JP2006064491A - 高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬及び方法。 - Google Patents

Abstract

【課題】
試料中のにごりの影響を受けずに正確な測定結果が得られるＨＤＬ−Ｃ測定試薬及びＨＤＬ−Ｃ測定方法を提供する。
【解決手段】
試料中の高密度リポタンパク質に含まれるコレステロールの測定に用いる試薬において、前記試料中の前記高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制する阻害剤と、無置換のシクロデキストリン、親水基を有するα−シクロデキストリン、及び親水基を有するβ−シクロデキストリンからなる群から選ばれる少なくとも一種のシクロデキストリンとを含有することを特徴とする、高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬を提供する。

Description

本発明は、臨床診断の分野において、試料に含まれる高密度リポタンパク質中のコレステロールを測定する試薬及び方法に関する。

リポタンパク質は、コレステロールなどの脂質とアポタンパク質との複合体の総称であり、血液などに含まれる。コレステロールは、主に脂肪酸とエステル結合したエステル型コレステロールとしてリポタンパク質中に存在する。リポタンパク質は比重の低いものから順にカイロミクロン（以下、ＣＭとする）、超低密度リポタンパク質（以下、ＶＬＤＬとする）、低密度リポタンパク質（以下、ＬＤＬとする）、高密度リポタンパク質（以下、ＨＤＬとする）などに分類されている。これらのうちＨＤＬは抗動脈硬化因子として注目されており、ＨＤＬ中コレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃとする）の測定は各種動脈硬化症を含む循環器系疾患の重要な臨床検査項目のひとつである。

試料中のＨＤＬなどの特定のリポタンパク質に含まれるコレステロールを測定する方法として、カリクスアレンを用いる方法が知られている（特許文献１）。該方法において、試料中のＨＤＬ以外のリポタンパク質はカリクスアレンと複合体を形成する。カリクスアレンとＨＤＬ以外のリポタンパク質との複合体は、コレステロールエステラーゼ（以下、ＣＥとする）による酵素反応を阻害され、ＨＤＬのみがコレステロールを測定する為の酵素反応系に導かれる。

生体から採取した血液などの試料は多くの成分からなる複雑な組成を持ち、各人で試料中のそれら成分の含有量が大幅に異なる。このため、試料によってはにごり（乳びともいう）を含むものがある。特許文献１記載のＨＤＬ測定方法で乳びを含む試料のコレステロールを測定すると、乳びの影響で正確に吸光度測定を行えないことがある。
ＷＯ９８／５９０６８号公報

本発明は、乳びの影響を受けずに正確な測定結果が得られるＨＤＬ−Ｃ測定試薬及びＨＤＬ−Ｃ測定方法を提供することを目的とする。

本発明は、試料中のＨＤＬ−Ｃの測定に用いる試薬において、試料中のＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制する阻害剤と、無置換のシクロデキストリン（以下、ＣＤとする）、親水基を有するα−シクロデキストリン（以下、αＣＤとする）、及び親水基を有するβ−シクロデキストリン（以下、βＣＤとする）からなる群から選ばれる少なくとも一種のＣＤとを含有することを特徴とする、ＨＤＬ−Ｃ測定試薬を提供する。
また、本発明は、試料中のＨＤＬ−Ｃを測定する方法において、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を阻害する阻害剤と、無置換のＣＤ、親水基を有するαＣＤ、及び親水基を有するβＣＤからなる群から選ばれる少なくとも一種のＣＤとを前記試料に添加する工程と、阻害剤及びＣＤの存在下でＨＤＬに含まれるコレステロールを遊離させる工程と、遊離したコレステロールを測定する工程とから成るＨＤＬ−Ｃ測定方法を提供する。

本発明によると、乳びの影響を受けずに正確な測定結果が得られるＨＤＬ−Ｃ測定試薬及びＨＤＬ−Ｃ測定方法が提供される。

以下、本発明の実施形態を説明する。

本実施形態における試料としては、血液、血漿、血清、尿、髄液、唾液、精液など、生体から採取した試料を例示できる。

本実施形態のＨＤＬ−Ｃ測定試薬は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制する阻害剤と、無置換のＣＤ、親水基を有するαＣＤ、及び親水基を有するβＣＤからなる群から選ばれる少なくとも一種のＣＤとを含有する。

