JPWO2003064684A1 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法及び試薬組成物 - Google Patents
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Abstract
第１工程でＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し、第２工程でＨＤＬコレステロールを特異的に定量する測定方法において、脂質代謝異常、リポ蛋白異常等の特殊試料の測定においても正確な値を得られる方法が開示されている。本発明の高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法は、被検試料に高密度リポ蛋白に作用する界面活性剤の非存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去することにより、高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、前記第１工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールをコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量する第２工程とを含み、前記第１工程のコレステロールオキシダーゼとして、分子量が６０キロダルトン以下のものを使用する。
Description
技術分野
本発明は、高密度リポ蛋白中（ＨＤＬ）のコレステロールの定量方法及びそれに用いられる試薬組成物に関する。
背景技術
ＨＤＬは、動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るので細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。
ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法としては、例えば超遠心分離によってＨＤＬを他のリポ蛋白と分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行なってその発色強度を測定する方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的にはほとんど用いられていない。
ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法として現在臨床検査の領域で一般に用いられている方法は、検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法である。この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むため、簡便性で満足できるものでなく、また、比較的多量の検体量を必要とする。
一方、酵素的にＨＤＬ中のコレステロールを分別定量する方法も既に検討されている。例えば、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を抗体とポリアニオンで予め凝集させておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集体を再溶解して吸光度を測定するという方法（特開平６−２４２１１０号公報）がある。しかしながら、この方法は少なくとも３回の試薬を添加する操作が必要なため、限定された分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があった。
また、他の方法としては胆汁酸塩又は非イオン界面活性剤の存在下に、酵素反応を行なう方法（特開昭６３−１２６４９８号公報）、さらに近年ではコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ酵素を化学修飾し、シクロデキストリン等の包接化合物存在下においてＨＤＬ中のコレステロールを特異的に捕える方法（特開平７−３０１６３６号公報）やＨＤＬ以外のリポ蛋白と凝集体や複合体を形成させ、その後にＨＤＬ中のコレステロールを酵素的反応で捕える方法（特開平８−１３１１９７号公報及び特開平８−２０１３９３号公報）が知られているが、いずれも臨床検体の一部のもので沈殿法との乖離が認められる等、特異性の点で問題となっている。
本出願人は、先に分画操作を要しないＨＤＬコレステロール定量方法を開発し（国際公開番号ＷＯ９８／２６０９０）、現在、臨床検査用試薬として検査の場で一般に用いられるようになってきた。この方法は、第１工程で試料中のＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去（消去とはエステル型コレステロールと遊離型コレステロールを分解し、その分解物が第２工程で検出されないようにすることを意味する）し、第２工程でＨＤＬコレステロールを特異的に定量するものである。
しかし、脂質代謝異常、リポ蛋白異常等の特殊な臨床検体においては、測定されるＨＤＬ量が実際のＨＤＬ量より大きくなることが問題であった。特殊な検体の特徴としては生化学検査でのトリグリセリド（ＴＧ）値やビリルビン値等が異常値を示す場合が多く、それ故に、この問題点を回避することが測定法としての有用性を高めることとなり、その方法が望まれる状況にある。
発明の開示
本発明の目的は、第１工程でＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し、第２工程でＨＤＬコレステロールを特異的に定量する測定方法において、脂質代謝異常、リポ蛋白異常等の特殊試料の測定においても正確な値を得られる方法を提供することである。
本願発明者らは正の測定誤差の原因について調査した結果、第１工程の消去時において特殊試料ではＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールがあまり消去されず、続く第２工程のＨＤＬ特異的反応に持ち越され、ＨＤＬの反応に正の影響となっていたことを突き止めた。
そこで、第１工程の消去を高める方法について検討した結果、第１工程に用いるコレステロールオキシダーゼ酵素に分子量の小さなものを使用することでＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの消去が高まることがわかった。
