KR20060127111A - 초저밀도 지단백질 잔유물 (ｖｌｄｌ 잔유물) 중의콜레스테롤 정량 방법, 시약 및 키트 - Google Patents

초저밀도 지단백질 잔유물 (ｖｌｄｌ 잔유물) 중의콜레스테롤 정량 방법, 시약 및 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20060127111A
KR20060127111A KR1020067015426A KR20067015426A KR20060127111A KR 20060127111 A KR20060127111 A KR 20060127111A KR 1020067015426 A KR1020067015426 A KR 1020067015426A KR 20067015426 A KR20067015426 A KR 20067015426A KR 20060127111 A KR20060127111 A KR 20060127111A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cyclodextrin
cholesterol
polyoxyethylene
reagent
density lipoprotein
Prior art date
Application number
KR1020067015426A
Other languages
English (en)
Inventor
가즈히토 미야우치
Original Assignee
교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 교와 메덱스 가부시키가이샤 filed Critical 교와 메덱스 가부시키가이샤
Publication of KR20060127111A publication Critical patent/KR20060127111A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

초저밀도 지단백질 잔유물에 함유된 에스테르-형태 및 유리-형태 콜레스테롤 (이하, 통틀어 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤로 언급함) 을 정량한다. 시료를 함유하는 수성 매질에서, (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌/폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르, 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용하게 할 수 있음) 의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테르 가수분해효소 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용하게 한다.

Description

초저밀도 지단백질 잔유물 (ＶＬＤＬ 잔유물) 중의 콜레스테롤 정량 방법, 시약 및 키트 {METHOD, REAGENT, AND KIT FOR DETERMINING CHOLESTEROL IN VERY-LOW-DENSITY LIPOPROTEIN REMNANT (VLDL REMNANT)}
본 발명은 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 (VLDL 잔유물) 중의 콜레스테롤의 정량 방법, 시약 및 키트에 관한 것이다.
혈액은 다양한 종류의 지단백질을 함유한다. 이러한 지단백질은 그들의 비중에 따라, 유미미립 (chylomicron, 이하 CM 으로 약칭함), 초저밀도 지단백질 (이하 VLDL 로 약칭함) 및 고밀도 지단백질 (이하 HDL 로 약칭함) 로 분류된다. 지단백질의 각 분류는 콜레스테롤, 트리글리세리드, 인지질 및 단백질과 같은 구성성분의 특정 비를 가지며, 생체내에서 상이한 작용을 갖는다.
이러한 지단백질 외에도, 혈액은 또한 지단백질 리파아제의 활성에 의해 지단백질의 대사 및 분해 과정에서 형성된 잔유물 지단백을 함유한다. 잔유물 지단백질은 유미미립 잔유물 (이하 CM 잔유물로 약칭함) 및 초저밀도 지단백질 잔유물 (이하 VLDL 잔유물로 약칭함) 로 분류된다. VLDL 잔유물에 포함되는 중간밀도 지단백질 (이하 IDL 로 약칭함) 은 비중이 1.006 내지 1.019 인 지단백질이고, 좁은 의미에서 VLDL 잔유물이라고 불린다.
잔유물 지단백질은 트리글리세리드 (TG) 가 풍부한 지단백질이고, apoE 및 콜레스테롤이 비교적 풍부하다. CM 잔유물은 주 아포단백질로서 apoB-48 및 apoE 를 갖고, VLDL 잔유물은 주 아포단백질로서 apoB-100 및 apoE 를 갖는다.
건강한 사람에서, 잔유물 지단백질은 간에서 빠르게 대사되어, 수용체 내로 결합된다. 그러나, 대사 장애 및 일상의 나쁜 생활습관 예를 들면 과식 및 운동 부족이 혈액 내에 축적되는 잔유물 지단백질의 증가를 가져오고, 혈액 내에 축적되는 이러한 잔유물 지단백질은 동맥경화증 발병의 가능성이 높은 유형 III 고지혈증 등을 유발한다. 동맥경화증 발병에서, 혈액 내에 축적되는 잔유물 지단백질은 동맥 벽의 대식세포 내로 쉽게 결합되고, 초기 병변을 형성하는 것으로 간주된다. 그러므로, 잔유물 지단백질은 동맥경화 질병에 대한 위험 인자 중 하나로 간주된다.
주 아포단백질로서 apoB-48 을 갖는 CM 잔유물은, 간의 LDL 수용체-관련 단백질 (LRP) 을 통해 결합되는 것으로 간주된다. 주 아포단백질로서 apoB-100 을 갖는 VLDL 잔유물은 간의 LDL 수용체를 통해 결합되는 것으로 간주된다. 최근, VLDL 수용체 경로는 잔유물 지단백질에 의해 대식세포로부터 거품세포 형성에 대한 신규 경로 중 하나로 보고되고 있다. 즉, VLDL 수용체의 발현이 단핵구로부터 대식세포로의 분화 과정을 촉진하고, 잔유물 지단백질이 VLDL 수용체를 통해 대식세포로부터 거품세포 형성을 야기하는 것으로 보고되고 있다.