ＨＤＬ−Ｃ測定においては、ＨＤＬからコレステロールを遊離させて後述するＵＶ法又は色素法によって測定する。このため、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を阻害する必要がある。

ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制する阻害剤としては、カリクスアレン、界面活性剤、ポリアニオン、水溶性ポリマー、抗体などが挙げられる。これらの阻害剤のうち一種又は二種以上を組み合わせて用いることができる。これらの阻害剤は試料中のＨＤＬ以外のリポタンパク質と複合体又は凝集体を形成する。複合体又は凝集体を形成すると、これらに含まれる物質（例えば、エステル型コレステロールなど）への酵素反応が妨げられるため、該複合体又は凝集体中のエステル型コレステロールからのコレステロールの遊離が抑制される。

カリクスアレンは、フェノールを基本骨格とし、フェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた環状オリゴマーである。
カリクスアレンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、カリクス（４）アレン、カリクス（６）アレン、カリクス（８）アレン、硫酸カリクス（４）アレン、硫酸カリクス（６）アレン、硫酸カリクス（８）アレン、酢酸カリクス（４）アレン、酢酸カリクス（６）アレン、酢酸カリクス（８）アレン、カルボキシカリクス（４）アレン、カルボキシカリクス（６）アレン、カルボキシカリクス（８）アレン、カリクス（４）アレンアミン、カリクス（６）アレンアミン、カリクス（８）アレンアミンなどが挙げられる。本実施形態においては、上記カリクスアレンから選ばれる一種又は二種以上を含む阻害剤を用いることができる。上述したカリクスアレンの中でも硫酸カリクスアレンが水溶性に優れ取り扱いが容易であるため、硫酸カリクスアレンを用いるのが好ましい。試薬と試料とを混合した液中のカリクスアレンの濃度は、０．０５〜２０ｍＭが好ましく、０．１〜５ｍＭがより好ましい。

界面活性剤は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。界面活性剤の中でもＨＬＢ値（Hydrophile-Lipophile Balance値：界面活性剤の親水性と疎水性の比率を示す値）が１６以上のものが好ましく、ＨＬＢ値が１７以上のものがより好ましい。具体的には、セチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ）、ラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５）、オレイルエーテル（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＯ−５０）、ベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＢ−３０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＫ―２３０）、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＳ−４０）、ポリオキシエチレンエーテル類（商品名：シグマ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９）などが挙げられる。本実施形態においては、上記界面活性剤から選ばれる一種又は二種以上を含む阻害剤を用いることができる。

ポリアニオンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンなどが挙げられる。本実施形態においては、上記ポリアニオンから選ばれる一種又は二種以上を含む阻害剤を用いることができる。これらの阻害剤は二価カチオンと共に用いられるのが好ましい。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。

水溶性ポリマーは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとする）などが挙げられる。本実施形態においては、上記水溶性ポリマーから選ばれる一種又は二種以上を含む阻害剤を用いることができる。これらの阻害剤は二価カチオンと共に用いることもできる。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。

抗体は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。抗体としてはポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく特に限定することはない。具体的には、抗アポリポタンパク抗体類（例えば、抗アポリポタンパクＢ抗体、抗アポリポタンパクＣ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体など）、抗リポタンパク抗体類（例えば、抗βリポタンパク抗体など）などが挙げられる。本実施形態においては、上記抗体から選ばれる一種又は二種以上を含む阻害剤を用いることができる。

ＨＤＬ−Ｃ測定においては、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と結合して複合体又は凝集体を形成する阻害剤が用いられる。このうち、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と凝集体を形成する阻害剤は、試料中のにごりを増加させることがあり、ＨＤＬ−Ｃの測定結果に好ましくない影響を与える可能性があるため、複合体を形成する阻害剤を用いるのが好ましい。このような阻害剤としては、例えばカリクスアレンが挙げられる。

また、本実施形態の試薬に、無置換のＣＤ、親水基を有するαＣＤ、及び親水基を有するβＣＤからなる群から選ばれる少なくとも一種のＣＤを添加することによって、乳びを含む試料についても正確にＨＤＬ−Ｃを測定することが可能となる。

