시다제의 사용량을 줄일 수 있는 것이 명백해졌다.

실시예 5

1.25단위/㎖ 퍼옥시다제(도요보), 0.01% 4-아미노안티피린, 0.02% 디술포부틸메타톨루이딘, 50mM NaCℓ을 공통으로 함유하고, 완충액의 종류와 pH, 콜레스테롤 옥시다제(도요보) 및 플루페남산(시그마)의 농도가 다는 하기 표 6에 기재된 시약(J∼L)을 조제했다.

시약	① 완충액(pH)② 콜레스테롤 옥시다제 농도③ 플루페남산 농도
J	① 50mM Bis-Tris (pH 6.0)② 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 단위/㎖③ 0, 0.01, 0.05, 0.1mM
K	① 50mM PIPES (pH 7.0)② 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 단위/㎖③ 0, 0.01, 0.05, 0.1mM
L	① 50mM MOPS (pH 8.0)② 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 단위/㎖③ 0, 0.01, 0.05, 0.1mM

혈청 검체 3㎕에 시약 J∼L을 300㎕ 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 600nm에서 흡광도를 측정했다. 이상의 조작은 히타찌 7150형 자동 분석기를 이용하여 행했다.

4 예의 혈청 검체를 시약 J∼L로 측정했다.

시약 J∼L 각각에 대하여, 5.0단위/㎖ 콜레스테롤 옥시다제, 0mM 플루페남산의 시약으로 얻어진 흡광도를 100으로 하고, 각 콜레스테롤 옥시다제, 플루페남산 농도의 시약별로 상대 흡광도를 계산했다.

(결과)

4 검체의 상대 흡광도를 평균한 결과를 도 3에 나타낸다. 또, 도중의 콜레스테롤 옥시다제는 COD로 표기했다.

이 결과, 어느 쪽의 pH에 있어서도, 플루페남산의 농도의존적으로 상대 흡광도가 증가했다. 반응촉진물질의 사용에 의해, 콜레스테롤 옥시다제의사용량을 줄일 수 있음이 확인됐다.

또한, 반응촉진물질이 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 사용하는 유리형 콜레스테롤의 측정법 또는 총콜레스테롤의 측정법에도 사용할 수 있는 것이 분명해졌다.

본 발명자들은 전기 「생물시료분석」 중에 보고된 HDL 등의 특정의 리포단백에만 작용하는 물질을 이용한 특정 획분중의 콜레스테롤의 정량치가 침전법의 값보다 높은 원인에 관하여 추구한 바, 측정될 수 없는 HDL획분 이외의 리포단백(LDL, VLDL 등)으로부터도 표면 내지 그의 극 부근에 존재하는 소량의 유리형 콜레스테롤이 인출되고, 이것이 정오차를 생기게 하는 원인인 것이라는 결론을 얻었다. 그리하여 이러한 발견에 기초로 하여 리포단백이 실질적으로 변화하지 않는 조건에서 유리형 콜레스테롤만을 미리 소비한 후, 콜레스테롤 값을 측정하면, 특정의 리포단백에만 작용하는 물질을 이용한 정량법의 값과 침전법에서의 값이 일치함을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 시료중의 특정의 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하기에 앞서, 리포단백을 함유하는 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 작용시킴을 특징으로 하는 콜레스테롤 정량용 시료의 전처리 방법을 제공하는것이다.

또한, 본 발명은 리포단백을 함유하는 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 작용시킨 후, 특정의 리포단백에만 작용하는 물질을 이용하여 특정의 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하는 것을 특징이라고 하는 특정의 리포단백 콜레스테롤 정량법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면, 원심분리 등의 기계적 전처리는 물론, 폴리아니온 등을 사용하지 않고, 간편한 조작으로 효율 좋게 특정 획분 중의 콜레스테롤을 정량하는 것이 가능하게 된다. 그리고, 폴리아니온 등에서 침전이 생기지 않으므로, 측정장치(특히, 셀)등이 더러워지지 않고, 또한, 측정치의 불규칙도 생기지 않기 때문에 종래의 콜레스테롤 측정방법에 비하여 우수한 것이다.

또한, 후기 실시예에 나타난 바와 같이, 중성 지방 레벨이 높은 검체에 대해서도 종래의 침전법과 상관이 높은 측정치가 얻어지는 것이며, 시료를 선택하지 않는 점에서도 우수한 것이다.

더욱이, 반응 촉진제를 사용한 경우는, 전처리에서 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소의 사용량을 적게 하는 것이 가능하다.

이와 같이, 본 발명 방법은 적은 시료로 간편한 조작에 의해 넓은 범위의 시료에 대하여 정확하고, 또한 특이적인 측정이 가능하기 때문에, 각종 자동분석장치에 적용할 수 있으며, 임상검사의 영역에 있어서도 극히 유용하다.

