KR20050052376A - 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법, 콜레스테롤탈수소효소 함유 조성물 및 콜레스테롤 측정 시약 - Google Patents

콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법, 콜레스테롤탈수소효소 함유 조성물 및 콜레스테롤 측정 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종래의 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법과는 다른 신규한 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 신규한 콜레스테롤 함유 조성물 및 콜레스테롤 측정 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
하기 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물을 첨가함으로써 목적이 달성된다.
R - (NH - CH2 - CO)n - NH - CH2 - COOH (1)
(식 중 R 은 수소, 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기 또는 치환기를 가져도 되는 카르보닐기를 나타내고, n 은 0∼2를 나타낸다.)

Description

콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법, 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물 및 콜레스테롤 측정 시약 {PROCESS FOR STABILIZING CHOLESTEROL DEHYDROGENASE AND COMPOSITION CONTAINING CHOLESTEROL DEHYDROGENASE, AND REAGENT FOR MEASUREMENT OF CHOLESTEROL}
본 발명은 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법, 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물 및 콜레스테롤 측정 시약에 관한 것이다.
종래, 효소를 이용한 측정 방법은 반응의 특이성, 재현성이 우수하고 조작이 간편한 것 등 때문에 다수 개발되어 왔다. 특히 임상검사의 분야에서는 혈액 시료 중의 성분의 측정에 다수의 방법이 알려져 있다.
그런데, 임상검사의 분야에서는 최근, 지질의 검사가 증가하고 특히 콜레스테롤은 성인병인 동맥경화증의 리스크 팩터(risk factor: 위험요인)로서 중요하며, 콜레스테롤의 검사가 많아지고 있다. 콜레스테롤을 측정하는 방법은 현재 효소를 이용하는 방법이 일반적이고 그것에는 콜레스테롤 옥시다제를 이용한 방법과 함께 콜레스테롤 탈수소효소를 이용한 방법이 알려져 있다 (일본 특개평 5-176797호 공보 참조). 전자의 방법에 있어서는 효소 반응에 의해 생성한 과산화수소를 퍼옥시다제(peroxidase)의 존재하에서 발생기질과 반응시켜서 퀴논계 색소에 전달하는 공정이 필요하고 조작이 복잡하다. 또한, 측정 검체 중에 포함되는 빌리루빈(bilirubin), 아스코르빈산 등에 의해 오차를 일으킨다고 하는 결점이 있다. 그것에 대해, 후자의 방법은 NAD(P)의 존재하에, 콜레스테롤과 콜레스테롤 탈수소효소의 효소 반응에 의해 생성되는 NAD(P)H의 양을 측정하는 것이므로, 생성된 NAD(P)H의 흡광도를 측정하는 것만 행하므로 간편하고 또한 시료 중의 불순물의 영향도 적다고 하는 이점을 가진다.
그러나, 콜레스테롤 탈수소효소는 불안정한 효소이고, 측정 시약으로서 조제하기 위해서는 여러 연구가 행해지고 있다.
예를 들면, 크리스탈린을 이용한 생리활성 단백질의 안정화 방법 (일본 특개평 7-236483호 공보 참조), 배당체(配糖體)를 이용한 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법 (일본 특개평 9-313178호 공보 참조), 킬레이트제를 이용한 생리활성 물질의 안정화 방법 (일본 특개 2001-299385호 공보 참조) 등이 제안되어 있다.
본 발명은 종래의 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법과는 다른 신규한 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 방법을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 신규한 콜레스테롤 함유 조성물 및 콜레스테롤 측정 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 제1 관점은 콜레스테롤 탈수소효소에 하기 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 탈수소효소 안정화 방법에 관한 것이다.
R - (NH - CH2 - CO)n - NH - CH2 - COOH (1)
(식 중 R 은 수소, 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기 또는 치환기를 가져도 되는 카르보닐기를 나타내고, n 은 0∼2 를 나타낸다.)
또한, 본 발명의 제2 관점은 상기 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물 및 콜레스테롤 탈수소효소를 함유하는 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 제3 관점은 상기 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물, 콜레스테롤 탈수소효소 및 보효소(補酵素)를 함유하는 콜레스테롤 측정 시약에 관한 것이다.
콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물은 콜레스테롤 탈수소효소 및 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물로 구성된다.
