JP2005176834A - コレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素酵素含有組成物及びコレステロール測定試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 コレステロール脱水素酵素に下記化学式(1)に示すグリシン系化合物を用いることによりコレステロール脱水素酵素の安定性を向上させる。
R−(NH−CH2−CO)n−NH−CH2−COOH (1)
(式中Rは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、nは0〜2を示す。)
Description
ところで、臨床検査の分野では最近、脂質の検査が増え、特にコレステロールは成人病である動脈硬化症のリスクファクターとして重要であり、コレステロールの検査が多くなっている。コレステロールを測定する方法は、現在酵素を用いる方法が一般的であり、それにはコレステロールオキシダーゼを用いた方法とともに、コレステロール脱水素酵素を用いた方法が知られている(特許文献1)。前者の方法においては、酵素反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色基質と反応させてキノン系色素に導く工程が必要であり、操作が煩雑である。また、測定試料中に含まれるビリルビン、アスコルビン酸などによって誤差を生じるという欠点がある。それに対して、後者の方法は、NAD(P)の存在下、コレステロールとコレステロール脱水素酵素との酵素反応により生成するNAD(P)Hの量を測定するもので、生成したNAD(P)Hの吸光度を測定するだけで測定が行えるので簡便であり、かつ試料中の夾雑物の影響も少ないという利点を有する。
例えば、クリスタリンを用いた生理活性タンパク質の安定化方法(特許文献2)、配糖体を用いたコレステロール脱水素酵素の安定化方法(特許文献3)、キレート剤を用いた生理活性物質の安定化方法(特許文献4)等が提案されている。
R−(NH−CH2−CO)n−NH−CH2−COOH (1)
(式中Rは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、nは0〜2を示す。)である。
また、本発明の第二の観点は上記化学式(1)に示すグリシン系化合物及びコレステロール脱水素酵素を含有するコレステロール脱水素酵素含有組成物に関する。
さらに、本発明の第三の観点は上記化学式(1)に示すグリシン系化合物、コレステロール脱水素酵素及び補酵素を含有するコレステロール測定試薬に関する。
R−(NH−CH2−CO)n−NH−CH2−COOH (1)
(式中Rは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、nは0〜2を示す。)
R−(NH−CH2−CO)n−NH−CH2−COOH (1)
(式中Rは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、nは0〜2を示す。)
ここで、Rは置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基、置換基を有しても良いカルボニル基、アルキル基としてはメチル基、エチル基などをあげることができ、フェ二ル基としてはヒドロキシフェニル基などを挙げることができる。また、置換基としてはヒドロキシメチル基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ニトロ基、メトキシ基、チオール基などをあげることができる。化学式(1)に示すグリシン系化合物を2種類以上組み合わせてもよい。また、化学式(1)に示すグリシン系化合物として、グリシン、グリシルグリシン、トリシンを好適に挙げることができる。また、これらのグリシン系化合物は緩衝作用を有しており緩衝剤の役割を合わせて発揮させても良い。
0.7U/mLコレステロール脱水素酵素、0.5Mの表1に示す化合物及び2mg/mLコール酸ナトリウムを含有する負荷液(pH8.8)を調製し、37℃で3日間放置後、以下に示す方法によりコレステロール脱水素酵素の残存活性を求めた。試料調製直後の酵素活性を100%として保存後の残存活性量を相対値で表した結果を表1に示す。表1に示すようにグリシン、グリシルグリシンまたはトリシンのようにグリシン系化合物の添加により、酵素の安定化が図られることが明らかとなった。
以下の組成の試薬を調製した。
試薬A:
コレステロール 1mg/mL
Triton X−100 20mg/mL
試薬B:
β−NAD 3mg/mL
トリス緩衝液(pH8.5) 0.3M
希釈液:
コール酸ナトリウム 3mg/mL
リン酸緩衝液(pH7.0) 20mM
負荷液を希釈液で10倍に希釈したものを試料液とした。200μLの試薬Aに試料液10μLを混和し、25℃で5分間恒温する。恒温した混合液に100μLの試薬Bを添加し、25℃340nmにおける1分間あたりの吸光度変化量を求めた。同様に試料液の代わりに希釈液を10μL添加し試薬ブランクを求めた。
表2に示す化合物について濃度の検討を行った。各化合物の濃度を0.1〜0.5Mに変化させた以外は実施例1と同様に行った。その結果を表2に示す。表2に示すように0.1〜0.5Mの範囲において十分な安定化効果が確認された。
