JPH04278098A - カンジダ症の検出方法及びキット - Google Patents
カンジダ症の検出方法及びキットInfo
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- JPH04278098A JPH04278098A JP6383291A JP6383291A JPH04278098A JP H04278098 A JPH04278098 A JP H04278098A JP 6383291 A JP6383291 A JP 6383291A JP 6383291 A JP6383291 A JP 6383291A JP H04278098 A JPH04278098 A JP H04278098A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素学的にカンジダ症
を簡便に検出する方法に関する。本発明はまた該方法に
用いる検出用キットに関する。
を簡便に検出する方法に関する。本発明はまた該方法に
用いる検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】カンジダ症はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ
）属の真菌により引起こされる感染症で、深在性真菌
症の中での頻度は最も高く、近年の増加は著しい。カン
ジダ症の検出方法としては、臨床試料より真菌を分離、
培養、同定する方法や、カンジダ抗原、抗カンジダ抗体
を検出する方法等がある。
）属の真菌により引起こされる感染症で、深在性真菌
症の中での頻度は最も高く、近年の増加は著しい。カン
ジダ症の検出方法としては、臨床試料より真菌を分離、
培養、同定する方法や、カンジダ抗原、抗カンジダ抗体
を検出する方法等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、臨床検査試料
より、被検菌を同定する方法は、長時間を要し、免疫学
的方法も操作が煩雑である。本発明の目的は、カンジダ
症を迅速かつ簡便に検出するための新規方法及びキット
を提供することにある。
より、被検菌を同定する方法は、長時間を要し、免疫学
的方法も操作が煩雑である。本発明の目的は、カンジダ
症を迅速かつ簡便に検出するための新規方法及びキット
を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はカンジダ症の検出方法に関し、カン
ジダ症の検出において、試料をグルコースオキシダーゼ
で処理し、次いでＮＡＤ（Ｐ）＋ の存在下でアルドヘ
キソースデヒドロゲナーゼ処理し、生成するＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ量を正常値と比較測定することを特徴とする。また
本発明の第２の発明はカンジダ症の検出用キットに関し
、グルコースオキシダーゼ及びアルドヘキソースデヒド
ロゲナーゼを含有することを特徴とする。
発明の第１の発明はカンジダ症の検出方法に関し、カン
ジダ症の検出において、試料をグルコースオキシダーゼ
で処理し、次いでＮＡＤ（Ｐ）＋ の存在下でアルドヘ
キソースデヒドロゲナーゼ処理し、生成するＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ量を正常値と比較測定することを特徴とする。また
本発明の第２の発明はカンジダ症の検出用キットに関し
、グルコースオキシダーゼ及びアルドヘキソースデヒド
ロゲナーゼを含有することを特徴とする。
【０００５】本発明によれば、カンジダ症の被検試料を
２種の酵素により処理することにより簡便にカンジダ症
を検出することができる。すなわち、該試料を第１の酵
素のグルコースオキシダーゼで処理し、次いでＮＡＤ（
Ｐ）＋ の存在下で第２の酵素のアルドヘキソースデヒ
ドロゲナーゼを作用させることにより、カンジダ症の被
検試料において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ からＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の生成が認められ、この生成ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を正常値
と比較測定することにより、簡便かつ迅速にカンジダ症
を検出することができる。
２種の酵素により処理することにより簡便にカンジダ症
を検出することができる。すなわち、該試料を第１の酵
素のグルコースオキシダーゼで処理し、次いでＮＡＤ（
Ｐ）＋ の存在下で第２の酵素のアルドヘキソースデヒ
ドロゲナーゼを作用させることにより、カンジダ症の被
検試料において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ からＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の生成が認められ、この生成ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を正常値
