JPH02200200A - Ｎａｄｈの定量法及びそれを用いた胆汁酸の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＮＡＤＨの定量法及びそれを用いた胆汁酸の定
量法に関する。さらに詳細には、主として臨床検査の分
野で利用することを目的とするＮＡＤＨの定量法及びこ
の反応系を組合わせた胆汁酸の定量法に関する。

［従来の技術］ 従来、臨床検査の分野などでは、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨ間
の酸化還元反応を伴う反応を利用し、該酸化還元反応に
関与する被検物質（例えば、脱水素酵素やその基質等）
を測定する方法が汎用されている。そのような例として
は、乳酸脱水素酵素や胆汁酸の定量が挙げられる。前者
は、乳酸とＮＡＤ＋とを乳酸脱水素酵素の存在下に反応
させてピルビン酸とＮ　Ａ　Ｄ　Ｈを生成させ、生成し
たＮＡＤＨを定量することにより乳酸脱水素酵素の活性
を定量するものである。また後者は、３α−ヒドロキシ
ステロイド・デヒドロゲナーゼ（以下、３α−Ｈ５Ｄと
いう）の存在下にその基質である胆汁酸とＮＡＤ＋とを
反応させ、生成するＮＡＤＨをｎ１定することにより胆
汁酸を定量するものである。

さらに、臨床検査等においては、前記の酸化還元反応に
、−又は二以上の別の反応を共役させた組合せ系を形成
させ、最終的にＮＡＤＨｆｆｉとして、その別の反応に
関与する酵素や基質を測定することも多く行われている
。そのような代表的な例を示すと、酵素の例としてはＧ
ＯＴ、ＧＰＴの定量を、基質の例としてはグルコース（
血糖）の定量を挙げることができる。

このように、臨床検査の分野では、ＮＡＤＨの生成量を
定量することにより、目的の酵素や基質のｎ１定を行な
うことが広く用いられており、従来、ＮＡＤＨの定量に
は、次の２つの方法がよく知られている。

■波長３４０　ｎｍｌこおけるＮＡＤＨの吸光度を測定
する方法：この方法は、ＮＡＤ＋は波長３４０　ｎｎ＋
には吸収がなく、還元型のＮＡＤＨは吸収をもつため、
波長３４Ｏｎ１１の吸光度の変化を測定することにより
、ＮＡＤＨ量を定量するものである。

■ＮＡＤＨとテトラゾリウム塩化合物を共役反応させ、
生成するホルマザンを測定する方法：この方法は、ジア
ホラーゼの存在下にＮＡＤＨでテトラゾリウム塩化合物
を還元し、生成した色素ホルマザンを比色定量するもの
である。

なお、この他にも螢光を測定する方法もあるが、螢光光
度計は臨床検査の分野ではあまり普及していないので一
般的ではない。

また、本発明の定量法の一つの測定対象である胆汁酸（
３α−ヒドロキシ胆汁酸）は胆汁の主成分の一部で、脂
質の腸管からの吸収を促進させる作用を有する。胆汁酸
は、通常は閉鎖的な回路で循環し肝細胞で処理されてい
るため、血中濃度は極めて低いが、肝・胆道系の疾患時
には胆汁酸の取り込み、処理等に機能障害が生じて血中
濃度が上昇する。血中胆汁酸濃度は、肝・胆道疾患を特
異的且つ鋭敏に反映するので、肝・胆道疾患の診断に有
用である。

この胆汁酸の定量法としては、種々の方法が提案されて
いるが、例えば、３α−Ｈ８Ｄの存在下に胆汁酸とＮＡ
Ｄ＋とを反応させ、生成したＮＡＤＨにジアホラーゼの
存在下でテトラゾリウム塩を作用させ、生成したホルマ
ザン色素を定量する方法（特公昭５９−１３１９７号公
報）が知られている。

［発明が解決しようとする課題］ 前記のＮＡＤＨの定量法のうち、■の波長３４０　ｎｍ
ｌこおけるＮＡＤＨの吸光度をｎ１定する方法は簡便で
はあるが、ＮＡＤＨの分子吸光係数（６，２Ｘ１０３Ｍ
　　−ｃＩｌ　）が小さいので感度が低いという問題が
ある。特に胆汁酸の測定においては微量なレベルの測定
が要求されるため、この方法では高精度な測定はできな
い。

