JP4643212B2 - コレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素酵素含有組成物及びコレステロール測定試薬 - Google Patents

Description

本発明はコレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素含有組成物及びコレステロール測定試薬に関する。

従来、酵素を用いた測定方法は、反応の特異性、再現性に優れ、操作が簡便であることなどから多数開発されてきた。特に臨床検査の分野では血液試料中の成分の測定に多くの方法が知られている。
ところで、臨床検査の分野では最近、脂質の検査が増え、特にコレステロールは成人病である動脈硬化症のリスクファクターとして重要であり、コレステロールの検査が多くなっている。コレステロールを測定する方法は、現在酵素を用いる方法が一般的であり、それにはコレステロールオキシダーゼを用いた方法とともに、コレステロール脱水素酵素を用いた方法が知られている（特許文献１）。前者の方法においては、酵素反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色基質と反応させてキノン系色素に導く工程が必要であり、操作が煩雑である。また、測定試料中に含まれるビリルビン、アスコルビン酸などによって誤差を生じるという欠点がある。それに対して、後者の方法は、ＮＡＤ（Ｐ）の存在下、コレステロールとコレステロール脱水素酵素との酵素反応により生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を測定するもので、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度を測定するだけで測定が行えるので簡便であり、かつ試料中の夾雑物の影響も少ないという利点を有する。

しかし、コレステロール脱水素酵素は不安定な酵素であり、測定試薬として調製するためには種々の工夫がなされている。
例えば、クリスタリンを用いた生理活性タンパク質の安定化方法（特許文献２）、配糖体を用いたコレステロール脱水素酵素の安定化方法（特許文献３）、キレート剤を用いた生理活性物質の安定化方法（特許文献４）等が提案されている。

特開平５−１７６７９７号公報 特開平７−２３６４８３号公報 特開平９−３１３１７８号公報 特開２００１−２９９３８５号公報

本発明は従来のコレステロール測定試薬の安定化方法とは異なる新規なコレステロー
ル測定試薬の安定化方法を目的とする。また、本発明は新規なコレステロール測定試薬を提供することを目的とする。

本発明の第一の観点は、補酵素を含有する第一液状試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二液状試薬とからなる、コレステロール測定試薬の安定化方法であって、第二液状試薬に、グリシン、グリシルグリシンおよびトリシンからなる群から選択される少なくとも一のグリシン系化合物を添加することを特徴とするコレステロール測定試薬の安定化方法に関する。
また、本発明の第二の観点は、補酵素を含有する第一液状試薬と、コレステロール脱水素酵素と、グリシン、グリシルグリシンおよびトリシンからなる群から選択される少なくとも一のグリシン系化合物を含有する第二液状試薬と、を含むコレステロール測定試薬に関する。

本発明によれば、コレステロール脱水素酵素を安定化することができ、安定な試薬の提供がかのうとなり、使用性が著しく向上し、臨床検査の分野に貢献できる。

コレステロール脱水素酵素含有組成物は、コレステロール脱水素酵素および化学式（１）で示されるグリシン系化合物からなる。
Ｒ−（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯ）_ｎ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ （１）
（式中Ｒは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、ｎは０〜２を示す。）

コレステロール脱水素酵素は特に限定はしないが微生物由来、動物由来または植物由来のものが例示され、好ましくは微生物由来のコレステロール脱水素酵素を挙げることができる。また、微生物の中でもノカルジアｓｐ．（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．）由来のコレステロール脱水素酵素が好ましい。また、これら微生物等を培養、精製することにより得られたコレステロール脱水素酵素や組換え体により得られたコレステロール脱水素酵素も使用可能である。さらに、糖やポリエチレングリコールなどで修飾されたものであってもよい。

コレステロール脱水素酵素の安定化に用いるグリシン系化合物は下記化学式（１）で示される。
Ｒ−（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯ）_ｎ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ （１）
（式中Ｒは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、ｎは０〜２を示す。）
ここで、Ｒは置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基、置換基を有しても良いカルボニル基、アルキル基としてはメチル基、エチル基などをあげることができ、フェ二ル基としてはヒドロキシフェニル基などを挙げることができる。また、置換基としてはヒドロキシメチル基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ニトロ基、メトキシ基、チオール基などをあげることができる。化学式（１）に示すグリシン系化合物を２種類以上組み合わせてもよい。また、化学式（１）に示すグリシン系化合物として、グリシン、グリシルグリシン、トリシンを好適に挙げることができる。また、これらのグリシン系化合物は緩衝作用を有しており緩衝剤の役割を合わせて発揮させても良い。

