ES2263476T3 - Procedimiento de pretratamiento de una muestra para cuantificar el colesterol y procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteinas especificas usando dicho procedimiento. - Google Patents
Procedimiento de pretratamiento de una muestra para cuantificar el colesterol y procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteinas especificas usando dicho procedimiento.Info
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Abstract
Un procedimiento para pretratar una muestra que contiene varias lipoproteínas, antes de medir el colesterol que existe en una específica de dichas lipoproteínas en dicha muestra, que comprende hacer que una enzima, que actúa en el colesterol libre como sustrato, actúe en dicha muestra para consumir sólo dicho colesterol libre previamente, en condiciones en las que dichas lipoproteínas permanecen sustancialmente sin cambiar.
Description
Procedimiento de pretratamiento de una muestra
para cuantificar el colesterol y procedimiento para cuantificar el
colesterol en lipoproteínas específicas usando dicho
procedimiento.
Esta invención se refiere a un procedimiento de
pretratamiento para distinguir y cuantificar con exactitud y
eficacia el colesterol, que existe en una fracción específica de
lipoproteínas, por procedimientos sencillos y usando una cantidad
de muestra pequeña, y también a un procedimiento para medir el
colesterol en la fracción específica de lipoproteínas usando el
procedimiento de pretratamiento.
Los lípidos tales como el colesterol forman
complejos con apoproteínas en la sangre para formar lipoproteínas.
Dependiendo de las diferencias de las propiedades físicas, las
lipoproteínas se clasifican en quilomicrones, lipoproteínas de muy
baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL)
lipoproteínas de alta densidad (HDL) etc. Entre estas lipoproteínas
se sabe que la LDL es una de las sustancias causativas que induce la
arteriosclerosis, mientras que se sabe que la HDL muestra actividad
antiarteriosclerótica.
Desde el punto de vista epidemiológico, se sabe
que el nivel de colesterol en la LDL presenta una correlación
positiva con la frecuencia de aparición de la enfermedad
arteriosclerótica, mientras que se sabe que el nivel de colesterol
en la HDL muestra una correlación inversa con la frecuencia de la
aparición de la enfermedad arteriosclerótica. Por lo tanto, hoy en
día se llevan a cabo ampliamente las mediciones del colesterol en
la LDL o HDL para prevenir o diagnosticar las enfermedades
cardiacas isquémicas.
Como procedimientos conocidos para la medición
del colesterol en la LDL o HDL, hay, por ejemplo, un procedimiento
en el que la LDL o HDL se separan de otras lipoproteínas por
separación ultracentrífuga y después se someten a la medición de
colesterol; y otro procedimiento en el que después de la separación
de la LDL o HDL de otras lipoproteínas por electroforesis, se tiñen
los lípidos y se mide la intensidad del color desarrollado. Sin
embargo, estos procedimientos no se usan en la práctica, porque
implican uno o más problemas en cuanto que los procedimientos son
complicados y no se pueden manejar muchas muestras.
Un procedimiento para la medición del colesterol
en la HDL que se usa actualmente en el campo de los ensayos
clínicos, es el procedimiento de precipitación en el que se añade un
reactivo de precipitación a una muestra para aglutinar las
lipoproteínas distintas del HDL, el aglutinado resultante se separa
por centrifugación, y el colesterol se aísla en el líquido
sobrenadante que sólo contiene HDL. Este procedimiento es más
sencillo comparado con la ultracentrifugación o la electroforesis,
pero debido a la inclusión de los procedimientos para añadir el
reactivo de precipitación y llevar a cabo la separación, se requiere
una cantidad relativamente grande de cada muestra, e implica un
problema potencial en cuanto a la producción de un error analítico.
Además, las etapas enteras de análisis de este procedimiento no se
pueden automatizar completamente.
Por otra parte, se han estudiado procedimientos
enzimáticos para la cuantificación fraccionada del colesterol en la
HDL. Los procedimientos conocidos incluyen, por ejemplo, llevar a
cabo una reacción enzimática en presencia de una sal de ácido
biliar y un tensioactivo no iónico (documento JP
63-126498 A). Este procedimiento usa el hecho de
que una reacción enzimática se desarrolla de forma proporcional a la
concentración de colesterol en la LDL en una etapa inicial de la
reacción, y la posterior velocidad de reacción es proporcional a la
concentración de colesterol en la HDL. Sin embargo, existe un
problema en la precisión, porque la reacción con el colesterol en
la HDL y la reacción con el colesterol en otras lipoproteínas no se
pueden distinguir completamente.
En los procedimientos conocidos también está
incluido el tener lipoproteínas distintas de la HDL aglutinadas
previamente, para hacer que reaccione enzimáticamente sólo el
colesterol en la HDL, e inactivar la enzima y al mismo tiempo,
volver a disolver el aglutinado, seguido de la medición de una
absorbancia (documento JP 6-242110 A). Sin embargo,
este procedimiento requiere al menos tres procedimientos para añadir
reactivos, de modo que sólo se puede aplicar a analizadores
automáticos particulares, lo cual conduce a un problema en la
posibilidad de una aplicación extensa. Además, este procedimiento no
es satisfactorio desde el punto de vista del daño al equipo
analítico y de la eliminación de los reactivos, debido al uso de una
sal con una alta concentración tras la redisolución del
agluti-
nado.
nado.
Todavía se conoce otro procedimiento más
(documento JP 9-299 A), que comprende en una primera
reacción, hacer que la colesterol oxidasa y colesterol esterasa
actúen en las lipoproteínas distintas del HDL en presencia de un
tensioactivo especial, y hacer reaccionar preferiblemente el
colesterol que está contenido en dichas otras lipoproteínas, y
después medir el colesterol en la HDL mientras se inhibe cualquier
reacción del colesterol en las lipoproteínas distintas de la HDL.
Sin embargo, este procedimiento es considerablemente diferente del
de la presente invención, entre otras cosas, porque en la primera
reacción, hay que poner al mismo tiempo el tensioactivo especial,
la colesterol oxidasa y colesterol esterasa fuera del sistema de
reacción, tanto con el colesterol libre como el colesterol
esterificado en las lipoproteínas distintas de la HDL.
Además, la patente japonesa nº 2.600.065
describe un procedimiento que usa de forma combinada un reactivo de
precipitación, que está adaptado para que produzca la precipitación
de las lipoproteínas distintas de la HDL, y un reactivo de medición
del colesterol para medir el colesterol (HDL-C) en
la HDL que no ha precipitado. Este procedimiento tiene utilidad
práctica cuando se usa una enzima modificada como enzima, y se usa
el sulfato de \alpha-ciclodextrina como reactivo
de precipitación. Sin embargo, este procedimiento también implica
un problema en la precisión, ya que la turbidez que se produce como
resultado del uso de un reactivo de precipitación, interfiere con el
sistema de medición.
