JPH05176797A - コレステロールの定量法および定量用試薬 - Google Patents
コレステロールの定量法および定量用試薬Info
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- JPH05176797A JPH05176797A JP35904491A JP35904491A JPH05176797A JP H05176797 A JPH05176797 A JP H05176797A JP 35904491 A JP35904491 A JP 35904491A JP 35904491 A JP35904491 A JP 35904491A JP H05176797 A JPH05176797 A JP H05176797A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 広範囲のｐＨ領域にて適応可能で、酵素の可
逆的反応の起こりにくいコレステロールの定量法（特
に、終点測定法による方法）および当該方法に使用され
る試薬を提供すること。 【構成】 コレステロール脱水素酵素を用いてコレステ
ロールを定量する方法であって、コレステロール脱水素
酵素による反応を抱水ヒドラジン、その塩またはその誘
導体の存在下に行うコレステロールの定量法、および抱
水ヒドラジン、その塩またはその誘導体を含有する上記
方法に使用される試薬。 【効果】 広範囲のｐＨ領域において適応可能で、酵素
の可逆的反応の起こりにくいコレステロール定量法であ
り、終点測定法に特に有利に使用可能である。また、自
動分析機にも有利に使用可能である。さらに、広範囲の
ｐＨ域が設定できるため他の共役酵素反応系と組み合わ
せることも容易で実用上の応用性も高い。
逆的反応の起こりにくいコレステロールの定量法（特
に、終点測定法による方法）および当該方法に使用され
る試薬を提供すること。 【構成】 コレステロール脱水素酵素を用いてコレステ
ロールを定量する方法であって、コレステロール脱水素
酵素による反応を抱水ヒドラジン、その塩またはその誘
導体の存在下に行うコレステロールの定量法、および抱
水ヒドラジン、その塩またはその誘導体を含有する上記
方法に使用される試薬。 【効果】 広範囲のｐＨ領域において適応可能で、酵素
の可逆的反応の起こりにくいコレステロール定量法であ
り、終点測定法に特に有利に使用可能である。また、自
動分析機にも有利に使用可能である。さらに、広範囲の
ｐＨ域が設定できるため他の共役酵素反応系と組み合わ
せることも容易で実用上の応用性も高い。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、主として臨床検査の分
野での使用を目的とするコレステロールの定量法および
当該定量法を行う際に使用される定量用試薬に関する。
野での使用を目的とするコレステロールの定量法および
当該定量法を行う際に使用される定量用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
酵素を用いたコレステロールの定量法として遊離型また
は結合型コレステロールを測定するにあたり、コレステ
ロールオキシダーゼを単独またはコレステロールエステ
ラーゼとともに用いる方法がよく知られている。しか
し、コレステロールオキシダーゼを用いて生成した過酸
化水素をパーオキシダーゼ等により発色系に導く方法は
操作が煩雑である上に、ビリルビン、アスコルビン酸等
の還元性物質の影響を受けて測定誤差を生じ易く、更に
呈色の安定性が良くない等の問題点がある。
酵素を用いたコレステロールの定量法として遊離型また
は結合型コレステロールを測定するにあたり、コレステ
ロールオキシダーゼを単独またはコレステロールエステ
ラーゼとともに用いる方法がよく知られている。しか
し、コレステロールオキシダーゼを用いて生成した過酸
化水素をパーオキシダーゼ等により発色系に導く方法は
操作が煩雑である上に、ビリルビン、アスコルビン酸等
の還元性物質の影響を受けて測定誤差を生じ易く、更に
呈色の安定性が良くない等の問題点がある。
【０００３】臨床検査の分野では、いわゆる終点測定方
法（エンドポイント法ともいう、または、初速度測定法
（レイトアッセイ法ともいう）と称する動力学的測定法
のいずれかが用いられている。コレステロールオキシダ
ーゼを用いる方法には、このような動力学的測定法も知
られている（特公昭５８−１８０８０号公報）が、この
方法でも前述のような還元性物質の影響を受けるという
問題点は依然として未解決のままであった。
法（エンドポイント法ともいう、または、初速度測定法
（レイトアッセイ法ともいう）と称する動力学的測定法
のいずれかが用いられている。コレステロールオキシダ
ーゼを用いる方法には、このような動力学的測定法も知
られている（特公昭５８−１８０８０号公報）が、この
方法でも前述のような還元性物質の影響を受けるという
問題点は依然として未解決のままであった。
【０００４】一方、コレステロールオキシダーゼではな
く、コレステロール脱水素酵素を用いるコレステロール