지금까지 보고된 잔유물 지단백질 또는 잔유물 지단백질 중의 콜레스테롤의 정량 방법에는 전기이동법, 초원심분리법, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 법 및 면역흡수법이 포함된다. 전기이동법으로는, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 법 및 아가로오스 겔 전기영동법이 보고되어 있다. 잔유물 지단백질의 정량 분석에 사용되는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 법은 VLDL 과 LDL 사이에 확인되는 비정상 밴드인 중간-밴드의 검출 방법이다. 또한 잔유물 지단백질의 질적 분석에 사용되는 아가로오스 겔 전기영동법은, 특히 유형 III 고지혈증의 진단에 효과적으로 사용된다. 유형 III 고지혈증에서, β-위치로 이동하는 β-VLDL 이 확인된다.
초원심분리법의 예는 비중이 1.006 내지 1.019 인 지단백질인 중간밀도 지단백질 (이하 IDL 로 약칭됨) 을 초원심분리에 의해 분리하고, 수득된 IDL 중의 콜레스테롤 (이하 IDL-C 로 약칭됨) 을 정량하는 것을 포함하는 방법이다. 그러나, 이러한 초원심분리법의 조작은 매우 복잡하다.
HPLC 법의 예에는, HPLC 에 의해 혈청 중의 CM 및 VLDL 을 분리하고 분리된 CM 및 분리된 VLDL 중의 콜레스테롤의 양을 분석하는 것을 포함하는, 혈청 시료 중의 유사-잔유물 지단백질 (이하 RLP 로 약칭됨) 의 분석 방법 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 105876/96 호), 및 비-다공성 불용해 운반체 상의 apoB-48 을 인지하지 않는 항-인간 apoA-I 단일클론 항체 및 apoB-48 을 인지하지 않는 항-인간 apoB-100 단일클론 항체를 면역화함으로써 제조된, 지단백질의 분리를 위한 패킹으로 충전된 지단백질 분리용 항체 컬럼에 의해 인간 혈청 시료 중의 RLP 이외의 지단백질을 분리한 다음, 분리되지 않은 지단백질인 RLP 중의 콜레스테롤의 양을 분석하는 것을 포함하는, 혈청 시료 중의 RLP 분석 방법 (일본 공개 미심사 특허 출 원 제 105875/96 호) 이 포함된다. 전자의 방법은 면역흡수법에 의해 정량된 바와 같은 RLP 중의 콜레스테롤의 양과 CM 콜레스테롤과 VLDL 콜레스테롤의 총 양 사이의 양호한 상관관계에 기초한 방법이다. 이러한 특허 공개에서, "RLP" 라는 용어는, 지단백질 리파아제로의 CM, VLDL 등의 분해에 의해 형성된 비정상 지단백질을 의미하는 것으로 사용된다.
최근, 면역흡수법에 의한 RLP 중의 콜레스테롤 정량법이 개발되었다. 본원에 사용되는 바와 같은 RLP 는 트리글리세리드가 풍부한 지단백질을 언급한다. 이러한 방법에 따라서, apoB-48 을 인지하지 않는 항-apoA-I 단일클론 항체 및 특이적 항-apoB-100 단일클론 항체를 함유하는 친화력 겔을 사용하는 면역친화력 크로마토그래피에 의해 혈청으로부터 RLP 를 분리하고, 분리된 RLP 중에 함유된 콜레스테롤을 정량한다. 상기 방법에 적용되는 RLP 중의 콜레스테롤 정량용 시약은 JIMRO Co., Ltd. 로부터 시판된다 (제품명: RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II) [Clinical Chemistry, the American Association for Clinical Chemistry, 제 48 권, p. 217-219 (2002)].
RLP 중의 콜레스테롤 정량 방법에 관해서, 또한 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소 및 인지질을 가수분해하는 효소가, 폴리옥시알킬렌 유도체 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 또는 그의 유도체의 존재하에서 시료에 작용하도록 하고, 생성된 과산화수소 또는 환원된 조촉매를 정량하는 것을 포함하는 방법에 대한 보고가 있다 (일본 공개 미심사 특허 출원 제 231597/2001 호). 상기 특허 공개의 실시예 1 의 정량용 시약을 사 용하여 정량된 바와 같은 시료 중의 콜레스테롤의 양과, JIMRO Co., Ltd. 로부터 시판되는 정량용 시약인 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 사용하여 정량된 바와 같은 시료 중의 RLP 중의 콜레스테롤의 양 사이에 양호한 상관관계가 인지된다. 그러나, RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 는 또한 시료 중의 잔유물 지단백질로 분류되지 않은 VLDL 중의 콜레스테롤에도 반응성이 있다고 보고되어 있다.
최근, 초원심분리 및 겔 여과의 조합에 의한 잔유물 지단백질의 분석에 대한 보고가 있다 ["Arteriosclerosis", Japan Atherosclerosis Society, 제 29 권, p. 235 (표제 번호 98) (2001)].
본 발명의 주제는 동맥경화 질병에 대한 위험 인자 중 하나인 VLDL 잔유물 중의 콜레스테롤 (이하 VLDL 잔유물 콜레스테롤로 언급되고, VLDL 잔유물-C 로 약칭됨) 의 정량을 위한, 간단하고 빠른 방법, 시약 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 (1) 내지 (23) 에 관한 것이다.
