ES2299704T3 - Procedimiento de cuantificacion de colesterol en lipoproteina de alta densidad y composiciones de reactivos. - Google Patents
Procedimiento de cuantificacion de colesterol en lipoproteina de alta densidad y composiciones de reactivos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para cuantificar colesterol en una lipoproteína de alta densidad, que comprende una primera etapa de supresión de colesterol en lipoproteínas diferentes de la lipoproteína de alta densidad mediante el tratamiento de una muestra de prueba con colesterol esterasa y colesterol oxidasa en ausencia de un tensoactivo que actúa en la lipoproteína de alta densidad y la eliminación del peróxido de hidrógeno generado; y una segunda etapa de adición de un tensoactivo que actúa específicamente sobre la lipoproteína de alta densidad al producto de dicha primera etapa y la cuantificación del peróxido de hidrógeno generado a partir del colesterol en la lipoproteína de alta densidad mediante las acciones de la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa; caracterizado porque dicha colesterol oxidasa utilizada en dicha primera etapa tiene un peso molecular de no más de 60 kilodaltons.
Description
Procedimiento de cuantificación de colesterol en
lipoproteína de alta densidad y composiciones de reactivos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para cuantificar colesterol en una lipoproteína de
alta densidad (HDL) y a una composición de reactivo utilizada para
el mismo.
Es sabido que HDL se refiere a la eliminación de
colesterol acumulado en las células debido a que recibe colesterol
de varios tejidos incluyendo las paredes de los vasos sanguíneos con
esclerosis arterial, de manera que la HDL es útil para estimar el
riesgo de diversas esclerosis arteriales incluyendo la esclerosis de
arteria coronaria, y que su nivel en sangre es un indicador del
riesgo de aparición de esclerosis arterial.
Los procedimientos para medir el colesterol en
HDL incluyen un procedimiento en el que la HDL se separa de otras
lipoproteínas mediante ultracentrifugación y, a continuación, se
mide la HDL; y un procedimiento en el que el colesterol en HDL se
separa mediante electroforesis, a continuación se tiñe el lípido y
se mide la intensidad del color generado. Sin embargo, estos
procedimientos son complejos o no se pueden ensayar un grupo de
muestras, de manera que no se utilizan habitualmente.
El procedimiento para medir el colesterol en HDL
que se utiliza generalmente en el campo de los tests clínicos es el
procedimiento en el que se añade un agente precipitante a la muestra
para coagular las lipoproteínas diferentes de HDL, extrayendo las
lipoproteínas coaguladas mediante centrifugación, y se mide el
colesterol en el sobrenadante resultante que contiene HDL solo.
Aunque este procedimiento es más sencillo que el procedimiento de
la ultracentrifugación y la electroforesis, no es satisfactoriamente
sencillo, ya que comprende la adición del agente precipitante y la
posterior separación y se necesita una cantidad de muestra
comparativamente grande.
Por otro lado, se han propuesto procedimientos
en los que se separa cuantitativamente el colesterol en HDL mediante
la utilización de enzimas. Por ejemplo, se conoce un procedimiento,
que comprende las etapas de coagulación previa de las lipoproteínas
diferentes de HDL mediante un anticuerpo y polianión, reacción
enzimática del colesterol en HDL solo, la inactivación de la enzima
y redisolución simultánea de la masa coagulada, y la medición de la
absorbancia de la solución resultante (Solicitud de Patente Japonesa
de dominio público (Kokai) No. 6-242110). Sin
embargo, este procedimiento tiene el problema de que es necesario
añadir reactivos al menos tres veces, de manera que este
procedimiento se puede llevar a la práctica sólo mediante aparatos
de análisis limitados. Por lo tanto, este procedimiento no se
utiliza de manera amplia.