の定量法も報告されており、たとえばニコチンアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性コレステロールデヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤ−ＣＤＨ）またはニコチンアデニン
ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性コレステロー
ルデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ−ＣＤＨ）（特公平２−
１８０６４号公報）を用いるコレステロールの定量法の
報告がある（特公平２−４９７２０号公報）。この方法
は、操作が簡単で血中のビリルビン、アスコルビン酸等
の影響を受けない優れた方法であるが、反応にはｐＨ
８．６以上のアルカリ条件が要求されている。また、こ
の酵素を動力学的測定法に応用した報告もある（特開昭
６１−１０８４００号公報）。しかし、この方法は終点
測定法でないため、測定時に必ず標準液で検定しなけれ
ばならず、再現性も良くないという問題点がある。
く、コレステロール脱水素酵素を用いるコレステロール
の定量法も報告されており、たとえばニコチンアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性コレステロールデヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤ−ＣＤＨ）またはニコチンアデニン
ジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性コレステロー
ルデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ−ＣＤＨ）（特公平２−
１８０６４号公報）を用いるコレステロールの定量法の
報告がある（特公平２−４９７２０号公報）。この方法
は、操作が簡単で血中のビリルビン、アスコルビン酸等
の影響を受けない優れた方法であるが、反応にはｐＨ
８．６以上のアルカリ条件が要求されている。また、こ
の酵素を動力学的測定法に応用した報告もある（特開昭
６１−１０８４００号公報）。しかし、この方法は終点
測定法でないため、測定時に必ず標準液で検定しなけれ
ばならず、再現性も良くないという問題点がある。
【０００５】終点測定法は、コレステロールの定量法と
しては再現性に優れるため、従来動力学的測定法として
用いられたコレステロール脱水素酵素による方法は、終
点測定法に改良することが望まれる。しかしながら、こ
こで用いるコレステロール脱水素酵素の至適ｐＨは９．
０付近であるが、この付近のｐＨでは反応成分であるβ
−ＮＡＤ（Ｐ）+ が不安定となり徐々に着色するため、
コレステロールの定量用試薬としてこのままでは使用で
きない。また、β−ＮＡＤ（Ｐ）+ を安定化するために
ｐＨを低下させると当該酵素の可逆的反応に起因して高
濃度のコレステロールは反応が進行せず、そのため臨床
検査でのコレステロールの定量に支障をきたす。
しては再現性に優れるため、従来動力学的測定法として
用いられたコレステロール脱水素酵素による方法は、終
点測定法に改良することが望まれる。しかしながら、こ
こで用いるコレステロール脱水素酵素の至適ｐＨは９．
０付近であるが、この付近のｐＨでは反応成分であるβ
−ＮＡＤ（Ｐ）+ が不安定となり徐々に着色するため、
コレステロールの定量用試薬としてこのままでは使用で
きない。また、β−ＮＡＤ（Ｐ）+ を安定化するために
ｐＨを低下させると当該酵素の可逆的反応に起因して高
濃度のコレステロールは反応が進行せず、そのため臨床
検査でのコレステロールの定量に支障をきたす。
【０００６】本発明の目的は、広範囲のｐＨ領域におい
て適応可能で、酵素の可逆的反応の起こりにくいコレス
テロールの定量法およびこの定量法を実施するにあたっ
て使用される定量用試薬を提供することにある。特に、
本発明の目的は、終点測定法が有利に使用可能なコレス
テロールの定量法およびこの定量法を実施するにあたっ
て使用される定量用試薬を提供することにある。
て適応可能で、酵素の可逆的反応の起こりにくいコレス
テロールの定量法およびこの定量法を実施するにあたっ
て使用される定量用試薬を提供することにある。特に、
本発明の目的は、終点測定法が有利に使用可能なコレス
テロールの定量法およびこの定量法を実施するにあたっ
て使用される定量用試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段および作用】本発明者ら
は、上述の目的を達成するために鋭意研究を重ねてきた
ところ、下記の反応で示されるコレステロール脱水素酵
素の反応系（以下、反応式Ａという）に抱水ヒドラジ
ン、その塩、またはその誘導体を存在させることによ
り、コレステロール脱水素酵素の至適ｐＨ付近のアルカ
リ側から中性付近の広いｐＨ範囲においてコレステロー
ルの定量が可能になることを見い出し、さらに研究を重
ねて本発明に至った。
は、上述の目的を達成するために鋭意研究を重ねてきた
ところ、下記の反応で示されるコレステロール脱水素酵
素の反応系（以下、反応式Ａという）に抱水ヒドラジ
ン、その塩、またはその誘導体を存在させることによ
り、コレステロール脱水素酵素の至適ｐＨ付近のアルカ
リ側から中性付近の広いｐＨ範囲においてコレステロー