また、■のホルマザンを測定する方法は、上記■の方法
よりも高感度であるが、テトラゾリウム塩が試料（血清
）中の還元性物質の影響を受けて正の誤差を与える場合
があること；及び生成された色素であるホルマザンが水
に不溶なため、通常は界面活性剤で分散させるが、それ
でも時間の経過にともない、ＩＩ定装置のキュベツト（
セル）に該色素が吸着し、測定精度の低下をもたらすと
いう問題がある。このため、前記公報記載の生成ホルマ
ザンを測定する胆汁酸の定量法においても同様な問題が
生ずる。

本発明は、上記のような従来技術の欠点を解消するため
に創案されたもので、高感度、とりわけ胆汁酸の測定の
ように微量レベルの測定にも適用可能なＮＡＤＨの定量
法及びそれを用いた胆汁酸の定量法を提供することを目
的とする。

［課題を解決するための手段、作用コ 上記の目的を達成するためになされた本発明のＮＡＤＨ
の定量法は、試料中のＮＡＤＨと酸化型グルタチオンと
をグルタチオン・リダクターゼ（以下、ＧＲという）の
存在下に反応させてＮＡＤ＋と還元型グルタチオンを生
成させ、生成した還元型グルタチオンとジスルフィド型
チオール定量試薬とを反応させ、該反応により生成した
チオール化合物を測定することによりＮＡＤＨを定量す
るか（以下、グルタチオン共投法という）、又はＮＡＤ
ＨとＬ−シスチンとをシスチン・リダクターゼ（以下、
ＣＲという）の存在下に反応させてＮＡＤ＋とＬ−シス
テインを生成させ、生成したし一システィンとジスルフ
ィド型チオール定量試薬とを反応させ、該反応により生
成したチオール化合物を測定することによりＮＡＤＨを
定量するものである（以下、シスチン共投法という）。

また、本発明の胆汁酸の定量法は、胆汁酸とＮＡＤ＋と
を３α−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼの存
在下に反応させ、生成したＮＡＤＨを上記のグルタチオ
ン共投法又はシスチン共投法により定量するものである
。

上記のグルタチオン共投法又はシスチン共投法に使用さ
れるジスルフィド型チオール定量試薬としては、分子内
に電子吸引基（例えば、ニトロ基、カルボキシ基、シア
ノ基、環内窒素原子等）を有する芳香族ジスルフィド化
合物が挙げられ、より具体的には、５，５′−ジチオビ
ス（２−ニトロ安息香酸）（以下、ＤＴＮＢという）、
４．４−ジピリジルジスルフィド、２，２′−ジピリジ
ルジスルフィド等が例示される。これらのジスルフィド
型チオール定量試薬は、還元型グルタチオン又はＬ−シ
ステインにより化学量論的に還元され、チオール化合物
を生成する。該チオール化合物は、キノイド型又はチオ
ピリドン型に異性化し、紫外〜可視部に強い吸収を有す
るので、吸光度を測定することにより還元型グルタチオ
ン又はＬ−システインを定量することができる。上記の
ジスルフィド型チオール定量試薬のうち、特にＤＴＮＢ
を用いるのが好ましい。ＤＴＮＢは還元されて５−チオ
−２−ニトロ−安息香酸（以下、ＴＮＢという）を生成
し、該チオール化合物はキノイド型に異性化し、波長４
１２ｎｍ付近に強い吸収を有するため、臨床検査の分野
で血清などの試料を分析する際の測定波長の点から有利
である。

前記のグルタチオン共投法及びシスチン共投法はそれぞ
れ下記の反応式−１及び２で表される。

反応式−１ 上記反応式−１で示されるグルタチオン共投法は、酵素
ＧＲ（ＥＣ１，６，４，２）の存在下、ＮＡＤＨと酸化
型グルタチオンとが反応してＮＡＤ＋と還元型グルタチ
オンに変換される反応系に、さらにジスルフィド型チオ
ール定量試薬がチオール化合物に変換させる反応系を共
役させ、生成したチオール化合物を測定することにより
、ＮＡＤＨを定量するものである。本方法をより具体的
に説明すると、ＮＡＤＨを含有する試料液に、酸化型グ
ルタチオン、ＧＲ及びジスルフィド型チオール定量試薬
を含む緩衝液（ｐＨ５，５〜８程度、好ましくはｐＨ約
７）を添加し、室温ないし加温下で所定時間（５〜２０
分間程度、通常１０分間程度）反応させ、生成するチオ
ール化合物を測定することにより行われる。生成したチ
オール化合物の測定は適宜な方法で行なうことができる
が、該チオール化合物の特性波長（通常３００〜４５０
　ｒｖ）における吸光度を測定する方法が簡便で好まし
く、得られた吸光度より、分子吸光係数に基づき又は標
準試料を用いて予め作成した検量線に基づき、試料中の
ＮＡＤＨ量を算出することができる。