Otros procedimientos incluyen un procedimiento
en el que se lleva a cabo una reacción enzimática en presencia de
una sal biliar o un tensoactivo no iónico (Solicitud de Patente
Japonesa de dominio público (Kokai) No. 63-126498);
un procedimiento desarrollado más recientemente en el que el
colesterol en HDL es atrapado específicamente por colesterol
esterasa y/o colesterol oxidasa modificados químicamente en
presencia de un compuesto de clatrato, tal como ciclodextrina
(Solicitud de Patente Japonesa de dominio público (Kokai) No.
7-301636); y un procedimiento en el que las
lipoproteínas diferentes de HDL forman agregados o complejos y, a
continuación, el colesterol en HDL es atrapado mediante una reacción
enzimática (Solicitud de Patente Japonesa de dominio público (Kokai)
No. 8-131197 y 8-201393). Sin
embargo, con estos procedimientos, los resultados para ciertas
muestras son diferentes de los resultados mediante el procedimiento
de precipitación, de manera que sus especificidades son
problemáticas.
El presente solicitante desarrolló previamente
un procedimiento para cuantificar colesterol en HDL que no necesita
una operación de fraccionamiento (Publicación Internacional
WO98/26090), y el reactivo para el mismo se utiliza actualmente de
forma general en tests clínicos reales. En este procedimiento, se
suprime el colesterol en lipoproteínas diferentes de HDL en una
muestra (el término "se suprime" significa en la presente
invención la descomposición de colesterol tipo éster y colesterol
libre y hacer los productos descompuestos indetectables en la
segunda etapa), y el colesterol en HDL se cuantifica específicamente
en la segunda etapa.
Sin embargo, este procedimiento tiene el
problema de que la cantidad medida de HDL es superior a la cantidad
real de HDL para muestras clínicas anormales, tales como en el
trastorno del metabolismo de los lípidos y la anormalidad en las
lipoproteínas. Las muestras anormales a menudo indican valores de
triglicéridos (TG), valores de bilirrubina y similares anormales en
tests bioquímicos, de manera que superando el problema mencionado
anteriormente se aumentará la utilidad del procedimiento de medición
y de este modo la solución requerida al problema.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención es proporcionar un procedimiento para cuantificar el
colesterol en HDL en el que el colesterol en lipoproteínas
diferentes de HDL se suprime n en la primera etapa, y se cuantifica
específicamente el colesterol en HDL en la segunda etapa, mediante
el cual se pueden obtener valores precisos incluso en mediciones de
muestras anormales, tales como en el trastorno del metabolismo de
los lípidos y la anormalidad en las lipoproteínas.
Los presentes inventores investigaron la causa
del error positivo de medición descubriendo que, con las muestras
anormales, el colesterol en las lipoproteínas diferentes de HDL no
se suprime bien en la primera etapa, y el colesterol se transfiere
a la reacción específica de HDL en la segunda etapa posterior,
produciendo de este modo una influencia positiva en la reacción de
HDL.
De este modo, los presentes inventores
estudiaron el método para incrementar el grado de supresión en la
primera etapa descubriendo que el grado de supresión del colesterol
en las lipoproteínas diferentes de HDL aumenta mediante la
utilización de una colesterol oxidasa que tiene un peso molecular
pequeño en la primera etapa.
Más particularmente, las partículas de
lipoproteínas se forman mediante la agregación de colesterol de tipo
éster, colesterol libre, TG (triglicéridos), fosfolípidos y
proteínas. Cada partícula tiene una estructura en la que las
proteínas y los fosfolípidos existen en la superficie de la
partícula, el colesterol libre existe en la misma, y el colesterol
de tipo éster y TG existen en el centro. Mediante la aplicación a
las lipoproteínas de una colesterol oxidasa que tiene un peso
molecular pequeño, la colesterol oxidasa puede entrar en el interior
de lipoproteínas diferentes de HDL y reacciona con el colesterol
libre existente próximo a la superficie para cambiar la estructura
de la partícula, de manera que la colesterol enterasa también actúa
sobre el colesterol de tipo éster, provocando de este modo la
reacción de supresión. En este caso, dado que la HDL es una
lipoproteína de alta densidad y el porcentaje de proteínas en la
superficie es elevado, la colesterol oxidasa de peso molecular
pequeño no puede entrar en el interior de la partícula, de manera
que la reacción no ocurre.