En relación con la medición del
HDL-C con una enzima modificada, en "SEIBUTSU
SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)", 19 (5),
305-320, que se considera que es un artículo
publicado sobre el procedimiento patentado antes descrito, se
describe que tras reconocer la incapacidad de medir el
HDL-C en el suero de un paciente hiperlipidémico
con la enzima modificada debido a un error positivo (es decir, que
da como resultado un valor más alto comparado con el obtenido por
el procedimiento de precipitación) inducido cuando la enzima
modificada se introduce simplemente en un sistema de reacción, el
HDL-C se midió usando sulfato de ciclodextrina, un
polianión, y cloruro magnésico como reactivo de precipitación para
evitar el error positivo.
Para reducir la influencia de la turbidez
producida por un reactivo de precipitación en el procedimiento
patentado descrito antes, también se conocen determinadas técnicas,
incluyendo hacer que haya simultáneamente un tensioactivo
(documento JP 8-116996 A), usar un anticuerpo
(documento JP 9-96637 A) y usar un compuesto de tipo
azúcar (documento JP 7-301636 A). Sin embargo, como
premisa todos necesitan incluir un reactivo que induzca la formación
de un aglutinado, de modo que para estos es fundamentalmente
indispensable usar un reactivo de precipitación tal como un
polianión.
Los autores de la presente invención
recientemente han encontrado el uso de una sustancia que actúa sólo
en la lipoproteína específica, permite cuantificar con precisión el
colesterol en la fracción específica de lipoproteínas sin usar un
reactivo de precipitación, y presentaron las solicitudes de patente
(documento JP 9-244821). Este procedimiento tiene
una correlación muy alta con el procedimiento de precipitación
convencional, pero comparando los valores de medición con el
procedimiento de precipitación, se ha admitido que este
procedimiento tiene una tendencia similar a la del procedimiento
descrito antes publicado en "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF
BIOLOGICAL SAMPLES)". Para obtener datos que concuerden con los
obtenidos por el procedimiento de precipitación convencional en las
instituciones médicas y similares, se añade un polianión o
similar.
Sin embargo, desde el punto de vista del
problema de un empañamiento o similar de la cubeta y dispersión de
los valores de medición, no se desea añadir un polianión o similar y
formar un precipitado en un sistema de medición. Por consiguiente,
se ha deseado firmemente eliminar el precipitado del sistema.
Además, económicamente tampoco es razonable usar un polianión o
similar para hacer que los datos resultantes concuerden con los
obtenidos por el procedimiento de precipitación a pesar de que el
polianión o similar no sea necesario desde el punto de vista del
principio de la medición. Por lo tanto, existe un gran deseo de
solucionarlo.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención es proporcionar un procedimiento que pueda cuantificar
con precisión y eficacia el colesterol en la fracción específica de
lipoproteínas mediante procedimientos sencillos, fundamentalmente
sin necesitar un polianión o similar, y que se pueda aplicar
adecuadamente a diferentes analizadores automáticos.
Los autores de la presente invención
desarrollaron una investigación de la causa que puede ser
responsable del problema descrito antes en "SEIBUTSU SHIRYO
BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)", es decir, el problema
de que el valor del colesterol en la fracción específica de
lipoproteínas cuantificado usando una sustancia que actúa sólo en
una lipoproteína específica tal como la HDL sea mayor que el valor
correspondiente determinado por el procedimiento de precipitación;
y llegaron a la conclusión de que incluso de las lipoproteínas que
no son la HDL (LDL, VLDL y similares) cuyo colesterol se supone que
no se mide, se libera una pequeña cantidad de colesterol libre que
existe en sus superficies o en la cercanía de sus superficies y
produce un error positivo. Basándose en este descubrimiento, se ha
encontrado que el valor del colesterol obtenido por un procedimiento
de cuantificación que usa una sustancia que actúa sólo en una
lipoproteína específica, se hace concordante con el correspondiente
valor obtenido por el procedimiento de precipitación cuando el valor
de colesterol se mide después del consumo previo del colesterol
libre solo, en condiciones en las que las lipoproteínas permanecen
sustancialmente sin cambiar, lo cual conduce a completar la presente
invención.
Descrita de forma específica, la presente
invención proporciona un procedimiento para pretratar una muestra
que contiene varias lipoproteínas, antes de medir el colesterol
existente en una específica de las lipoproteínas de la muestra, que
comprende hacer que una enzima, que actúa en el colesterol libre
como sustrato, actúe en la muestra para consumir sólo el colesterol
libre previamente, en condiciones en las que las lipoproteínas
permanecen sustancialmente sin cambiar.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para cuantificar el colesterol que existe en una
lipoproteína específica en una muestra, que comprende hacer que una
enzima que actúa en el colesterol libre como sustrato, actúe en la
muestra con la lipoproteína contenida en la misma, para consumir
sólo el colesterol libre en condiciones en las que las
lipoproteínas permanecen sustancialmente sin cambiar; y después
medir el colesterol que existe en la lipoproteína específica usando
una sustancia que actúe sólo en la lipoproteína específica.
La Figura 1 es un diagrama que muestra una
correlación entre la presente invención en el Ejemplo 1 y el
procedimiento de precipitación;
La Figura 2 es un diagrama que muestra una
correlación entre la presente invención en el Ejemplo 2 y el
procedimiento de precipitación; y
La Figura 3 es un diagrama que muestra los
efectos de un acelerador de la reacción en el Ejemplo 5.
En la presente invención, antes de medir el
colesterol que existe en una lipoproteína específica en una muestra,
se hace actuar una enzima que actúa en el colesterol libre como
sustrato, como pretratamiento de la muestra, de modo que el
colesterol libre sea consumido.
Como enzima que actúa en el colesterol libre
como sustrato, se puede usar cualquier enzima siempre que actúe en
el colesterol libre como sustrato. Son ejemplos la colesterol
deshidrogenasa y la colesterol oxidasa. Pueden tener cualquier
origen tal como de origen de microorganismos, origen animal u origen
de plantas, y también pueden ser las preparadas por ingeniería
genética. Además pueden estar químicamente modificadas o sin
modificar. La enzima en general se usa con 0,001 a 100 U/ml,
prefiriéndose de 0,1 a 100 U/ml.