ＣＤはグルコースを基本骨格とする環状オリゴ糖である。本実施形態には無置換のＣＤ、親水基を有するαＣＤ、及び親水基を有するβＣＤからなる群から選ばれる少なくとも一種のＣＤを用いることができる。親水基としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アミノ基、スルホ基などが挙げられる。またこのような親水基を有するアルキル基、例えばヒドロキシアルキル基、アルキル置換アミノアルキル基などを有するαＣＤ又はβＣＤを用いることができる。具体的には、αＣＤ、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン（以下、ＨＰαＣＤとする），ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシブチル−β−シクロデキストリン（以下、ＨＢβＣＤとする）、ジエチルアミノエチル−β−シクロデキストリンなどが挙げられる。本実施形態においては、上記ＣＤから選ばれる一種又は二種以上を用いることができる。試薬と試料とを混合した測定用試料中のＣＤの濃度（終濃度）は、０．０１〜２ｗ／ｖ％の範囲内で用いるのが好ましい。

本実施形態におけるＨＤＬ−Ｃ測定試薬は、リポタンパク質中のエステル型コレステロールに作用し、コレステロールと脂肪酸に分解する酵素をさらに含む。

上述の酵素として、具体的にはＣＥ、リパーゼ、リポプロテインリパーゼなどを用いることができる。これらの酵素はＰＥＧ等を結合させて化学修飾したもの又は化学修飾していないものの何れを用いてもよい。これらの酵素の由来は、微生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、これらの酵素は遺伝子操作によって得られたものであってもよい。

上述の酵素の作用によってＨＤＬから遊離したコレステロールを測定する方法としては、公知のＨＤＬ−Ｃ測定法の何れも用いることができる。例えば、ＵＶ法や色素法などによって測定することができる。

以下、ＵＶ法及び色素法について説明する。

先ずＵＶ法について説明する。
ＵＶ法とは、ＨＤＬから遊離したコレステロールを酸化型補酵素の存在下でコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＤＨとする）を作用させることによってコレステノンに分解し、同時に生ずる還元型補酵素の吸光度を測定する方法である。下記の化学反応式に示すように、ＣＤＨの作用によって生成するＨＤＬ−Ｃの物質量（モル）と、当該反応の際に生ずる還元型補酵素の物質量（モル）とは化学量論的に等しい為、還元型補酵素の濃度を測定することによってＨＤＬ−Ｃの濃度を求めることができる。

ＵＶ法で用いられるＣＤＨは、ＰＥＧ等を結合させて化学修飾した酵素又は化学修飾していない酵素の何れを用いてもよい。ＣＤＨの由来は、微生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、遺伝子操作によって得られたＣＤＨを用いてもよい。

酸化型補酵素としてはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、βＮＡＤとする）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ｔ−βＮＡＤとする）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、βＮＡＤＰとする）、及びＴｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ｔ−βＮＡＤＰとする）から選ばれる一種又は二種を用いることができる。
ＨＤＬ−Ｃが存在するとＣＤＨの作用で酸化型補酵素はそれぞれの還元型、即ちβＮＡＤＨ，ｔ−βＮＡＤＨ，βＮＡＤＰＨ，ｔ−βＮＡＤＰＨに変換される。βＮＡＤＨ及び／又はβＮＡＤＰＨは３４０ｎｍの吸光度で測定され、ｔ−βＮＡＤＨ及び／又はｔ−βＮＡＤＰＨは４０５ｎｍの吸光度で測定される。

ＵＶ法によるＨＤＬ−Ｃ測定においては、ＣＤＨを安定化させるＣＤＨ安定化物質として、グリシン系化合物、コール酸、配糖体、アデノシン一リン酸（以下、ＡＭＰとする）、クリスタリン、キレート剤及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる一種又は二種以上のＣＤＨ安定化物質を試薬に含有させてもよい。

上述のグリシン系化合物は下記化学式（１）で示される。
Ｒ−（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯ）_ｎ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ （１）
（式中Ｒは水素又は／及び置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、又は置換基を有してもよいカルボニル基を示し、ｎは０又は１を示す）
ここで、Ｒは置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、置換基を有してもよいカルボニル基、アルキル基としてはメチル基、エチル基などを挙げることができ、フェニル基としてはヒドロキシフェニル基などを挙げることができる。また、置換基としてはヒドロキシメチル基、水酸基、アミノ基、カルボニル基、ニトロ基、メトキシ基、チオール基などを挙げることができる。試薬にグリシン系化合物を添加する場合、上記のうちの一種又は二種以上が選択される。また、上記化学式（１）に示すグリシン系化合物として、グリシン、グリシルグリシン、トリシンを用いるのが好ましい。試薬中のグリシン系化合物の濃度は０．０１〜２Ｍが好ましく、より好ましくは０．１〜１．５Ｍである。