Es decir, la presente invención proporciona un
procedimiento para cuantificar colesterol en una lipoproteína de
alta densidad, que comprende una primera etapa de supresión de
colesterol en lipoproteínas diferentes de la lipoproteína de alta
densidad mediante el tratamiento de una muestra de prueba con
colesterol esterasa y colesterol oxidasa en ausencia de un
tensoactivo que actúa sobre la lipoproteína de alta densidad y la
eliminación del peróxido de hidrógeno generado; y una segunda etapa
de adición de un tensoactivo que actúa específicamente sobre la
lipoproteína de alta densidad al producto de la primera etapa y la
cuantificación del peróxido de hidrógeno generado a partir del
colesterol en la lipoproteína de alta densidad mediante las acciones
de la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa; caracterizado
porque la colesterol oxidasa utilizada en la primera etapa tiene un
peso molecular de no más de 60 kilodaltons. La presente invención
también proporciona una composición de reactivo para cuantificar el
colesterol en una lipoproteína de alta densidad, que se utiliza para
la primera etapa del procedimiento descrito anteriormente según la
presente invención, que comprende la colesterol esterasa, la
colesterol oxidasa que tiene un peso molecular de no más de 60
kilodaltons y un componente que elimina el peróxido de
hidrógeno.
Mediante el procedimiento de la presente
invención, en un procedimiento para medir las HDL en una muestra de
prueba que contiene HDL y otras lipoproteínas tales como LDL, VLDL y
CM, la HDL se puede cuantificar de manera selectiva, simple y
precisa incluso cuando la muestra es una muestra de prueba anormal
tal como TG elevados o una de un paciente que padece de un trastorno
hepático (bilirrubina elevada).
Entre el colesterol contenido en lipoproteínas
se incluye colesterol de tipo éster (éster de colesterol) y
colesterol libre. En esta memoria, el término "colesterol"
incluye a ambos a menos que se especifique lo contrario.
La muestra de prueba sometida al procedimiento
de la presente invención puede ser cualquier muestra que pueda
contener lipoproteínas, tales como HDL, LDL, VLDL y CM. Entre los
ejemplos de muestras de prueba se incluyen fluidos corporales,
tales como sangre, suero y plasma, así como diluciones de los
mismos, aunque las muestras de prueba no se limitan a las mismas.
El procedimiento de la presente invención es particularmente útil
cuando la muestra de prueba es una muestra anormal, tal como una
muestra de sangre que contiene TG en un nivel no inferior a 400
mg/dl, particularmente no inferior a 1000 mg/dl, o que contiene
bilirrubina a un nivel no inferior a 2,00 mg/dl, particularmente no
inferior a 3,00 mg/dl. Estos valores son valores en sangre de
sangre no diluida. Tal y como se ha mencionado anteriormente,
mediante el procedimiento conocido, existe el problema de que la
cantidad determinada de HDL, que se mide frecuentemente para
muestras que contienen un nivel de TG elevado o un nivel de
bilirrubina elevado, es superior que la cantidad real de HDL. Tal
como se mostrará concretamente en los siguientes Ejemplos, mediante
el procedimiento de la presente invención, la cantidad de HDL se
puede medir de manera precisa incluso cuando la muestra es una
muestra de sangre que contiene un nivel de TG elevado o un nivel de
bilirrubina elevado. Debe indicarse que "muestra de sangre"
incluye en la presente invención la sangre completa, suero y plasma,
así como diluciones de la misma.