No se imponen limitaciones particulares en las
condiciones en las que la enzima descrita antes, que actúa en el
colesterol libre como sustrato, se hace actuar en la muestra, y se
pueden usar las condiciones recomendadas para la enzima. Sin
embargo, es necesario prestar atención para que durante la etapa en
la que la enzima que actúa en el colesterol libre como sustrato, se
hace actuar en la muestra, no se produzca una reacción por la cual
un colesterol esterificado se convierte en colesterol libre.
Concretamente, no es importante si existe o no la colesterol
esterasa. Lo que es necesario es mantener las condiciones para no
permitir que la colesterol esterasa actúa en la práctica.
Junto con la enzima que actúa en el colesterol
libre como sustrato, cuando sea necesario se puede usar una
coenzima. Como coenzima se puede usar el dinucleótido de
nicotinamida y adenina o similar. Dichas coenzimas se pueden usar
solas o combinadas. La cantidad que hay que usar varía dependiendo
de la coenzima. La coenzima se puede usar de 0,001 a 100 U/ml,
preferiblemente de 0,1 a 100 U/ml, aunque no se impone una
limitación particular sobre la misma.
Respecto a la enzima que actúa en el colesterol
libre como sustrato y que se usa en la presente invención, como se
ha descrito antes no se impone limitación en cuanto a su origen. La
concentración y similares se pueden elegir de forma adecuada para
lograr el rendimiento y la facilidad de manejo deseados. Por
consiguiente, si se desea completar el pretratamiento en un tiempo
predeterminado, por ejemplo, sólo es necesario usar la enzima con
una cantidad mayor, y si por el contrario se desea conservar la
enzima, sólo es necesario hacer el tiempo de pretratamiento
más
largo.
largo.
Sin embargo, en el caso de un reactivo de
diagnóstico para uso exclusivo en mediciones con analizadores
automáticos, se desea cumplir ambos requisitos al mismo tiempo.
Concretamente, es necesario completar el pretratamiento en un
tiempo corto usando la enzima en una cantidad pequeña. En dicho
caso, la existencia simultánea de un acelerador de la reacción
seleccionado del grupo descrito a continuación, en el pretratamiento
que usa una enzima que actúa en el colesterol libre como sustrato,
permite obtener el rendimiento deseado con una cantidad reducida de
la enzima sin hacer el tiempo de pretratamiento más largo.
Los aceleradores de la reacción que se pueden
usar para el propósito anterior pueden incluir, por ejemplo, ácido
flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina y mevionolina,
incluyendo sus sales y derivados de metales (derivados de aluminio y
similares) siempre que dichas sales y derivados de metales existan.
Entre estos, el ácido flufenámico y el ácido mefenámico son
conocidos como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, y el ácido
fusídico y la monensina son conocidos como antibióticos.
Cuando se usa dicho compuesto como un acelerador
de la reacción, es necesario escoger de forma adecuada su
concentración y similares teniendo en cuenta sus propiedades
físicas, pH y fuerza iónica del sistema de medición, y los tipos y
concentraciones de las sustancias que existen junto al mismo.
La concentración del acelerador de la reacción
se puede determinar experimentalmente de acuerdo con las condiciones
del sistema de medición. Sin embargo, en general, el ácido
flufenámico se puede usar de aproximadamente 0,01 a 100 mM; el
ácido fusídico de aproximadamente 0,01 a 10 mM; el ácido mefenámico,
la 2,2',6',2''-terpiridina y el acetato de
betametasona, cada uno, de aproximadamente 0,01 a 5 mM; la
monensina y mevinolina, cada una, de aproximadamente 0,01 a 1 mM; y
el ácido tíglico de aproximadamente 1 a 500 mM.
El uso del acelerador de la reacción descrito
antes ha permitido reducir la cantidad de la enzima, que actúa en
el colesterol libre como sustrato, a una décima parte. Por otra
parte, cuando la enzima se usa con la misma cantidad, el acelerador
de la reacción puede acortar el tiempo de reacción.
En el pretratamiento descrito antes con la
enzima que actúa en el colesterol libre como sustrato (y también
con el acelerador de la reacción, si es necesario), también se
pueden usar otras enzimas (excluyendo las que influyen
sustancialmente en las lipoproteínas) y sales, tampones para regular
el pH, tensioactivos (excluyendo las que influyen sustancialmente
en las lipoproteínas), conservantes, proteínas tales como albúmina,
y agentes que tienen afinidad por lipoproteínas específicas, tales
como anticuerpos, antibióticos, saponinas, lecitinas y polianiones
en la medida que no produzcan aglutinación de la lipoproteína
específica, de modo que la acción de la enzima se ajuste sin
afectar a la especificidad de la medición.
Por lo tanto, en la presente invención se pueden
usar como agentes de pretratamiento para medir el colesterol que
existe en lipoproteínas específicas en las muestras, los que
contienen los siguientes ingredientes.
Enzimas que actúan en el colesterol libre como
sustrato, por ejemplo, la colesterol deshidrogenasa y la colesterol
oxidasa.
Aceleradores de la reacción, por ejemplo ácido
flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina y mevionolina.
Coenzimas tales como NAD, otras enzimas tales
como peroxidasa, catalasa, diaforasa y ascorbato oxidasa, ácidos
tales como ácido pirúvico, sales, tampones para regular el pH,
tensioactivos que no influyan sustancialmente en las lipoproteínas,
conservantes, proteínas tales como albúmina, anticuerpos,
antibióticos, saponinas, lecitinas, polianiones y acopladores tales
como 4-aminoantipirina, agentes de desarrollo de
color oxidantes tales como dadores de hidrógeno, p. ej., el
reactivo de Trinder, aceptores de electrones tales como metosulfato
de fenazina, y agentes de desarrollo de color reductores tales como
azul de nitro-tetrazolio.
En la presente invención, el colesterol que
existe en una lipoproteína específica en una muestra se mide después
de consumir el colesterol libre en las lipoproteínas mediante el
pretratamiento descrito antes.
Se puede usar cualquier procedimiento para medir
el colesterol que existe en la lipoproteína específica en la
muestra siempre que el procedimiento pueda medir el colesterol que
existe en la lipoproteína específica usando una sustancia que actúe
sólo en la lipoproteína específica.
Un ejemplo ilustrativo del procedimiento puede
comprender proporcionar como sustancia que actúa en la lipoproteína
específica, un tensioactivo seleccionado de
alquilen-fenil-éteres polioxietilenados o
alquilen-tribencilfenil-éteres polioxietilenados
descritos en el documento JP 11-56395 A; añadir un
reactivo de tipo enzima que mide el colesterol en presencia de la
sustancia; y después medir la cantidad de colesterol que ha
reaccionado en un tiempo en el que el colesterol en la lipoproteína
de alta densidad reacciona preferentemente frente a las otras
lipoproteínas, con el reactivo enzimático de medición del
colesterol.