上記化学式（１）で表されるグリシン系化合物と共に他の安定化物質、例えばコール酸、配糖体、アデノシン一リン酸、クリスタリン若しくはキレート剤またはこれらの誘導体をコレステロール脱水素酵素含有組成物に添加しても良い。コール酸またはその誘導体としては例えばコール酸の塩類（例えば、ナトリウム塩など）、デオキコール酸又はその塩類（例えば、ナトリウム塩など）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ)等が例示することができる。また、配糖体またはその誘導体としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミドおよびｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド等を例示することができる。さらに、アデノシン一リン酸またはその誘導体としては、例えばアデノシン一リン酸またはその塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）等を例示することができる。また、クリスタリンまたはその誘導体としては、例えばα−クリスタリン、β−クリスタリン、γ−クリスタリン、δ−クリスタリン等を例示することができる。また、キレート剤としては、例えばエチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ハイドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、ハイドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＰＯ）、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）等を例示することができる。

化学式（１）で示されるグリシン系化合物によるコレステロール脱水素酵素の安定化効果は、コレステロール脱水素酵素含有組成物が液状状態において顕著な効果を奏するが、凍結乾燥状態においても顕著な効果を発揮し得る。コレステロール脱水素酵素含有組成物に添加する化学式（１）に示すグリシン系化合物の添加量は、その種類、コレステロール脱水素酵素含有組成物中のコレステロール脱水素酵素含有量、コレステロール脱水素酵素含有組成物の保存条件などに応じて適宜設定できる。例えばコレステロール脱水素酵素含有組成物に添加するグリシン系化合物の濃度は０．００１〜２０００ｍＭが好ましく、より好ましくは１０〜１５００ｍＭ、さらに好ましくは１００〜１０００ｍＭである。

コレステロール脱水素酵素含有組成物は、例えば総コレステロール、遊離コレステロール測定のほか、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールまたは超低密度リポタンパク質（ＶＤＬＤ）コレステロールなどのリポタンパク質コレステロールの測定に用いることが可能である。

総コレステロール測定試薬は、コレステロール脱水素酵素の反応に必要な補酵素（以下補酵素と略す）およびコレステロール遊離酵素および反応促進剤からなる第一試薬およびコレステロール脱水素酵素含有組成物からなる第二試薬からなる。また、遊離コレステロール測定試薬は、補酵素および反応促進剤からなる第一試薬およびコレステロール脱水素酵素含有組成物からなる第二試薬からなる。

補酵素としては、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−ＮＡＤ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ｔ−ＮＡＤＰ）等が挙げられる。コレステロールの存在によって、これら補酵素は、それぞれの還元型、すなわちＮＡＤＨ、ｔ−ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ｔ−ＮＡＤＰＨに変換される。

反応促進剤としては、コレステロールがコレステロール脱水素酵素により酸化された物質であるΔ４−コレステノンのケトン基をブロックできるものであれば特に限定されないが、ヒドラジン、その水和物、その塩、その誘導体を挙げることができる。ヒドラジン誘導体としては、ヒドラジルを基本骨格とする化合物が該当する。これらの具体例としては、ヒドラジン水和物としてヒドラジン（１水和物）ヒドラジン誘導体としては、二塩化ヒドラジニウム、一臭化ヒドラジニウム、硫酸ヒドラジニウムが好適であり、そのほか塩化フェニルヒドラジニウム、フェニルヒドラジン−Ｐ−スルホン酸、硫酸フェニルヒドラジニウム、ヒドラジンピリジン等を挙げることができる。

添加するヒドラジン、その水和物、その塩、その誘導体の量は、その種類、その組成、その他の条件によって異なるが、通常は試料、第一試薬及び第二試薬が混合されたときの濃度として５〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭである。

コレステロール遊離酵素としてはリポタンパク質にエステル結合したコレステロールを遊離させる作用を有するものであれば特に限定されず、具体的にはコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等を示すことができる。