El procedimiento de la presente invención
comprende una primera etapa y una segunda etapa. En la primera
etapa, el colesterol en LDL, VLDL y CM se suprime en ausencia de un
tensoactivo que actúa sobre HDL. En la segunda etapa posterior, se
cuantifica el colesterol utilizando un tensoactivo para HDL. Como
colesterol oxidasa utilizada en la primera etapa, se utiliza una que
tiene un peso molecular bajo.
El término "suprimir" en la primera etapa
significa descomponer el colesterol, y hacer que los productos
descompuestos sean indetectables en la segunda etapa. Los
procedimientos para suprimir selectivamente el colesterol en las
lipoproteínas diferentes de HDL, es decir, en LDL, VLDL, CM y
similares, incluyen los siguientes procedimientos.
\newpage
Es decir, la colesterol esterasa y la colesterol
oxidasa actúan sobre la muestra de prueba en ausencia de un
tensoactivo que actúa sobre HDL, y se elimina el peróxido de
hidrógeno generado. Mediante la acción de la colesterol esterasa,
se hidroliza el colesterol de tipo éster en las lipoproteínas para
producir colesterol libre y ácidos grasos. El colesterol libre
generado de esta manera y el colesterol libre existente de manera
inherente en las lipoproteínas se oxidan mediante la acción de la
colesterol oxidasa para producir colestenona y peróxido de
hidrógeno. Se elimina el peróxido de hidrógeno generado de esta
manera. Entre los procedimientos para eliminar el peróxido de
hidrógeno se incluyen un procedimiento en el que el peróxido de
hidrógeno se descompone en agua y oxígeno mediante catalasa; y un
procedimiento en el que un compuesto dador de hidrógeno basado en
fenol o basado en anilina, tal como DAOS
(N-etil-N-(2-hidroxisulfopropil)-3,5-dimetoxianilina),
que reacciona con peróxido de hidrógeno para producir una quinona
incolora, reacciona con el peróxido de hidrógeno para convertir el
peróxido de hidrógeno en la quinona incolora, aunque los
procedimientos para eliminar el peróxido de hidrógeno no se limitan
a estos procedimientos.
En la primera etapa mencionada anteriormente,
mediante el tratamiento de la muestra con la colesterol oxidasa de
peso molecular bajo en ausencia de un tensoactivo que actúa sobre
HDL, el colesterol en HDL no reacciona de manera sustancial,
mientras que el colesterol en las otras lipoproteínas, tales como
LDL, VLDL y CM reacciona y se suprime. Mediante esto, en la segunda
etapa posterior, se cuantifica de manera selectiva el colesterol en
HDL.
El peso molecular de la colesterol oxidasa
utilizada en la primera etapa es de 20 kDa a 60 kDa, preferiblemente
de 30 kDa a 40 kDa. La colesterol oxidasa que tiene un peso
molecular en este intervalo, que se utiliza en el procedimiento de
la presente invención, se puede obtener a partir de varios
microorganismos, tales como bacterias y levaduras, y su origen no es
limitativo. Además, dado que dicho colesterol está disponible
comercialmente, se puede utilizar uno disponible comercialmente. En
los procedimientos conocidos para medir la HDL, se pueden haber
utilizado colesterol oxidasas de peso molecular elevado que tienen
pesos moleculares de más de 60 kilodaltons.
La concentración de la colesterol esterasa en la
mezcla de reacción en la primera etapa puede ser preferiblemente de
aproximadamente 0,2 a 2,0 U/ml y son eficaces las colesterol
esterasas producidas por bacterias que pertenecen al género
Pseudomonas. La concentración de la colesterol oxidasa puede ser
preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 1,5 U/ml. En los casos en
los que se utiliza catalasa como componente para eliminar el
peróxido de hidrógeno, la concentración de la catalasa puede ser
preferiblemente de aproximadamente 50 a 2000 U/ml. La concentración
de la peroxidasa utilizada para convertir el peróxido de hidrógeno
en una quinona incolora puede ser preferiblemente de
aproximadamente 0,4 a 1,0 U/ml. La concentración compuesto dador de
hidrógeno basado en fenol o basado en anilina puede ser
preferiblemente de aproximadamente 0,4 a 2,0 mmol/ml.