Los ejemplos de productos comerciales de los
tensioactivos primeros, los alquilen-fenil-éteres
polioxietilenados, pueden incluir "Emulgen
A-60" (nombre comercial, producto de Kao
Corporation), mientras que los ejemplos de los últimos
tensioactivos, los alquilen-tribencilfenil-éteres,
pueden incluir "Emulgen B66" (nombre comercial, producto de Kao
Corporation).
Como un procedimiento alternativo, hay un
procedimiento que usa las enzimas modificadas que se describen en
las páginas 305-320 de "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI
(ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)", 19 (5), como sustancias que
actúan sólo en lipoproteínas específicas respectivamente. Aunque se
usan el sulfato de \alpha-ciclodextrina y el
cloruro magnésico en el procedimiento de esta publicación para
inhibir reacciones con las fracciones de lipoproteínas distintas de
la HDL, el uso del procedimiento de pretratamiento de esta invención
descrito antes, hace que ya no sea necesario usar dichas
sustancias.
Salvo por el uso de la sustancia que actúa en el
colesterol específico, el procedimiento para medir el colesterol
que existe en la lipoproteína específica se puede practicar usando
los reactivos usados en los procedimientos convencionales de
medición de colesterol. Los ejemplos de ingredientes que pueden
contener los reactivos para usar, pueden incluir enzimas tales como
la colesterol esterasa, colesterol oxidasa, colesterol
deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa, diaforasa y peroxidasa,
agentes de desarrollo de color, coenzimas, aceptores de electrones,
proteínas (albúmina, etc.), conservantes, tensioactivos, sales,
ácidos y tampones para regular el pH.
Como tensioactivos, aparte de los ingredientes
descritos antes, se pueden usar tensioactivos tanto iónicos como no
iónicos. Son ilustrativos los
polioxietilen-alquil-éteres,
polioxietilen-alquilfenil-éteres, condensados de
polioxietileno-polioxipropileno,
polioxietilen-alquil-éter-sulfatos,
sales de alquilbencenosulfonatos y sales de ácidos biliares. La
cantidad de tensioactivo que se va a usar varía dependiendo del
compuesto. Sin embargo, el tensioactivo se puede usar en una
cantidad de 0,0001% a 5%, preferiblemente de 0,001% a 5%, aunque no
se impone ninguna limitación particular sobre la misma.
No se imponen limitaciones particulares en los
tampones. Se pueden usar tampones convencionales tales como tampón
de Good, tampón de fosfato, tampón de Tris y tampón de ftalato. El
tampón se puede usar en una cantidad de 0,005 M a 2 M,
preferiblemente de 0,01 M a 1 M, aunque no se impone ninguna
limitación particular sobre la
misma.
misma.
El procedimiento para cuantificar el colesterol
en una fracción específica de lipoproteínas de la presente
invención, típicamente comprende primeramente añadir un agente de
pretratamiento que actúa sólo en el colesterol libre, en la muestra
que se va a medir y hacer que el agente de pretratamiento actúe en
la muestra, y después añadir y mezclar un reactivo de medición del
colesterol (en lo sucesivo denominado "reactivo de
cuantificación"), que contiene una sustancia capaz de actuar en
la lipoproteína específica y un reactivo usado para un procedimiento
convencional de medición del colesterol, para medir la cantidad de
colesterol en la fracción específica de lipopro-
teínas.
teínas.
Los ejemplos específicos incluyen, pero no se
limitan, un procedimiento que comprende mezclar la colesterol
deshidrogenasa y una coenzima (NAD) con una muestra y después añadir
un reactivo de medición del colesterol que comprende la colesterol
esterasa y colesterol oxidasa; un procedimiento que comprende
mezclar la colesterol deshidrogenasa y el NAD con una muestra y
después añadir un reactivo de medición del colesterol que comprende
la colesterol esterasa; un procedimiento que comprende mezclar una
muestra y la colesterol oxidasa junto con peroxidasa,
4-aminoantipirina o catalasa y después añadir un
reactivo de medición del colesterol que comprende la colesterol
esterasa; y un procedimiento que comprende mezclar una muestra y la
colesterol oxidasa junto con peroxidasa,
4-aminoantipirina, etc. y después añadir un reactivo
de medición del colesterol que comprende colesterol esterasa,
colesterol deshidrogenasa y NAD.
Los ejemplos del procedimiento para medir
colesterol en una fracción específica de lipoproteínas pueden
incluir un procedimiento que usa de forma combinada la colesterol
esterasa y la colesterol oxidasa como reactivo enzimático y un
procedimiento que usa de forma combinada la colesterol esterasa y la
colesterol deshidrogenasa, aunque también se pueden usar todos los
ensayos enzimáticos conocidos.
En la presente invención, la enzima para usar en
la primera reacción como la reacción de pretratamiento y la enzima
para usar en la medición del colesterol como procedimiento de
cuantificación mediante la segunda reacción, pueden ser iguales o
diferentes. Además, la enzima se puede usar en una cantidad en
exceso en la primera reacción y también se puede usar en la segunda
reacción. En lo esencial, sólo es necesaria para consumir el
colesterol libre que existe en una pequeña cantidad en las
superficies de las lipoproteínas (primera reacción/reacción de
pretratamiento) y después llevar el sistema de reacción a un estado
en el que la enzima actúe sólo en la lipoproteína específica que se
va a medir, de modo que se pueda cuantificar la mayor parte del
colesterol (colesterol libre + colesterol esterificado) que forma
la lipoproteína.
Además, no se impone una limitación particular
en el procedimiento para detectar finalmente el colesterol después
de añadir dicho reactivo enzimático de medición del colesterol. Se
puede usar, por ejemplo, absorbiometría en la que la detección se
lleva a cabo combinando peroxidasa con un cromógeno o diaforasa o un
aceptor de electrones con un reactivo de desarrollo del color
reductor, o un procedimiento en el que se detecta directamente una
coenzima o peróxido de hidrógeno. La coenzima se puede amplificar
por un sistema de ciclos de coenzima.
Para poner en práctica el procedimiento de la
presente invención con facilidad, se prefiere usar un kit de
cuantificación que sea adecuado para medir el colesterol en la
lipoproteína específica.