リポ蛋白質コレステロール測定試薬は、反応制御物質および補酵素からなる第一試薬およびコレステロール脱水素酵素含有組成物およびコレステロール遊離酵素からなる第二試薬からなる。

リポ蛋白質としてはＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びレムナント様リポ蛋白質などがあり、これらのリポ蛋白質と複合体を形成する反応制御物質を添加することによりこれらリポ蛋白質コレステロールを測定することが可能である。

反応制御物質としては、カリクスアレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リンタングステン酸，デキストラン硫酸，ヘパリン等をあげることができ、さらに、これら物質とＭg⁺⁺，Ｍn⁺⁺，Ｃa⁺⁺，Ｌi⁺⁺，Ｎi⁺⁺等のカチオンと組合せて用いることもできる。

反応制御剤としてはカリクスアレンが好ましい。以下にカリクスアレンを用いたリポ蛋白質コレステロールの測定方法を説明する。

カリクスアレンは、フェノールを基本骨格とし、フェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた環状オリゴマーである。カリクスアレンとしては、カリクス（４）アレン〔Ｃａｌｉｘ(４)ａｒｅｎｅ〕、カリクス（６）アレン、カリクス（８）アレン、硫酸カリクス（４）アレン、硫酸カリクス（６）アレン、硫酸カリクス（８）アレン、酢酸カリクス（４）アレン、酢酸カリクス（６）アレン、酢酸カリクス（８）アレン、カルボキシカリクス（４）アレン、カルボキシカリクス（６）アレン、カルボキシカリクス（８）アレン、カリクス（４）アレンアミン、カリクス（６）アレンアミン、カリクス（８）アレンアミンなどが挙げられる。これらカリクスアレンから選ばれる一種または二種以上を用いることができる。

補酵素およびコレステロール遊離酵素は上述した補酵素およびコレステロール遊離酵素を用いることができる。

第一試薬中のカリクスアレンの濃度は測定対象、カリクスアレンの種類およびｐＨ等の測定条件に応じて決定する必要があり、その至適濃度は実験的に決定することができる。

所望により遊離コレステロールや測定対象でないリポ蛋白質コレステロールを消去するために第一試薬にコレステロールオキシダーゼまたはコレステロール脱水素酵素を添加することができる。好適にはコレステロールオキシダーゼが用いられる。

例えば、ＨＤＬコレステロールを測定する場合、第一反応でカリクスアレンを添加してＨＤＬ以外のリポ蛋白質とカリクスアレンとの複合体を形成させて安定化させ、第二反応で酵素等を添加して、ＨＤＬコレステロール濃度を測定すればよい。

ＬＤＬコレステロールを測定する場合は、先に述べた条件を組み合わせて、第一反応でＬＤＬとカリクスアレンとの複合体を形成させ安定化させる一方で、ＨＤＬ及びＶＬＤＬコレステロール及び遊離コレステロールを予め反応させて消去し、残ったＬＤＬコレステロールを第二反応にて測定する。

ＶＬＤＬコレステロールを測定する場合は、先に述べた条件を組み合わせて、第一反応でＶＬＤＬとカリクスアレンとの複合体を形成させ安定化させる一方で、ＨＤＬ及びＬＤＬコレステロールを予め反応させて消去し、残ったＶＬＤLコレステロールを第二反応にて測定する。

試料としては、血清、血漿、尿、唾液、精液などを例示することができる。

以下に実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
０.７Ｕ／ｍＬコレステロール脱水素酵素、０．５Ｍの表１に示す化合物及び２ｍｇ／ｍＬコール酸ナトリウムを含有する負荷液(ｐＨ８.８)を調製し、３７℃で３日間放置後、以下に示す方法によりコレステロール脱水素酵素の残存活性を求めた。試料調製直後の酵素活性を１００％として保存後の残存活性量を相対値で表した結果を表１に示す。表１に示すようにグリシン、グリシルグリシンまたはトリシンのようにグリシン系化合物の添加により、酵素の安定化が図られることが明らかとなった。

１．コレステロール脱水素酵素の活性測定方法。
以下の組成の試薬を調製した。
試薬Ａ：
コレステロール １ｍｇ／ｍＬ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ２０ｍｇ／ｍＬ
試薬Ｂ：
β−ＮＡＤ ３ｍｇ／ｍＬ
トリス緩衝液（ｐＨ８.５） ０.３Ｍ