La reacción en la primera etapa se lleva a cabo
en un tampón con un pH de 5 a 8. El tampón puede ser preferiblemente
tampón fosfato, tampón de glicina, tampón Tris o tampón de Good.
Especialmente, se prefieren Bis-Tris, PIPES, MOPSO,
BES, HEPES y POPSO que son tampón de Good. La concentración del
tampón puede ser preferiblemente de aproximadamente 10 a 500
mM.
Se puede añadir opcionalmente una lipoproteína
hidrolasa a la mezcla de reacción en la primera etapa. La adición de
esta enzima es preferida, ya que especialmente el colesterol en VLDL
reacciona fácilmente. La concentración de esta enzima en la mezcla
de reacción puede ser preferiblemente de aproximadamente 5,0 a 10,0
U/ml. Además, la solución de reacción en la primera etapa puede
contener opcionalmente un tensoactivo que no actúa sustancialmente
sobre HDL y/o el otro componente o componentes, tales como
compuestos de clatrato que incluyen ciclodextrina en una cantidad o
cantidades que no afectan de manera adversa al efecto de la presente
invención.
La temperatura de reacción en la primera etapa
puede ser preferiblemente de aproximadamente 25ºC a 40ºC y los más
preferido es 37ºC. El tiempo de reacción puede ser de
aproximadamente 2 a 10 minutos.
En la siguiente segunda etapa, se añade al
producto de reacción de la primera etapa un tensoactivo que actúa
específicamente sobre HDL, y se cuantifica enzimáticamente el
colesterol en lipoproteína de alta densidad. El término
"tensoactivo que actúa específicamente sobre HDL" significa un
tensoactivo mediante el cual el colesterol en HDL reacciona debido a
la acción de enzimas, tales como la colesterol esterasa y la
colesterol oxidasa (la proporción de reacción no es inferior al 70%,
preferiblemente no inferior al 90%), mientras que el colesterol en
las lipoproteínas diferentes de HDL no reaccionan sustancialmente
(la proporción de reacción no es superior al 30%, preferiblemente
no superior al 20%). El equilibrio de
hidrofilicidad-lipofilicidad (HLB) del tensoactivo
utilizado aquí es de 13 a 14. Como tensoactivo, se prefieren
tensoactivos no iónicos, y son especialmente preferidos derivados de
óxido de polialquileno. Entre los derivados de óxido de
polialquileno, los más preferidos son los óxidos de polietileno. El
rango mencionado anteriormente de HLB se puede conseguir mezclando
una serie de tensoactivos, y también se puede utilizar dicha mezcla
de una serie de tensoactivos. El procedimiento para calcular el HLB
de tensoactivos es bien conocido, y se describe, por ejemplo, en
Hiroshi HORIGUCHI, "New Surfactants", 1986, Sankyo
Shuppan.
Entre los ejemplos específicos preferidos del
tensoactivo se incluyen polioxietilen lauril éter, polioxietilen
cetil éter, polioxietilen oleil éter, éter de polioxietilen de
alcohol superior (C4-C35), polioxietilen octal
fenil éter, polioxietilen nonil fenil éter, polioxibencil fenil éter
y similares, aunque el tensoactivo no se limita a los mismos.
Aunque la concentración del tensoactivo en la
segunda etapa no está limitada, puede ser preferiblemente de un 0,05
a un 3% en peso, más preferiblemente de un 0,1 a un 1,5% en peso en
base a la mezcla total de reacción.