R - (NH - CH2 - CO)n - NH - CH2 - COOH (1)
(식 중 R 은 수소, 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기 또는 치환기를 가져도 되는 카르보닐기를 나타내고, n 은 0∼2 를 나타낸다.)
콜레스테롤 탈수소효소는 특별히 한정되지 않지만 미생물 유래, 동물 유래 또는 식물 유래의 것이 예시되고, 바람직하게는 미생물 유래의 콜레스테롤 탈수소효소를 들 수 있다. 또한, 미생물 중에서도 노카르디아 sp.(Nocardia sp.) 유래의 콜레스테롤 탈수소효소가 바람직하다. 또한, 이들 미생물들을 배양, 정제함으로써 얻어진 콜레스테롤 탈수소효소나 조환체(組換體)에 의해 얻어진 콜레스테롤 탈수소효소도 사용할 수 있다. 또한 당이나 폴리에틸렌글리콜 등으로 변성시킨 것이어도 된다.
콜레스테롤 탈수소효소의 안정화에 이용하는 글리신계 화합물은 하기 화학식 (1)로 나타낸다.
R - (NH - CH2 - CO)n - NH - CH2 - COOH (1)
(식 중 R 은 수소, 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기 또는 치환기를 가져도 되는 카르보닐기를 나타내고, n 은 0∼2 를 나타낸다.)
여기서, R은 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기, 치환기를 가져도 되는 카르보닐기, 알킬기로는 메틸기, 에틸기 등을 들 수 있으며, 페닐기로는 히드록시페닐기 등을 들 수 있다. 또한, 치환기로는 히드록시메틸기, 수산기, 아미노기, 카르복실기, 니트로기, 메톡시기, 티올기 등을 들 수 있다. 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물을 2종 이상 조합시켜도 된다. 또한, 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물로서 글리신, 글리실글리신, 트리신을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 이들 글리신계 화합물은 완충작용을 가지고 있어 완충제의 역할을 함께 발휘시켜도 된다.
상기 화학식 (1)로 표시되는 글리신계 화합물과 함께 다른 안정화 물질, 예를 들면 콜산, 배당체, 아데노신-인산, 크리스탈린 혹은 킬레이트제 또는 이들의 유도체를 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물에 첨가해도 된다. 콜산 또는 그 유도체로는 예를 들면 콜산의 염류 (예를 들면, 나트륨염 등), 데옥시콜산 또는 그의 염류 (예를 들면, 나트륨염 등), 3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트 (CHAPS), 3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트 (CHAPSO), N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)콜아미드(데옥시-BIGCHAP) 등이 예시될 수 있다. 또한, 배당체 또는 그의 유도체로는 예를 들면, n-도데실-β-D-말토시드 (도데실말토스), n-헵틸-β-D-티오글루코시드, n-옥틸-β-D-글루코시드, n-옥틸-β-D-티오글루코시드, 디기토닌(digitonin), 슈크로스 모노카프레이트(sucrose monocaprate), 슈크로스 모노라우레이트, 2-에틸헥실글루코시드, n-옥타노일-N-메틸글루카미드, n-메틸글루카미드, n-노나노일-N-메틸글루카미드 및 n-데카노일-N-메틸글루카미드 등을 예시할 수 있다. 또한, 아데노신-인산 또는 그의 유도체로는 예를 들면 아데노신-인산 또는 그의 염 (나트륨염, 칼륨염 등) 등을 예시할 수 있다. 또한, 크리스탈린 또는 그의 유도체로는 예를 들면 α-크리스탈린, β-크리스탈린, γ-크리스탈린, δ-크리스탈린 등을 예시할 수 있다. 또한, 킬레이트제로는 예를 들면 에틸렌디아민 2아세트산(EDDA), 이미노 2아세트산(IDA), 니트릴로 3아세트산(NTA), 하이드록시에틸이미노 2아세트산(HIDA), 에틸렌디아민 2프로피온산(EDDP), 에틸렌디아민 테트라키스메틸렌 포스폰산(EDTPO), 하이드록시에틸에틸렌디아민 4아세트산(EDTA-OH), 디아미노프로판올 4아세트산(DPTA-OH), 니트릴로트리스메틸렌 포스폰산(NTPO), 비스(아미노페닐)에틸렌글리콜 4아세트산(BAPTA), 니트릴로 3프로피온산(NTP), 디히드록시에틸글리신(DHEG), 글리콜에테르디아민 4아세트산(GEDTA) 등을 예시할 수 있다.