具体的には、リポ蛋白は、エステル型コレステロールや遊離型コレステロール、ＴＧ（中性脂肪）、リン脂質、蛋白の集合体として粒子系を形成している。構造としては表面部位に蛋白とリン脂質、その内側に遊離型コレステロール、中心部にエステル型コレステロールとＴＧが存在している。このリポ蛋白に対し分子量の小さなコレステロールオキシダーゼ酵素を用いることで、ＨＤＬ以外のリポ蛋白に対し、粒子内部へ入り込むことができ、表面の近い位置に存在する遊離型コレステロールと反応し、粒子構造を変化させることで、コレステロールエステラーゼ酵素も作用し消去反応が高まるようになった。この際、ＨＤＬについては高密度のリポ蛋白であり、表面部位の蛋白の占める割合が高いことから、低分子量のコレステロールオキシダーゼ酵素が粒子内に入り込めず、反応は起こらない。
すなわち、本発明は、被検試料に高密度リポ蛋白に作用する界面活性剤の非存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去することにより、高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、前記第１工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールをコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量する第２工程とを含む、高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程のコレステロールオキシダーゼとして、分子量が６０キロダルトン以下のものを使用することを特徴とする方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法の第１工程に用いられる試薬組成物であって、コレステロールエステラーゼと、分子量６０キロダルトン以下のコレステロールオキシダーゼと、過酸化水素除去成分とを少なくとも含む、上記本発明の方法による高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量用試薬組成物を提供する。
本発明の方法によれば、煩雑な分画分離操作を必要とせず、ＨＤＬ並びにＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びＣＭ等の他のリポ蛋白を含む被検試料中のＨＤＬを測定する方法において、高ＴＧや肝臓疾患患者（高ビリルビン）等の特殊被検試料についてもＨＤＬを選択的に、簡便かつ正確に定量することができる。
発明を実施するための最良の形態
リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
本発明の方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法では、とりわけ、被検試料が特殊検体であり、ＴＧ値の観点では４００ｍｇ／ｄＬ以上、特に１０００ｍｇ／ｄＬ以上の血液試料、又はビリルビン値の観点では２．００ｍｇ／ｄＬ以上、特に３．００ｍｇ／ｄＬ以上の血液試料である場合に威力を発揮する。なお、これらの値は未希釈の血中値である。上記の通り、公知の方法では、これらの高ＴＧ値又は高ビリルビン値血液試料に比較的多く測定されるＨＤＬ量が、現実のＨＤＬ量よりも大きくなるという問題が生じていた。下記実施例において具体的に示されるように、本発明の方法によれば、被検試料が高ＴＧ値又は高ビリルビン値血液試料である場合でも正確にＨＤＬ量を測定することができる。なお、ここで言う、「血液試料」には、全血、血清及び血漿並びにこれらの希釈物が包含される。
本発明の方法は、第１工程及び第２工程から成り、第１工程ではＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において、被検試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを消去し、続く第２工程では、ＨＤＬに特異的な界面活性剤を用いてコレステロールを定量する。その際、第１工程でのコレステロールオキシダーゼ酵素に低分子量のものを使用する。
第１工程における「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＨＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることができる。
すなわち、ＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において、被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去する。コレステロールエステラーゼの作用により、リポ蛋白中のエステル型コレステロールが加水分解されて遊離型コレステロールと脂肪酸が生じる。次いで、この生じた遊離型コレステロールと元々リポ蛋白中に存在する遊離型コレステロールがコレステロールオキシダーゼの作用で酸化されてコレステノンと過酸化水素が生じる。この生じた過酸化水素を除去する。過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼの作用により、例えばＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）のような、過酸化水素と反応して無色キノンを生じるフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と反応させて過酸化水素を無色キノンに転化する方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
上記第１工程は、ＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において低分子量のコレステロールオキシダーゼ酵素を作用させることで、ＨＤＬ中のコレステロールはほとんど反応せず、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等の他のリポ蛋白中のコレステロールが反応して消去される。さらに、次の第２工程においてＨＤＬ特異的な界面活性剤の作用によりＨＤＬ中のコレステロールが選択的に定量される。