グリシルグリシンとグリシンの併用によるコレステロール脱水素酵素の安定化の検討を行った。
2U/mLコレステロール脱水素酵素、14mMドデシルマルトース、0.5Mグリシルグリシンおよび各濃度のグリシンを添加して負荷液を調製し(pH8.8)、37℃で所定期間保存した後のコレステロール脱水素酵素の残存率を検討した。また、コレステロール脱水素酵素の残存活性は実施例1に示す方法で行った。
負荷液調製直後の酵素活性を100%として保存後の残存活性量を相対値で表した結果を表3に示す。表3に示すようにグリシンを添加することによりさらに安定化効果が向上することが明らかとなった。
配糖体であるドデシルマルトース、アデノシン一リン酸(AMP)の併用によるコレステロール脱水素酵素の安定化の検討を行った。
2U/mLコレステロール脱水素酵素、0.5Mグリシルグリシンおよび0.5Mグリシンに種々の濃度ドデシルマルトースおよびAMPを添加した負荷液を調製し(pH8.8)、37℃で所定期間保存した後のコレステロール脱水素酵素の残存率を検討した。
試料調製直後の酵素活性を100%として保存後の残存活性量を相対値で表した結果を表4に示す。表4に示すようにドデシルマルトース、AMPを添加することによりさらに安定化効果が向上することが明らかとなった。
総コレステロール測定試薬の安定性
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いた総コレステロール測定試薬を以下に示す。総コレステロール測定試薬の第一試薬はPIPES 25mM、二塩化ヒドラジニウム 100mM、ノニオンA−10R 0.5%、トライトンX−100 0.5%、コール酸ナトリウム 2mM、β−NAD 5mM、コレステロールエステラーゼ 5U/mLを含む溶液(pH7.0)、第二試薬はグリシン 200mM、コール酸ナトリウム 5mM、コレステロール脱水素酵素 14U/mLを含む溶液(pH8.5)から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにTAPSを用いたグリシンを含有しない総コレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いた総コレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しない総コレステロール測定試薬より良好であった。
HDLコレステロール測定試薬の安定性
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いたHDLコレステロール測定試薬を以下に示す。HDLコレステロール測定試薬の第一試薬はHEPES 50mM、二塩化ヒドラジニウム 80mM、硫酸カリクス(8)アレン 2mM、β−NAD 5.0mM、 コレステロール酸化酵素 0.5U/mlを含む溶液(pH6.5)、試薬二試薬はグリシン 200mM、コレステロール脱水素酵素 20U/ml、コレステロールエステラーゼ 6U/mlを含む溶液(pH8.5)から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにTAPSを用いたグリシンを含有しないHDLコレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いたHDLコレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しないHDLコレステロール測定試薬より良好であった。
LDLコレステロール測定試薬の安定性の確認
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いたLDLコレステロール測定試薬を以下に示す。LDLコレステロール測定試薬の第一試薬はHEPES 50mM、硫酸カリクス(6)アレン 1.2 mM、コール酸ナトリウム 2mM、コレステロールオキシダーゼ 0.5 U/ml、β−NAD 5mM、コレステロールエステラーゼ 1 U/mlを含む溶液(pH7.0)、第二試薬はグリシン 200mM、二塩化ヒドラジニウム 300 mM、コレステロール脱水素酵素 20U/mlを含む溶液(pH8.5)から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにTAPSを用いたグリシンを含有しないLDLコレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いたLDLコレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しないLDLコレステロール測定試薬より良好であった。
VLDLコレステロール測定試薬の安定性の確認
コレステロール脱水素酵素の安定化剤としてグリシンを用いたVLDLコレステロール測定試薬を以下に示す。VLDLコレステロール測定試薬の第一試薬はHEPES 50mM、硫酸カリクス(6)アレン 10mM、コール酸ナトリウム 2mM、コレステロールオキシダーゼ 0.5 U/ml、β−NAD 5mM、コレステロールエステラーゼ 1 U/mlを含む溶液(pH7.0)、第二試薬はグリシン 200mM、二塩化ヒドラジニウム 300 mM、コレステロール脱水素酵素 20U/mlを含む溶液(pH8.5)から構成される。また、対照として上記第二試薬のグリシンの代わりにTAPSを用いたグリシンを含有しないVLDLコレステロール測定試薬も調製した。