上記の方法において、試料中のＮＡＤＨ含量としては３
ｍＭ程度以下、好ましくは１．５ｍＭ程度以下に調整す
るのがよい。

緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液
等が例示される。緩衝液に含有される酸化型グルタチオ
ンの濃度としては０．３〜３．ＯｍＭ程度、好ましくは
１ｍＭ程度とされ、ジスルフィド型チオール定量試薬の
濃度としては０．　５〜５ｍＭ程度、好ましくは１ｍＭ
程度とされる。

またＧＲの濃度としては１〜２０単位／１！、好ましく
は１０単位／１！程度とされる。なお、還元型グルタチ
オン及び反応生成物であるチオール化合物の自動酸化を
防止するため、該緩衝液にはＥＤＴＡを添加するのが好
ましく、ＥＤＴＡの濃度としては１ｍＭ〜０．１Ｍ程度
とすればよい。また自動酸化の防止はＥＤＴＡとα、α
′−ジピリジルを共存させることによっても行なうこと
ができる。

前記反応式−２で示されるシスチン共投法は、酵素ＣＲ
（ＥＣ１，６，４，１）の存在下、ＮＡＤＨとＬ−シス
チンとが反応してＮＡＤ＋とＬ−システインとに変換さ
れる反応系に、さらにジスルフィド型チオール定量試薬
がチオール化合物に変換される反応系を共役させ、生成
したチオール化合物を測定することにより、ＮＡＤＨを
定量するものである。本方法をより具体的に説明すると
、ＮＡＤＨを含有する試料液に、Ｌ−シスチン、ＣＲ及
びジスルフィド型チオール定量試薬を含む緩衝液（ｐＨ
５，５〜８程度、好ましくはｐＨ約７）を添加し、室温
ないし加温下に所定時間（５〜２０分間程度、通常１０
分間程度）反応させ、生成するチオール化合物を測定す
ることにより行われる。生成した千オール化合物の測定
及びＮＡＤＨｆｆｉの算出は、上記グルタチオン共投法
と同様にして行なうことができる。

上記の方法において、試料中のＮＡＤＨ含量、緩衝液の
種類、Ｌ−シスチンの濃度、酵素ＣＲの濃度、ジスルフ
ィド型チオール定量試薬の濃度等は上記グルタチオン共
投法と略同様である。

本発明のＮＡＤＨの定量法は、高感度であると共に試料
中の還元性夾雑物質等の影響を受けないため、ＮＡＤＨ
の定量を介して酵素活性や基質量を定量する種々の方法
の何れにも適用することができる。

また、本発明の他の目的は、上記グルタチオン共投法又
はシスチン共投法を用いて、血清、尿、胆汁等に含有さ
れる胆汁酸の定量法を提供するもので、グルタチオン共
投法又はシスチン共投法は従来のＮＡＤＨの定量法の問
題点を解決した優れた方法であるので、胆汁酸のような
微量レベルの７１１１ｊ定に好適に用いられる。

上記の胆汁酸の定量法は下記の反応式−３で表される。

反応式−３ 又は 即ち、胆汁酸（３α−ヒドロキシ胆汁酸）はＮＡＤ＋と
共に３α−Ｈ３Ｄの作用で、３−ケト胆汁酸とＮＡＤＨ
に変換される。ここで生成されたＮＡＤＨを前記のグル
タチオン共投法又はシスチン共投法と組合わせて定量す
ることにより、胆汁酸の定量を行うことができる。本方
法の一例を、グルタチオン共投法を用いて吸光度測定に
より行なう例でより具体的に説明すると、胆汁酸を含有
する試料液に、酸化型グルタチオン、ジスルフィド型チ
オール定量試薬、ＧＲ及びＮＡＤ＋を含有する緩衝液（
Ｉ）（ｐＨ５，５〜８程度、好ましくはｐＨ約７）を添
加し、室温ないし加温下にて所定時間（約５〜１０分間
）放置した後、吸光度の測定を行なう（ブランク）。次
いで３α−Ｈ８Ｄを含有する緩衝液（Ｉ）（ｐａ５．５
〜８程度、好ましくはｐＨ約７）を添加して室温ないし
加温下に所定時間（５〜２０分間程度、通常１５分間程
度）反応させ、反応液の吸光度を測定する。得られた吸
光度からブランクの吸光度を差し引いた吸光度差を求め
、該吸光度差より分子吸光係数に基づいて又は標準試料
を用いて予め作成した検量線に基づいて、胆汁酸量を算
出することができる。