第１工程で用いるコレステロールオキシダーゼ酵素の分子量は２０〜６０ｋＤａであり、好ましくは３０〜４０ｋＤａである。なお、本発明の方法に用いられる、この範囲の分子量を有するコレステロールオキシダーゼは、各種の細菌や酵母等の微生物等から得ることができるが、その由来については何ら限定されるものではなく、また、このようなコレステロールオキシダーゼは市販されているので、市販品を用いることができる。なお、公知のＨＤＬの測定方法では、分子量６０キロダルトンを超える高分子量のコレステロールオキシダーゼが用いられていた。
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜２．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜１．５Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。さらに、過酸化水素除去成分としてカタラーゼを用いる場合には、カタラーゼの濃度は５０〜２０００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍＬが好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．４〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
第１工程の反応は、ｐＨ５〜８の緩衝液中で行なう。緩衝液としてはリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液が好ましい。特にグッドの緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
なお、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白加水分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロールが反応し易くなるので好ましい。この酵素の反応液中の濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、第１工程の反応液中には、任意的に、ＨＤＬに実質的に作用しない界面活性剤やシクロデキストリン等の包接化合物等の他の成分が本発明の効果を阻害しない含量で含まれていてもよい。
第１工程の反応温度は２５℃〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は２〜１０分間程度でよい。
続く第２工程では、前記第１工程の産物に、ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する。ここで、「ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤」とは、当該界面活性剤の存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ等の酵素を作用させた場合に、ＨＤＬ中のコレステロールは反応する（反応率７０％以上、好ましくは９０％以上）が、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど反応しない（反応率３０％以下、好ましくは２０％以下）こととなる界面活性剤を言う。ここで用いる界面活性剤の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）は、１３〜１４である。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤が好ましく、とりわけ、ポリアルキレンオキサイド誘導体が好ましい。また、ポリアルキレンオキサイド誘導体の中でもポリエチレンオキサイド誘導体が最も好ましい。また、複数の界面活性剤を混合することによりＨＬＢを上記の範囲内に調整することもでき、このような複数の界面活性剤の混合物を用いることもできる。なお、界面活性剤のＨＬＢの算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀口博著、昭和６１年、三共出版に記載されている。
好ましい界面活性剤の具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４〜３５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシベンジルフェニルエーテル等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
第２工程における界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．０５〜３重量％が好ましく、さらには０．１〜１．５重量％が好ましい。
上記界面活性剤の存在下において、被検試料中のＨＤＬコレステロールを酵素的に定量することができる。すなわち、第１工程では、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールが大部分消去されるが第２工程での反応との相乗効果によりＨＤＬ中のコレステロールのみが定量される。
コレステロールの酵素的な定量方法自体はこの分野において周知であり、例えば第１工程と同様、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用によりコレステロールエステル及び遊離型コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素を定量することにより行なう。過酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等により測定することにより行なうことができる。キノン色素は、例えば過酸化水素と４−アミノアンチピリン及びＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）を反応させることにより形成される。これにより形成されるキノン色素は、ＤＡＯＳを用いた場合には波長５９３ｎｍに最大吸収を有し、ＨＤＡＯＳを用いた場合には波長５８３ｎｍに最大吸収を有する。キノン色素を生成する化合物の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、例えば４−アミノアンチピリンでは好ましくは０．１〜２．０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１．５ｍＭであり、ＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳでは好ましくは０．１〜１．５ｍＭ、さらに好ましくは０．４〜１．０ｍＭである。また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．４〜５Ｕ／ｍＬが好ましい。なお、第２工程の好ましい反応条件（反応温度、反応時間、緩衝液、ｐＨ）は、第１工程の好ましい反応条件と同じである。