화학식 (1)로 나타내는 글루신계 화합물에 의한 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화 효과는 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물이 액상 상태에서 현저한 효과를 나타내는데, 동결건조 상태 또는 동결 상태에서도 현저한 효과를 발휘할 수 있다. 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물에 첨가하는 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물의 첨가량은 그의 종류, 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물 중의 콜레스테롤 탈수소효소 함유량, 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물의 보존 조건 등에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물에 첨가하는 글리신계 화합물의 농도는 0.001∼2000mM 이 바람직하고 더욱 바람직하게는 10∼1500mM, 더욱더 바람직하게는 100∼1000mM 이다.
콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물은 예를 들면 총 콜레스테롤, 유리 콜레스테롤 이외에, 고밀도 리포단백질(HDL)-콜레스테롤, 저밀도 리포단백질(LDL)-콜레스테롤 또는 초저밀도 리포단백질(VDLD)-콜레스테롤 등의 리포 단백질 콜레스테롤의 측정에 이용하는 것이 바람직하다.
총 콜레스테롤 측정 시약은 콜레스테롤 탈수소효소의 반응에 필요한 보효소(이하 보효소라고 약칭한다) 및 콜레스테롤 에스테라제 및 반응 촉진제로 이루어지는 제1 시약과, 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물로 이루어지는 제2 시약으로 구성된다. 또한, 유리 콜레스테롤 측정 시약은 보효소 및 반응 촉진제로 이루어지는 제1 시약과 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물로 이루어지는 제2 시약으로 구성된다.
보효소로서, β-니코틴아미드 아데닌디누클레오티드 산화형 (NAD), 티오-니코틴아미드 아데닌디누클레오티드 산화형 (t-NAD), β-니코틴아미드 아데닌디누클레오티드 인산 산화형(NADP), 티오-니코틴아미드 아데닌디누클레오티드 인산 산화형 (t-NADP)등을 들 수 있다. 콜레스테롤의 존재에 의해 이들 보효소는 각각 환원형 즉 NADH, t-NADH, NADPH, t-NADPH 로 변환된다.
반응촉진제로는 콜레스테롤이 콜레스테롤 탈수소효소에 의해 산화된 물질인 Δ4-콜레스테논(cholestenon)의 케톤기를 블록화 할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, 히드라진, 그의 수화물, 그의 염, 그의 유도체를 들 수 있다. 히드라진 유도체로는 히드라질을 기본 골격으로 하는 화합물이 해당한다. 이들의 구체예로는, 히드라진 수화물로서 히드라진 (1수화물), 히드라진 유도체로는 이염화 히드라지늄, 일브롬화 히드라지늄, 황산 히드라지늄이 적절하고 그 외에 염화페닐 히드라지늄, 페닐 히드라진-P-술폰산, 황산페닐 히드라지늄, 히드라진 피리딘 등을 들 수 있다.
첨가하는 히드라진, 그의 수화물, 그의 염, 그의 유도체의 양은 그의 종류, 그의 조성, 그 밖의 조건에 따라 달라지나 통상은 시료, 제1 시약 및 제2 시약이 혼합된 때의 농도로 5∼500mM, 바람직하게는 20∼200mM 이다.
콜레스테롤 유리 효소로는 리포단백질에 에스테르 결합한 콜레스테롤을 유리시키는 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 구체적으로는 콜레스테롤 에스테라제, 리포프로테인 리파제 등을 들 수 있다.
리포단백질 콜레스테롤 측정 시약은 반응제어물질 및 보효소로 이루어진 제1 시약과 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물 및 콜레스테롤 유리 효소로 이루어진 제2 시약으로 구성된다.
리포단백질로는 HDL, LDL, VLDL, CM 및 렘난트(remnant) 모양의 리포단백질 등이 있고, 이들 리포단백질과 복합체를 형성하는 반응제어물질을 첨가함으로써 이들 리포단백질 콜레스테롤을 측정하는 것이 가능하다.
반응제어물질로는 칼릭스아렌류(calix arene), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 인텅스텐산, 덱스트란 황산, 헤파린 등을 들 수 있고 또한 이들 물질과 Mg++, Mn++, Ca ++, Li++, Ni++ 등의 양이온과 조합시켜 이용할 수 있다.