上記の緩衝液（１）としてはリン酸緩衝液、トリス緩衝
液等が用いられ、該緩衝液中のＮＡＤ＋の濃度は、試料
中の胆汁酸濃度に依存するが、１〜５ｍＭ程度、通常３
ｍＭ程度とされる。また該緩衝液中の酸化型グルタチオ
ン濃度、ジスルフィド型チオール定量試薬濃度及びＧＲ
濃度は、前記のグルタチオン共投法によるＮＡＤＨの定
量法における濃度と略同様である。なお、試料が血清等
の場合、試料中に含まれる乳酸脱水素酵素の影響を排除
するため、オキザミン酸塩（例えば、オキザミン酸カリ
ウム等）を添加するのが好ましく、該オキザミン酸塩は
５〜３０ｍＭ程度、好ましくは２０ｍＭ程度添加される
。

緩衝液（Ｉ）としてはリン酸緩衝液、トリス緩衝液等が
用いられ、該緩衝液中の３α−Ｈ５Ｄの濃度としては１
〜２０単位／１！程度、好ましくは１０単位／１！程度
とされる。

なお、緩衝液（１）及び（Ｉ）には、還元型グルタチオ
ン及びチオール化合物の自動酸化を防止するため、ＥＤ
ＴＡを添加するのが好ましい。

本発明の胆汁酸の定量法をシスチン共投法を用いて行な
うには、上記方法中のグルタチオン共投法を、前述のシ
スチン共投法に変更することにより、実質的に同様な方
法で行なうことができる。

［発明の効果及び作用］ 本発明のＮＡＤＨの定量法によれば、高感度であると共
に試料中の還元性物質の影響やキュベツト内への色素沈
着の影響を受けることな（ＮＡＤＨの定量ができるとい
う効果を奏する。即ち、本発明のグルタチオン共投法及
びシスチン共投法では、生成物であるチオール化合物の
分子吸光係数が大きいのみならず、１分子のＮＡＤＨよ
り２分子のチオール化合物が生成するので、測定感度を
上げることができる。例えば、前記ＴＮＢの分子吸光係
数は１３．６Ｘ　１０３　Ｍ　　−Ｃｍ　　であり、ま
た１分子のＮＡＤＨから２分子のＴＮＢが生成すること
から、ＮＡＤＨ（分子吸光係数：　６．２　Ｘ　１０３
Ｍ　’−ｃｍ−１）を波長３４０ｎ１１テ測定する従来
法に比べて約４．４倍（１３，８Ｘ１０３　Ｘ２　／６
．２　Ｘ１０３′、４．４倍）感度を上昇させることが
できる。また、本発明で用いるチオール−ジスルフィド
交換反応はＳＨ基の特異的な測定法であるため、従来の
ホルマザンを測定する方法のように他の還元性物質の影
響を受けることがない。さらに生成したチオール化合物
はホルマザンに比べて可溶性であるため、キュベツト（
セル）への吸着の問題もない。

また、本発明の胆汁酸の定量法は、上記の優れた効果を
有するグルタチオン共投法又はシスチン共投法を用いた
ものであり、胆汁酸のように微量レベルの被検物質でも
高精度で測定できるという効果を奏する。

［実施例］ 以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例Ｉ ＮＡＤＨ標準液を試料とし、ジスルフィド型チオール定
量試薬としてＤＴＮＢを用い、グルタチオン共投法によ
りＮＡＤＨの定量を行なった。

まず、各種濃度のＮＡＤＨ溶液０．１１ｆ（ＮＡＤＨを
安定化させるために０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
に溶解させた）を下記の組成からなる試薬（１）２．５
ｙｆと混和し、１０分間放置した後に波長４１５ｎｍの
吸光度を測定した。

