【発明の詳細な説明】
コレステロール分離と蛍光分析
関連出願
この出願は、参照によりこの中に組み込まれた1996年7月24日に出願された米
国仮出願No.60/022,354の優先権を請求している。
発明の分野
本発明は、血清リポタンパク質中におけるコレステロール及びコレステロール
エステルの量を決定するための方法と試薬に関する。特に生化学物質及び化学物
質の分析と試験を行うことが必要である医療的及び実験的診断分野における特定
の用途を有する。
発明の背景
冠動脈心臓病に対するHDLコレステロールの関係が、“人血漿におけるタンパ
ク質−脂質の関係(Protein-lipid Relationships in Human Plasma)，Am.J.Med.
,11:480-493(1951)”と題する論文においてディー・ピー・バー（Ｄ.Ｐ．Ｂａｒ
ｒ）等によって、そして、“血漿−高密度−リポタンパク質濃度と虚血性心臓病
の発達(Plasma-High Density-Lipoproteins Concentration and Development of
Ischemic Heart Disease),”Lancet,1:16-19(1976)と題する論文においてジー・
ジェー・ミラー(G.J．Miller)とエヌ・イー・ミラー(N.E.Miller)によって、報
告された。"ＨＤＬコレステロール及び冠動脈心臓病における他の脂質−協同的
なリポタンパク質表現型研究(HDL Cholesterol and Other Lipids in Coronary
Heart Disease-The Cooperative Lipoprotein Phenotyping Study)"に報告され
たようなダブリュー・ピー・カステリー(W.P.Castelli)らの研究は、冠動脈心臓
病のリスクを決定する際に、正に実験室的試験としてHDLコレステロールを評価
することに注意を集中した1。リポタンパク質の複数の分画におけるコレステロ
ールの含有量は、
1冠動脈心臓病のリスクを決定する際に正に実験室的試験としてHDLコレステロ
ールを評価することを論じた他の研究には、ダブリュー・ビー・カネル(W.B.Kan
nel)ら"血清コレステロール、リポタンパク質及び冠動脈心臓病のリスク(Serum
Cholesterol，Lipoproteins，and the Risk of Coronary Heart Disease)"、
超遠心分離より、あるいは選択的に沈降させることにより、いくらかの媒体に電
気泳動させることによって決定されている2。
血清リポタンパク質を臨床的実験的に測定するのは、第一に冠動脈心臓病のリ
スクと血清リポタンパク質との間に予想される関連があるためである。全血清コ
レステロール、トリグリセリド、HDLコレステロール、LDLコレステロールを実験
的に測定する指針となる現行プラクティスは、ナショナル・コレステロール・エ
デュケーション・プログラム（NCEP）により召集された専門家委員会の推奨に由
来する。専門家委員会は、治療決定の分岐点(cutpoints)のための提案事項を発
展させる際に疫学的、臨床学的、介入研究を検討し、大人と子供に対する精密検
査の手順を推奨した。
NCEP委員会による臨床上の推奨事項では、臨床研究所に対して全HDL、LDL、コ
レステロール及びトリグリセロイドの測定を行うように指示した。トリグリセリ
ドは、アテロームを発生させると思われるキロミクロン、超低密度リポタンパク
質(VLDL)及び中間密度リポタンパク質(IDL)と最初に関係づけられるが、疫学の
研究における冠動脈心臓病のリスクとトリグリセリドの関係は曖昧である。その
コレステロール含有量に基づき、有効化したアテローム発生性のリポタンパク質
と
Ann.Inter.Med.７４(1)：1−12(1971)；ティー・ゴードン(T．Gordon)ら“(冠動
脈心臓病に対する防衛的因子としての高密度リポタンパク質(High Density Lipo
protein As a Protective Factor Aginst Coronary Heart Disease)”The Frami
ngham Study，Am．J．Med.，62:707−714(1977);andアール・エス・ガレン(R.S
．Galen)“ＨＤＬコレステロール、危険因子がどのように有効か(HDL Cholester
ol，How Good a Risk Factor)、Diag．Med．39-58，Nov/Dec(1979)がある。2
それぞれ、オー・エフ・デラーラ(O.F.Delalla),ら“血清リポタンパク質の超遠