と比較測定することにより、簡便かつ迅速にカンジダ症
を検出することができる。
【０００６】本発明において使用可能なカンジダ症検出
用の被検試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿
等が挙げられるが、この中でも尿は採取が最も簡便であ
り、以下尿を例とし説明する。
用の被検試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿
等が挙げられるが、この中でも尿は採取が最も簡便であ
り、以下尿を例とし説明する。
【０００７】本発明の酵素反応は緩衝液中で行うのがよ
く、例えば尿５０μｌに１００ｍＭリン酸カルシウム緩
衝液ｐＨ７．０を５００μｌ添加すれば良い。緩衝液と
してはトリス緩衝液、グリシン緩衝液等でも良く、ｐＨ
は６〜９、好ましくはｐＨ７〜８とするのが良い。最初
の酵素反応は、グルコースオキシダーゼを用いて行う。 グルコースオキシダーゼとしては〔ＥＣ１．１．３．４
〕に属する酵素なら何でも良いが、例えばアスペルギル
ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物の生産するグル
コースオキシダーゼを用いれば良い〔メソッズ イン
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ）、第ＩＸ巻、第８２頁（１９６６）
〕。グルコースオキシダーゼの添加量としては、例えば
尿５０μｌにに対し、５単位以上添加されていれば良い
が、反応を３７℃、５分以内で終了させる場合は、例え
ば１００単位添加すれば良い。
く、例えば尿５０μｌに１００ｍＭリン酸カルシウム緩
衝液ｐＨ７．０を５００μｌ添加すれば良い。緩衝液と
してはトリス緩衝液、グリシン緩衝液等でも良く、ｐＨ
は６〜９、好ましくはｐＨ７〜８とするのが良い。最初
の酵素反応は、グルコースオキシダーゼを用いて行う。 グルコースオキシダーゼとしては〔ＥＣ１．１．３．４
〕に属する酵素なら何でも良いが、例えばアスペルギル
ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物の生産するグル
コースオキシダーゼを用いれば良い〔メソッズ イン
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ ）、第ＩＸ巻、第８２頁（１９６６）
〕。グルコースオキシダーゼの添加量としては、例えば
尿５０μｌにに対し、５単位以上添加されていれば良い
が、反応を３７℃、５分以内で終了させる場合は、例え
ば１００単位添加すれば良い。
【０００８】第２の酵素反応はアルドヘキソースデヒド
ロゲナーゼを用いて行う。アルドヘキソースデヒドロゲ
ナーゼとしては〔ＥＣ１．１．１．１１９〕に属する酵
素であれば何でも良いが、例えばグルコノバクターセリ
ヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ
）の生産するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを用い
れば良い〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第２
４３巻、第８号、第１９３６〜１９４１頁（１９６８）
〕。アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの使用量として
は、例えば第１の酵素処理物に対して、１単位以上添加
されていれば良いが、第２の酵素反応を３７℃、５分以
内で終了させる場合は例えば３５単位添加すれば良い。 第２の酵素反応はＮＡＤ（Ｐ）＋ 存在下で行い、生成
するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を測定する。ＮＡＤ（Ｐ）＋ と
しては例えばＮＡＤＰ＋ を第２の酵素反応液に添加し
ておけば良い。
ロゲナーゼを用いて行う。アルドヘキソースデヒドロゲ
ナーゼとしては〔ＥＣ１．１．１．１１９〕に属する酵
素であれば何でも良いが、例えばグルコノバクターセリ
ヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ
）の生産するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを用い
れば良い〔ザ ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第２
４３巻、第８号、第１９３６〜１９４１頁（１９６８）
〕。アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの使用量として
は、例えば第１の酵素処理物に対して、１単位以上添加
されていれば良いが、第２の酵素反応を３７℃、５分以
内で終了させる場合は例えば３５単位添加すれば良い。 第２の酵素反応はＮＡＤ（Ｐ）＋ 存在下で行い、生成
するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を測定する。ＮＡＤ（Ｐ）＋ と