コール酸又はその誘導体としては、例えばコール酸の塩類（例えば、ナトリウム塩など）、デオキシコール酸又はその塩類（例えば、ナトリウム塩など）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ）などが挙げられる。

配糖体又はその誘導体としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドなどが挙げられる。

ＡＭＰ又はその誘導体としては、例えば、ＡＭＰ又はその塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）などが挙げられる。

クリスタリン又はその誘導体としては、例えば、α−クリスタリン、β−クリスタリン、γ−クリスタリン、δ−クリスタリンなどが挙げられる。

キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ハイドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、ハイドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＰＯ）、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）などが挙げられる。

次に色素法について説明する。
色素法においては、先ず遊離したＨＤＬ−Ｃをコレステロールオキシダーゼ（以下、ＣＯＤとする）の作用によってコレステノンに分解する。この際同時に生ずる過酸化水素と色原体とからペルオキシダーゼ（以下、ＰＯとする）の作用によってキノン系色素が生成される。生成したキノン系色素の発色を５００ｎｍ以上（色原体の種類に依存する）の吸光度で測定して過酸化水素の濃度を求め、これをＨＤＬ−Ｃの濃度に換算する。

ＣＯＤ及びＰＯはＰＥＧ等を結合させて化学修飾したもの又は化学修飾していないものの何れを用いてもよい。これらの酵素の由来は、微生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、これらの酵素は遺伝子操作によって得られたものであってもよい。

色原体としては過酸化水素と反応して呈色するものであれば何れも用いることができる。例えば、４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡとする）等のカップラとデベロッパ（カップラと酸化縮合して色素を生ずる物質）との組み合わせが用いられる。例えば４−ＡＡとフェノール系化合物，ナフトール系化合物又はアニリン系化合物との組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組合せなどや、例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。デベロッパとしてのフェノール系化合物の具体例としては、例えばフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１ −ナフトール−２−カルボン酸等が挙げられ、また、アニリン系化合物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニル−エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）などが挙げられる。カップラとデベロッパとの組合せを用いる場合、カップラの使用量は、用いるカップラの種類や組み合わせるデベロッパの種類などにより異なるため一概には言えないが、ＨＤＬ−Ｃ測定時の反応液中の濃度として、通常０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭであり、カップラとして４−ＡＡを使用する場合の使用量は、ＨＤＬ−Ｃ測定時の反応液中の濃度として、通常０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．１〜５ｍＭである。また、デベロッパの使用量は、用いるデベロッパの種類や組み合わせるカップラの種類等により異なるため一概には言えないが、ＨＤＬ−Ｃ測定時の反応液中の濃度として、通常０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．１〜５ｍＭである。トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例としては、例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、１０−〔３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノカルボニル〕−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンなどが挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラアミノベンジジンなどが挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチルアミノフェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾールなどが挙げられる。これら色原体の使用量は、通常この分野で用いられる濃度である。

ＨＤＬ−Ｃを測定する為の反応系は第一反応及び第二反応の、二段階の反応系とするのが好ましい。本実施形態では、第一反応に用いる試薬を第一試薬とし、第二反応に用いる試薬を第二試薬とする。

ＵＶ法を用いてＨＤＬ−Ｃ測定を行う場合、第一試薬には、阻害剤、ＣＤ、及び補酵素を含有させ、第二試薬には、エステル型コレステロールを分解する酵素及びＣＤＨを含有させる。なお、第一試薬に含まれる補酵素を、第二試薬に含有させてもよい。また、第二試薬に含まれるＣＤＨを、第一試薬に含有させてもよい。
なお、ＣＤＨを第一試薬に含有させる場合、前述のＣＤＨ安定化物質を第一試薬に含有させてもよい。また、ＣＤＨを第二試薬に含有させる場合、前述のＣＤＨ安定化物質を第二試薬に含有させてもよい。