ルの定量が可能になることを見い出し、さらに研究を重
ねて本発明に至った。
【０００８】
【化１】
【０００９】本発明のコレステロールの定量用試薬は、
コレステロール脱水素酵素を用いてコレステロールを測
定する際に使用されるコレステロールの定量用試薬であ
って、抱水ヒドラジン、その塩またはその誘導体を含有
することを特徴とする。本発明のコレステロールの定量
法は、コレステロール脱水素酵素を用いてコレステロー
ルを定量する方法であって、コレステロール脱水素酵素
による反応を抱水ヒドラジン、その塩またはその誘導体
の存在下に行うことを特徴とする。
コレステロール脱水素酵素を用いてコレステロールを測
定する際に使用されるコレステロールの定量用試薬であ
って、抱水ヒドラジン、その塩またはその誘導体を含有
することを特徴とする。本発明のコレステロールの定量
法は、コレステロール脱水素酵素を用いてコレステロー
ルを定量する方法であって、コレステロール脱水素酵素
による反応を抱水ヒドラジン、その塩またはその誘導体
の存在下に行うことを特徴とする。
【００１０】本発明で使用されるコレステロール脱水素
酵素としては、ＮＡＤ−ＣＤＨとＮＡＤＰ−ＣＰＨがあ
り、コレステロール脱水素酵素による反応系は前記反応
式Ａで示した通りである。
酵素としては、ＮＡＤ−ＣＤＨとＮＡＤＰ−ＣＰＨがあ
り、コレステロール脱水素酵素による反応系は前記反応
式Ａで示した通りである。
【００１１】コレステロール脱水素酵素は可逆的反応を
呈し、反応がコレステノンの生成に進行してある程度進
むと平衡に達する。そのため、従来はコレステロール脱
水素酵素の至適ｐＨであるｐＨ９．０付近にして更に反
応の進行を促している。このような至適ｐＨにおいて
は、当該酵素量を最小量にできると共に、試薬とした場
合、原料に混入する他の酵素が起因するブランク値の上
昇を押さえることもできる。
呈し、反応がコレステノンの生成に進行してある程度進
むと平衡に達する。そのため、従来はコレステロール脱
水素酵素の至適ｐＨであるｐＨ９．０付近にして更に反
応の進行を促している。このような至適ｐＨにおいて
は、当該酵素量を最小量にできると共に、試薬とした場
合、原料に混入する他の酵素が起因するブランク値の上
昇を押さえることもできる。
【００１２】本発明は、抱水ヒドラジン、その塩または
その誘導体の存在下にコレステロール脱水素酵素を反応
させることにより、上記反応で生成されたΔ４−コレス
テノンのケトン基をブロックすることができるという新
知見に基づくものである。この結果コレステロールの測
定での逆反応を押さえることができ、広いｐＨ範囲でコ
レステロールの定量を可能とするものである。具体的に
は、本発明では反応液のｐＨは、ｐＨ１０．０を越える
アルカリ領域からｐＨ７．０以下の中性領域まで適応で
きる。
その誘導体の存在下にコレステロール脱水素酵素を反応
させることにより、上記反応で生成されたΔ４−コレス
テノンのケトン基をブロックすることができるという新
知見に基づくものである。この結果コレステロールの測
定での逆反応を押さえることができ、広いｐＨ範囲でコ
レステロールの定量を可能とするものである。具体的に
は、本発明では反応液のｐＨは、ｐＨ１０．０を越える
アルカリ領域からｐＨ７．０以下の中性領域まで適応で
きる。
【００１３】本発明に用いる抱水ヒドラジン、その塩お
よびその誘導体としては、Δ４−コレステノンのケトン
基をブロックすることができるものであれば、特に限定
はない。抱水ヒドラジン誘導体としては、ヒドラジルを
基本骨格基とする化合物が該当できる。これらの具体例
としては、ヒドラジン（１水和物）、二塩化ヒドラジニ
ウム、一臭化ヒドラジニウム、硫酸ヒドラジニウムが好
適であり、そのほか塩化フェニルヒドラジニウム、フェ
ニルヒドラジン−Ｐ−スルホン酸、硫酸フェニルヒドラ
ジニウム、ヒドラジンピリジン等を挙げることもでき
る。
よびその誘導体としては、Δ４−コレステノンのケトン
基をブロックすることができるものであれば、特に限定
はない。抱水ヒドラジン誘導体としては、ヒドラジルを
基本骨格基とする化合物が該当できる。これらの具体例
としては、ヒドラジン（１水和物）、二塩化ヒドラジニ
ウム、一臭化ヒドラジニウム、硫酸ヒドラジニウムが好
適であり、そのほか塩化フェニルヒドラジニウム、フェ
ニルヒドラジン−Ｐ−スルホン酸、硫酸フェニルヒドラ
ジニウム、ヒドラジンピリジン等を挙げることもでき
る。
【００１４】本発明のコレステロールの定量法によれ
ば、コレステロール脱水素酵素による反応を抱水ヒドラ
ジン、その塩またはその誘導体の存在下に行うことにな
る。ここで添加する抱水ヒドラジン、その塩、その誘導
体の量は、その種類、その組成、その他の条件によって
異なるが、通常は反応系における組成物全量に対して５
〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭである。
ば、コレステロール脱水素酵素による反応を抱水ヒドラ
ジン、その塩またはその誘導体の存在下に行うことにな
る。ここで添加する抱水ヒドラジン、その塩、その誘導
体の量は、その種類、その組成、その他の条件によって
異なるが、通常は反応系における組成物全量に対して５
〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭである。
【００１５】本発明の方法によるコレステロールの定量
法は臨床検査の分野では、遊離型または結合型コレステ
ロールのいずれの測定にも利用できる。即ち、遊離型コ
レステロールの測定では単独で、結合型コレステロール
の測定では公知のコレステロールエステラーゼの反応系
を組合わせることにより測定が行われる。
法は臨床検査の分野では、遊離型または結合型コレステ
ロールのいずれの測定にも利用できる。即ち、遊離型コ
レステロールの測定では単独で、結合型コレステロール
の測定では公知のコレステロールエステラーゼの反応系
を組合わせることにより測定が行われる。
【００１６】本発明の方法は動力学的方法および終点測
定法の両者に応用できるが、特に終点測定法として臨床
検査の分野で有用に用いることができる。通常、終点測
定法では、反応が短時間に終結することが必要である。
即ち、反応が長時間に渡って続くような場合は、検体に
よって反応時間が異なり自動分析装置のように短時間の
測定による方法では再現性も悪く、臨床検査では適用で
きない。ところが、本発明によれば反応は２分〜３分で
終了するため臨床検査に極めて好適である。
定法の両者に応用できるが、特に終点測定法として臨床
検査の分野で有用に用いることができる。通常、終点測
定法では、反応が短時間に終結することが必要である。
即ち、反応が長時間に渡って続くような場合は、検体に
よって反応時間が異なり自動分析装置のように短時間の
測定による方法では再現性も悪く、臨床検査では適用で
きない。ところが、本発明によれば反応は２分〜３分で
終了するため臨床検査に極めて好適である。
【００１７】本発明において、コレステロールの定量法
は、緩衝液、ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ
を検体（血清、コレステロール等）と混合して、一定時
間反応させ、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を測定する
ことによって行われる。本発明のコレステロールの定量
法における基本原理はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成反応であ
る。ここでは主波長が３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
吸光度の上昇を測定するため、吸光度の減少反応と比較
すると検量線の上限が高くとれるため、コレステロール
の測定範囲を広くとることができる。更にコレステロー
ルオキシダーゼ法のような還元性物質の影響を受けるこ
ともない。
は、緩衝液、ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ
を検体（血清、コレステロール等）と混合して、一定時
間反応させ、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を測定する
ことによって行われる。本発明のコレステロールの定量
法における基本原理はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成反応であ
る。ここでは主波長が３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
吸光度の上昇を測定するため、吸光度の減少反応と比較
すると検量線の上限が高くとれるため、コレステロール
の測定範囲を広くとることができる。更にコレステロー
ルオキシダーゼ法のような還元性物質の影響を受けるこ
ともない。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。実施例にお
いて使用した試薬は、以下に示したｐＨ１０．０、ｐＨ
８．０、ｐＨ７．３のものである。また、これら試薬に
おいては、抱水ヒドラジン等を添加したものと添加して
いないものを同時に作った。また、それぞれの反応性を
考慮して酵素、補酵素およびヒドラジンの量を定めた。
本発明はこれらに限定されるものではない。実施例にお
いて使用した試薬は、以下に示したｐＨ１０．０、ｐＨ
８．０、ｐＨ７．３のものである。また、これら試薬に
おいては、抱水ヒドラジン等を添加したものと添加して
いないものを同時に作った。また、それぞれの反応性を
考慮して酵素、補酵素およびヒドラジンの量を定めた。
【００１９】 試薬Ａ−１ コレステロールエステラーゼ ６単位／ｍｌ β−ＮＡＤ+ ６．５ｍＭ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ ヒドラジン ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ１０．０） ０．１Ｍ 試薬Ａ−２ コレステロール脱水素酵素 １０単位／ｍｌ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ トリス緩衝液（ｐＨ１０．０） ０．１Ｍ