しては例えばＮＡＤＰ＋ を第２の酵素反応液に添加し
ておけば良い。
【０００９】本反応で生成する例えばＮＡＤＰＨの定量
には公知の方法を用いることができる。例えば、ＮＡＤ
ＰＨそのものの３４０ｎｍにおける吸光度から定量する
か、ＮＡＤＰＨにニトロブルーテトラゾリウムあるいは
ヨードニトロテトラゾリウムなどのテトラゾリウム塩（
酸化型）の存在下、ジアホラーゼ、メトキシフェナジン
メトサルフェート、フェナジンメトサルフェートなどを
作用させて生成するホルマザン色素の可視部の吸光度（
例えばニトロブルーテトラゾリウムを使用する場合は５
４０〜５８０ｎｍ）から定量するか、ＮＡＤＰＨに、Ｎ
ＡＤＰＨオキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素を
様々な方法で定量する方法等がある。過酸化水素の定量
方法としては、４−アミノアンチピリンとフェノール、
又は４−アミノアンチピリンとＴＯＯＳ（同仁化学研究
所製）、又はＡＢＴＳ（和光純薬社製）などの過酸化水
素の存在下パーオキシダーゼを作用させると色素を形成
する色素原とパーオキシダーゼを過酸化水素と共存させ
ることにより生成する色素を各々の色素の特異的吸収波
長の吸光度を測定することにより定量する方法、又は化
学発光を利用して定量する方法等がある。
には公知の方法を用いることができる。例えば、ＮＡＤ
ＰＨそのものの３４０ｎｍにおける吸光度から定量する
か、ＮＡＤＰＨにニトロブルーテトラゾリウムあるいは
ヨードニトロテトラゾリウムなどのテトラゾリウム塩（
酸化型）の存在下、ジアホラーゼ、メトキシフェナジン
メトサルフェート、フェナジンメトサルフェートなどを
作用させて生成するホルマザン色素の可視部の吸光度（
例えばニトロブルーテトラゾリウムを使用する場合は５
４０〜５８０ｎｍ）から定量するか、ＮＡＤＰＨに、Ｎ
ＡＤＰＨオキシダーゼを作用させて生じる過酸化水素を
様々な方法で定量する方法等がある。過酸化水素の定量
方法としては、４−アミノアンチピリンとフェノール、
又は４−アミノアンチピリンとＴＯＯＳ（同仁化学研究
所製）、又はＡＢＴＳ（和光純薬社製）などの過酸化水
素の存在下パーオキシダーゼを作用させると色素を形成
する色素原とパーオキシダーゼを過酸化水素と共存させ
ることにより生成する色素を各々の色素の特異的吸収波
長の吸光度を測定することにより定量する方法、又は化
学発光を利用して定量する方法等がある。
【００１０】本発明のキットに含有される試薬としては
グルコースオキシダーゼ、アルドヘキソースデヒドロゲ
ナーゼがある。この試薬は水溶液でも、凍結乾燥品でも
良い。また、ＮＡＤ（Ｐ）＋ を含有させても良く、こ
れらのキットを用いることにより容易に、簡便にカンジ
ダ症を検出することができる。
グルコースオキシダーゼ、アルドヘキソースデヒドロゲ
ナーゼがある。この試薬は水溶液でも、凍結乾燥品でも
良い。また、ＮＡＤ（Ｐ）＋ を含有させても良く、こ
れらのキットを用いることにより容易に、簡便にカンジ
ダ症を検出することができる。
【００１１】
【実施例】以下に本発明を実施例をもって説明するが、
本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものでは
ない。
本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものでは
ない。
【００１２】実施例１
健常人１４例及びカンジダ症患者１７例の尿試料各１０
０μｌに、２００Ｕ／ｍｌとなるようグルコースオキシ
ダーゼ（東洋紡社製）を溶解した１００ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１．０ｍｌ加え、３７℃で
１５分放置する。それぞれの反応液を５００μｌずつ２
本に分注し、一方（テスト側）に、７０Ｕ／ｍｌとなる
よう、前記ザ ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリーに記載の方法により調製した、グル
コノバクター セリヌス ＩＦＯ ３２６７株が
生産するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを、かつ１
ｍＭとなるようＮＡＤＰ＋ を溶解した１００ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を５００μｌ加え、他
方（ブランク側）には１ｍＭとなるようにＮＡＤＰ＋
を溶解した１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）を５００μｌ加え、３７℃で１０分間放置する。上
記反応液の３４０ｎｍの吸光度を測定し、テスト側とブ
ランク側の吸光度の差より、生成したＮＡＤＰＨ量を求
めると図１の様になった。すなわち図１は本発明の方法
により測定した、ＮＡＤＰＨの生成量のクレアニチン補
正値（縦軸、μｍｏｌ ／ｇ．Ｃｒ）をカンジダ症患者
、健常人別にプロットしたグラフである。図１に示す様
にカンジダ症患者においては、ＮＡＤＰＨの生成量が健