色素法を用いてＨＤＬ−Ｃ測定を行う場合、第一試薬には、阻害剤及びＣＤを含有させ、第二試薬には、エステル型コレステロールを分解する酵素、ＣＯＤ、ＰＯ、及び色原体を含有させる。なお、第二試薬に含まれるＣＯＤ、ＰＯ、又は／及び色原体を第一試薬に含有させてもよい。

第一試薬にはさらに緩衝剤が含まれる。第一試薬に含まれる緩衝剤は特に限定されないが、ｐＨを弱酸性〜中性に緩衝できるものが好ましい。
第二試薬にはさらに緩衝剤が含まれる。第二試薬に含まれる緩衝剤は特に限定されないが、ｐＨを中性〜弱塩基性に緩衝できるものが好ましい。

以下、実験例を示して本実施形態を具体的に説明する。

以下の実験例は、試料中のＨＤＬ−Ｃを上述のＵＶ法で測定したものである。

＜実験例１＞
（試薬の調製）
緩衝剤としてＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０５）と、阻害剤として硫酸カリクス（８）アレンと、補酵素としてβＮＡＤとを混合し、試薬中のＰＩＰＥＳ濃度が１０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン濃度が１．０ｍＭ、βＮＡＤ濃度が５．５ｍＭとなるよう対照第一試薬を調製した。対照第一試薬にはＣＤは含まれていない。
対照第一試薬の他に、対照第一試薬に含まれる各成分とＨＰαＣＤとを混合して、第一試薬Ａ、及び第一試薬Ｂの二種類の第一試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０５）と、硫酸カリクス（８）アレンと、βＮＡＤと、ＨＰαＣＤとを混合し、試薬中のＰＩＰＥＳ濃度が１０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン濃度が１．０ｍＭ、βＮＡＤ濃度が５．５ｍＭ、ＨＰαＣＤ濃度が０．１５ｗ／ｖ％となるよう第一試薬Ａを調製した。
ＨＰαＣＤを０．２０ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ａと同様にして第一試薬Ｂを調製した。
次に、緩衝剤としてＴＡＰＳ（ｐＨ８．６０）と、ＣＥ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来）と、ＣＤＨ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．由来）と、グリシンと、コール酸ナトリウムとを混合し、試薬中のＴＡＰＳ濃度が０．２Ｍ、ＣＥ濃度が２５ＫＵ／Ｌ、ＣＤＨ濃度が２５ＫＵ／Ｌ、グリシン濃度が０．４Ｍ、コール酸ナトリウム濃度が０．１ｗ／ｖ％となるよう第二試薬を調製した。

（試料の調製）
測定用の試料として、対照試料１、試料Ａ、及び試料Ｂを調製した。
対照試料１は、試料ベースとしてヒトの血清を精製したＨＤＬ標準血清（シスメックス製）と、生理食塩水とを９対１の比で混合して調製したものである。対照試料１には乳び成分は含まれていない。
試料Ａは、ＨＤＬ標準血清と生理食塩水と、乳び成分として１０ｗ／ｖ％のイントラファット（２０ｗ／ｖ％イントラファット原液（武田薬品工業製）を生理食塩水で２倍に希釈したもの）（以下、ＩＦとする）とを１８対１対１の比で混合して調製した乳び試料である。即ち試料ＡにはＩＦが０．５ｗ／ｖ％含まれている。
試料Ｂは、ＨＤＬ標準血清と前述の１０ｗ／ｖ％のＩＦとを９対１の比で混合して調製した乳び試料である。即ち試料ＢにはＩＦが１．０ｗ／ｖ％含まれている。

（測定）
上記のようにして調製した試薬及び試料を用いて、試料中のＨＤＬ−Ｃ濃度の測定を行い、試料中に存在する乳び（ＩＦ）のＨＤＬ−Ｃ測定結果への影響と、試薬に添加されたＨＰαＣＤの乳びに対する効果を分析した。ＨＤＬ−Ｃ測定においては、日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、試料４μＬと第一試薬１８０μＬと第二試薬６０μＬとを混合して測定用試料を作成し、ＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。測定中の温度に関しては、反応開始から測定終了まで３７℃に保たれるように設定した。