Aunque estos kits se pueden diseñar fácilmente
basándose en la explicación anterior, a continuación se describirán
ejemplos de los mismos dividiéndolos en los que usan la colesterol
oxidasa y los que usan la colesterol deshidrogenasa como ejemplo
típico de enzimas que actúan en el colesterol libre como
sustrato.
(a) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol oxidasa y una sustancia que consume peróxido de hidrógeno (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción); y
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica, colesterol esterasa y un agente de desarrollo de color.
\newpage
(b) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol oxidasa, colesterol esterasa y una sustancia que consume peróxido de hidrógeno, y que además comprende un acelerador de la reacción; y
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica y un agente de desarrollo de color.
(c) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1), (2) y (3):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol oxidasa y una sustancia que consume peróxido de hidrógeno, (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción);
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica; y
- (3)
- un tercer reactivo que comprende colesterol esterasa y un agente de desarrollo de color.
En los kits descritos antes, la expresión
"sustancia que consume peróxido de hidrógeno" significa una
sustancia que consume y elimina el peróxido de hidrógeno producido
por la reacción entre la colesterol oxidasa y el colesterol. Son
ejemplos la catalasa, acopladores tales como
4-aminoantipirina, y agentes de desarrollo de color
oxidantes-reductores incluyendo dadores de hidrógeno
tales como el reactivo de Trinder.
Entre estos, un acoplador tal como la
4-aminoantipirina y un dador de hidrógeno tal como
el reactivo de Trinder desarrollan un color cuando reaccionan
combinados con el peróxido de hidrógeno, y se pueden usar como el
agente de desarrollo de color en el reactivo (2) o (3) descritos
antes. Como reactivo (1) para usar en la etapa de pretratamiento de
acuerdo con la presente invención, se prefiere usar sólo uno de un
acoplador y un dador de hidrógeno y que el peróxido de hidrógeno
sea consumido por una reacción que no desarrolla color. Huelga
decir que se puede someter el peróxido de hidrógeno a una reacción
de desarrollo de color y después hacer un ajuste a un valor medible
[este ajuste se puede hacer restando la intensidad de un color, que
ha desarrollado el reactivo (1), de la intensidad de un color que ha
desarrollado el reactivo (2) o el reactivo (3)].
(d) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa y una coenzima (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción); y
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica y colesterol esterasa.
(e) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa y una coenzima (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción); y
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica, colesterol oxidasa, colesterol esterasa, peroxidasa y un agente de desarrollo de color.
(f) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa, una coenzima y colesterol esterasa, y que además comprende un acelerador de la reacción; y
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica.
(g) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa, una coenzima y colesterol esterasa (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción); y
\newpage
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica, colesterol oxidasa, peroxidasa y un agente de desarrollo de color.
(h) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1), (2) y (3):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa y una coenzima (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción);
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica; y
- (3)
- un tercer reactivo que comprende colesterol esterasa.
(i) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1), (2) y (3):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa y una coenzima (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción);
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica; y
- (3)
- un tercer reactivo que comprende colesterol oxidasa, colesterol esterasa, peroxidasa y un agente de desarrollo de color.
(j) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa, una coenzima y una sustancia que consume el producto de reacción de la coenzima (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción); y
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica y colesterol esterasa.
(k) Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos (1) y (2):
- (1)
- un primer reactivo que comprende colesterol deshidrogenasa, una coenzima y una sustancia que consume el producto de reacción de la coenzima (y que en algunos casos además comprende un acelerador de la reacción); y
- (2)
- un segundo reactivo que comprende una sustancia que actúa sólo en la lipoproteína específica, colesterol esterasa y un agente de desarrollo de color.
En los kits descritos antes que usan la
colesterol deshidrogenasa, la expresión "sustancia que consume el
producto de reacción de la coenzima" significa una sustancia que
convierte una coenzima reducida (por ejemplo NADH) que se produce
en la reacción entre el colesterol, la colesterol deshidrogenasa y
una coenzima (por ejemplo, NAD) otra vez en la coenzima original.
Un ejemplo es una combinación de lactato deshidrogenasa y ácido
pirúvico (sustrato). En cada uno de los kits descritos antes, el
producto de reacción de la coenzima se produce por la adición del
reactivo (1). En cada uno de los kits (d), (f), (h) y (j) de los
kits descritos antes, se puede medir la luz de la misma longitud de
onda como color desarrollado por la adición del reactivo (1) en la
etapa de medición sin consumo previo del producto de reacción. Sin
embargo, en este caso hay que cuantificar el colesterol en la
lipoproteína específica restando la intensidad del color que se
desarrolla en la etapa de pretratamiento en la que se añade el
reactivo (1), de la intensidad del color desarrollado por el
reactivo (2) o el reactivo (3). Como alternativa, también se puede
añadir previamente la sustancia que consume el producto de reacción
al reactivo (1) y posteriormente al consumo del producto de
reacción, añadir el reactivo (2) o el reactivo (3) para el
desarrollo de un color. En este caso, se prefiere la adición de una
sustancia que reduce la acción de la sustancia que consume el
producto de reacción, al reactivo (2) o al reactivo (3). Por otra
parte, en cada uno de los kits (e), (g), (i) y (k) no es
absolutamente necesario restar la intensidad del color que se
desarrolla en la etapa de pretratamiento, de la intensidad del color
medida en la etapa de medición, porque en la etapa de medición se
mide un color desarrollado de una longitud de onda diferente del
color desarrollado en la etapa de pretra-
tamiento.
tamiento.
También hay que indicar que la aplicación de los
aceleradores de reacción antes mencionados, tales como el ácido
flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina y mevionolina, no está
limitada ni al procedimiento o agente de pretratamiento de la
presente invención ni al procedimiento o kit de cuantificación de
la presente invención para el colesterol en una lipoproteína
específica, usando dicho procedimiento o kit de cuantificación el
procedimiento o agente de pretratamiento.
Si se permite que exista un acelerador de la
reacción tal como el ácido flufenámico simultáneamente cuando se
lleva a cabo un procedimiento de cuantificación del colesterol que
usa una enzima que actúa en el colesterol como sustrato, por
ejemplo, un procedimiento de cuantificación que usa de forma
combinada colesterol oxidasa, peroxidasa, un agente de desarrollo
de color y similares, o un procedimiento de cuantificación del
colesterol total que usa de forma combinada la colesterol oxidasa,
colesterol esterasa, peroxidasa, un agente de desarrollo del color
y similares, obviamente se pueden conseguir efectos ventajosos tales
como que se puede reducir la cantidad de enzima que hay que usar,
siendo capaz dicha enzima de actuar en el colesterol libre como
sustrato y siendo la colesterol oxidasa en el procedimiento
ilustrado antes, y se puede acortar el tiempo de la reacción
enzimática.