En presencia del tensoactivo mencionado
anteriormente, el colesterol de HDL en la muestra de prueba se puede
cuantificar enzimáticamente. Es decir, en la primera etapa, se
suprime la mayoría del colesterol en las lipoproteínas diferentes
de HDL y con el efecto sinérgico con la reacción en la segunda
etapa, se cuantifica el colesterol en HDL solo.
El procedimiento para cuantificar
enzimáticamente el colesterol per se es bien conocido en la
técnica. Por ejemplo, como en la primera etapa, el colesterol se
cuantifica mediante la generación de peróxido de hidrógeno por éster
de colesterol y colesterol libre mediante las acciones de colesterol
esterasa y colesterol oxidasa, y cuantificando el peróxido de
hidrógeno generado. La cuantificación del peróxido de hidrógeno se
puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, la reacción de peróxido
de hidrógeno con un compuesto que forma un pigmento de quinona, y
midiendo la cantidad del pigmento de quinona generado al medir la
absorbancia o similares. El pigmento de quinona se puede formar, por
ejemplo, reaccionando el peróxido de hidrógeno y
4-amino antipirina y DAOS o HDAOS
(N-(2-hidroxisulfopropil)-3,5-dimetoxianilina).
El pigmento de quinona formado de esta manera tiene la absorbancia
máxima a 593 NM cuando se utiliza DAOS, y tiene la absorbancia
máxima a 583 NM cuando se utiliza HDAOS. Aunque la concentración
del compuesto que produce el pigmento de quinona no está limitado,
la concentración de 4-amino antipirina puede ser,
por ejemplo, preferiblemente de 0,1 a 2,0 mM, más preferiblemente
de 0,5 a 1,5 mM, y la concentración de DAOS o HDAOS puede ser
preferiblemente de 0,1 a 1,5 mM, más preferiblemente de 0,4 a 1,0
mM. Aunque la concentración de la peroxidasa no está limitada, puede
ser preferiblemente de 0,4 a 5 U/ml en la mezcla total de reacción.
Las condiciones de reacción preferidas (temperatura de reacción,
tiempo de reacción, tampón y pH) son las mismas que las condiciones
de reacción preferidas en la primera etapa.
En los casos en los que el peróxido de hidrógeno
generado se descompone con la catalasa, se utiliza un inhibidor de
catalasa, tal como asida sódica, en la segunda etapa con el fin de
inhibir la catalasa, ya que es necesario inhibir la catalasa en la
segunda etapa.
La presente invención también proporciona una
composición de reactivo, según la reivindicación 5, para cuantificar
el colesterol en lipoproteína de alta densidad, que se utiliza para
la primera etapa del procedimiento de la presente invención, que
comprende colesterol esterasa, colesterol oxidasa que tiene un peso
molecular de no más de 60 kilodaltons y un componente que elimina el
peróxido de hidrógeno. Como componente que elimina el peróxido de
hidrógeno se puede utilizar, tal y como se ha mencionado
anteriormente, (1) catalasa o (2) compuesto dador de hidrógeno
basado en fenol o basado en anilina y peroxidasa, o similares. La
proporción de los componentes en la composición de reactivo es la
proporción con la que se consiguen las concentraciones mencionadas
anteriormente cuando se utilizan. La composición de reactivo puede
comprender además el agente tampón y/o lipoproteína hidrolasa
mencionados anteriormente.
La presente invención se describirá a
continuación de forma más concreta mediante ejemplos de la misma.
Debería indicarse sin embargo que la presente invención no se limita
a los ejemplos siguientes. En los ejemplos siguientes, todos los
"%" son en peso a menos que se especifique lo contrario.
Utilizando muestras que contenían cantidades
conocidas de HDL, LDL, VLDL y CM purificadas, respectivamente, se
cuantificó enzimáticamente el colesterol de cada una de las
lipoproteínas en presencia de un tensoactivo no iónico Emulen 911
(polioxietilen nonil éter, HLB 13,7), Emulen B66 (derivado de
polioxietileno, HLB 13,2) o una mezcla de Emulgen B66 y Emulgen A90
(derivado de polioxietileno, HLB 14,5), todos ellos disponibles
comercialmente de KAO CORPORATION. Esta operación se llevó a cabo
tal y como se indica a continuación.