（実験結果）
実験結果を下記の表１に示す。表１において、ＨＤＬ−Ｃ濃度の欄にはそれぞれの試料ＨＤＬ−Ｃ濃度（ｍｇ／ｄＬ）の測定値を示す。ＨＤＬ−Ｃ回収率とは、試料中に含まれる乳び成分がＨＤＬ−Ｃ測定結果へ与える影響の度合いを示す指標のことである。回収率は百分率（％）であらわされる。対照試料１を測定したときのＨＤＬ−Ｃ回収率は１００．０％とし、試料Ａ及び試料Ｂを測定したときのＨＤＬ−Ｃ回収率は、下記計算式で求めた。
ＨＤＬ−Ｃ回収率＝｛（試料Ａ又は試料ＢのＨＤＬ−Ｃ濃度測定値）／（対照試料のＨＤＬ−Ｃ濃度測定値）｝×１００ （％）

表１に示すように、対照第一試薬（ＨＰαＣＤを含まない試薬）を用いて対照試料１（ＩＦを含まない試料）のＨＤＬ−Ｃを測定した場合、ＨＤＬ−Ｃ濃度の測定値が４１．３ｍｇ／ｄＬとなった。つまり、対照試料１にはＨＤＬ−Ｃが４１．３ｍｇ／ｄＬの濃度で含まれていると考えられる。
対照第一試薬でＩＦを０．５ｗ／ｖ％含む試料ＡのＨＤＬ−Ｃを測定した場合、ＨＤＬ−Ｃ濃度の測定値が３６．７ｍｇ／ｄＬとなった。この値は、対照第一試薬で対照試料１を測定したときのＨＤＬ−Ｃ濃度測定値に比べると、８８．９％の回収率となる。
また、対照第一試薬でＩＦを１．０ｗ／ｖ％含む試料ＢのＨＤＬ−Ｃを測定した場合、ＨＤＬ−Ｃ濃度の測定値が２５．２ｍｇ／ｄＬとなった。この値は、対照第一試薬で対照試料１を測定したときのＨＤＬ−Ｃ濃度測定値に比べると回収率が６１．１％となる。
以上より、ＨＰαＣＤを含まない試薬を用いてＩＦを含む試料のＨＤＬ−Ｃを測定すると、試料中のＩＦの影響によって実際のＨＤＬ−Ｃ濃度よりも低い測定値となることが分かった。

第一試薬Ａを用いて試料Ａ及び試料ＢのＨＤＬ−Ｃを測定した場合、回収率がそれぞれ１０７．７％及び７４．３％となった。
また、第一試薬Ｂを用いて試料Ａ及び試料ＢのＨＤＬ−Ｃを測定した場合、回収率がそれぞれ１０４．７％及び９６．０％となった。

これらの結果は、ＨＰαＣＤを含む第一試薬を用いることにより試料に含まれるＩＦのＨＤＬ−Ｃ測定結果に対する影響を低減できたことを示している。また、試料中のＩＦ濃度に対応して第一試薬のＨＰαＣＤ濃度を調整することにより、ＨＤＬ−Ｃの回収率の向上を図れることが判明した。

〈実験例２〉
（試薬の調製）
対照第一試薬に含まれる各成分とαＣＤとを混合して、第一試薬Ｃ、第一試薬Ｄ、第一試薬Ｅ、及び第一試薬Ｆの四種類の第一試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０５）と、硫酸カリクス（８）アレンと、βＮＡＤと、αＣＤとを混合し、試薬中のＰＩＰＥＳ濃度が１０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン濃度が１．０ｍＭ、βＮＡＤ濃度が５．５ｍＭ、αＣＤ濃度が０．１０ｗ／ｖ％となるよう第一試薬Ｃを調製した。
αＣＤを０．２０ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｃと同様にして第一試薬Ｄを調製した。
αＣＤを０．３０ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｃと同様にして第一試薬Ｅを調製した。
αＣＤを０．４０ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｃと同様にして第一試薬Ｆを調製した。

（試料の調製）
ＨＤＬ標準血清に代えてＨＤＬコントロールＭ（シスメックス製）を用いること以外は対照試料１と同様にして対照試料２を調製した。
ＨＤＬ標準血清に代えてＨＤＬコントロールＭ（シスメックス製）を用いること以外は試料Ａと同様にして試料ａを調製した。即ち、試料ａにはＩＦが０．５ｗ／ｖ％含まれている。
ＨＤＬ標準血清に代えてＨＤＬコントロールＭ（シスメックス製）を用いること以外は試料Ｂと同様にして試料ｂを調製した。即ち、試料ｂにはＩＦが１．０ｗ／ｖ％含まれている。