【００２０】 試薬ａ−１ コレステロールエステラーゼ ６単位／ｍｌ β−ＮＡＤ+ ８．４ｍＭ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ トリス緩衝液（ｐＨ１０．０） ０．１Ｍ 試薬ａ−２ コレステロール脱水素酵素 ２５単位／ｍｌ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ トリス緩衝液（ｐＨ１０．０） ０．１Ｍ
【００２１】 試薬Ｂ−１ コレステロールエステラーゼ ６単位／ｍｌ β−ＮＡＤ+ ６．５ｍＭ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ ヒドラジン １５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１Ｍ 試薬Ｂ−２ コレステロール脱水素酵素 １５単位／ｍｌ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ トリス緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１Ｍ
【００２２】 試薬ｂ−１ コレステロールエステラーゼ ６単位／ｍｌ β−ＮＡＤ+ ８．４ｍＭ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ トリス緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１Ｍ 試薬ｂ−２ コレステロール脱水素酵素 ３０単位／ｍｌ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ トリス緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１Ｍ
【００２３】 試薬Ｃ−１ コレステロールエステラーゼ ６単位／ｍｌ β−ＮＡＤ+ ６．５ｍＭ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ ヒドラジン ２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．３） ０．１Ｍ 試薬Ｃ−２ コレステロール脱水素酵素 ２０単位／ｍｌ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．３） ０．１Ｍ
【００２４】 試薬ｃ−１ コレステロールエステラーゼ ６単位／ｍｌ β−ＮＡＤ+ ８．４ｍＭ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．３） ０．１Ｍ 試薬ｃ−２ コレステロール脱水素酵素 ３０単位／ｍｌ トリトンＸ−１００ ３ｇ／ｌ リン酸緩衡液（ｐＨ７．３） ０．１Ｍ
【００２５】実施例１ 本発明の方法の反応性を調べた。試薬ａ−１、ａ−２お
よび試薬Ｂ−１、Ｂ−２を用いて、あらかじめ分子吸光
係数の管理された日立７１５０自動分析機を使い、タイ
ムコースを確認した。その結果は図１に示した通りであ
る。しかして、試薬ａ−１、ａ−２および試薬Ｂ−１、
Ｂ−２とも反応は２〜３分で終了しているが、試薬ａ−
１、ａ−２は完全にコレステロールを消費しないうちに
反応が停止し、試薬Ｂ−１、Ｂ−２ではコレステロール
脱水素酵素の反応が平衡に達することもなくコレステロ
ールを消費していることがわかる。
よび試薬Ｂ−１、Ｂ−２を用いて、あらかじめ分子吸光
係数の管理された日立７１５０自動分析機を使い、タイ
ムコースを確認した。その結果は図１に示した通りであ
る。しかして、試薬ａ−１、ａ−２および試薬Ｂ−１、
Ｂ−２とも反応は２〜３分で終了しているが、試薬ａ−
１、ａ−２は完全にコレステロールを消費しないうちに
反応が停止し、試薬Ｂ−１、Ｂ−２ではコレステロール
脱水素酵素の反応が平衡に達することもなくコレステロ
ールを消費していることがわかる。
【００２６】実施例２ これらの試薬を用いて、日立７１５０形自動分析装置に
より以下の操作を行った。まず、検体として血清の希釈
系列それぞれ１０μｌに第１試薬２５０μｌを加えて３
７℃で５分間加温し、主波長３４０ｎｍ、副波長７００
ｎｍで吸光度を測定した。次に、第２試薬１００μｌを
加えて３７℃で５分間加温し、同じ波長で吸光度変化量
を測定した。同様に検体の代わりに精製水を用いて試薬
ブランクを測定した。更に４種類の検体について既知の
標準液の測定値をもとにして求める方法と、直接ＮＡＤ
Ｈの分子吸光係数（ε＝６．３cm2/m mole) から求める
方法で測定した。そして対照として市販のコレステロー
ル測定用試薬( 国際試薬（株）製品でコレステロールオ
キシダーゼを用いる方法）による測定値も求めた。これ
らの結果は図２〜図４および表１に示す。
より以下の操作を行った。まず、検体として血清の希釈
系列それぞれ１０μｌに第１試薬２５０μｌを加えて３
７℃で５分間加温し、主波長３４０ｎｍ、副波長７００
ｎｍで吸光度を測定した。次に、第２試薬１００μｌを
加えて３７℃で５分間加温し、同じ波長で吸光度変化量
を測定した。同様に検体の代わりに精製水を用いて試薬
ブランクを測定した。更に４種類の検体について既知の
標準液の測定値をもとにして求める方法と、直接ＮＡＤ
Ｈの分子吸光係数（ε＝６．３cm2/m mole) から求める
方法で測定した。そして対照として市販のコレステロー
ル測定用試薬( 国際試薬（株）製品でコレステロールオ