試薬（１）：　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　２Ｎａ、１ｍＭ
酸化型グルタチオン、１ｍＭ　　ＤＴＮＢ及び１０単位
／νＩＧＲを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０ その結果を第１図に示す。第１図に示されるように少な
くともＮＡＤＨが１．５ｍＭまでは直線性が得られ、Ｎ
ＡＤＨ々（波長４１５ｎｍの吸光度測定により定量でき
ることが判明した。

実施例２ 試料として胆汁酸の一成分であるコール酸を用い、３α
−Ｈ５Ｄの存在下ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元し、生成し
たＮＡＤＨをＤＴＮＢを用いたグルタチオン共投法で定
量することによりコール酸の定量を行なった。

まず、各種濃度のコール酸ナトリウム溶液１００μｇに
下記の組成からなる試薬（２）２．Ｏｉｆを加え３７℃
で５分間加温後、波長４１５ｎＩ１１の吸光度（Ａ）を
測定した。次いで、下記の組成からなる試薬（３）０．
５ｉｆを加え３７℃で１５分間加温し、波長４１５ｒｖ
の吸光度（Ｂ）を測定し、吸光度差ＣＢ−Ａ）を求めた
。

試薬（２）：　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　２Ｎａ、１ｍＭ
酸化型グルタチオン、１ｍＭ　　ＤＴＮＢ、１０単位／
　ｘｉ　Ｇ　Ｒ及び３ｍＭ　　ＮＡＤ＋を含む０．１Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ７，０ 試薬（３）：　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　２Ｎａ及び１０
単位／１！３α−Ｈ５Ｄを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７，０ コール酸ナトリウム濃度に対して吸光度差（Ｂ−Ａ）を
プロットした図を第２図に示す。第２図に示されるよう
に少なくともコール酸ナトリウムが０．５ｍＭまでは直
線性が得られ、コール酸ナトリウム（即ち胆汁酸）が波
長４１５ｎｍの吸光度測定により定量できることが判明
した。

実施例３ 試料としてヒト血清（１０検体）を使用し、グルタチオ
ン共投法を用いた本発明の胆汁酸の定量法により胆汁酸
の定量を行なった。

まず、ヒト血清１００μｇに下記の組成からなる試薬（
４）２．Ｏｚｆを加え３７℃で５分間加温後、波長４１
５ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。次いで、実施例２で
用いた試薬（３）０．５ｙｆを加え３７℃で１５分間加
温し、波長４１５ｎｍの吸光度（Ｂ）を測定し、吸光度
差（Ｂ−Ａ）を求めた。そして胆汁酸濃度が既知の標準
液を試料に用いて同様に操作し、得られた検量線からこ
れらのヒト血清中の胆汁酸の値を求めた。

試薬（４）：実施例２で用いた試薬■に、試料であるヒ
ト血清中の乳酸脱水素酵素の影響を除くためオキザミン
酸カリウム２０ｍＭを添加したもの。

一方、対照として、従来法であるホルマザン法に基づい
て、これらのヒト血清中の胆汁酸量を求めた。そして、
両者の測定値を比較したところ、相関係数０，９３とな
りよく相関しており、本発明の方法により胆汁酸の定量
を行えることが明らかとなった。さらに、この際、本発
明の方法はホルマザン法に比べ、吸光度変化量が約１３
２６倍大きく、高感度であった。

実施例４ ＮＡＤＨ標準液を試料とし、ジスルフィド型チオール定
量試薬としてＤＴＮＢを用い、シスチン共投法によりＮ
ＡＤＨの定量を行なった。

まず、各種濃度のＮＡＤＨ溶液０．１ｙｆ（ＮＡＤＨを
安定化させるために０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
に溶解させた）を下記の組成からなる試薬（５）２．５
ｙｆと混和し、１０分間放置した後に波長４１５ｒｖの
吸光度を測定した。

試薬（５）：　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　２Ｎａ、１ｍＭ
Ｌ−シスチン、１ｍＭ　　ＤＴＮＢ及び１０単位／　ｘ
ｌ　ＣＲを含む０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０ その結果を第３図に示す。第３図に示されるように少な
くともＮＡＤＨが１．５ｍＭまでは直線性が得られ、Ｎ
ＡＤＨが波長４１５ｎｉの吸光度測定により定量できる
ことが判明した。