A una solución que contenía 0,5 U/ml de
colesterol esterasa 0,4 U/ml de colesterol oxidasa, 0,5 U/ml de
peroxidasa, 1,0 mmol/l de 4-aminoantipirina y 0,5
mmol/l de HDAOS en 50 mM de tampón PIPES, pH 7,0, se añadió Emulgen
911 o Emulgen B66 a una concentración del 0,1% en peso o se añadió
una mezcla de Emulgen B66/Emulgen A90 (9/1) a una concentración del
1,3% en peso. Se mezclaron veinte microlitros de cada muestra con
2,0 ml del reactivo preparado de esta manera y la mezcla resultante
se dejó reaccionar a 37ºC durante 10 minutos, seguido de la
medición de la absorbancia a 600 nm.
Como resultado, la proporción de reacción (es
decir, la proporción del colesterol cuantificado en el colesterol
total) fue de aproximadamente el 95% para el colesterol en HDL, y
aproximadamente del 18 al 22% para los colesteroles en otras
lipoproteínas.
A partir de esto, se puede observar que Emulgen
911, Emulgen B66 y la mezcla Emulgen B66/Emulgen A90 están dentro
del alcance del término "tensoactivo que actúa específicamente
sobre la lipoproteína de alta densidad".
Se prepararon tres tipos de reactivos que tienen
las siguientes composiciones:
En los tres tipos de reactivos, sólo el peso
molecular de la colesterol oxidasa fue diferente, y todos los otros
componentes fueron igual.
Primer
reactivo
- Tampón BES, pH 7,0
- 100 mmol/l
- HDAOS
- 0,7 mmol/l
- Colesterol esterasa
- 1,5 U/ml
- Catalasa
- 80 U/ml
Segundo
reactivo
- Tampón BES, pH 7,0
- 100 mmol/l
- 4-aminoantipirina
- 4,0 mmol/l
- peroxidasa
- 4,0 U/ml
- azida sódica
- 0,1%
- Emulgen B88 (HLB 13,2) comercialmente disponible de KAO CORPORATION
- {}\hskip0.6cm 1,3%
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las colesterol oxidasas (CO) que tiene
pesos moleculares diferentes se añadió al primer reactivo de cada
reactivo hasta una concentración de 0,8 U/ml.
Reactivo
1
CO de peso molecular elevado (marca comercial:
CON II, disponible comercialmente de Asahi Kasei Corporation, peso
molecular: 61,8 kDa).
Reactivo
2
CO de peso molecular bajo (marca comercial:
COO-321, disponible comercialmente de Toyobo Co.,
Ltd., peso molecular: 55,0 kDa).
Reactivo
3
CO de peso molecular bajo (marca comercial: CO,
disponible comercialmente de Asahi Kasei Corporation, peso
molecular: 38,0 kDa).
Reactivo
4
CO de peso molecular bajo (marca comercial:
COO-311, disponible comercialmente de Toyobo Co.,
Ltd., peso molecular: 34,0 kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
A 4 \mul de cada una de las muestras (suero)
de individuos sanos, muestras de TG elevados y muestras de
bilirrubina (BIL) elevada, se añadieron 300 \mul del primer
reactivo descrito anteriormente calentado previamente a 37ºC y la
mezcla se dejó reaccionar a 37ºC durante 5 minutos. A continuación,
se añadieron 100 \mul del segundo reactivo y la mezcla se dejó
reaccionar a 37ºC durante 5 minutos, seguido de la medición de la
absorbancia a 600 nm de la solución de reacción. Por otro lado, se
determinaron las cantidades de colesterol en HDL en las mismas
muestras mediante el procedimiento de ultracentrifugación en "New
Biochemistry Experiments Lecture", vol. 4, Lipid 1,
"Triglycerides and Lipoproteins", 181 (1993). Se calculó el
porcentaje de la diferencia entre el valor determinado utilizando
cada reactivo y el valor determinado mediante el procedimiento de
ultracentrifugación.