キシダーゼを用いる方法）による測定値も求めた。これ
らの結果は図２〜図４および表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】以上の結果、本発明の方法はヒドラジンを
添加しない従来の方法に比べ検体の希釈系列からみて直
線性が優れていることが判る。また検体の測定値からみ
ると、本発明の方法は標準液の測定値から求めた値と、
ＮＡＤＨの分子吸光係数から求めた値は一致し、しかも
市販の試薬ともよく一致した値が得られた。これに対し
て、ヒドラジンを添加しない従来の方法はＮＡＤＨの分
子吸光係数から求めた値が全般に低値を示し、終点測定
法での測定に問題があることが判る。更に本発明の方法
では、各ｐＨ間で直線性や測定値に有意な差がないこと
も判る。
添加しない従来の方法に比べ検体の希釈系列からみて直
線性が優れていることが判る。また検体の測定値からみ
ると、本発明の方法は標準液の測定値から求めた値と、
ＮＡＤＨの分子吸光係数から求めた値は一致し、しかも
市販の試薬ともよく一致した値が得られた。これに対し
て、ヒドラジンを添加しない従来の方法はＮＡＤＨの分
子吸光係数から求めた値が全般に低値を示し、終点測定
法での測定に問題があることが判る。更に本発明の方法
では、各ｐＨ間で直線性や測定値に有意な差がないこと
も判る。
【００２９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の方法は広
範囲のｐＨ領域において適応可能で、従って酵素の可逆
的反応の起こりにくいコレステロール定量法であり、終
点測定法としてもコレステロールの定量が可能であり、
自動分析機が普及している臨床検査の分野で、有用な方
法として供することができる。また広範囲のｐＨ域が設
定できるため他の共役酵素反応系と組み合わせることも
容易で実用上の応用性も高いという効果を有する。
範囲のｐＨ領域において適応可能で、従って酵素の可逆
的反応の起こりにくいコレステロール定量法であり、終
点測定法としてもコレステロールの定量が可能であり、
自動分析機が普及している臨床検査の分野で、有用な方
法として供することができる。また広範囲のｐＨ域が設
定できるため他の共役酵素反応系と組み合わせることも
容易で実用上の応用性も高いという効果を有する。
【図１】本発明の方法の反応性を示したグラフである。
【図２】本発明の方法と従来の方法（ｐＨ１０．０のと
き）の対比を示したグラフである。
き）の対比を示したグラフである。
【図３】本発明の方法と従来の方法（ｐＨ８．０のと
き）の対比を示したグラフである。
き）の対比を示したグラフである。
【図４】本発明の方法と従来の方法（ｐＨ７．３のと
き）の対比を示したグラフである。
き）の対比を示したグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年２月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】臨床検査の分野では、いわゆる終点測定方
法（エンドポイント法ともいう）または、初速度測定法
（レイトアッセイ法ともいう）と称する動力学的測定法
のいずれかが用いられている。コレステロールオキシダ
ーゼを用いる方法には、このような動力学的測定法も知
られている（特公昭５８−１８０８０号公報）が、この
方法でも前述のような還元性物質の影響を受けるという
問題点は依然として未解決のままであった。
法（エンドポイント法ともいう）または、初速度測定法
（レイトアッセイ法ともいう）と称する動力学的測定法
のいずれかが用いられている。コレステロールオキシダ
ーゼを用いる方法には、このような動力学的測定法も知
られている（特公昭５８−１８０８０号公報）が、この
方法でも前述のような還元性物質の影響を受けるという
問題点は依然として未解決のままであった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】本発明で使用されるコレステロール脱水素
酵素としては、ＮＡＤ−ＣＤＨとＮＡＤＰ−ＣＤＨがあ
り、コレステロール脱水素酵素による反応系は前記反応
式Ａで示した通りである。
酵素としては、ＮＡＤ−ＣＤＨとＮＡＤＰ−ＣＤＨがあ
り、コレステロール脱水素酵素による反応系は前記反応
式Ａで示した通りである。
Claims (4)
- 【請求項１】 コレステロール脱水素酵素を用いてコレ
ステロールを定量する方法であって、コレステロール脱
水素酵素による反応を抱水ヒドラジン、その塩またはそ
の誘導体の存在下に行うことを特徴とするコレステロー
ルの定量法。 - 【請求項２】 終点測定法による請求項１記載のコレス
テロールの定量法。 - 【請求項３】 抱水ヒドラジン、その塩またはその誘導
体を含有することを特徴とするコレステロール脱水素酵
素を用いてコレステロールを測定する際に使用されるコ
レステロールの定量用試薬。 - 【請求項４】 終点測定法に使用される請求項３記載の