반응제어제로는 칼릭스아렌류가 바람직하다. 이하에 칼릭스아렌류를 이용한 리포단백질 중의 콜레스테롤의 측정방법을 설명한다.
칼릭스아렌류는 페놀을 기본 골격으로 하고 페놀의 4∼8분자를 메틸렌기로 환상으로 중합시킨 환상 올리고머이다. 칼릭스아렌류로는 칼릭스(4)아렌 [Calix(4)arene], 칼릭스(6)아렌, 칼릭스(8)아렌, 황산 칼릭스(4)아렌, 황산 칼릭스(6)아렌, 황산 칼릭스(8)아렌, 아세트산 칼릭스(4)아렌, 아세트산 칼릭스(6)아렌, 아세트산 칼릭스(8)아렌, 카르복시칼릭스(4)아렌, 카르복시칼릭스(6)아렌, 카르복시칼릭스(8)아렌, 칼릭스(4)아렌아민, 칼릭스(6)아렌아민, 칼릭스(8)아렌아민 등을 들 수 있다. 이들 칼릭스아렌류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다.
보효소 및 콜레스테롤 유리 효소는 상술한 보효소 및 콜레스테롤 유리 효소를 이용할 수 있다.
제1 시약 중의 칼리스아렌류의 농도는 측정 대상, 칼릭스아렌의 종류 및 pH 등의 측정조건에 따라 결정할 필요가 있고 그 지적농도(至適濃度)는 실험적으로 결정할 수 있다.
소망에 따라 유리 콜레스테롤이나 측정대상이 아닌 리포단백질 중의 콜레스테롤을 소거하기 위해서 제1 시약에 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 탈수소효소를 첨가할 수 있다. 적절히는 콜레스테롤 옥시다제가 이용된다.
예를 들면, HDL 콜레스테롤을 측정하는 경우 제1 반응에서 칼릭스아렌류를 첨가하여 HDL 이외의 리포단백질과 칼릭스아렌류와의 복합체를 형성시켜 안정화시키고 제2 반응에서 효소 등을 첨가하여 HDL 콜레스테롤 농도를 측정하면 된다.
LDL 콜레스테롤을 측정하는 경우는 앞에서 기술한 조건을 조합하여 제1 반응에서 LDL과 칼릭스아렌류와의 복합체를 형성시켜 안정화시키는 한편, HDL 및 VLDL 콜레스테롤 및 유리 콜레스테롤을 미리 반응시켜 소거하고, 남아있던 LDL 콜레스테롤을 제2 반응에서 측정한다.
VLDL 콜레스테롤을 측정하는 경우는 앞에서 기술한 조건을 조합하여 제1 반응에서 VLDL 과 칼릭스아렌류와의 복합체를 형성시켜 안정화시키는 한편, 콜레스테롤을 미리 반응시켜 소거하고, 남아있던 VLDL 콜레스테롤을 제2 반응으로 측정한다.
시료로는 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 정액 등을 예시할 수 있다.
실시예
이하에서 실시예를 열거하고 있으나 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
0.7 U/mL 콜레스테롤 탈수소효소, 표 1에서 나타내는 0.5M 의 화합물 및 2mg/mL 콜산 나트륨을 함유하는 부하액 (pH 8.8) 을 조제하고 37℃ 에서 3일간 방치후, 이하에 나타내는 방법에 의해 콜레스테롤 탈수소효소의 잔존활성을 구했다. 시료 조제 직후의 효소 활성을 100% 로 하여 보존후의 잔존활성량을 상대치로 표시한 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타내는 것과 같이 글리신, 글리실글리신 또는 트리신 같은 글리신계 화합물의 첨가에 의해 효소의 안정화가 나타나는 것이 확실해졌다.
1. 콜레스테롤 탈수소효소의 활성 측정방법.
이하의 조성의 시약을 조제했다.