なお、第１工程において、生じた過酸化水素をカタラーゼで分解する場合には、第２工程ではこのカタラーゼを阻害する必要があるので、第２工程において例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を用いてカタラーゼを阻害する。
本発明は、また、上記本発明の方法の第１工程に用いられる試薬組成物であって、コレステロールエステラーゼと、分子量６０キロダルトン以下のコレステロールオキシダーゼと、過酸化水素除去成分とを少なくとも含む、本発明の方法による高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量用試薬組成物をも提供する。過酸化水素除去成分としては、上記の通り、（１）カタラーゼ、又は（２）フェノール系若しくはアニリン系水素供与体化合物とペルオキシダーゼ等を用いることができる。試薬組成物中の各成分の比率は、使用時に上記した各濃度になる比率である。試薬組成物は、さらに、上記した緩衝剤やリポ蛋白加水分解酵素を含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記例において、「％」は特に断りがない限り「重量％」を示す。
参考例
既知濃度の精製ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ又はＣＭを含む試料を用い、花王（株）製非イオン性界面活性剤エマルゲン９１１（ポリオキシエチレンノニルエーテル、ＨＬＢ１３．７）、エマルゲンＢ６６（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ１３．２）、又はエマルゲンＢ６６とエマルゲンＡ９０（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ１４．５）の混合物の存在下で各リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量した。この操作は具体的に次のように行なった。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０、コレステロールエステラーゼ０．５Ｕ／ｍＬ、コレステロールオキシダーゼ０．４Ｕ／ｍＬ、ペルオキシダーゼ０．５Ｕ／ｍＬ、４−アミノアンチピリン１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＤＡＯＳ ０．５ｍｍｏｌ／Ｌに、エマルゲン９１１若しくはエマルゲンＢ６６を０．１重量％、又はエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物（９／１）１．３重量％を含む試薬を調整し、試料２０μＬに試薬２．０ｍＬを混和し、３７℃、１０分間反応させた後、６００ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、コレステロールの反応率（コレステロール中の定量されたコレステロールの割合）は、ＨＤＬ中のコレステロールが約９５％、その他のリポ蛋白中のコレステロールが約１８〜２２％であった。
このことから、エマルゲン９１１、エマルゲンＢ６６、及びエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物は、本発明で言う「高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤」に該当する。
実施例１
次の組成から成る３種類の試薬を調製した。
３種類の試薬は第１試薬中に用いるコレステロールオキシダーゼ酵素の分子量が異なり、それ以外の成分は全て同じとした。
＜共通成分＞
第１試薬
第２試薬
＜試薬＞
各試薬に分子量の異なるコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）を第１試薬中に０．８Ｕ／ｍＬになるように添加。
試薬１
高分子量ＣＯ（商品名：ＣＯＮ ＩＩ、旭化成社製、分子量６１．８ＫＤａ）
試薬２
低分子量ＣＯ（商品名：ＣＯＯ−３２１、東洋紡社製、分子量５５．０ＫＤａ）
試薬３
低分子量ＣＯ（商品名：ＣＯ、旭化成社製、分子量３８．０ＫＤａ）
試薬４
低分子量ＣＯ（商品名：ＣＯＯ−３１１、東洋紡社製、分子量３４．０ＫＤａ） 健常者、高ＴＧ、高ビリルビン（ＢＩＬ）の試料（血清）各４μＬに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μＬを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１００μＬを３７℃で５分間反応させ、反応液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロール量を算出した。一方、「新生化学実験講座第４巻 脂質Ｉ 中性脂質とリポ蛋白質」、１８１（１９９３）に記載された超遠心法により同じ試料中のＨＤＬコレステロールを定量し、超遠心法の値に対する各試薬の差の％を算出した。
（各試薬値−超遠心法値）／超遠心法値 ×１００
また、ＴＧ値及びＢＩＬ値の具体的な測定方法は次の通りであった。
ＴＧ値の測定方法としては「臨床検査法提要 第３１版」、５５９（１９９８）に記載されたＬＰＬ−ＧＫ−ＧＰＯ系による酵素法を使用した。ＢＩＬ値は「臨床検査法提要 第３１版」、５８４（１９９８）に記載されたＪｅｎｄｒａｓｓｉｋ−Ｇｒｏｆ法のＭｉｃｈａｅｌｓｓｏｎ変法を使用した。
結果を記表１ないし表３に示す。なお、括弧内の数値は、上記式により算出される、超遠心法値との差の％を示す。
表１に示されるように、健常者ではどの試薬も超遠心と同様な値が得られているが、高ＴＧや高ＢＩＬでは低分子量のコレステロールオキシダーゼ酵素を用いた本発明の方が、超遠心の値に近いことがわかる。