Además, tomando como referencia la descripción
de esta memoria descriptiva en el procedimiento de cuantificación
del colesterol (por ejemplo, selección de un tensioactivo para
limitar un objetivo de una lipoproteína específica que se va a
medir), se puede diseñar de forma más específica un procedimiento de
cuantificación que se desee.
La presente invención ha hecho posible
cuantificar de forma eficaz el colesterol en una fracción específica
por procedimientos sencillos sin usar un polianión o similares, por
no decir un pretratamiento mecánico tal como la centrifugación.
Puesto que los procedimientos de la presente invención no forman un
precipitado que de otra forma se produciría por la adición del
polianión o similar, los aparatos de medición (especialmente las
cubetas) y similares no se empañan, y además los valores medidos no
tienen dispersión. Por lo tanto, los procedimientos de acuerdo con
la presente invención son superiores a los procedimientos
convencionales de medición del colesterol.
Además, como se demostrará en los Ejemplos
posteriores, se pueden obtener valores de medición que muestran una
gran correlación con los obtenidos por el procedimiento convencional
de precipitación, incluso con respecto a muestras con niveles altos
de triglicéridos. Por lo tanto, los procedimientos de acuerdo con la
presente invención también son excelentes en cuanto que se pueden
aplicar a diferentes muestras sin limitación.
Además, el uso del acelerador de la reacción
permite usar la enzima que actúa en el colesterol libre como
sustrato, en una cantidad menor en la etapa de pretratamiento.
Como se ha descrito antes, los procedimientos de
acuerdo con la presente invención permiten mediciones exactas y
específicas de una variedad de muestras mediante procedimientos
sencillos y usando las muestras en pequeñas cantidades. Por
consiguiente, se pueden aplicar a diferentes analizadores
automáticos y también son extremadamente útiles en el campo de los
ensayos clínicos.
La presente invención después se describirá con
más detalle con los Ejemplos. Sin embargo, hay que tener en cuenta
que la presente invención no se limita de ninguna forma a los
Ejemplos.
Se cuantificó el colesterol en la HDL de cada
una de 30 muestras de suero que contenían lipoproteínas, por el
procedimiento descrito a continuación de acuerdo con la presente
invención y por el procedimiento de precipitación, y se compararon
los valores de medición.
Se añadió tampón de fosfato 10 mM (primer
reactivo; pH 8,5) (300 \mul) que contenía colesterol
deshidrogenasa 0,1 U/ml (producto de Amano Pharmaceutical Co.
Ltd.), NAD 2,5 mM y 4-aminoantipirina al 0,03%, a
cada muestra (3 \mul) (pretratamiento). Aproximadamente 5 minutos
más tarde, se añadió un reactivo de cuantificación del colesterol
(segundo reactivo) (100 \mul) que estaba compuesto de tampón de
MES 100 mM (pH 6) que contenía "Emulgen B-66"
al 1%, colesterol esterasa 1,3 U/ml (producto de Asahi Chemical
Industry Co., Ltd.), colesterol oxidasa 2 U/ml (producto de Asahi
Chemical Industry Co., Ltd.), peroxidasa 5 U/ml (producto de Toyobo
Co. Ltd.) y
disulfobutil-meta-toluidina al
0,04%.
Justo antes de la adición del segundo reactivo y
tras un tiempo transcurrido de cinco minutos después de la adición,
se midió la absorbancia a 600 nm. A partir de la diferencia de
absorbancia, se determinó la concentración de colesterol HDL en la
muestra de suero (procedimiento de 2 puntos). Como sustancia para el
calibrado se usó una muestra de suero control con una concentración
conocida de colesterol HDL. Los procedimientos anteriores se
llevaron a cabo usando el "analizador automático Hitachi
7150".
Se mezcló el "agente de precipitación HDLC 2
Daiichi" (producto de Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) (200
\mul) con la muestra (200 \mul), seguido de centrifugación a
3.000 rpm durante 10 minutos. Se recogió el líquido sobrenadante
(50 \mul) seguido de la mezcla con un reactivo de cuantificación
del colesterol (3 ml) compuesto de tampón de MES 100 mM (pH 6,5)
que contenía Triton X-100 al 1%, colesterol esterasa
1 U/ml, colesterol oxidasa 1 U/ml, peroxidasa 5 U/ml,
disulfobutil-meta-toluidina al 0,04%
y 4-aminoantipirina al 0,04%. Después de incubar la
mezcla resultante a
37ºC durante 10 minutos, se midió su absorbancia a 600 nm para determinar la concentración del colesterol en
37ºC durante 10 minutos, se midió su absorbancia a 600 nm para determinar la concentración del colesterol en
\hbox{la HDL.}
Los resultados se muestran en la Tabla 1 y la
Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Como puede verse fácilmente a partir de los
resultados, el procedimiento de la invención, a pesar de la omisión
de un polianión o similar, mostró una correlación extremadamente
buena con el procedimiento de precipitación convencional.
Se llevaron a cabo las mediciones por otro
procedimiento de la presente invención que era similar al
procedimiento de la invención llevado a cabo en el Ejemplo 1,
excepto que en el primer reactivo la colesterol deshidrogenasa, el
NAD y el tampón de fosfato se sustituyeron por la colesterol oxidasa
5 U/ml (producto de Toyobo Co., Ltd.), peroxidasa 5 U/ml (producto
de Toyobo Co., Ltd.) y tampón MES 100 mM (pH 6). Los valores de
medición se compararon con los obtenidos por el procedimiento de
precipitación en el Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Tabla 2 y
Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Como puede verse fácilmente a partir de los
resultados, el procedimiento de la invención, a pesar de la omisión
de un polianión o similar, mostró una correlación extremadamente
buena con el procedimiento de precipitación convencional.