시약 A:
콜레스테롤 1mg/mL
트리톤 X-100 20mg/mL
시약 B:
β-NAD 3mg/mL
트리스 완충액 (pH 8.5) 0.3M
희석액:
콜산 나트륨 3mg/mL
인산 완충액 (pH 7.0) 20mM
2. 측정 방법
부하액을 희석액으로 10배 희석한 것을 시료액으로 했다. 200μL 의 시약 A에 시료액 10μL 을 혼화하고 25℃ 에서 5분간 항온한다. 항온한 혼합액에 100μL 의 시약 B를 첨가하고 25℃, 340nm 에서 1분간의 흡광도 변화량을 구했다. 마찬가지로 상기 시료액 대신 희석액을 100μL 첨가하여 시약 블랭크를 구했다.
[표 1]
시약명 잔존율(%)
글리신 52
글리실글리신 50
트리신 48
TAPS 28
비신 23
HEPES 15
CHES 1
트리스(히드록시메틸)아미노메탄 4
2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올 0
디에탄올아민 1
피롤린산 칼륨 9
붕산 9
실시예 2
표 2에 나타내는 화합물에 대하여 농도의 검토를 행했다. 각 화합물의 농도를 0.1∼0.5M 으로 변화시킨 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 행했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타내는 바와 같이 0.1∼0.5M 의 범위에서 안정화 효과가 확인되었다.
[표 2]
단위: 잔존율 (%)
시약명 37℃ㆍ2일간 보존
0.5M 0.4M 0.3M 0.2M 0.1M
글리신 66 59 53 48 31
글리실글리신 51 47 41 39 38
트리신 53 47 41 35 30
TAPS 35 32 29 28 27
2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올 1 0 2 3 9
디에탄올아민 1 1 1 1 6
피롤린산칼륨 16 13 7 1 0
실시예 3
글리실글리신과 글리신의 병용에 의한 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화의 검토를 행했다.
2U/mL 콜레스테롤 탈수소효소, 14mM 도데실말토스, 0.5M 글리실글리신 및 각 농도의 글리신을 첨가하여 부하액을 조제하고 (pH 8.8), 37℃ 에서 소정 기간 보존한 후의 콜레스테롤 탈수소효소의 잔존율을 검토했다. 또한, 콜레스테롤 탈수소효소의 잔존활성은 실시예 1에 나타내는 방법으로 행했다.
부하액 조제 직후의 효소활성을 100% 로 하여 보존후의 잔존활성량을 상대치로 표시한 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타내는 바와 같이 글리신을 첨가함으로써 안정화 효과가 더욱 향상하는 것이 명백해졌다.
[표 3]
단위: 잔존율 (%)
글리실글리신(M) 글리신(M) 37℃ㆍ1일 37℃ㆍ2일
0.5 0.00 66.7 54.0
0.5 0.05 67.8 73.8
0.5 0.10 69.3 62.2
0.5 0.20 72.1 67.0
0.5 0.30 74.3 65.8
0.5 0.40 75.8 68.5
0.5 0.50 77.3 71.0
0.5 0.60 79.4 80.2
실시예 4
배당체인 도데실말토스, 아데노신-인산 (AMP)의 병용에 의한 콜레스테롤 탈수소효소의 안정화의 검토를 행했다.
2U/mL 콜레스테롤 탈수소효소, 0.5M 글리실글리신 및 0.5M 글리신에 여러 농도의 도데실말토스 및 AMP 를 첨가한 부하액을 조제하고 (pH 8.8), 37℃ 에서 소정 기간 보존한 후의 콜레스테롤 탈수소효소의 잔존율을 검토했다.
부하액 조제 직후의 효소활성을 100% 로 하여 보존후의 잔존활성량을 상대치로 표시한 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에 나타내는 바와 같이 도데실 말토스, AMP를 첨가함으로써 안정화 효과가 더욱 향상하는 것이 명백해졌다.