本発明は、高密度リポ蛋白中（ＨＤＬ）のコレステロールの定量方法及びそれに用いられる試薬組成物に関する。
背景技術
ＨＤＬは、動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るので細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。
ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法としては、例えば超遠心分離によってＨＤＬを他のリポ蛋白と分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行なってその発色強度を測定する方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的にはほとんど用いられていない。
ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法として現在臨床検査の領域で一般に用いられている方法は、検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法である。この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むため、簡便性で満足できるものでなく、また、比較的多量の検体量を必要とする。
一方、酵素的にＨＤＬ中のコレステロールを分別定量する方法も既に検討されている。例えば、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を抗体とポリアニオンで予め凝集させておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集体を再溶解して吸光度を測定するという方法（特開平６−２４２１１０号公報）がある。しかしながら、この方法は少なくとも３回の試薬を添加する操作が必要なため、限定された分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があった。
また、他の方法としては胆汁酸塩又は非イオン界面活性剤の存在下に、酵素反応を行なう方法（特開昭６３−１２６４９８号公報）、さらに近年ではコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ酵素を化学修飾し、シクロデキストリン等の包接化合物存在下においてＨＤＬ中のコレステロールを特異的に捕える方法（特開平７−３０１６３６号公報）やＨＤＬ以外のリポ蛋白と凝集体や複合体を形成させ、その後にＨＤＬ中のコレステロールを酵素的反応で捕える方法（特開平８−１３１１９７号公報及び特開平８−２０１３９３号公報）が知られているが、いずれも臨床検体の一部のもので沈殿法との乖離が認められる等、特異性の点で問題となっている。
本出願人は、先に分画操作を要しないＨＤＬコレステロール定量方法を開発し（国際公開番号ＷＯ９８／２６０９０）、現在、臨床検査用試薬として検査の場で一般に用いられるようになってきた。この方法は、第１工程で試料中のＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去（消去とはエステル型コレステロールと遊離型コレステロールを分解し、その分解物が第２工程で検出されないようにすることを意味する）し、第２工程でＨＤＬコレステロールを特異的に定量するものである。
しかし、脂質代謝異常、リポ蛋白異常等の特殊な臨床検体においては、測定されるＨＤＬ量が実際のＨＤＬ量より大きくなることが問題であった。特殊な検体の特徴としては生化学検査でのトリグリセリド（ＴＧ）値やビリルビン値等が異常値を示す場合が多く、それ故に、この問題点を回避することが測定法としての有用性を高めることとなり、その方法が望まれる状況にある。
発明の開示
本発明の目的は、第１工程でＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去し、第２工程でＨＤＬコレステロールを特異的に定量する測定方法において、脂質代謝異常、リポ蛋白異常等の特殊試料の測定においても正確な値を得られる方法を提供することである。
本願発明者らは正の測定誤差の原因について調査した結果、第１工程の消去時において特殊試料ではＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールがあまり消去されず、続く第２工程のＨＤＬ特異的反応に持ち越され、ＨＤＬの反応に正の影響となっていたことを突き止めた。
そこで、第１工程の消去を高める方法について検討した結果、第１工程に用いるコレステロールオキシダーゼ酵素に分子量の小さなものを使用することでＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの消去が高まることがわかった。
具体的には、リポ蛋白は、エステル型コレステロールや遊離型コレステロール、ＴＧ（中性脂肪）、リン脂質、蛋白の集合体として粒子系を形成している。構造としては表面部位に蛋白とリン脂質、その内側に遊離型コレステロール、中心部にエステル型コレステロールとＴＧが存在している。このリポ蛋白に対し分子量の小さなコレステロールオキシダーゼ酵素を用いることで、ＨＤＬ以外のリポ蛋白に対し、粒子内部へ入り込むことができ、表面の近い位置に存在する遊離型コレステロールと反応し、粒子構造を変化させることで、コレステロールエステラーゼ酵素も作用し消去反応が高まるようになった。この際、ＨＤＬについては高密度のリポ蛋白であり、表面部位の蛋白の占める割合が高いことから、低分子量のコレステロールオキシダーゼ酵素が粒子内に入り込めず、反応は起こらない。
すなわち、本発明は、被検試料に高密度リポ蛋白に作用する界面活性剤の非存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去することにより、高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、前記第１工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールをコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量する第２工程とを含む、高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程のコレステロールオキシダーゼとして、分子量が６０キロダルトン以下のものを使用することを特徴とする方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法の第１工程に用いられる試薬組成物であって、コレステロールエステラーゼと、分子量６０キロダルトン以下のコレステロールオキシダーゼと、過酸化水素除去成分とを少なくとも含む、上記本発明の方法による高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量用試薬組成物を提供する。