(1) 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 중의 에스테르화된 및 유리 콜레스테롤 (이하 집합적으로 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤로 언급함) 의 정량 방법으로, (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함) 의 존재하에서, 시료를 함유하는 수성 매질에서, (c) 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 또는 (d) 산화된 조효소의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 중의 콜레스테롤에 작용하여 과산화수소 또는 환원된 조효소를 생성할 수 있게 하는 것; 및 생성된 과산화수소 또는 환원 조효소를 정량하는 것을 포함하는 방법.
(2) 상기 (1) 에 있어서, 초저밀도 지단백질 잔유물이 중간밀도 지단백질인 방법.
(3) 상기 (1) 또는 (2) 에 있어서, 효소 반응이 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민의 존재하에서 수행되는 방법.
(4) 상기 (3) 에 있어서, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체가 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 디메틸-γ-시클로덱스트린, 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린, 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린, 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린, 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린, 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린, 글리코실-γ-시클로덱스트린, 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 말토실-γ-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술페이트, γ-시클로덱스트린 술페이트 및 β-시클로덱스트린 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 방법.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르인 방법.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 과산화수소의 정량이 페록시다아제의 존재하에서, 생성된 과산화수소를 크로모겐과 반응시켜 색소를 생성하고, 생성된 색소를 정량함으로써 수행되는 방법.
(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 환원된 조효소의 정량이 반응 용액의 흡광도를 측정함으로써 수행되는 방법.
(8) (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함), 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소를 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 시약.
(9) 상기 (8) 에 있어서, 추가로 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약.
(10) (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함), 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 탈수소효소 및 산화된 조효소를 포함하는, 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 시약.
(11) 상기 (10) 에 있어서, 추가로 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약.
(12) 상기 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤이 중간밀도 지단백질인 시약.
(13) 상기 (8) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 추가로 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약.
(14) 상기 (13) 에 있어서, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체가 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 디메틸-γ-시클로덱스트린, 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린, 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린, 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린, 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린, 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린, 글리코실-γ-시클로덱스트린, 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 말토실-γ-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술페이트, γ-시클로덱스트린 술페이트 및 β-시클로덱스트린 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 시약.
(15) 상기 (8) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르인 시약.
(16) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제를 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 한 종류의 계면활성제와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르를 포함하고, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 키트.
(17) (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함) 을 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 키트.
(18) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제를 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 산화된 조효소를 포함하고, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 한 종류의 계면활성제와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르를 포함하는 키트.
(19) (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함) 을 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 산화된 조효소를 포함하는 키트.
(20) 상기 (16) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 초저밀도 지단백질 잔유물이 중간밀도 지단백질인 키트.
(21) 상기 (16) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 키트.
(22) 상기 (21) 에 있어서, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체가 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 디메틸-γ-시클로덱스트린, 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린, 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린, 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린, 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린, 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린, 글리코실-γ-시클로덱스트린, 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 말토실-γ-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술페이트, γ-시클로덱스트린 술페이트 및 β-시클로덱스트린 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 키트.
(23) 상기 (16) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르가 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르인 키트.
본 발명의 방법은 하기에 상세히 기재된다.
본 발명은 (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합이 콜레스테롤의 정량 반응에서 사용되는 효소가 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 하는 계면활성제로서 뛰어난 효과를 갖는다는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 2 가지 종류의 계면활성제가 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 하기 위한 조합으로 사용된다.
본 발명은 또한 상기 효소가 시클로덱스트린 및 그의 유도체 및/또는 알부민을 효소 반응에서 수성 매질에 존재하도록 함으로써, VLDL 잔유물-C 이외의 지단백질 중의 콜레스테롤, 특히 LDL 중의 콜레스테롤에 작용하는 것을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 시료 중의 VLDL 잔유물-C 는 수성 매질에서 시료 중의 RLP 중의 에스테르화된 콜레스테롤을, (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 시료 중의 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 함) 의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라아제의 작용에 의해 유리 콜레스테롤로 전환시켜 (c) 결과 유리 콜레스테롤 및 VLDL 잔유물 중의 유리 콜레스테롤로부터 콜레스테롤 산화효소의 작용에 의해 과산화수소를 생성하거나 또는 (d) 상기 유리 콜레스테롤로부터 산화된 조효소의 존재하에서, 콜레스테롤 탈수소효소의 작용에 의해 환원된 조효소를 생성할 수 있게 하고, 생성된 과산화수소 또는 환원된 조효소를 정량함으로써 정량할 수 있다.
본 방법에서, 시클로덱스트린 및 그의 유도체 및/또는 알부민의 존재하에서 효소 반응을 수행하는 것이, 효소가 VLDL 잔유물 이외의 지단백질 중의 콜레스테롤에 작용하는 것을 억제할 수 있기 때문에 바람직하다.
본 발명의 방법은 시료 중의, 예를 들어 전체 혈액, 혈장 및 혈청, 바람직하게는 혈장 및 혈청 중의 VLDL 잔유물 콜레스테롤을 정량하기 위해 사용할 수 있다.