Usando los reactivos del Ejemplo 1 y Ejemplo 2,
se midieron cinco muestras de suero con diferentes niveles de
triglicéridos. Después los valores de medición se compararon con los
obtenidos por el procedimiento de precipitación. Los resultados se
muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 3, con la presente
invención también se obtuvieron valores de las mediciones de niveles
comparables a los obtenidos por el procedimiento convencional,
respecto a las muestras con niveles altos de triglicéridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo las mediciones de una forma
similar al Ejemplo 2, excepto que en el primer reactivo la
colesterol oxidasa 5 U/ml se cambió para dar las composiciones de
reactivos con las concentraciones y combinaciones de ingredientes
mostradas a continuación en la Tabla 4. Los valores de las
mediciones se compararon con los obtenidos por el procedimiento de
precipitación y también con los obtenidos por el procedimiento de la
invención (sistema de ensayo estándar) del Ejemplo 2. Y además como
segundo reactivo, se usó el mismo reactivo que el segundo reactivo
usado en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
| Sistema de | Contenido de la composición | |
| ensayo | ||
| Estándar | Colesterol oxidasa | |
| (5 U/ml) | ||
| A | Colesterol oxidasa | |
| (1 U/ml) | ||
| B | Ácido flufenámico \hskip0.5cm + \hskip0.5cm colesterol oxidasa | |
| (0,15 mM) | (1 U/ml) | |
| C | Ácido mefenámico \hskip0.5cm + \hskip0.5cm colesterol oxidasa | |
| (0,1 mM) | (1 U/ml) | |
| D | 2,2',6',2''-terpiridina \hskip0.5cm + \hskip0.5cm colesterol oxidasa | |
| (0,5 mM) | (1 U/ml) | |
| E | Ácido tíglico \hskip1cm + \hskip1cm colesterol oxidasa | |
| (50 mM) | (1 U/ml) | |
| F | Ácido fusídico \hskip1cm + \hskip1cm colesterol oxidasa | |
| (0,1 mM) | (1 U/ml) | |
| G | \hskip-0.5cm Acetato de betametasona \hskip0.5cm + \hskip0.5cm colesterol oxidasa | |
| (0,2 mM) | (1 U/ml) | |
| H | Monensina \hskip1cm + \hskip1cm colesterol oxidasa | |
| (0,2 mM) | (1 U/ml) | |
| I | Mevinolina \hskip1cm + \hskip1cm colesterol oxidasa | |
| (0,05 mM) | (1 U/ml) |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cuando la cantidad de colesterol oxidasa se
redujo a una quinta parte (sistema de ensayo A) comparado con el
sistema de ensayo estándar (Ejemplo 2), el coeficiente de
correlación disminuyó ligeramente y aumentó ligeramente el valor de
corte. Sin embargo, cuando se usó el acelerador de la reacción, se
obtuvieron resultados sustancialmente comparables a los del sistema
de ensayo estándar, incluso cuando la cantidad de colesterol oxidasa
era una quinta parte. Por lo tanto, a partir de estos resultados se
hace evidente que el uso de un acelerador de la reacción permite
reducir la cantidad de colesterol oxidasa que hay que usar.
Se prepararon los reactivos J a L mostrados a
continuación en la Tabla 6, que contenían en común peroxidasa 1,25
U/ml (producto de Toyobo Co., Ltd.),
4-aminoantipirina al 0,01%,
disulfobutil-m-toluidina al 0,02% y
NaCl 50 mM y que se diferenciaban entre sí en el tipo y pH del
tampón y las concentraciones de la colesterol oxidasa (producto de
Toyobo Co., Ltd.) y ácido flufenámico (producto de Sigma Chemical
Co.).
\vskip1.000000\baselineskip
| (1) Tampón (pH) | |
| Reactivo | (2) Concentración de colesterol oxidasa |
| (3) Concentración de ácido flufenámico | |
| (1) Bis-Tris 50 mM (pH 6,0) | |
| J | (2) 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 U/ml |
| (3) 0, 0,01, 0,05, 0,1 mM | |
| (1) PIPES 50 mM (pH 7,0) | |
| K | (2) 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 U/ml |
| (3) 0, 0,1, 0,5, 1,0 mM | |
| (1) MOPS 50 mM (pH 8,0) | |
| L | (2) 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 U/ml |
| (3) 0, 1,0, 5,0, 10,0 mM |
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos J a L (300 \mul) se añadieron
por separado a partes alícuotas (3 \mul) de cada muestra de
suero. Después de incubar las muestras resultantes a 37ºC durante 5
minutos, se midieron sus absorbancias a 600 nm. Los procedimientos
anteriores se llevaron a cabo usando el analizador automático
Hitachi 7150.
Se midieron cuatro muestras de suero con los
Reactivos J a L.
Se calcularon las absorbancias relativas
respecto a cada uno de los reactivos J a L para las concentraciones
individuales de colesterol oxidasa y ácido flufenámico, suponiendo
que la absorbancia obtenida con un reactivo que contenía colesterol
oxidasa 5,0 U/ml y ácido flufenámico 0 mM era 100.
Los resultados que se obtuvieron haciendo la
media de las absorbancias relativas de las cuatro muestras se
presentan en la Figura 3, en la que "COD" significa colesterol
oxidasa.
Como puede observarse fácilmente a partir de los
resultados, la absorbancia relativa aumentaba dependiendo de la
concentración de ácido flufenámico independientemente del pH. Por lo
tanto, se ha confirmado que el uso de un acelerador de la reacción
permite reducir la cantidad de colesterol oxidasa que se va a
usar.
También ha quedado claro que el acelerador de la
reacción también se puede usar en un procedimiento para la medición
del colesterol libre o colesterol total, que usa una enzima que
actúa en el colesterol libre como sustrato.
Claims (34)
1. Un procedimiento para pretratar una muestra
que contiene varias lipoproteínas, antes de medir el colesterol que
existe en una específica de dichas lipoproteínas en dicha muestra,
que comprende hacer que una enzima, que actúa en el colesterol
libre como sustrato, actúe en dicha muestra para consumir sólo dicho
colesterol libre previamente, en condiciones en las que dichas
lipoproteínas permanecen sustancialmente sin cambiar.
2. Un procedimiento para pretratar una muestra
que contiene varias lipoproteínas, antes de medir el colesterol que
existe en una específica de dichas lipoproteínas en dicha muestra,
que comprende hacer que una enzima, que actúa en el colesterol
libre como sustrato, y un acelerador de la reacción que se
selecciona de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, actúen
en dicha muestra para consumir sólo dicho colesterol libre
previamente, en condiciones en las que dichas lipoproteínas
permanecen sustancialmente sin cambiar.
3. Un procedimiento de pretratamiento de
acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha enzima es la
colesterol oxidasa o la colesterol deshidrogenasa.
4. Un procedimiento para cuantificar el
colesterol que existe en una lipoproteína específica en una muestra,
que comprende hacer que una enzima que actúa en el colesterol libre
como sustrato, actúe en dicha muestra con dicha lipoproteína
contenida en la misma, para consumir sólo dicho colesterol libre en
condiciones en las que dichas lipoproteínas permanecen
sustancialmente sin cambiar; y después medir dicho colesterol que
existe en dicha lipoproteína específica usando una sustancia que
actúa sólo en dicha lipoproteína específica.