本発明の方法によれば、煩雑な分画分離操作を必要とせず、ＨＤＬ並びにＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びＣＭ等の他のリポ蛋白を含む被検試料中のＨＤＬを測定する方法において、高ＴＧや肝臓疾患患者（高ビリルビン）等の特殊被検試料についてもＨＤＬを選択的に、簡便かつ正確に定量することができる。
発明を実施するための最良の形態
リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
本発明の方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法では、とりわけ、被検試料が特殊検体であり、ＴＧ値の観点では４００ｍｇ／ｄＬ以上、特に１０００ｍｇ／ｄＬ以上の血液試料、又はビリルビン値の観点では２．００ｍｇ／ｄＬ以上、特に３．００ｍｇ／ｄＬ以上の血液試料である場合に威力を発揮する。なお、これらの値は未希釈の血中値である。上記の通り、公知の方法では、これらの高ＴＧ値又は高ビリルビン値血液試料に比較的多く測定されるＨＤＬ量が、現実のＨＤＬ量よりも大きくなるという問題が生じていた。下記実施例において具体的に示されるように、本発明の方法によれば、被検試料が高ＴＧ値又は高ビリルビン値血液試料である場合でも正確にＨＤＬ量を測定することができる。なお、ここで言う、「血液試料」には、全血、血清及び血漿並びにこれらの希釈物が包含される。
本発明の方法は、第１工程及び第２工程から成り、第１工程ではＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において、被検試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを消去し、続く第２工程では、ＨＤＬに特異的な界面活性剤を用いてコレステロールを定量する。その際、第１工程でのコレステロールオキシダーゼ酵素に低分子量のものを使用する。
第１工程における「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＨＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることができる。
すなわち、ＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において、被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去する。コレステロールエステラーゼの作用により、リポ蛋白中のエステル型コレステロールが加水分解されて遊離型コレステロールと脂肪酸が生じる。次いで、この生じた遊離型コレステロールと元々リポ蛋白中に存在する遊離型コレステロールがコレステロールオキシダーゼの作用で酸化されてコレステノンと過酸化水素が生じる。この生じた過酸化水素を除去する。過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼの作用により、例えばＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）のような、過酸化水素と反応して無色キノンを生じるフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と反応させて過酸化水素を無色キノンに転化する方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
上記第１工程は、ＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において低分子量のコレステロールオキシダーゼ酵素を作用させることで、ＨＤＬ中のコレステロールはほとんど反応せず、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等の他のリポ蛋白中のコレステロールが反応して消去される。さらに、次の第２工程においてＨＤＬ特異的な界面活性剤の作用によりＨＤＬ中のコレステロールが選択的に定量される。
第１工程で用いるコレステロールオキシダーゼ酵素の分子量は２０〜６０ｋＤａであり、好ましくは３０〜４０ｋＤａである。なお、本発明の方法に用いられる、この範囲の分子量を有するコレステロールオキシダーゼは、各種の細菌や酵母等の微生物等から得ることができるが、その由来については何ら限定されるものではなく、また、このようなコレステロールオキシダーゼは市販されているので、市販品を用いることができる。なお、公知のＨＤＬの測定方法では、分子量６０キロダルトンを超える高分子量のコレステロールオキシダーゼが用いられていた。
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜２．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜１．５Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。さらに、過酸化水素除去成分としてカタラーゼを用いる場合には、カタラーゼの濃度は５０〜２０００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍＬが好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．４〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
第１工程の反応は、ｐＨ５〜８の緩衝液中で行なう。緩衝液としてはリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液が好ましい。特にグッドの緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