グリシンを用いたVLDLコレステロール測定試薬の安定性はグリシンを含有しないVLDLコレステロール測定試薬より良好であった。
Claims (18)
- コレステロール脱水素酵素に下記化学式(1)に示すグリシン系化合物を添加することを特徴とするコレステロール脱水素酵素安定化方法。
R−(NH−CH2−CO)n−NH−CH2−COOH (1)
(式中Rは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、nは0〜2を示す。) - 前記グリシン系化合物が、グリシン、グリシルグリシンおよびトリシンからなる群から選択される少なくとも一である請求項1に記載のコレステロール脱水素酵素安定化方法。
- 配糖体、コール酸及びアデノシン一リン酸からなる群から選択される少なくとも一を含有する請求項1または2に記載のコレステロール脱水素酵素安定化方法。
- 前記グリシン系化合物の濃度が10〜2000mMである請求項1〜3のいずれかに記載のコレステロール脱水素酵素安定化方法。
- 下記化学式(1)に示すグリシン系化合物及びコレステロール脱水素酵素を含有するコレステロール脱水素酵素含有組成物。
R−(NH−CH2−CO)n−NH−CH2−COOH (1)
(式中Rは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、nは0〜2を示す。) - 前記グリシン系化合物が、グリシン、グリシルグリシンおよびトリシンからなる群から選択される少なくとも一である請求項5に記載のコレステロール脱水素酵素含有組成物。
- 配糖体、コール酸及びアデノシン一リン酸からなる群から選択される少なくとも一を含有する請求項5または6に記載のコレステロール脱水素酵素含有組成物。
- 下記化学式(1)に示すグリシン系化合物、コレステロール脱水素酵素及び補酵素を含有するコレステロール測定試薬。
R−(NH−CH2−CO)n−NH−CH2−COOH (1)
(式中Rは水素、置換基を有しても良いアルキル基、置換基を有しても良いフェニル基または置換基を有しても良いカルボニル基を示し、nは0〜2を示す。) - 前記コレステロール測定試薬が、第一試薬及び第二試薬からなる総コレステロール測定試薬であり、
前記第一試薬は前記補酵素、コレステロール遊離酵素及び反応促進剤からなり、
前記第二試薬は前記グリシン系化合物、前記コレステロール脱水素酵素からなる請求項8に記載のコレステロール測定試薬。 - 前記コレステロール測定試薬が、第一試薬及び第二試薬からなる遊離コレステロール測定試薬であり、
前記第一試薬は前記補酵素及び反応促進剤からなり、
前記第二試薬は前記グリシン系化合物、前記コレステロール脱水素酵素からなる請求項8に記載のコレステロール測定試薬。 - 前記コレステロール測定試薬が、第一試薬及び第二試薬からなるリポタンパク質コレステロール測定試薬であって、
前記第一試薬は反応制御物質及び前記補酵素からなり、
前記第二試薬は前記グリシン系化合物、前記コレステロール脱水素酵素および、コレステロール遊離酵素からなる請求項8に記載のコレステロール測定試薬。 - 前記反応制御物質がカリクスアレン、ポリエチレングリコール、リンタングステン酸、デキストラン硫酸及びヘパリンからなる群から選択される少なくとも一である請求項11に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。
- 前記反応制御物質がカリクスアレンである請求項11または12に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。
- 前記第二試薬に含有される前記グリシン系化合物の濃度が10〜2000mMである請求項11〜13のいずれか1に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。
- 前記リポタンパク質コレステロール測定試薬が高密度リポタンパク質(HDL)コレステロール測定試薬、低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール測定試薬または超低密度リポタンパク質(VDLD)コレステロールである請求項11〜14のいずれか1に記載のリポタンパク質コレステロール測定試薬。
- 試料と請求項11の第一試薬とを混合し、HDL以外のリポ蛋白質と反応制御物質との複合体を形成させる工程および、前記混合物に請求項11の第二試薬を添加しHDLコレステロールを測定する工程からなるHDLコレステロールの測定方法。
- 試料と請求項11の第一試薬とを混合し、LDLと反応制御物質との複合体を形成させる工程、LDL以外のリポタンパク質コレステロールを消去する工程および、請求項11の第二試薬を添加しLDLコレステロールを測定する工程からなるLDLコレステロールの測定方法。
- 試料と請求項11の第一試薬とを混合し、VLDLと反応制御物質との複合体を形成させる工程、VLDL以外のリポタンパク質コレステロールを消去する工程および、請求項11の第二試薬を添加しVLDLコレステロールを測定する工程からなるVLDLコレステロールの測定方法。
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