(A-B)/B x
100
(donde A representa el valor
obtenido utilizando cada reactivo y B representa el valor obtenido
mediante el procedimiento de
ultracentrifugación).
Los procedimientos concretos para medir el valor
de TG y el valor de BIL fueron los siguientes:
Como procedimiento para medir el valor de TG, se
utilizó el procedimiento enzimático basado en
LPL-GK-GPO descrito en "Clinical
Test Handbook, vol. 31", 559 (1998). El valor de BIL se midió
utilizando el procedimiento modificado de Michaelsson que es una
modificación del procedimiento de Jendrassik-Grof
descrito en "Clinical Test Handbook, vol 31", 559 (1998).
Los resultados se muestran en las tablas 1 a 3.
Los valores entre paréntesis indican el porcentaje de la diferencia
del valor obtenido mediante el procedimiento de ultracentrifugación,
cuyo porcentaje se calculó mediante la ecuación descrita
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se muestra en la Tabla 1, para las
muestras de individuos sanos, se obtuvieron valores similares a los
valores determinados mediante el procedimiento de
ultracentrifugación cuando se utilizó cualquiera de los reactivos,
mientras que para las muestras de TG elevados o BIL elevados, los
valores obtenidos utilizando una colesterol oxidasa de peso
molecular bajo fueron más próximos a los valores obtenidos mediante
el procedimiento de ultracentrifugación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido
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1998, vol. 31, 559 [0047].
Claims (6)
1. Procedimiento para cuantificar colesterol en
una lipoproteína de alta densidad, que comprende una primera etapa
de supresión de colesterol en lipoproteínas diferentes de la
lipoproteína de alta densidad mediante el tratamiento de una muestra
de prueba con colesterol esterasa y colesterol oxidasa en ausencia
de un tensoactivo que actúa en la lipoproteína de alta densidad y
la eliminación del peróxido de hidrógeno generado; y una segunda
etapa de adición de un tensoactivo que actúa específicamente sobre
la lipoproteína de alta densidad al producto de dicha primera etapa
y la cuantificación del peróxido de hidrógeno generado a partir del
colesterol en la lipoproteína de alta densidad mediante las acciones
de la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa;
caracterizado porque dicha colesterol oxidasa utilizada en
dicha primera etapa tiene un peso molecular de no más de 60
kilodaltons.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha colesterol oxidasa tiene un peso molecular de 30 a 40
kilodaltons.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho tensoactivo que actúa específicamente sobre la
lipoproteína de alta densidad tiene un valor de HLB de 13 a 14.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicho tensoactivo que actúa específicamente sobre la
lipoproteína de alta densidad es un derivado de óxido de
polialquileno.
5. Composición de reactivo para utilizar en un
procedimiento para cuantificar colesterol en una lipoproteína de
alta densidad, comprendiendo dicho procedimiento la supresión del
colesterol en lipoproteínas diferentes de la lipoproteína de alta
densidad mediante el tratamiento de una muestra de prueba con
colesterol esterasa y colesterol oxidasa en ausencia de un
tensoactivo que actúa sobre la lipoproteína de alta densidad y la
eliminación del peróxido de hidrógeno generado,
en la que dicho reactivo comprende:
- (i)
- dicha colesterol esterasa,
- (ii)
- dicha colesterol oxidasa que tiene un peso molecular de no más de 60 kilodaltons y
- (iii)
- un componente que elimina el peróxido de hidrógeno.
6. Composición de reactivo según la
reivindicación 5, en la que dicha colesterol oxidasa tiene un peso
molecular de 30 a 40 kilodaltons.
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