なお、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白加水分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロールが反応し易くなるので好ましい。この酵素の反応液中の濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、第１工程の反応液中には、任意的に、ＨＤＬに実質的に作用しない界面活性剤やシクロデキストリン等の包接化合物等の他の成分が本発明の効果を阻害しない含量で含まれていてもよい。
第１工程の反応温度は２５℃〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は２〜１０分間程度でよい。
続く第２工程では、前記第１工程の産物に、ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する。ここで、「ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤」とは、当該界面活性剤の存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ等の酵素を作用させた場合に、ＨＤＬ中のコレステロールは反応する（反応率７０％以上、好ましくは９０％以上）が、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど反応しない（反応率３０％以下、好ましくは２０％以下）こととなる界面活性剤を言う。ここで用いる界面活性剤の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）は、１３〜１４である。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤が好ましく、とりわけ、ポリアルキレンオキサイド誘導体が好ましい。また、ポリアルキレンオキサイド誘導体の中でもポリエチレンオキサイド誘導体が最も好ましい。また、複数の界面活性剤を混合することによりＨＬＢを上記の範囲内に調整することもでき、このような複数の界面活性剤の混合物を用いることもできる。なお、界面活性剤のＨＬＢの算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀口博著、昭和６１年、三共出版に記載されている。
好ましい界面活性剤の具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４〜３５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシベンジルフェニルエーテル等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
第２工程における界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．０５〜３重量％が好ましく、さらには０．１〜１．５重量％が好ましい。
上記界面活性剤の存在下において、被検試料中のＨＤＬコレステロールを酵素的に定量することができる。すなわち、第１工程では、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールが大部分消去されるが第２工程での反応との相乗効果によりＨＤＬ中のコレステロールのみが定量される。
コレステロールの酵素的な定量方法自体はこの分野において周知であり、例えば第１工程と同様、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用によりコレステロールエステル及び遊離型コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素を定量することにより行なう。過酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等により測定することにより行なうことができる。キノン色素は、例えば過酸化水素と４−アミノアンチピリン及びＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）を反応させることにより形成される。これにより形成されるキノン色素は、ＤＡＯＳを用いた場合には波長５９３ｎｍに最大吸収を有し、ＨＤＡＯＳを用いた場合には波長５８３ｎｍに最大吸収を有する。キノン色素を生成する化合物の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、例えば４−アミノアンチピリンでは好ましくは０．１〜２．０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１．５ｍＭであり、ＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳでは好ましくは０．１〜１．５ｍＭ、さらに好ましくは０．４〜１．０ｍＭである。また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．４〜５Ｕ／ｍＬが好ましい。なお、第２工程の好ましい反応条件（反応温度、反応時間、緩衝液、ｐＨ）は、第１工程の好ましい反応条件と同じである。
なお、第１工程において、生じた過酸化水素をカタラーゼで分解する場合には、第２工程ではこのカタラーゼを阻害する必要があるので、第２工程において例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を用いてカタラーゼを阻害する。
本発明は、また、上記本発明の方法の第１工程に用いられる試薬組成物であって、コレステロールエステラーゼと、分子量６０キロダルトン以下のコレステロールオキシダーゼと、過酸化水素除去成分とを少なくとも含む、本発明の方法による高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量用試薬組成物をも提供する。過酸化水素除去成分としては、上記の通り、（１）カタラーゼ、又は（２）フェノール系若しくはアニリン系水素供与体化合物とペルオキシダーゼ等を用いることができる。試薬組成物中の各成分の比率は、使用時に上記した各濃度になる比率である。試薬組成物は、さらに、上記した緩衝剤やリポ蛋白加水分解酵素を含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記例において、「％」は特に断りがない限り「重量％」を示す。