효소 반응은 (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 2 가지 종류 이상의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 시료 중의 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 할 수 있음), 콜레스테롤의 정량을 위해 필요한 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소 (콜레스테롤 탈수소효소가 사용되는 경우, 산화된 조효소가 필요함) 및, 필요한 경우, 시클로덱스트린 및/또는 알부민을 함유하는 완충액과 같은 수용액에서 수행한다. 반응에 의해 생성된 과산화수소 또는 환원된 조효소의 정량은 단독으로 공지된 방법에 의해 수행한다.
수용액은, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소를 활성화시키기 위해 일반적으로 사용되는 효소 활성제, 안정제, 방부제, 간섭 억제제 및 단백질 (예를 들어, 생물학적 시료 중의 글로불린) 을 가용화하기 위한 다양한 종류의 염을, VLDL 잔유물-C 의 정량 반응의 특이성에 영향을 주지 않는 한, 요구될 수 있는 대로 함유할 수 있다.
콜레스테롤 에스테르 가수분해 반응 및 유리 콜레스테롤의 산화 또는 탈수소화 반응을 2 가지 종류의 계면활성제의 존재하에서 연속적으로 수행할 수 있다. 시료를 수용액에서 계면활성제와 접촉시킨 다음, 효소를 첨가함으로써 반응을 수행할 수 있는데, 일반적으로는 수성 매질에 모든 필요한 성분을 동시에 또는 그들을 필요에 따라 2 개 또는 3 개의 그룹으로 나눈 다음 첨가함으로써 수행할 수 있다. 더욱 편리하게는 하기 기재되는 VLDL 잔유물-C 의 정량 키트를 사용한다.
수성 매질에서, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소를 일반적으로 0.001 내지 400 U/ml, 바람직하게는 0.01 내지 200 U/ml, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 100 U/ml 의 농도로 사용한다.
수성 매질에서, 2 가지 종류의 계면활성제의 각각의 농도는 바람직하게는 0.001 내지 5 (w/v)%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 2.5 (w/v)%, 특히 바람직하게는 0.05 내지 1 (w/v)% 이다.
수성 매질에서, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체의 농도는 바람직하게는 0.001 내지 5 (w/v)%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 2.5 (w/v)%, 특히 바람직하게는 0.01 내지 1 (w/v)% 이다.
수성 매질에서, 알부민의 농도는 바람직하게는 0.001 내지 5 (w/v)%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 2.5 (w/v)%, 특히 바람직하게는 0.01 내지 1 (w/v)% 이다.
효소 반응은 일반적으로 10 내지 50 ℃, 바람직하게는 20 내지 40 ℃ 에서 수행하고, 일반적으로 2 내지 30 분 내에 완료한다.
생성된 과산화수소는, 예를 들어 과산화수소를 페록시다아제의 존재하에서, 산화에 의해 색소로 전환되는 크로모겐과 반응시켜 색소를 생성하고, 생성된 색소의 흡수 최대 파장에서 반응 용액의 흡광도 변화를 측정함으로써 정량한다. 과산화수소는 또한 그것을 화학 발광 물질 예를 들어, 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌 또는 아크리디늄 에스테르와 반응하게 하여, 광자를 생성하게 하고, 생성된 광자를 정량함으로써 정량한다.
환원된 조효소는 효소 반응에 의해 형성된 환원된 조효소를 함유하는 용액의 흡광도를, 300 내지 500 nm, 바람직하게는 330 내지 400 nm, 더욱 바람직하게는 340 nm 근처에서 측정함으로써 정량할 수 있다. 환원된 조효소는 또한 환원된 조효소를 크로모겐과 반응시켜 색소를 생성하고, 생성된 색소를 정량함으로써 정량할 수 있다. 예를 들어, 환원된 조효소를 디아포라아제, 전자 운반체 (예, 1-메톡시-5-메틸페나쥼 메틸 술페이트) 및 크로모겐과 반응시켜, 색소를 생성하고, 색소의 흡수 최대 파장에서 반응 용액의 흡광도를 측정함으로써 환원된 조효소를 정량할 수 있다. 크로모겐으로서, 환원에 의해 색소로 전환되는 크로모겐이 사용된다.
시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도는, 콜레스테롤 농도와 공지된 농도로 VLDL 잔유물-C 를 함유하는 시료를 사용해서 미리 제조된 과산화수소 또는 환원된 조효소의 양 사이의 관계를 나타내는 적정 곡선으로부터 계산할 수 있다.
콜레스테롤 에스테라아제로서, 콜레스테롤 에스테르를 가수분해할 수 있는 효소, 예를 들어 콜레스테롤 에스테라아제 및 지단백질 리파아제를 사용하고, 이들은 동물-, 식물- 또는 미생물-유래의 효소, 유전자 공학 기술에 의해 생성된 효소 또는 화학적으로 개질된 효소일 수 있다. 화학적으로 개질된 효소의 예에는 화학적 개질기, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 주성분으로 포함하는 기, 폴리프로필렌 글리콜과 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 폴리사카라이드를 포함하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기 및 킬레이트 작용을 갖는 기로 개질된 효소가 포함된다. 특히 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜을 주성분으로 포함하는 기로 개질된 효소이다. 수용성 폴리사카라이드의 예에는 덱스트란, 풀루란 및 가용성 전분이 포함된다.