[표 4]
단위: 잔존율 (%)
도데실말토스 AMP 37℃ㆍ1일 37℃ㆍ2일 37℃ㆍ3일
5.9mM 5mM 7.5mM 10mM 84.2 75.7 69.9
84.9 78.1 73.1
87.5 80.5 76.4
7.8mM 5mM 7.5mM 10mM 88.8 82.3 77.8
91.0 86.1 80.4
90.7 87.1 81.9
9.8mM 5mM 7.5mM 10mM 91.9 87.6 82.2
91.8 87.0 83.4
93.9 90.3 85.2
실시예 5
총 콜레스테롤 측정 시약의 안정성
콜레스테롤 탈수소효소의 안정화제로서 글리신을 이용한 총 콜레스테롤 측정 시약을 이하에 나타낸다. 총 콜레스테롤 측정 시약의 제1 시약은 PIPES 25mM, 이염기히드라지늄 100mM, 노니온 A-10R 0.5%, 트라이톤X-100 0.5%, 콜산나트륨 2mM, β-NAD 5mM, 콜레스테롤 에스테라제 5U/mL 를 함유하는 용액 (pH 7.0)으로 구성되고, 제2 시약은 글리신 200mM, 콜산나트륨 5mM, 콜레스테롤 탈수소효소 14U/mL 를 함유하는 용액 (pH 8.5)으로 구성된다. 또한, 대조로서 상기 제2 시약의 글리신 대신에, TAPS 을 이용한 글리신 무함유의 총 콜레스테롤 측정 시약도 조제했다.
글리신을 이용한 총 콜레스테롤 측정 시약의 안정성은 글리신을 함유하지 않은 총 콜레스테롤 측정 시약보다 양호했다.
실시예 6
HDL 콜레스테롤 측정 시약의 안정성
콜레스테롤 탈수소효소의 안정화제로서 글리신을 이용한 HDL 콜레스테롤 측정 시약을 이하에 나타낸다. HDL 콜레스테롤 측정 시약의 제1 시약은 HEPES 50mM, 이염기히드라지늄 80mM, 황산칼릭스(8)아렌 2mM, β-NAD 5.0mM, 콜레스테롤 산화효소 0.5U/mL 를 함유하는 용액 (pH 6.5)으로 구성되고, 제2 시약은 글리신 200mM, 콜레스테롤 탈수소효소 20U/mL, 콜레스테롤 에스테라제 6U/mL 를 함유하는 용액 (pH 8.5)으로 구성된다. 또한, 대조로서 상기 제2 시약의 글리신 대신에, TAPS 을 이용한 글리신 무함유의 HDL 콜레스테롤 측정 시약도 조제했다.
글리신을 이용한 HDL 콜레스테롤 측정 시약의 안정성은 글리신을 함유하지 않은 HDL 콜레스테롤 측정 시약보다 양호했다.
실시예 7
LDL 콜레스테롤 측정 시약의 안정성
콜레스테롤 탈수소효소의 안정화제로서 글리신을 이용한 LDL 콜레스테롤 측정 시약을 이하에 나타낸다. LDL 콜레스테롤 측정 시약의 제1 시약은 HEPES 50mM, 황산칼릭스(6)아렌 1.2mM, 콜산나트륨 2mM, 콜레스테롤 옥시다제 0.5U/mL, β-NAD 5mM, 콜레스테롤 에스테라제 산화효소 1U/mL 를 함유하는 용액 (pH 7.0)으로 구성되고, 제2 시약은 글리신 200mM, 이염기히드라지늄 300mM, 콜레스테롤 탈수소효소 20U/mL 를 함유하는 용액 (pH 8.5)으로 구성된다. 또한, 대조로서 상기 제2 시약의 글리신 대신에, TAPS 을 이용한 글리신 무함유의 LDL 콜레스테롤 측정 시약도 조제했다.
글리신을 이용한 LDL 콜레스테롤 측정 시약의 안정성은 글리신을 함유하지 않은 LDL 콜레스테롤 측정 시약보다 양호했다.
실시예 8
VLDL 콜레스테롤 측정 시약의 안정성
콜레스테롤 탈수소효소의 안정화제로서 글리신을 이용한 VLDL 콜레스테롤 측정 시약을 이하에 나타낸다. VLDL 콜레스테롤 측정 시약의 제1 시약은 HEPES 50mM, 황산칼릭스(6)아렌 10mM, 콜산나트륨 2mM, 콜레스테롤 옥시다제 0.5U/mL, β-NAD 5mM, 콜레스테롤 에스테라제 산화효소 1U/mL 를 함유하는 용액 (pH 7.0)으로 구성되고, 제2 시약은 글리신 200mM, 이염기히드라지늄 300mM, 콜레스테롤 탈수소효소 20U/mL 를 함유하는 용액 (pH 8.5)으로 구성된다. 또한, 대조로서 상기 제2 시약의 글리신 대신에, TAPS 을 이용한 글리신 무함유의 VLDL 콜레스테롤 측정 시약도 조제했다.