参考例
既知濃度の精製ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ又はＣＭを含む試料を用い、花王（株）製非イオン性界面活性剤エマルゲン９１１（ポリオキシエチレンノニルエーテル、ＨＬＢ１３．７）、エマルゲンＢ６６（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ１３．２）、又はエマルゲンＢ６６とエマルゲンＡ９０（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ１４．５）の混合物の存在下で各リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量した。この操作は具体的に次のように行なった。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０、コレステロールエステラーゼ０．５Ｕ／ｍＬ、コレステロールオキシダーゼ０．４Ｕ／ｍＬ、ペルオキシダーゼ０．５Ｕ／ｍＬ、４−アミノアンチピリン１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＤＡＯＳ ０．５ｍｍｏｌ／Ｌに、エマルゲン９１１若しくはエマルゲンＢ６６を０．１重量％、又はエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物（９／１）１．３重量％を含む試薬を調整し、試料２０μＬに試薬２．０ｍＬを混和し、３７℃、１０分間反応させた後、６００ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、コレステロールの反応率（コレステロール中の定量されたコレステロールの割合）は、ＨＤＬ中のコレステロールが約９５％、その他のリポ蛋白中のコレステロールが約１８〜２２％であった。
このことから、エマルゲン９１１、エマルゲンＢ６６、及びエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物は、本発明で言う「高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤」に該当する。
実施例１
次の組成から成る３種類の試薬を調製した。
３種類の試薬は第１試薬中に用いるコレステロールオキシダーゼ酵素の分子量が異なり、それ以外の成分は全て同じとした。
＜共通成分＞
第１試薬
各試薬に分子量の異なるコレステロールオキシダーゼ（ＣＯ）を第１試薬中に０．８Ｕ／ｍＬになるように添加。
試薬１
高分子量ＣＯ（商品名：ＣＯＮ ＩＩ、旭化成社製、分子量６１．８ＫＤａ）
試薬２
低分子量ＣＯ（商品名：ＣＯＯ−３２１、東洋紡社製、分子量５５．０ＫＤａ）
試薬３
低分子量ＣＯ（商品名：ＣＯ、旭化成社製、分子量３８．０ＫＤａ）
試薬４
低分子量ＣＯ（商品名：ＣＯＯ−３１１、東洋紡社製、分子量３４．０ＫＤａ） 健常者、高ＴＧ、高ビリルビン（ＢＩＬ）の試料（血清）各４μＬに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μＬを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１００μＬを３７℃で５分間反応させ、反応液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロール量を算出した。一方、「新生化学実験講座第４巻 脂質Ｉ 中性脂質とリポ蛋白質」、１８１（１９９３）に記載された超遠心法により同じ試料中のＨＤＬコレステロールを定量し、超遠心法の値に対する各試薬の差の％を算出した。
（各試薬値−超遠心法値）／超遠心法値 ×１００
また、ＴＧ値及びＢＩＬ値の具体的な測定方法は次の通りであった。
ＴＧ値の測定方法としては「臨床検査法提要 第３１版」、５５９（１９９８）に記載されたＬＰＬ−ＧＫ−ＧＰＯ系による酵素法を使用した。ＢＩＬ値は「臨床検査法提要 第３１版」、５８４（１９９８）に記載されたＪｅｎｄｒａｓｓｉｋ−Ｇｒｏｆ法のＭｉｃｈａｅｌｓｓｏｎ変法を使用した。
結果を記表１ないし表３に示す。なお、括弧内の数値は、上記式により算出される、超遠心法値との差の％を示す。
Claims (5)
- 被検試料に高密度リポ蛋白に作用する界面活性剤の非存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去することにより、高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、前記第１工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールをコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量する第２工程とを含む、高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第１工程のコレステロールオキシダーゼとして、分子量が６０キロダルトン以下のものを使用することを特徴とする方法。
- 前記コレステロールオキシダーゼの分子量が３０〜４０キロダルトンである請求項１記載の方法。
- 高密度リポ蛋白に特異的に作用する前記界面活性剤は、ＨＬＢ値が１３〜１４の界面活性剤である請求項１又は２記載の方法。
- 高密度リポ蛋白に特異的に作用する前記界面活性剤は、ポリアルキレンオキサイド誘導体である請求項３記載の方法。
- 請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法の第１工程に用いられる試薬組成物であって、コレステロールエステラーゼと、分子量６０キロダルトン以下のコレステロールオキシダーゼと、過酸化水素除去成分とを少なくとも含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法による高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量用試薬組成物。
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