常人に比べ高値を示す。生成したＮＡＤＰＨ量は下記式
により求めた。
０μｌに、２００Ｕ／ｍｌとなるようグルコースオキシ
ダーゼ（東洋紡社製）を溶解した１００ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１．０ｍｌ加え、３７℃で
１５分放置する。それぞれの反応液を５００μｌずつ２
本に分注し、一方（テスト側）に、７０Ｕ／ｍｌとなる
よう、前記ザ ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリーに記載の方法により調製した、グル
コノバクター セリヌス ＩＦＯ ３２６７株が
生産するアルドヘキソースデヒドロゲナーゼを、かつ１
ｍＭとなるようＮＡＤＰ＋ を溶解した１００ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を５００μｌ加え、他
方（ブランク側）には１ｍＭとなるようにＮＡＤＰ＋
を溶解した１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）を５００μｌ加え、３７℃で１０分間放置する。上
記反応液の３４０ｎｍの吸光度を測定し、テスト側とブ
ランク側の吸光度の差より、生成したＮＡＤＰＨ量を求
めると図１の様になった。すなわち図１は本発明の方法
により測定した、ＮＡＤＰＨの生成量のクレアニチン補
正値（縦軸、μｍｏｌ ／ｇ．Ｃｒ）をカンジダ症患者
、健常人別にプロットしたグラフである。図１に示す様
にカンジダ症患者においては、ＮＡＤＰＨの生成量が健
常人に比べ高値を示す。生成したＮＡＤＰＨ量は下記式
により求めた。
【００１３】（テスト側吸光度−ブランク側吸光度）／
（６．２２×０．０５×１０−３）×１．０＝〔ＮＡＤ
ＰＨ〕（μｍｏｌ ）／リットル・尿 ６．２２ ：ＮＡＤＰＨのｍＭ分子吸光
係数１．０ ：反応液の総量（ｍｌ
）０．０５×１０−３：尿試料の量（リットル）
（６．２２×０．０５×１０−３）×１．０＝〔ＮＡＤ
ＰＨ〕（μｍｏｌ ）／リットル・尿 ６．２２ ：ＮＡＤＰＨのｍＭ分子吸光
係数１．０ ：反応液の総量（ｍｌ
）０．０５×１０−３：尿試料の量（リットル）
【００
１４】実施例２ カンジダ症の検出用キットの構成試薬として下記の試薬
を調製した。 〔第１試薬〕６６００Ｕの実施例１記載のリン酸カリウ
ムグルコースオキシダーゼを１００ｍｌの１００ｍＭ緩
衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの。 〔第２試薬〕１２００Ｕの実施例１記載のアルドヘキソ
ースデヒドロゲナーゼ、及び４０ｍｇのＮＡＤＰ＋ を
２０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解したもの。 自動分析装置日立７１５０を用い測定を行った。試料測
定時は同時に純水を２本試料と同様に測定する。全試料
測定後、下記の手順により、生成したＮＡＤＰＨ量を求
めた。なお日立７１５０は反応時間１０分の間にＰ１
〜Ｐ５０までの５０点において吸光度が測定できる。
１４】実施例２ カンジダ症の検出用キットの構成試薬として下記の試薬
を調製した。 〔第１試薬〕６６００Ｕの実施例１記載のリン酸カリウ
ムグルコースオキシダーゼを１００ｍｌの１００ｍＭ緩
衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの。 〔第２試薬〕１２００Ｕの実施例１記載のアルドヘキソ
ースデヒドロゲナーゼ、及び４０ｍｇのＮＡＤＰ＋ を
２０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解したもの。 自動分析装置日立７１５０を用い測定を行った。試料測
定時は同時に純水を２本試料と同様に測定する。全試料
測定後、下記の手順により、生成したＮＡＤＰＨ量を求
めた。なお日立７１５０は反応時間１０分の間にＰ１
〜Ｐ５０までの５０点において吸光度が測定できる。
【００１５】〔（ｓＰ５０−ｓＰ２４−〈ｂＰ５０−ｂ
Ｐ２４〉）／（６．２２×０．０１０）〕×０．４１０
＝〔ＮＡＤＰ＋ 〕μｍｏｌ ／ｍｌ．尿ｓＰ５０：試
料測定時のＰ５０の吸光度ｓＰ２４： 〃 〃
Ｐ２４ 〃ｂＰ５０：純水測定時のＰ５０
〃ｂＰ２４： 〃 〃 Ｐ２４
〃
Ｐ２４〉）／（６．２２×０．０１０）〕×０．４１０
＝〔ＮＡＤＰ＋ 〕μｍｏｌ ／ｍｌ．尿ｓＰ５０：試
料測定時のＰ５０の吸光度ｓＰ２４： 〃 〃
Ｐ２４ 〃ｂＰ５０：純水測定時のＰ５０
〃ｂＰ２４： 〃 〃 Ｐ２４
〃
【００１６】この方法により得た測定値は実施例１
により得られた測定値と同じ値であった。
により得られた測定値と同じ値であった。
【００１７】
【発明の効果】以上詳細に述べた様に、本発明によりカ
ンジダ症の酵素学的に簡便な検出方法及びカンジダ症検
出用キットが開発された。本発明によれば試料として尿
試料、分析装置として自動分析装置を使用でき、短時間
に大量の試料を低コストで処理することが可能となった
。
ンジダ症の酵素学的に簡便な検出方法及びカンジダ症検
出用キットが開発された。本発明によれば試料として尿