글리신을 이용한 VLDL 콜레스테롤 측정 시약의 안정성은 글리신을 함유하지 않은 VLDL 콜레스테롤 측정 시약보다 양호했다.
이상 설명한 바와 같이 글리신계 화합물을 이용함으로써 콜레스테롤 탈수소효소가 안정화한 시약의 공급이 가능해지고, 사용성이 현저하게 향상되며, 임상 검사의 분야에 공헌할 수 있다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물에 의하여 콜레스테롤 탈수소효소를 안정화시키는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 탈수소효소 안정화 방법:
    R - (NH - CH2 - CO)n - NH - CH2 - COOH (1)
    (식 중 R 은 수소, 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기 또는 치환기를 가져도 되는 카르보닐기를 나타내고, n 은 0 또는 2를 나타낸다.)
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 글리신계 화합물이 글리신, 글리실글리신 및 트리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 탈수소효소 안정화 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    배당체, 콜산 및 아데노신-인산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 탈수소효소 안정화 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 글리신계 화합물의 농도가 10∼2000mM 인 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 탈수소효소 안정화 방법.
  5. 하기 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물 및 콜레스테롤 탈수소효소를 함유하는 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물:
    R - (NH - CH2 - CO)n - NH - CH2 - COOH (1)
    (식 중 R 은 수소, 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기 또는 치환기를 가져도 되는 카르보닐기를 나타내고, n 은 0 또는 2를 나타낸다.)
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 글리신계 화합물이 글리신, 글리실글리신 및 트리신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물.
  7. 제 5항에 있어서,
    배당체, 콜산 및 아데노신-인산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 탈수소효소 함유 조성물.
  8. 하기 화학식 (1)로 나타내는 글리신계 화합물, 콜레스테롤 탈수소효소 및 보효소를 함유하는 콜레스테롤 측정 시약:
    R - (NH - CH2 - CO)n - NH - CH2 - COOH (1)
    (식 중 R 은 수소, 치환기를 가져도 되는 알킬기, 치환기를 가져도 되는 페닐기 또는 치환기를 가져도 되는 카르보닐기를 나타내고, n 은 0 또는 2를 나타낸다.)
  9. 상기 콜레스테롤 측정 시약이 제1 시약 및 제2 시약으로 이루어진 총 콜레스테롤 측정 시약으로서,
    상기 제1 시약은 상기 보효소, 콜레스테롤 유리 효소 및 반응 촉진제로 구성되고, 상기 제2 시약은 상기 글리신계 화합물 및 상기 콜레스테롤 탈수소효소로 구성된 제8항에 따른 콜레스테롤 측정 시약인 것을 특징으로 하는 총 콜레스테롤 측정 시약.
  10. 상기 콜레스테롤 측정 시약이 제1 시약 및 제2 시약으로 이루어진 유리 콜레스테롤 측정 시약으로서,
    상기 제1 시약은 상기 보효소 및 반응 촉진제로 구성되고, 상기 제2 시약은 상기 글리신계 화합물 및 상기 콜레스테롤 탈수소효소로 구성된 제8항에 따른 콜레스테롤 측정 시약인 것을 특징으로 하는 유리 콜레스테롤 측정 시약.
  11. 상기 콜레스테롤 측정 시약이 제1 시약 및 제2 시약으로 이루어진 리포단백질 콜레스테롤 측정 시약으로서,
    상기 제1 시약은 반응 제어 물질 및 상기 보효소로 구성되고, 상기 제2 시약은 상기 글리신계 화합물, 상기 콜레스테롤 탈수소효소 및 콜레스테롤 유리 효소로 구성된 제8항에 따른 콜레스테롤 측정 시약인 것을 특징으로 하는 리포단백질 콜레스테롤 측정 시약.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 반응 제어 물질이 칼릭스아렌, 폴리에틸렌글리콜, 인텅스텐산, 덱스트란 황산 및 헤파린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 리포단백질 콜레스테롤 측정 시약.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 반응 제어 물질이 칼릭스아렌인 것을 특징으로 하는 리포단백질 콜레스테롤 측정 시약.