コレステロールの定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3359044A JP2994831B2 (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | コレステロールの定量法および定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3359044A JP2994831B2 (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | コレステロールの定量法および定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176797A true JPH05176797A (ja) | 1993-07-20 |
| JP2994831B2 JP2994831B2 (ja) | 1999-12-27 |
Family
ID=18462454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3359044A Expired - Fee Related JP2994831B2 (ja) | 1991-12-27 | 1991-12-27 | コレステロールの定量法および定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2994831B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846754A (en) * | 1996-05-28 | 1998-12-08 | Bayer Corporation | Enzyme determination with protease inactivation |
| WO2001094619A1 (fr) | 2000-06-07 | 2001-12-13 | International Reagents Corporation | Methode d'analyse de composants dans des echantillons biologiques |
| JP2001346598A (ja) * | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Internatl Reagents Corp | Ｈｄｌ亜画分の分析方法 |
| JP2005176834A (ja) * | 2003-11-28 | 2005-07-07 | Sysmex Corp | コレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素酵素含有組成物及びコレステロール測定試薬 |
| US7208287B2 (en) * | 1999-03-01 | 2007-04-24 | Sysmex Corporation | Reagent set and method for detecting cholesterol in a high-density lipoprotein or low density lipoprotein |
-
1991
- 1991-12-27 JP JP3359044A patent/JP2994831B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846754A (en) * | 1996-05-28 | 1998-12-08 | Bayer Corporation | Enzyme determination with protease inactivation |
| US7208287B2 (en) * | 1999-03-01 | 2007-04-24 | Sysmex Corporation | Reagent set and method for detecting cholesterol in a high-density lipoprotein or low density lipoprotein |
| WO2001094619A1 (fr) | 2000-06-07 | 2001-12-13 | International Reagents Corporation | Methode d'analyse de composants dans des echantillons biologiques |
| JP2001346598A (ja) * | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Internatl Reagents Corp | Ｈｄｌ亜画分の分析方法 |
| JP4708531B2 (ja) * | 2000-06-07 | 2011-06-22 | シスメックス株式会社 | Ｈｄｌ亜画分中のコレステロールの測定法 |
| JP2005176834A (ja) * | 2003-11-28 | 2005-07-07 | Sysmex Corp | コレステロール脱水素酵素の安定化方法、コレステロール脱水素酵素含有組成物及びコレステロール測定試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2994831B2 (ja) | 1999-12-27 |
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