Claims

시료중의 특정 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하기에 앞서, 리포단백을 함유하는 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 정량용 시료의 전처리 방법.
시료중의 특정 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하기에 앞서, 리포단백을 함유하는 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소 및 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질을 작용시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 정량용 시료의 전처리 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소가 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 데히드로게나제인 전처리 방법.
리포단백을 함유하는 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 작용시킨 후, 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 이용하여 특정 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하는 것을 특징으로 하는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량법.
리포단백을 함유하는 시료에 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소 및 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질을 작용시킨 후, 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 이용하여 특정 리포단백 중에 존재하는 콜레스테롤을 측정하는 것을 특징으로 하는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소가 콜레스테롤 옥시다제 및/또는 콜레스테롤 데히드로게나제인 정량법.
제 4항 내지 제 7항의 어느 1 항에 있어서, 특정 리포단백이 고비중 리포단백인 정량법.
유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 함유하고, 리포단백에 작용하는 물질을 실질적으로 포함하지 않는 콜레스테롤 측정용 시료의 전처리제.
유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소와 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질을 함유하고, 리포단백에 작용하는 물질을 실질적으로 포함하지 않는 콜레스테롤 측정용 시료의 전처리제.
유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소를 포함하고, 콜레스테롤에스테라제를 실질적으로 포함하지 않는 콜레스테롤 측정용 시료의 전처리제.
유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소와 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질을 포함하고, 콜레스테롤 에스테라제를 실질적으로 포함하지 않는 콜레스테롤 측정용 시료의 전처리제.
제 8항 내지 제 10항의 어느 1항에 있어서, 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소가 콜레스테롤 데히드로게나제 또는 콜레스테롤 옥시다제인 콜레스테롤 측정용 시료의 전처리제.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 옥시다제 및 과산화수소 소비물질을 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 에스테라제 및 발색제를

함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제 및 보효소를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하다및 콜레스테롤 에스테라제를 함유하는

제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제 및 보효소를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤

에스테라제, 퍼옥시다제 및 발색제를 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제 및 과산화수소 소비물질을

함유하는 제 1시약,

(2)특정 리포단백에만 작용하는 물질 및 발색제를 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제, 보효소 및 콜레스테롤 에스테라제를

함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제, 보효소 및 콜레스테롤 에스테라제를

함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤옥시다제, 퍼옥시다제 및

발색제를 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤옥시다제 및 과산화수소 소비물질을 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 에스테라제 및 발색제를 함유하는 제 3시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제 및 보효소를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 에스테라제를 함유하는 제 3시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제 및 보효소를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제, 퍼옥시다제 및 발색제를

함유하는 제 3시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제, 보효소 및 보효소 반응 생성물 소비물질을

함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질 및 콜레스테롤 에스테라제를 함유하는

제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) 콜레스테롤 데히드로게나제, 보효소 및 보효소 반응 생성물 소비물질을

함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 에스테라제 및 발색제를

함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a)콜레스테롤옥시다제, (b) 플루페남산, 메페남산,

2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손

아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질 및

(c) 과산화수소 소비물질을 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 에스테라제 및

발색제를 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤 데히드로게나제, (b)플루페남산, 메페남산,

2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손

아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응 촉진 및

(c)보효소를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질 및 콜레스테롤 에스테라제를

함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a)콜레스테롤옥시다제, (b)플루페남산, 메페남산,

2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손

아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질, (c)

콜레스테롤 에스테라제 및 (d)과산화수소 소비물질을

함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질 및 발색제를 함유하는

제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤 데히드로게나제, (b)보효소, (c)플루페남산,

메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산,

베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응

촉진물질 및 (d)콜레스테롤 에스테라제를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤 데히드로게나제, (b)보효소, (c)플루페남산,

메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산,

베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응

촉진물질 및 (d)콜레스테롤 에스테라제를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 옥시다제,

퍼옥시다제 및 발색제를 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤옥시다제, (b)플루페남산, 메페남산,

2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산,

베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응

촉진물질 및 (c)과산화수소 소비물질을 함유하는군 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 에스테라제 및 발색제를 함유하는 제 3시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤 데히드로게나제, (b)플루페남산, 메페남산,

2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손

아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질 및

(c)보효소를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 에스테라제를 함유하는 제 3시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤 데히드로게나제, (b)플루페남산, 메페남산,

2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손

아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질 및

(c) 보효소를 함유하는 제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질을 함유하는 제 2시약,

(3) 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제, 퍼옥시다제 및

발색제를 함유하는 제 3시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤 데히드로게나제, (b)보효소, (c)플루페남산,

메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산,

베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응

촉진물질 및 (d)보효소 반응 생성물 소비물질을 함유하는

제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질 및 콜레스테롤 에스테라제를

함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
다음 시약,

(1) (a) 콜레스테롤 데히드로게나제, (b)보효소, (c)플루페남산,

메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산,

베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응

촉진물질 및 (d) 보효소 반응 생성물 소비물질을 함유하는

제 1시약,

(2) 특정 리포단백에만 작용하는 물질, 콜레스테롤 에스테라제 및

발색제를 함유하는 제 2시약

으로 되는 특정 리포단백 중의 콜레스테롤 정량용 킷트.
플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 유리형 콜레스테롤을기질로 하는 효소의 반응촉진물질.
제 34항에 있어서, 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소가 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 데히드로게나제인 반응 촉진물질.
유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소 및 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응촉진물질을 작용시키는 것을 특징으로 하는 유리형 콜레스테롤의 정량법.
적어도 유리형 콜레스테롤을 기질로 하는 효소 및 플루페남산, 메페남산, 2,2',6',2"-테르피리딘, 티글린산, 후시딘산, 베타메타손 아세테이트, 모넨신 및 메비노린에서 선택된 반응 촉진물질을 작용시키는 것을 특징으로 하는 총콜레스테롤의 정량법.