화학적 개질용 시약 (화학 개질제) 의 예에는 상기 화학적 개질 기 및 작용기 또는 효소의 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기 등과 반응할 수 있는 구조를 모두 갖는 화합물이 포함된다. 효소의 아미노기와 반응할 수 있는 작용기 또는 구조의 예에는 카르복실기, 활성화된 에스테르기 (예를 들어, N-히드록시숙신이미드기), 산 무수물, 산 염화물, 알데히드, 에폭시드기, 1,3-프로판술톤 및 1,4-부탄술톤이 포함된다. 효소의 카르복실기와 반응할 수 있는 작용기 또는 구조의 예는 아미노기이다. 효소의 술프히드릴기와 반응성인 기 또는 구조의 예는 말레이미드기, 디술피드 및 α-할로에스테르 (예를 들어, α-요오드 에스테르) 이다.
화학적 개질제의 예는, 주성분으로 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 기 및 N-히드록시숙신이미드기를 갖는 Sunbright VFM-4101, Sunbright MEAC-50HS 및 Sunbright MEC-50HS (모두 NOF Corporation 에서 제조됨), 주성분으로 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 기 및 산 무수물 구조를 갖는 Sunbright AKM 시리즈 (예를 들어, Sunbright AKM-1510), Sunbright ADM 시리즈 및 Sunbright ACM 시리즈 (모두 NOF Corporation 에서 제조됨), 주성분으로 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 기 및 에폭시드기를 갖는 EPOX-3400 및 M-EPOX-5000 (둘 다 Sheawater Polymers 에서 제조됨), 킬레이트 작용을 갖는 기 및 산 무수물 구조를 갖는 디에틸렌트리아민-N,N,N',N'',N''-펜타아세트산 무수물 (DTPA 무수물, Dojindo Laboratories), 폴리우레탄 개질에 대해 활성화된 폴리우레탄 P4000 (Boehringer Mannheim), 덱스트란 개질에 대해 덱스트란 T40 및 활성화된 TCT (Boehringer Mannheim) 이다.
효소의 화학적 개질은, 예를 들어 다음과 같은 방식으로 수행할 수 있다.
콜레스테롤 에스테라아제는 HEPES 완충액과 같은 pH 8.0 이상의 완충액에 희석하고, 0 내지 55 ℃ 에서, 0.01 내지 500 배 몰 양의 화학적 개질제를 첨가한 후, 5 분 내지 5 시간 동안 교반한다. 실제 효소 반응에서, 상기 반응 혼합물을 화학적으로 개질된 콜레스테롤 에스테라아제와 같은 것을, 또는 필요하다면, 미반응된 화학 개질제를 한외 여과기로 제거한 후 사용할 수 있다.
본 방법에서 사용되는 콜레스테롤 산화효소는 동물-, 식물- 또는 미생물-유래의 효소, 유전자 공학 기술에 의해 생성된 효소, 화학적으로 개질된 효소 등일 수 있다.
화학적으로 개질된 효소는 화학 개질에 대한 상기 방법에 의해 제조할 수 있다.
콜레스테롤 탈수소효소로서, 산화된 조효소의 존재하에서 콜레스테롤을 산화시킴으로써 환원된 조효소를 생성하는 능력을 갖는 임의의 효소를 사용할 수 있고, 이들은 동물-, 식물- 또는 미생물-유래의 효소, 유전자 공학 기술에 의해 생성된 효소 또는 화학적으로 개질된 효소일 수 있다. 화학적으로 개질된 효소는 예를 들어, 상기 화학 개질제를 사용하는 화학 개질에 대한 상기 방법에 의해 제조할 수 있다.
콜레스테롤 탈수소효소의 사용에 의한 정량을 위해 본 발명의 방법에 사용되는 산화된 조효소의 예는 NAD, NADP, 티오-NAD 및 티오-NADP 이다.
본 발명에서 사용되는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르는, 본 발명에서 사용되는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제와의 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 하는 작용을 가진다. 단독으로 사용되는 경우, 반드시 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 하는 작용을 가질 필요는 없다. 이하, 본 발명에서 사용되는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르를 "계면활성제 1" 이라고 언급한다.
본 발명에서 사용되는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제는, 본 발명에서 사용되는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 하는 작용을 갖는다. 단독으로 사용되는 경우, 반드시 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 VLDL 잔유물-C 에 특이적으로 작용하게 하는 작용을 가질 필요는 없다. 이하, 본 발명에서 사용되는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제를 "계면활성제 2" 라고 언급한다.
폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르의 예에는 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르가 포함된다. 바람직한 것은 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르이다.
폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르의 알킬에는 탄소수 6 내지 15 의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 예를 들어 헥실, 이소헥실, 헵틸, 이소헵틸, 옥틸, 이소옥틸, 노닐, 이소노닐, 데실, 이소데실, 운데실, 이소운데실, 도데실, 이소도데실, 트리데실, 이소트리데실, 테트라데실, 이소테트라데실, 펜타데실 및 이소펜타데실이 포함된다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르의 구체적인 예는 Emulgen L-40 (폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르), Emulgen 911 (폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르) 및 Emulgen 810 (폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르) (모두 Kao Corporation 에서 제조됨), 및 Nonion HS-210 (폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르), Nonion HS-215 (폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르), Nonion NS-208.5 (폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르) 및 Nonion HS-208 (폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르) (모두 NOF Corporation 에서 제조됨) 이다. 바람직한 것은 Emulgen L-40 이다.
폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물에는 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시부틸렌의 랜덤 중합체 및 블록 중합체, 예를 들어 하기 화학식 (I) 로 나타나는 화합물이 포함된다:
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이할 수 있고, 각각은 1 내지 200 의 정수를 나타내고; R 은 수소 원자 또는 직쇄 또는 분지된 알킬을 나타냄) [이하 화합물 (I) 로 언급함]. 화합물 (I) 의 알킬에는 탄소수 1 내지 30 의 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 이소헵틸, 옥틸, 이소옥틸, 노닐, 이소노닐, 데실, 이소데실, 운데실, 이소운데실, 도데실, 이소도데실, 트리데실, 이소트리데실, 테트라데실, 이소테트라데실, 펜타데실, 이소펜타데실, 헥사데실, 이소헥사데실, 헵타데실, 이소헵타데실, 옥타데실, 이소옥타데실, 노나데실, 이소노나데실, 이코실, 헤네이코실, 도코실 (베헤닐), 트리코실, 테트라코실, 펜타코실, 헥사코실, 헵타코실, 옥타코실, 노나코실 및 트리아콘틸이 포함된다.
화합물 (I) 의 구체적인 예에는 Pronon B-204 및 Pronon B-208 (둘 다 NOF Corporation 에서 제조됨) 이 포함된다. 폴리옥시부틸렌 부분의 분자량은 바람직하게는 700 이상, 더욱 바람직하게는 1,000 이상, 특히 바람직하게는 1,500 이상이다.
폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르의 예는 Aoki Oil Industrial Co., Ltd. 에서 시판되는 BLAUNON DSP-9, BLAUNON DSP-12.5, BLAUNON DSP-20, BLAUNON DSP-10, BLAUNON TSP-5, BLAUNON TSP-7.5, BLAUNON TSP-16, BLAUNON TSP-20 및 BLAUNON TSP-50 이다.
폴리옥시알킬렌 장쇄 분지된 알킬 에테르의 예는 NOF Corporation 에서 시판되는 Unilub MT-0620B 이다.
시클로덱스트린 또는 그의 유도체의 예는 시클로덱스트린, 디메틸시클로덱스트린, 트리메틸시클로덱스트린, 히드록시에틸시클로덱스트린, 히드록시프로필시클로덱스트린, 카르복시메틸시클로덱스트린, 글리코실시클로덱스트린, 말토실시클로덱스트린, 시클로덱스트린 술페이트 및 시클로덱스트린 중합체이고, 바람직한 것은 히드록시에틸시클로덱스트린 및 히드록시프로필시클로덱스트린이다.
시클로덱스트린의 예는 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 및 γ-시클로덱스트린이다.
디메틸시클로덱스트린의 예는 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린 및 디메틸-γ-시클로덱스트린이다.
트리메틸시클로덱스트린의 예는 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린 및 트리메틸-γ-시클로덱스트린이다.
히드록시에틸시클로덱스트린의 예는 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린 및 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린이다.
히드록시프로필시클로덱스트린의 예는 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린이다.
카르복시메틸시클로덱스트린의 예는 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린 및 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린이다.
글리코실시클로덱스트린의 예는 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린 및 글리코실-γ-시클로덱스트린이다.
말토실시클로덱스트린의 예는 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린 및 말토실-γ-시클로덱스트린이다.
시클로덱스트린 술페이트의 예는 α-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술페이트 및 γ-시클로덱스트린 술페이트이다.
시클로덱스트린 중합체의 예는 β-시클로덱스트린 중합체이다. 2 가지 종류 이상의 시클로덱스트린 또는 그의 유도체를 조합으로 사용할 수 있다.
알부민의 예에는 소, 말, 양 및 인간 유래의 알부민이 포함되고, 소혈청 알부민 (BSA) 이 바람직하다. 유전자 공학 기술에 의해 제조된 알부민을 또한 사용할 수 있다. 2 가지 종류 이상의 알부민을 조합으로 사용할 수 있다.
수성 매질의 예에는 탈이온화수, 증류수 및 완충 용액이 포함되고, 바람직한 것은 완충 용액이다.
완충 용액 중에 사용되는 완충제의 예에는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산염 완충제 및 Good's 완충제가 포함된다. Good's 완충제의 예에는 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-2-히드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-히드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 [(H)EPPS], N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO) 및 N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 가 포함된다.
완충 용액의 pH 는 일반적으로 4 내지 10, 바람직하게는 5 내지 9 이고, 완충 용액의 농도는 일반적으로 0.001 내지 0.5 mol/l, 바람직하게는 0.005 내지 0.2 mol/l, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 mol/l 이다.