5. Un procedimiento para cuantificar el
colesterol que existe en una lipoproteína específica en una muestra,
que comprende hacer que una enzima que actúa en el colesterol libre
como sustrato, y un acelerador de la reacción que se selecciona de
ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, actúen
en dicha muestra con dicha lipoproteína contenida en la misma, para
consumir sólo dicho colesterol libre en condiciones en las que
dichas lipoproteínas permanecen sustancialmente sin cambiar; y
después medir dicho colesterol que existe en dicha lipoproteína
específica usando una sustancia que actúa sólo en dicha
lipoproteína específica.
6. Un procedimiento de cuantificación de
acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que dicha enzima es la
colesterol oxidasa y/o colesterol deshidrogenasa.
7. Un procedimiento de cuantificación de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
4-6, en el que dicha lipoproteína específica es
lipoproteína de alta densidad.
8. Uso de una composición que comprende una
enzima, que actúa en el colesterol libre como sustrato, y
sustancialmente sin sustancia que actúe en la lipoproteína como
agente de pretratamiento para una muestra en la que se va a medir el
colesterol.
9. Un agente de pretratamiento para medir el
colesterol de una muestra, que comprende una enzima que actúa en el
colesterol libre como sustrato, un acelerador de la reacción que se
selecciona de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y
sustancialmente sin sustancias que actúen en la lipoproteína.
10. Uso de una composición que comprende una
enzima que actúa en el colesterol libre como sustrato, y
sustancialmente sin colesterol esterasa como agente de
pretratamiento para una muestra en la que se va a medir el
colesterol.
colesterol.
11. Un agente de pretratamiento para medir el
colesterol de una muestra, que comprende una enzima, que actúa en
el colesterol libre como sustrato, un acelerador de la reacción que
se selecciona de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y
sustancialmente sin colesterol esterasa.
12. Un agente de pretratamiento de acuerdo con
la reivindicación 9, en el que dicha enzima es la colesterol
deshidrogenasa o colesterol oxidasa.
13. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
oxidasa y una sustancia que consume peróxido de hidrógeno; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica,
colesterol esterasa y un agente de desarrollo de color.
\newpage
14. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
deshidrogenasa y una coenzima; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica y
colesterol esterasa.
15. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
deshidrogenasa y una coenzima; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica,
colesterol oxidasa, colesterol esterasa, peroxidasa y un agente de
desarrollo de color.
16. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
deshidrogenasa, una coenzima y colesterol esterasa; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica,
colesterol oxidasa, peroxidasa y un agente de desarrollo de
color.
17. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
oxidasa, y una sustancia que consume peróxido de hidrógeno; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica; y
(3) un tercer reactivo que comprende colesterol
esterasa y un agente de desarrollo de color.
18. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
deshidrogenasa y una coenzima;
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica; y
(3) un tercer reactivo que comprende colesterol
esterasa.
19. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
deshidrogenasa y una coenzima;
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica; y
(3) un tercer reactivo que comprende colesterol
oxidasa, colesterol esterasa, peroxidasa y un agente de desarrollo
de color.
20. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
deshidrogenasa, una coenzima y una sustancia que consume el
producto de reacción de la coenzima; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica y
colesterol esterasa.
21. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende colesterol
deshidrogenasa, una coenzima y una sustancia que consume el producto
de reacción de la coenzima; y
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica,
colesterol esterasa y un agente de desarrollo de color.
22. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol oxidasa, (b) un acelerador de la reacción seleccionado
de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (c)
una sustancia que consume peróxido de hidrógeno; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica,
colesterol esterasa y un agente de desarrollo de color.
23. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol deshidrogenasa, (b) un acelerador de la reacción
seleccionado de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (c)
una coenzima; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica y
colesterol esterasa.
24. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol oxidasa, (b) un acelerador de la reacción seleccionado
de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, (c)
colesterol esterasa y (d) una sustancia que consume peróxido de
hidrógeno; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica y un
agente de desarrollo de color.
25. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol deshidrogenasa, (b) una coenzima, (c) un acelerador de la
reacción seleccionado de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (d)
colesterol esterasa; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica.
26. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol deshidrogenasa, (b) una coenzima, (c) un acelerador de la
reacción seleccionado de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina y mevionolina, y (d)
colesterol esterasa; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica,
colesterol oxidasa, peroxidasa y un agente de desarrollo de
color.
27. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol oxidasa, (b) un acelerador de la reacción seleccionado
de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (c)
una sustancia que consume peróxido de hidrógeno; y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica; y
(3) un tercer reactivo que comprende colesterol
esterasa y un agente de desarrollo de color.
28. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol deshidrogenasa, (b) un acelerador de la reacción
seleccionado de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (c)
una coenzima;
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica; y
(3) un tercer reactivo que comprende colesterol
esterasa.
29. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol deshidrogenasa, (b) un acelerador de la reacción
seleccionado de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (c)
una coenzima;
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica; y
(3) un tercer reactivo que comprende colesterol
oxidasa, colesterol esterasa, peroxidasa y un agente de desarrollo
de color.
30. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol deshidrogenasa, (b) una coenzima, (c) un acelerador de
la reacción seleccionado de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (d)
una sustancia que consume el producto de reacción de la coenzima;
y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica y
colesterol esterasa.
31. Un kit de cuantificación para el colesterol
en una lipoproteína específica, que comprende los siguientes
reactivos:
(1) un primer reactivo que comprende (a)
colesterol deshidrogenasa, (b) una coenzima, (c) un acelerador de
la reacción seleccionado de ácido flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina, y (d)
una sustancia que consume el producto de reacción de la coenzima;
y
(2) un segundo reactivo que comprende una
sustancia que actúa sólo en dicha lipoproteína específica,
colesterol esterasa y un agente de desarrollo de color.
32. Uso de un compuesto seleccionado de ácido
flufenámico, ácido mefenámico,
2,2',6',2''-terpiridina, ácido tíglico, ácido
fusídico, acetato de betametasona, monensina o mevionolina como
acelerador de la reacción para una enzima que puede actuar en el
colesterol libre como sustrato.
33. El uso de acuerdo con la reivindicación 32,
en el que dicha enzima es la colesterol oxidasa o la colesterol
deshidrogenasa.
34. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 ó
10, en el que dicha enzima es la colesterol deshidrogenasa o la
colesterol oxidasa.
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