実施例５ 試料として胆汁酸の一成分であるコール酸を用い、３α
−Ｈ８Ｄの存在下ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元し、生成し
たＮＡＤＨをＤＴＮＢを用いたシスチン共投法で定量す
ることによりコール酸の定量を行なった。

まず、各種濃度のコール酸ナトリウム溶液１００μｇに
下記の組成からなる試薬（６）２．Ｏｚｊを加え３７℃
で５分間加温後、波長４１５ｒ＋ｍの吸光度（Ａ）を測
定した。次いで、下記の組成からなる試薬（７）０．５
ｉｆを加え３７℃で１５分間加温し、波長４１５ｎｍの
吸光度（Ｂ）を測定し、吸光度差（Ｂ−Ａ）を求めた。

試薬（６）：　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　２Ｎａ、１ｍＭ
Ｌ−’ｉミスチン１ｍＭ　　ＤＴＮＢ、１０単位／　１
１　ＣＲ及び３ｍＭ　　ＮＡＤ＋を含む０．１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ７，０ 試薬（７）　：　１　ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　２
　Ｎ　ａ及び１０単位／１！３α−Ｈ８Ｄを含む０，１
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０ コール酸ナトリウム濃度に対して吸光度差（Ｂ−Ａ）を
プロットした図を第４図に示す。第４図に示されるよう
に少なくともコール酸ナトリウムが０．５ｍＭまでは直
線性が得られ、コール酸ナトリウム（即ち胆汁酸）が波
長４１５ｎｉの吸光度測定により定量できることが判明
した。

実施例６ 試料としてヒト血清（１０検体）を使用し、シスチン共
投法を用いた本発明の胆汁酸の定量法により胆汁酸の定
量を行なった。

まず、ヒト血清１００μｇに下記の組成からなる試薬（
８）２．０１１１を加え３７℃で５分間加温後、波長４
１５ｎＩＩｌの吸光度（Ａ）を測定した。次いで、実施
例５で用いた試薬（７）０．５１１を加え３７℃で１５
分間加温し、波長４１５ｎ１１の吸光度（Ｂ）を測定し
、吸光度差（Ｂ−Ａ）を求めた。そして胆汁酸濃度が既
知の標準液を試料に用いて同様に操作し、得られた検量
線からこれらのヒト血清中の胆汁酸の値を求めた。

試薬（８）：実施例５で用いた試薬（６）に、試料であ
るヒト血清中の乳酸脱水素酵素の影響を除くためオキザ
ミン酸カリウム２０ｍＭを添加したもの。

一方、対照として、従来法であるホルマザン法に基づい
て、これらのヒト血清中の胆汁酸量を求めた。そして、
両者の測定値を比較したところ、相関係数０．９１とな
りよく相関しており、本発明の方法により胆汁酸の定量
を行えることが明らかとなった。また、実施例３と同様
に、本発明の方法はホルマザン法に比べて高感度であっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＮ　Ａ　Ｄ　Ｈｉ’ａ度と吸
光度との相関を示す図、 第２図は実施例２におけるコール酸ナトリウム濃度と吸
光度差との相関を示す図、 第３図は実施例４におけるＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ濃度と吸光度
との相関を示す図、及び 第４図は実施例５におけるコール酸ナトリウム濃度と吸
光度差との相関を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
   （以下、ＮＡＤＨという）と酸化型グルタチオンとをグ
   ルタチオン・リダクターゼの存在下に反応させるか、又
   はＮＡＤＨとＬ−シスチンとをシスチン・リダクターゼ
   の存在下に反応させて、それぞれ酸化型β−ニコチンア
   ミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＾＋という
   ）と還元型グルタチオン又はＮＡＤ＾＋とＬ−システイ
   ンを生成させ、生成した還元型グルタチオン又はＬ−シ
   ステインをそれぞれジスルフィド型チオール定量試薬と
   反応させ、該反応により生成したチオール化合物を測定
   することを特徴とするＮＡＤＨの定量法。 ２、ジスルフィド型チオール定量試薬が、５，５′−ジ
   チオビス（２−ニトロ安息香酸）である請求項１記載の
   ＮＡＤＨの定量法。 ３、胆汁酸とＮＡＤ＾＋とを３α−ヒドロキシステロイ
   ド・デヒドロゲナーゼの存在下に反応させ、生成したＮ
   ＡＤＨを請求項１又は請求項２記載の方法で定量するこ
   とを特徴とする胆汁酸の定量法。