（測定）
第一試薬として対照第一試薬及び第一試薬Ｃ〜Ｆを用いること、及び試料として対照試料２、試料ａ及びｂを用いること以外は実験例１と同様にして各試料のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。

（実験結果）
実験結果を下記の表２に示す。

表２の結果は、αＣＤを含有する第一試薬を用いることにより試料に含まれるＩＦのＨＤＬ−Ｃ測定結果に対する影響を低減できたことを示している。また、試料中のＩＦ濃度に対応して第一試薬のαＣＤ濃度を調整することにより、ＨＤＬ−Ｃの回収率の向上を図れることが判明した。

〈実験例３〉
（試薬の調製）
対照第一試薬に含まれる各成分とＨＢβＣＤとを混合して、第一試薬Ｇ、第一試薬Ｈ、及び第一試薬Ｉの三種類の第一試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０５）と、硫酸カリクス（８）アレンと、βＮＡＤと、ＨＢβＣＤとを混合し、試薬中のＰＩＰＥＳ濃度が１０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン濃度が１．０ｍＭ、βＮＡＤ濃度が５．５ｍＭ、ＨＢβＣＤ濃度が０．２５ｗ／ｖ％となるよう第一試薬Ｇを調製した。
ＨＢβＣＤを０．５０ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｇと同様にして第一試薬Ｈを調製した。
ＨＢβＣＤを１．００ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｇと同様にして第一試薬Ｉを調製した。

（測定）
第一試薬として、対照第一試薬及び第一試薬Ｇ〜Ｉを用いること以外は実験例２と同様にして、各試料のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。

（実験結果）
実験結果を下記表３に示す。

表３の結果は、ＨＢβＣＤを含有する第一試薬を用いることにより試料に含まれるＩＦのＨＤＬ−Ｃ測定結果に対する影響を低減できたことを示している。また、試料中のＩＦ濃度に対応して第一試薬のＨＢβＣＤ濃度を調整することにより、ＨＤＬ−Ｃの回収率の向上を図れることが判明した。

〈実験例４〉
（試薬の調製）
実験例４においては、対照第一試薬に含まれる各成分とジメチル−β−シクロデキストリン（以下、ＤＭβＣＤとする）とを混合して、第一試薬Ｊ及び第一試薬Ｋの二種類の第一試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０５）と、硫酸カリクス（８）アレンと、βＮＡＤと、ＤＭβＣＤとを混合し、試薬中のＰＩＰＥＳ濃度が１０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン濃度が１．０ｍＭ、βＮＡＤ濃度が５．５ｍＭ、ＤＭβＣＤ濃度が０．５０ｗ／ｖ％となるよう第一試薬Ｊを調製した。
ＤＭβＣＤを１．００ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｊと同様にして第一試薬Ｋを調製した。

（測定）
第一試薬として対照第一試薬と第一試薬Ｊと第一試薬Ｋとを用いること以外は実験例２と同様にして各試料のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。

（実験結果）
実験結果を下記表４に示す。

表４に示すように、第一試薬Ｊを用いて試料Ａ及び試料ＢのＨＤＬ−Ｃを測定した場合、ＨＤＬ−Ｃ濃度の測定値がそれぞれ−８．９ｍｇ／ｄＬ及び−６６．９ｍｇ／ｄＬとなった。
また、第一試薬Ｋを用いて試料Ａ及び試料ＢのＨＤＬ−Ｃを測定した場合、ＨＤＬ−Ｃ濃度の測定値がそれぞれ−３．１ｍｇ／ｄＬ及び−５７．４ｍｇ／ｄＬとなった。

第一試薬Ｊ又は第一試薬Ｋを用いてＩＦを含む試料のＨＤＬ−Ｃ測定を行うと、ＨＤＬ−Ｃ濃度の測定値が何れも負の値を示した。故に、ＤＭβＣＤにはＩＦの影響を軽減する効果がないということが分かった。