과산화수소의 정량에 사용되는 크로모겐은 산화에 의해 색소로 전환되는 것들, 예를 들어 류코-유형 크로모겐 및 산화 커플링-유형 크로모겐이다. 류코-유형 크로모겐은 과산화수소의 존재하에서 스스로 색소로 전환되는 물질 및 페록시다아제와 같은 과산화성 물질이다. 류코-유형 크로모겐의 예는 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-(N-메틸카르바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨 염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 이다.
산화성 커플링-유형 크로모겐은 과산화수소 및 페록시다아제와 같은 과산화성 물질의 존재하에서 산화에 의해 2 개의 화합물의 커플링에 의해 색소로 전환되는 크로모겐이다. 2 개의 화합물의 조합의 예에는 커플러와 아닐린의 조합 및 커플러와 페놀의 조합이 포함된다. 커플러의 예는 4-아미노안티피린 (4-AA) 및 3-메틸-2-벤조티아졸리논 히드라진이다. 아닐린의 예에는 N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡실아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민 및 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 이 포함된다. 페놀의 예에는 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오도벤조산 (HTIB) 이 포함된다.
페록시다아제는 1 내지 100 kU/l 의 농도로 사용된다. 크로모겐은 0.01 내지 10 g/l 의 농도로 사용된다.
환원된 조효소의 정량을 위해 사용되는 크로모겐의 예에는 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로미드 (MTT), 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 모노나트륨 염 (WST-1) 및 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 모노나트륨 염 (WST-3) 이 포함된다.
효소 활성제의 예에는 음이온성 계면활성제, 예를 들어 담즙산 및 알킬술포네이트가 포함된다. 담즙산의 예는 콜산, 디옥시콜산, 타우로콜산 및 케노디옥시콜산이다. 알킬술포네이트의 예는 1-펜타술포네이트, 1-헥사술포네이트, 1-헵타술포네이트 및 1-옥타술포네이트이다. 알킬술포네이트의 염의 예는 암모늄 염, 리튬 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염 및 칼슘 염이다.
안정제의 예는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 수크로오스 및 염화칼슘이다.
방부제의 예에는 나트륨 아지드 및 항생제가 포함된다.
간섭 저해제의 예에는 아스코르브산의 효과를 억제하기 위한 아스코르베이트 산화효소 및 빌리루빈의 효과를 억제하기 위한 칼륨 퍼로시아나이드가 포함된다.
염의 예는 리튬 클로라이드, 리튬 술페이트, 나트륨 클로라이드, 나트륨 술페이트, 칼륨 클로라이드, 칼륨 술페이트, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 술페이트, 마그네슘 니트레이트 및 칼슘 니트레이트이다.
본 발명의 VLDL 잔유물-C 의 정량 방법의 특정 구현예를 하기에 예증한다.
방법 1
(1) 시험 시료, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소, 계면활성제 1 및 계면활성제 2 의 존재하에서, 수성 매질에서 효소 반응을 수행함;
(2) 생성된 과산화수소를 측정함; 및
(3) 상기 (2) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 2
(1) 시험 시료, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 계면활성제 1 및 계면활성제 2 의 존재하에서, 수성 매질에서 효소 반응을 수행함;
(2) 형성된 환원된 조효소를 측정함; 및
(3) 상기 (2) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 3
(1) 시험 시료, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소, 계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민의 존재하에서, 수성 매질에서 효소 반응을 수행함;
(2) 생성된 과산화수소를 측정함; 및
(3) 상기 (2) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 4
(1) 시험 시료, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민의 존재하에서, 수성 매질에서 효소 반응을 수행함;
(2) 형성된 환원된 조효소를 측정함; 및
(3) 상기 (2) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 5
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 2 를 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 생성된 과산화수소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 6
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 2 를 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 형성된 환원된 조효소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 7
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 2 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민을 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 생성된 과산화수소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 8
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 2 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민을 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 형성된 환원된 조효소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 9
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 1 및 계면활성제 2 를 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 생성된 과산화수소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 10
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 1 및 계면활성제 2 를 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 형성된 환원된 조효소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 11
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민을 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 생성된 과산화수소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
방법 12
(1) 수성 매질에서 시험 시료와 계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민을 미리 혼합함;
(2) 상기 (1) 의 혼합물, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소의 존재하에서 효소 반응을 수행함;
(3) 형성된 환원된 조효소를 측정함; 및
(4) 상기 (3) 에서 측정된 값 및 미리 작성된 적정 곡선으로부터 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정함을 포함하는 방법.
(VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약)
본 발명의 한 구현예에서, VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약은, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 VLDL 잔유물 중의 에스테르화된 및 유리 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 (계면활성제 1) 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제 (계면활성제 2) 를 포함한다.
상기 시약은 과산화수소의 정량용 시약을 포함할 수 있다. 과산화수소의 정량용 시약은, 예를 들어, 페록시다아제 및 산화에 의해 색소로 전환되는 크로모겐을 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약은, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 탈수소효소, 산화된 조효소, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 VLDL 잔유물 중의 에스테르화된 및 유리 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 (계면활성제 1) 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제 (계면활성제 2) 를 포함한다.