  14. 제 11항에 있어서,
    상기 제2 시약에 함유되는 상기 글리신계 화합물의 농도가 10∼2000mM 인 것을 특징으로 하는 리포단백질 콜레스테롤 측정 시약.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 리포단백질 콜레스테롤 측정 시약이 고밀도 리포단백질(HDL) 콜레스테롤 측정 시약, 저밀도 리포단백질(LDL) 콜레스테롤 측정 시약 또는 초저밀도 리포단백질(VLDL) 콜레스테롤 측정 시약인 것을 특징으로 하는 리포단백질 콜레스테롤 측정 시약.
  16. HDL 콜레스테롤 측정 방법은,
    시료와 제11항의 제1 시약을 혼합하고, HDL 이외의 리포단백질과 반응 제어 물질의 혼합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 혼합물에 제11항의 제2 시약을 첨가하여 HDL 콜레스테롤을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 HDL 콜레스테롤 측정 방법.
  17. LDL 콜레스테롤 측정 방법은,
    시료와 제11항의 제1 시약을 혼합하고, LDL 과 반응 제어 물질의 복합체를 형성시키는 단계;
    LDL 이외의 리포단백질 콜레스테롤을 소거하는 단계; 및
    제11항의 제2 시약을 첨가하여 LDL 콜레스테롤을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 LDL 콜레스테롤 측정 방법.
  18. VLDL 콜레스테롤 측정 방법은,
    시료와 제11항의 제1 시약을 혼합하고, VLDL 과 반응 제어 물질의 복합체를 형성시키는 단계;
    LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 소거하는 단계; 및
    제11항의 제2 시약을 첨가하여 VLDL 콜레스테롤을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 LDL 콜레스테롤 측정 방법.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4746926B2 (ja) * 2005-06-29 2011-08-10 シスメックス株式会社 グルコース−６−リン酸脱水素酵素含有試薬及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素安定化方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2315501C3 (de) * 1973-03-28 1980-02-21 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
JPS61108400A (ja) * 1984-10-31 1986-05-27 Amano Pharmaceut Co Ltd コレステロ−ルの定量法
JPS60156386A (ja) * 1984-12-05 1985-08-16 Toyobo Co Ltd 安定化されたグリセロリン酸オキシダ−ゼ組成物
JP2936340B2 (ja) * 1990-06-08 1999-08-23 大塚薬品工業株式会社 酵素水溶液の安定化
JP2994831B2 (ja) * 1991-12-27 1999-12-27 国際試薬株式会社 コレステロールの定量法および定量用試薬
JPH06284886A (ja) * 1993-04-01 1994-10-11 Amano Pharmaceut Co Ltd 酵素の溶液中での安定化方法
JP3696267B2 (ja) * 1994-02-28 2005-09-14 天野エンザイム株式会社 生理活性蛋白質の安定化方法
JPH1033196A (ja) * 1996-07-23 1998-02-10 Unitika Ltd 試験片
EP0931164B1 (en) * 1996-07-24 2003-03-26 Helena Laboratories Corporation Cholesterol separation and fluorescent analysis
EP0821239A3 (en) * 1996-07-25 1998-06-17 Wako Pure Chemical Industries, Ltd Method for measuring an amount of LDL-cholesterol
US5998216A (en) * 1996-10-01 1999-12-07 Beth Israel Deaconess Medical Center Stabilizing formulation for preserving the integrity of proteins present in a body fluid sampled ex-vivo for evaluation as a specimen
US6114134A (en) * 1997-06-25 2000-09-05 International Reagents Corporation Method for assaying biological specimens for substances contained in the components thereof and reagent to be used in this method
CN1200113C (zh) * 1998-09-18 2005-05-04 协和梅迪克斯株式会社 脂蛋白中胆固醇的分别定量法和定量用试剂
DK1197564T3 (da) * 1999-06-21 2006-10-02 Daiichi Pure Chemicals Co Ltd Metode til forbehandling af en pröve til kvantificering af cholesterol og metode til kvantificering af cholesterol i specifikke lipoproteiner ved anvendelse af samme
US6379940B2 (en) * 2000-03-21 2002-04-30 Usb Corporation Stable composition comprising a nuclease and a phosphatase
JP4130724B2 (ja) * 2000-04-27 2008-08-06 シスメックス株式会社 キレート物質を含む測定試薬
US6986998B2 (en) * 2000-06-07 2006-01-17 International Reagents Corporation Method of analyzing components in biological samples
JPWO2004035817A1 (ja) * 2002-10-16 2006-02-16 協和メデックス株式会社 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬

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