希釈液：
コール酸ナトリウム ３ｍｇ／ｍＬ
リン酸緩衝液（ｐＨ７.０） ２０ｍＭ

２．測定方法
負荷液を希釈液で１０倍に希釈したものを試料液とした。２００μＬの試薬Ａに試料液１０μＬを混和し、２５℃で５分間恒温する。恒温した混合液に１００μＬの試薬Ｂを添加し、２５℃３４０ｎｍにおける１分間あたりの吸光度変化量を求めた。同様に試料液の代わりに希釈液を１０μＬ添加し試薬ブランクを求めた。

（実施例２）
表２に示す化合物について濃度の検討を行った。各化合物の濃度を０．１〜０．５Ｍに変化させた以外は実施例１と同様に行った。その結果を表２に示す。表２に示すように０．１〜０．５Ｍの範囲において十分な安定化効果が確認された。

（実施例３）
グリシルグリシンとグリシンの併用によるコレステロール脱水素酵素の安定化の検討を行った。
２Ｕ／ｍＬコレステロール脱水素酵素、１４ｍＭドデシルマルトース、０．５Ｍグリシルグリシンおよび各濃度のグリシンを添加して負荷液を調製し（ｐＨ８.８）、３７℃で所定期間保存した後のコレステロール脱水素酵素の残存率を検討した。また、コレステロール脱水素酵素の残存活性は実施例１に示す方法で行った。
負荷液調製直後の酵素活性を１００％として保存後の残存活性量を相対値で表した結果を表３に示す。表３に示すようにグリシンを添加することによりさらに安定化効果が向上することが明らかとなった。

（実施例４）
配糖体であるドデシルマルトース、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の併用によるコレステロール脱水素酵素の安定化の検討を行った。
２Ｕ／ｍＬコレステロール脱水素酵素、０．５Ｍグリシルグリシンおよび０.５Ｍグリシンに種々の濃度ドデシルマルトースおよびＡＭＰを添加した負荷液を調製し（ｐＨ８.８）、３７℃で所定期間保存した後のコレステロール脱水素酵素の残存率を検討した。
試料調製直後の酵素活性を１００％として保存後の残存活性量を相対値で表した結果を表４に示す。表４に示すようにドデシルマルトース、ＡＭＰを添加することによりさらに安定化効果が向上することが明らかとなった。

（実施例５）
総コレステロール測定試薬の安定性
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いた総コレステロール測定試薬を以下に示す。総コレステロール測定試薬の第一試薬はＰＩＰＥＳ ２５ｍＭ、二塩化ヒドラジニウム １００ｍＭ、ノニオンＡ−１０Ｒ ０．５％、トライトンＸ−１００ ０．５％、コール酸ナトリウム ２ｍＭ、β−ＮＡＤ ５ｍＭ、コレステロールエステラーゼ ５Ｕ／ｍＬを含む溶液（ｐＨ７．０）、第二試薬はグリシン ２００ｍＭ、コール酸ナトリウム ５ｍＭ、コレステロール脱水素酵素 １４Ｕ／ｍＬを含む溶液（ｐＨ８．５）から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにＴＡＰＳを用いたグリシンを含有しない総コレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いた総コレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しない総コレステロール測定試薬より良好であった。

（実施例６）
ＨＤＬコレステロール測定試薬の安定性
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いたＨＤＬコレステロール測定試薬を以下に示す。ＨＤＬコレステロール測定試薬の第一試薬はＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ、二塩化ヒドラジニウム ８０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン ２ｍＭ、β−ＮＡＤ ５．０ｍＭ、 コレステロール酸化酵素 ０．５Ｕ／ｍｌを含む溶液（ｐＨ６．５）、試薬二試薬はグリシン ２００ｍＭ、コレステロール脱水素酵素 ２０Ｕ／ｍｌ、コレステロールエステラーゼ ６Ｕ／ｍｌを含む溶液（ｐＨ８．５）から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにＴＡＰＳを用いたグリシンを含有しないＨＤＬコレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いたＨＤＬコレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しないＨＤＬコレステロール測定試薬より良好であった。