心分離分析(Ultracentrifugal Analysis of Serum Lipoprotein)”Methods of B
iochemical Analysis，Vol.1．459−478(1954)、エム・バースティン(M.Burstein
)ら,“キロミクロンの沈殿及びラウリル硫酸ナトリウムを用いる人血清からの超
低密度リポタンパク質(Precipitation of chylomicrons and very low densityl
ipoproteins from human serum with sodium lauryl sulfate)”Life Science,1
1:177-184(1972)；及びエス・エー・コッブ(S.A．Cobb)ら“電気泳動によって分
離された血清リポタンパク質中のコレステロールの酵素的決定(Enzymic Determi
nation of Cholesterol in Serum Lipoproteins Separated by Electrophoresis
)”Clin．Chem.，24(7):1116-1120(1978)。
して、LDLは、NCEP臨床ガイドラインにおける治療決定のための主要な基本とな
る3。LDLの主要なタンパク質成分は、以前免疫測定法によって測定されたアポタ
ンパク質Ｂ100(apoB)である。正確にLDLコレステロールを定量化しかつ参照方法
の基礎となる共通の研究方法は、ベータ定量化法と命名されるが、ベータはＬＤ
Ｌに対する電気泳動的用語を意図する。ベータ定量化技術は、超遠心分離と化学
的沈降4とを組み合わせる場合がある。ベータ定量化方法は、しばしば、リポタ
ンパク質リトル“ａ”（"Iipoprotein little ａ"）を意味するＬｐ(ａ)リポタ
ンパク質5を含む、いわゆるブロードカット“broad cut”ＬＤＬを与える。ナシ
ョナル・コレステロール・エデュケーション・プログラムのリポタンパク質測定
作業グループ(ＮＣＥＰ委員会)は、その"低密度リポタンパク質コレステロール
の測定の推奨"(NIH刊行物)中で、二者択一の方法がお決まりの診断上の用途では
必要であり、好ましくは、そのうちの１つの方法は、コレステロール定量化のた
めにLDLを直接分離するものであると結論を出した。そのような一つの直接方法
には、電気泳動がある。エル・エー・ルイス(L.A.Lewis)とジェージェーオプル
ト(J.J.Opplt),CRC Handbook of Electorophoresis,Vols.1 and 2,Boca Raton,C
RC press Inc.(1981)、に論評されている電気泳動法は、リポタンパク質の量的
及び質的な分析で長い使用の歴史を持つ。電気泳動法は、主要な複数のリポタン
パク質クラスを分離し定量することを可能とするだけではなく、加えて、異常な
又は
3ナショナル・コレステロール・エデュケーション・プログラム、成人の高血液
コレステロールの評価、治療及び検出上の治療専門家委員会の2番目の報告(成人
治療委員会II)、ＮＣＥＰ(1993)。4
米国健康及び人間サービス局“リピッド・リサーチ・クリニックス・プログラ
ム(Lipid Research Clinics Program)”研究所運用の方法、第2版、ＮＩＨ出版
物(１９８３)、及びジェー・ディー・ベルチャー(J.D.Belcher)ら、“低密度リ
ポタンパク質コレステロール濃度の測定(Measurment of low density lipoprote
in cholesterol concentration)”、リピッドとリポタンパク危険因子の臨床的
な研究測定のための方法、ワシントンＤ．Ｃ、ＡＡＣＣ出版物。5
ジー・ウターマン(G.Utermann),“リポタンパク質(ａ)の不思議(The mysteries
of lipoprotein(a))”Science,246:904-910(1989)，及びジェー・ロスカルゾ(J
.Loscalzo)，“リポタンパク質(a)、即ち、アテローム発生性疾患に対する特有
の危険因子(Lipoprotein(a):a unique risk factor for atherothrombotic dise
ase)”Arteriosclerosis 10:672-679(1990)。
変形パターンを検出する場合に役に立つ視覚的な表示を行う。アガロースは、明
瞭な背景と簡便性を提供するもので、全体のリポタンパク質を分離するために好
ましい媒体とされてきました6。初期の電気泳動法は、一般に、質量分析に対し
て役立つと考えられていたが、ジー・アール・ワーニック(G.R.Warnick)ら,"(リ