試料、分析装置として自動分析装置を使用でき、短時間
に大量の試料を低コストで処理することが可能となった
。
【図１】本発明の方法により測定した、ＮＡＤＰＨの生
成量のクレアチニン補正値（μｍｏｌ ／ｇ．Ｃｒ）を
カンジダ症患者、健常人別にプロットしたグラフである
。
成量のクレアチニン補正値（μｍｏｌ ／ｇ．Ｃｒ）を
カンジダ症患者、健常人別にプロットしたグラフである
。
Claims (2)
- 【請求項１】 カンジダ症の検出において、試料をグ
ルコースオキシダーゼで処理し、次いでＮＡＤ（Ｐ）＋
の存在下でアルドヘキソースデヒドロゲナーゼ処理し
、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を正常値と比較測定するこ
とを特徴とするカンジダ症の検出方法。 - 【請求項２】 カンジダ症の検出用キットであって、
グルコースオキシダーゼ及びアルドヘキソースデヒドロ
ゲナーゼを含有することを特徴とするカンジダ症検出用
キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6383291A JPH04278098A (ja) | 1991-03-06 | 1991-03-06 | カンジダ症の検出方法及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6383291A JPH04278098A (ja) | 1991-03-06 | 1991-03-06 | カンジダ症の検出方法及びキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04278098A true JPH04278098A (ja) | 1992-10-02 |
Family
ID=13240722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6383291A Pending JPH04278098A (ja) | 1991-03-06 | 1991-03-06 | カンジダ症の検出方法及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04278098A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002330765A (ja) * | 2001-05-08 | 2002-11-19 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | アルドヘキソースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体及び該形質転換体から得られる組換えアルドヘキソースデヒドロゲナーゼタンパク質 |
| EP1376133A1 (en) * | 2001-03-15 | 2004-01-02 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of screening prediabetic state and screening reagent |
-
1991
- 1991-03-06 JP JP6383291A patent/JPH04278098A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1376133A1 (en) * | 2001-03-15 | 2004-01-02 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of screening prediabetic state and screening reagent |
| EP1376133A4 (en) * | 2001-03-15 | 2006-04-19 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | SCREENING PROCEDURE FOR THE PRÄDIABETIS CONDITION AND SCREENING REAGENT |
| US7198905B2 (en) | 2001-03-15 | 2007-04-03 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of screening methods prediabetic state and screening reagent |
| JP2002330765A (ja) * | 2001-05-08 | 2002-11-19 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | アルドヘキソースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含有する形質転換体及び該形質転換体から得られる組換えアルドヘキソースデヒドロゲナーゼタンパク質 |
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