（実施例７）
ＬＤＬコレステロール測定試薬の安定性の確認
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いたＬＤＬコレステロール測定試薬を以下に示す。ＬＤＬコレステロール測定試薬の第一試薬はＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ、硫酸カリクス（６）アレン １．２ ｍＭ、コール酸ナトリウム ２ｍＭ、コレステロールオキシダーゼ ０．５ Ｕ／ｍｌ、β−ＮＡＤ ５ｍＭ、コレステロールエステラーゼ １ Ｕ／ｍｌを含む溶液（ｐＨ７．０）、第二試薬はグリシン ２００ｍＭ、二塩化ヒドラジニウム ３００ ｍＭ、コレステロール脱水素酵素 ２０Ｕ／ｍｌを含む溶液（ｐＨ８．５）から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにＴＡＰＳを用いたグリシンを含有しないＬＤＬコレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いたＬＤＬコレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しないＬＤＬコレステロール測定試薬より良好であった。

（実施例８）
ＶＬＤＬコレステロール測定試薬の安定性の確認
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いたＶＬＤＬコレステロール測定試薬を以下に示す。ＶＬＤＬコレステロール測定試薬の第一試薬はＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ、硫酸カリクス（６）アレン １０ｍＭ、コール酸ナトリウム ２ｍＭ、コレステロールオキシダーゼ ０．５ Ｕ／ｍｌ、β−ＮＡＤ ５ｍＭ、コレステロールエステラーゼ １ Ｕ／ｍｌを含む溶液（ｐＨ７．０）、第二試薬はグリシン ２００ｍＭ、二塩化ヒドラジニウム ３００ ｍＭ、コレステロール脱水素酵素 ２０Ｕ／ｍｌを含む溶液（ｐＨ８．５）から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにＴＡＰＳを用いたグリシンを含有しないＶＬＤＬコレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いたＶＬＤＬコレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しないＶＬＤＬコレステロール測定試薬より良好であった。

以上説明したようにグリシン系化合物を用いることによりコレステロール脱水素酵素が安定化された試薬の供給が可能となる。

Claims (11)

1. 補酵素を含有する第一液状試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二液状試薬とからなる、コレステロール測定試薬の安定化方法であって、
   第二液状試薬に、グリシン、グリシルグリシンおよびトリシンからなる群から選択される少なくとも一のグリシン系化合物を添加することを特徴とするコレステロール測定試薬の安定化方法。
2. 第二液状試薬が、さらに、配糖体、コール酸及びアデノシン一リン酸からなる群から選択される少なくとも一を含有する請求項１に記載のコレステロール測定試薬の安定化方法。
3. 前記グリシン系化合物の濃度が１０〜２０００mMである請求項１又は２に記載のコレステロール測定試薬の安定化方法。
4. 補酵素を含有する第一液状試薬と、
   コレステロール脱水素酵素と、グリシン、グリシルグリシンおよびトリシンからなる群から選択される少なくとも一のグリシン系化合物を含有する第二液状試薬と、
   を含むコレステロール測定試薬。
5. 前記コレステロール測定試薬が、総コレステロール測定試薬であり、前記第一液状試薬は、さらにコレステロール遊離酵素及び反応促進剤を含む、請求項４に記載のコレステロール測定試薬。
6. 前記コレステロール測定試薬が、遊離コレステロール測定試薬であり、前記第一液状試薬は、さらに反応促進剤を含む、請求項４に記載のコレステロール測定試薬。
7. 前記コレステロール測定試薬が、リポタンパク質コレステロール測定試薬であって、前記第一液状試薬は、さらに反応制御物質を含み、前記第二液状試薬は、さらにコレステロール遊離酵素を含む、請求項４に記載のコレステロール測定試薬。
8. 前記反応制御物質がカリクスアレン、ポリエチレングリコール、リンタングステン酸、デキストラン硫酸及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも一である請求項７に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。
9. 前記反応制御物質がカリクスアレンである請求項７または８に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。
10. 前記第二液状試薬に含有される前記グリシン系化合物の濃度が１０〜２０００mMである請求項７〜９のいずれか１に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。
11. 前記リポタンパク質コレステロール測定試薬が高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール測定試薬、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール測定試薬または超低密度リポタンパク質（ＶＤＬＤ）コレステロールである請求項７〜１０のいずれか１に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。