ポタンパク質の定量、即ち脂質研究臨床法と比較した電気泳動法(Lipoprotein q
uantification:An electrophretic method compared with the lipid research
clinics method),"Clin．Chem，28:2116-20(1982)による論文に報告された他の
方法と比較して正確さが乏しく系統的な偏りが大きいので、リポタンパク質の定
量化に対しては望ましくなかった。
発明の要旨
本発明は、電気泳動に続いてリポタンパク質中のコレステロール及びコレステ
ロールエステルを定量する際に使用するためのものである。本発明は、高密度リ
ポタンパク質(HDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、及び超低密度リポタンパク質
(VLDL)のコレステロール含有量を評価するために使用される。本発明の方法と試
薬は、電気泳動されたリポタンパク質バンドのコレステロール含有量を安価で、
迅速かつ効率的に蛍光分析を行うものである。本システムによる発明は、電気泳
動を使用して主要な複数のリポタンパク質クラスを分離する。最も遠い方向に移
動しているアルファバンドが、ＨＤＬに相当する。次のバンド、プレ・ベータは
、VLDLに相当し、そして最もゆっくり動いているベータバンドがおおむねLDLに
相
6アール・ピー・ノーブ(R.P．Nobe)，“アガロースゲル中の血漿リポタンパク質
の電気泳動的分離(Electrophoretic separation of plasma lipoproteins inaga
rose gel),”J．Lipid Res．9:693(1968);エフ・ティー・リンドグレン(F.T.Lin
dgren)ら,"基準として分析的な遠心分離を使用して、リポタンパク質を定量する
ための簡単にする方法(A comparison of simplified methods for lipoprotein
quantitation using the analytic ultracentrifuge as a standard),”lipids,
12:278(1997);ディー・コンロン(D.Conlon)ら,"最新アガロースゲル電気泳動に
よる高密度リポタンパク質コレステロール定量化決定(Quantitative determinai
tion of high-density lipoprotein cholesterol by agarose gel electrophore
sis updated),”Clin．Chem.，24:227(1979)；及びエヌ・エム・パパドポロス(N
.M.Papadopoulos),"最新アガロースゲル電気泳動による高リポタンパク質表現型
決定(Hyperlipoproteinemia fhenotype determination by agarose gel electro
phoresis updated),”Clin．Chem.，24:227-229(1978).
当する。もし、一つのバンドが、速いプレ・ベータ移動性を有し、アルファと起
点との間に現れたなら、それは、LDLに相当し、LDLバンドと定量化されるべきで
ある。このバンドは、すべての試験片には観察されないかもしれない。キロミク
ロンがもし現れたなら、起点に留まる。
電気泳動が完了したら、リポタンパク質バンドが本発明の酵素的試薬により発
光化されるので、このバンドのコレステロール含有量が蛍光濃度計により定量が
できる。試薬の活性成分、及び試薬のpHが7.5〜9.5の時の反応の方向を下記に示
す。*試薬の活性成分は、太文字で示す。
産出されたNADHの量は、サンプル中に最初から存在するコレステロール及びコ
レステロールエステルの量に直接的に比例する。それぞれの分画中の相対的なパ
ーセントコレステロールは、スキャニング濃度計を使用する蛍光モードで走査す
ることにより得られ、スキャニング濃度計は励起されたNADH分子からの放射を検
出する。
それゆえ、この発明は、電気泳動バンドの蛍光分析を行うためにリポタンパク
質を発光化する試薬を広く含み、前記試薬は、酵素的成分と酸化剤成分からなる
。
さらに、本発明は、電気泳動プレート上の高密度リポタンパク質(HDL)、低密
度リポタンパク質(LDL)、及び超低密度リポタンパク質(VLDL)中のコレステロー
ル含有量を蛍光分析するための方法を含み、この方法は、
（１）リポタンパク質を電気泳動的に分離すること、
（２）分離されたタンパク質を酵素的成分と酸化剤成分からなる試薬で発光化す
ること、
（３）発光化されたタンパク質を適切な波長で電磁波放射することによって励起