〈実験例５〉
（試薬の調製）
実験例５においては、対照第一試薬に含まれる各成分とトリメチル−β−シクロデキストリン（以下、ＴＭβＣＤとする）とを混合して、第一試薬Ｌ及び第一試薬Ｍの二種類の第一試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０５）と、硫酸カリクス（８）アレンと、βＮＡＤと、ＴＭβＣＤとを混合し、試薬中のＰＩＰＥＳ濃度が１０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン濃度が１．０ｍＭ、βＮＡＤ濃度が５．５ｍＭ、ＴＭβＣＤ濃度が０．５０ｗ／ｖ％となるよう第一試薬Ｌを調製した。
ＴＭβＣＤを１．００ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｌと同様にして第一試薬Ｍを調製した。

（測定）
第一試薬として対照第一試薬と第一試薬Ｌと第一試薬Ｍとを用いること以外は実験例２と同様にして各試料のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。

（実験結果）
実験結果を下記表５に示す。

第一試薬Ｌ又は第一試薬Ｍを用いてＩＦを含む試料のＨＤＬ−Ｃ測定を行うと、対照試料２のＨＤＬ−Ｃ濃度測定値に比べて何れも非常に低い測定値を示した。故に、ＴＭβＣＤにはＩＦの影響を軽減する効果がないということが分かる。

〈実験例６〉
（試薬の調製）
実験例６においては、対照第一試薬に含まれる各成分とパーシャリーメチル−β−シクロデキストリン（以下、ＰＭβＣＤとする）とを混合して、第一試薬Ｎ及び第一試薬Ｏの二種類の第一試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０５）と、硫酸カリクス（８）アレンと、βＮＡＤと、ＰＭβＣＤとを混合し、試薬中のＰＩＰＥＳ濃度が１０ｍＭ、硫酸カリクス（８）アレン濃度が１．０ｍＭ、βＮＡＤ濃度が５．５ｍＭ、ＰＭβＣＤ濃度が０．５０ｗ／ｖ％となるよう第一試薬Ｎを調製した。
ＰＭβＣＤを１．００ｗ／ｖ％の濃度で含有させること以外は第一試薬Ｎと同様にして第一試薬Ｏを調製した。

（測定）
第一試薬として対照第一試薬と第一試薬Ｎと第一試薬Ｏとを用いること以外は実験例２と同様にして各試料のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。

（実験結果）
実験結果を下記表６に示す。

第一試薬Ｎ又は第一試薬Ｏを用いてＩＦを含む試料のＨＤＬ−Ｃ測定を行うと、対照試料２のＨＤＬ−Ｃ濃度測定値に比べて何れも非常に低い測定値を示した。故に、ＤＭβＣＤにはＩＦの影響を軽減する効果がないということが分かる。

Claims (7)

1. 試料中の高密度リポタンパク質に含まれるコレステロールの測定に用いる試薬において、前記高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制する阻害剤と、無置換のシクロデキストリン、親水基を有するα−シクロデキストリン、及び親水基を有するβ−シクロデキストリンからなる群から選ばれる少なくとも一種のシクロデキストリンとを含有することを特徴とする、高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬。
2. 前記阻害剤が、カリクスアレン、界面活性剤、ポリアニオン、水溶性ポリマー、及び抗体からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１記載の高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬。
3. 前記親水基が、親水基を有するアルキル基である請求項１記載の高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬。
4. 前記親水基を有するアルキル基が、ヒドロキシアルキル基及びアミノアルキル基からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３記載の高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬。
5. 前記親水基を有するアルキル基が、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシブチル基、及びジエチルアミノエチル基からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項３記載の高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬。
6. 前記シクロデキストリンの終濃度が０．０１〜２ｗ／ｖ％となる請求項１記載の高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬。
7. 試料中の高密度リポタンパク質に含まれるコレステロールを測定する方法において、前記高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制する阻害剤と、無置換のシクロデキストリン、親水基を有するα−シクロデキストリン、及び親水基を有するβ−シクロデキストリンからなる群から選ばれる少なくとも一種のシクロデキストリンとを前記試料に添加する工程と、前記阻害剤及びシクロデキストリンの存在下で前記高密度リポタンパク質に含まれるコレステロールを遊離させる工程と、遊離したコレステロールを測定する工程とから成る高密度リポタンパク質中コレステロール測定方法。