すること、
（４）励起されたタンパク質を蛍光分析能力を有する濃度計で走査することから
なる。
本発明の詳細な説明
いくつかの伝統的な電気泳動装置が、本発明を実施するために使用することが
できる。下記に述べる好ましい具体例を実施する際に、ヘレナ・ラボラトリーズ
・
の装置の使用法が、参照してここに組み込む米国特許明細書第4,810,348号と第
照してここで組み込む1997年５月１日付で出願した共に継続中で譲受人が同一の
出願番号・・・(代理人整理番号No.5043)に記載されている。本発明は、ヘレナ・ラ
ボラトリーズ・コーポレーションによって販売されているスキャニング電気泳
本発明の好ましい具体例において、アガロースゲルマトリックス又はプレート
を使用して新鮮な血清サンプルを電気泳動にかける。電気泳動法は、自然状態下
で行われる。アガロースに加えて、使用されるゲルには、グアニジン塩酸塩又は
塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、アジ化ナトリウム、その他防腐剤及び電
気泳動緩衝液、好ましくは、pH7.6〜9.6の範囲のEDTA／バルビタールナトリウム
を含む。好ましい具体例において、該バルビタールナトリウムは約8.6のpHを持
して、サンプルを12℃で40分間２２５ボルトで電気泳動する。他の分析器及びシ
ステムについては分析を最適化するために異なった条件を必要とする可能性があ
ると理解すべきである。
電気泳動工程の後、アガロースプレートは、約５分間空気乾燥させる。この空
気乾燥工程は、試薬を適用する前にゲル表面から余分な湿気を除くためである。
プレートはこの段階では完全に乾燥しない。次に、本発明の発光化剤即ち試薬を
適用する。
試薬の反応成分の濃度は、下記のとおりである。
コレステロールエステラーゼ(シュードモナス属Pseudomnae sp．)4.5U/mL*
コレステロールデヒドロゲナーゼ(ノカルジア属:Nocardia.sp) 0.9U/mL*
NAD 29mM
*U/mLは、再構成された試薬(以下で述べる)中のミリリットル当たりの単位を示
す。
NADは、ニコチン アミド アデニンジヌクレオチドで、酸化剤である。更に詳
しく述べると、NADは、プロトン受容体補酵素である。還元型においてはNADHは
、適切な波長で電磁波放射により励起された時に蛍光を発する。
使用する前は、試薬の活性成分は試薬の緩衝液と別に貯える。活性試薬を再構
成し、使用のために試薬を調製するために上掲した量の活性成分を不活性成分pH
範囲が7.5〜9.5のトリシン緩衝液885mMに溶解する。活性成分は活性成分のすべ
てが溶解されるまで、静かに攪拌しなければならない。再構築した試薬は、２−
６℃で約２‐４時間安定である。
一旦試薬を電気泳動プレートに適用すると、電気泳動プレートは約３分間30℃
でコレステロール及びコレステロールエステルと共にインキュベートする。イン
キュベーション期間後、電気泳動されたプレートは、54℃で３分間乾燥する。再
び、他の分析及びシステムについては、分析を最適化するため異なった条件が必
要とされる可能性があることを理解すべきである。その後、プレートを蛍光測定
する状態で走査する。蛍光パターンは、ヘレナ・ラボラトリーズ・コーポレーシ
が、蛍光分析能力を有する濃度計であれば、使用ことができる。分画は、、ニコ
チンアミド アデニン ジヌクレオチドの還元型NADHが存在するためにピーク励起
波長が356nmで蛍光を発する。
テスト結果
全コレステロール*が１２４〜２００mg/dLの範囲の５７人の患者の全員につ
３装置7により試験した。それら２３個の試験片は正常な全コレステロールを有
する速度の大きいpreベータを持っていた。下記のデータが得られた。
N=５７
範囲(X＋２SD)
HDL(％) 20.5〜49.7
VLDL(％) 0〜27.3
LDL＋preベータ(％) 36.6〜69.4
全コレステロールは、37℃で全コレステロール法を使用して試験した。
結果
を分離する。陽極に向かって最も遠くに移動するアルファバンドは、HDLに相当
する。次のバンド、プレ・ベータは、VLDLに相当し、最もゆっくり移動するベー
タバンドは、おおむねLDLに相当する。もし一つのバンドが、速いプレ・ベータ
の移動性でアルファと起点間に現れたなら、それはLDLに相当し、LDLの量に加え
られるべきである。このバンドは、すべての試験片に観測されないかもしれない
。キロミクロンが、もし存在すれば、起点に留まる。
計算結果
セント及びそれぞれのバンドに対する絶対的な値を自動的に計算し、プリントす
る。
限界
この方法は、複数のリポタンパク質クラスを分離し定量化することを意図する
。
7リポタンパク質コレステロール値は、年齢と性別によって変化し、異なる地理
学上の位置と人種の中に広範な変化が報告された。それゆえ、それぞれの研究は
、その特別の種族に対するそれ自身の予期された範囲を確立することが基本であ
る。
速いプレ・ベータ移動性を有し、アルファと起点との間に１つのバンドを表示す
る試験片に対して、このバンドは全LDL分画の一部として報告されるべきもので
ある。この結論を実証するために十分な臨床的な研究がなされていないので、こ
のバンドは、Lp(a)として報告されるべきではない。
このシステムは、バンド当たり感度が2mg/dLで、全コレステロールが400mg/dL
迄、又はバンド当たり少なくとも250mg/dL迄にリニアーである。このシステムの
リニアー性を超える患者のサンプルの定量は、食塩水で希釈し、再試験すべきで
ある。
結果の解釈
NCEPガイドラインについての治療上の決定は、まずLDLコレステロールレベル(
表1)を基にする。分類スキームで考えられるリスク因子には、年齢(45歳以上の
男性及び55歳以上の女性)、未熟CHD、禁煙、高血圧症及び糖尿病の家族暦がある
。治療は、LDLコレステロールが次の切断点以上,即ち、すべての患者が160mg/dL
以上であり２以上の危険因子が130mg/dL以上の値であるとき適当である。
HDLコレステロールは、35mg/dL以下で高危険性と考えられており、分類スキー
ムにおける危険因子の一つとしてカウントされる。60mg/dLを超えるHDLコレステ
ロール値は、防衛的なものと考えられ、危険因子の全数を一つ減らす。
治療決定切断点
全コレステロール
望ましい血中コレステロール ＜200mg/dL
ボーダライン高血中コレステロール 200〜239mg/dL
高血中コレステロール ≧240mg/dL
LDL−コレステロール
食餌治療 開始
レベル LDL目標値
CHDなし、かつ、２リスク因子未満* ≧160mg/dL ＜160mg/dL
CHDなし、かつ、２以上のリスク因子* ≧130mg/dL ＜130mg/dL
CHDあり ＞100mg/dL ≦100mg/dL
LDLコレステロール
医薬療法 開始
レベル LDL目標値
CHDなし、かつ、２リスク因子未満 ≧190mg/dL ＜16mg/dL
CHDなし、かつ、２以上のリスク因子 ≧160mg/dL ＜130mg/dL
CHDあり ≧130mg/dL ≦100mg/dL
HDL−コレステロール
低HDLコレステロール ＜３５mg/dL
保護すべきHDLコレステロール ＞６０mg/dL
トリグリセリド
望ましい値 ＜250mg/dL
ボーダライン値 250−500mg/dL
高い値 500−1000mg/dL
極めて高い値/膵炎 ＞1000mg/dL
性能特性精度操作範囲内
単一の患者サンプルを、一つのゲル上で全30回流した。この精度研究では、CV
sは５％以下であった。VLDLはこのサンプル中で観察されなかった。
N=30
操作の間
低、中間及び高LDLレベルを現す３人の異なる患者のサンプルを同様に試験し
たが、優れた再現性を示した。リニアー性と感度
加熱したコレステロールサンプルの順次希釈し、本発明の試薬と方法を使用し
て試験した。リニアー性についての研究によって、システムが全コレステロール
400mg/dLまで、あるいはバンド当たり少なくとも250mg/dLまではリニアー性があ
り、かつ、システムの感度はバンド当たり2.0mg/dLまでであることが示された。
比較研究
サンプルに対する全コレステロール範囲は、115mg/dL〜311mg/dLであった。すべ
ての患者のトリグリセリドレベルは500mg/dL以下であった。
ｎ＝２０
Y＝ R
HDL 0.804X+5.132 0.955
VLDL 1.361X＋2.335 0.932
LDL 1.166X−18.772 0.884
全バンド 0.779X＋7.170 0.968
究所試験に関する。
8日付について優先権出願が出願された。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 27/26 ３２５Ａ
(72)発明者 グアダーニョ フィリップ アンジェロ
アメリカ合衆国 テキサス州 77662 ヴ
ィドー コンコード 465
(72)発明者 ロビンソン スーザン シャ
アメリカ合衆国 テキサス州 77656 シ
ルスビー インウッド 126
(72)発明者 ミリカン ステイシー エロイズ
アメリカ合衆国 テキサス州 77706 ボ
ーモント サンミードウ 1033
(72)発明者 中里 時亜
埼玉県浦和市常磐９―21―19