상기 시약은 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함할 수 있다. 환원된 조효소의 정량용 시약은, 예를 들어, 디아포라아제, 전자 운반체 및 환원에 의해 색소로 전환되는 크로모겐을 포함한다.
상기 시약은 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 추가로 포함할 수 있다
본 발명의 VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약의 특정 구현예를 하기에 예증한다.
시약 1
콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소, 계면활성제 1, 계면활성제 2 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
시약 2
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 계면활성제 1 및 계면활성제 2 를 포함하는 시약
시약 3
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 계면활성제 1, 계면활성제 2 및 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약
시약 4
콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소, 계면활성제 1, 계면활성제 2, 과산화수소의 정량용 시약, 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
시약 5
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
시약 6
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 계면활성제 1, 계면활성제 2, 환원된 조효소의 정량용 시약, 및 시클로덱스트린 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
(VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트)
본 발명의 VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약은 키트의 형태로 보존, 배포 및 사용할 수 있다. 키트는 2 가지 또는 3 가지의 시약으로 구성될 수 있고, 바람직한 것은 2 가지의 시약을 포함하는 키트이다.
2 가지의 시약 (제 1 시약 및 제 2 시약) 을 포함하는 키트에서, 콜레스테롤 에스테라아제, 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소는 개별 시약에 함유될 수 있으나, 바람직하게는 동일한 시약, 특히 바람직하게는 제 2 시약에 함유된다. 이러한 효소가 개별 시약에 함유되는 경우, 콜레스테롤 에스테라아제는 제 1 시약에 함유되고, 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소는 제 2 시약에 함유된다.
폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제는 제 1 시약 또는 제 2 시약에 함유될 수 있으나, 바람직하게는 제 1 시약에 함유된다.
폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르는 제 1 시약 또는 제 2 시약에 함유된다. 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민은 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상에 함유되고, 바람직하게는 제 1 시약에 함유된다. 산화된 조효소는 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상에 함유된다. 과산화수소의 정량용 시약은 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상에 함유되나, 시약이 산화성 커플링-유형 크로모겐을 포함하는 경우, 그의 화합물은 바람직하게는 각각 개별 시약에 함유된다. 환원된 조효소의 정량용 시약은 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상에 함유된다.
상기 키트의 특정 구현예는 하기에 예증된다.
키트 1
제 1 시약
계면활성제 2 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 2
제 1 시약
계면활성제 2 를 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 시약
키트 3
제 1 시약
계면활성제 2 를 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소 및 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 4
제 1 시약
계면활성제 2, 과산화수소의 정량용 시약, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 5
제 1 시약
계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 시약
키트 6
제 1 시약
계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소 및 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 7
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 8
제 1 시약
계면활성제 1 및 계면활성제 2 를 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 시약
키트 9
제 1 시약
계면활성제 1 및 계면활성제 2 를 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소 및 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 10
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2, 과산화수소의 정량용 시약, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 11
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 시약
키트 12
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
계면활성제 1, 콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소 및 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 13
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
제 2 시약
콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 14
제 1 시약
계면활성제 1 및 계면활성제 2 를 포함하는 시약
제 2 시약
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 시약
키트 15
제 1 시약
계면활성제 1 및 계면활성제 2 를 포함하는 시약
제 2 시약
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소 및 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 16
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2, 과산화수소의 정량용 시약, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소 및 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약
키트 17
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 시약
키트 18
제 1 시약
계면활성제 1, 계면활성제 2, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약
제 2 시약
콜레스테롤 에스테라아제, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소 및 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약
본 발명의 VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약 및 키트는 VLDL 잔유물-C 의 정량 및 IDL-C 의 정량을 위해 사용할 수 있다.
상기 VLDL 잔유물-C 의 정량 방법 또는 시약의 명세서에 기재된 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 산화효소, 산화된 조효소, 콜레스테롤 탈수소효소, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체, 알부민, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제, 과산화수소의 정량용 시약 및 환원된 조효소의 정량용 시약을, 본 발명의 VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약 및 키트의 성분으로 사용할 수 있다.
본 발명의 VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약 및 키트는 필요에 따라서, 상기 기재된 수성 매질, 효소 활성제, 안정제, 방부제, 간섭 억제제 및 생물학적 시료 중의 글로불린과 같은 단백질을 가용화하기 위한 다양한 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 VLDL 잔유물-C 의 정량용 시약 및 키트는 효소, 2 가지 종류의 계면활성제, 및 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 수성 매질 중의 용액으로서, VLDL 잔유물-C 의 정량 방법의 상기 명세서에 기재된 농도로 포함한다.
본 발명의 특정 구현예는 하기 실시예에 예증된다. 하기 제조사로부터의 시약 및 장치가 실시예에 사용되었다: MOPS (Good's 완충제, Dojindo Laboratories), TOOS (Trinder's 시약, Dojindo Laboratories), 나트륨 술페이트 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Emulgen L-40 (폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르, Kao Corporation), Pronon B-208 (폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, NOF Corporation), 페록시다아제 (POD) (Toyobo Co., Ltd.), 아스코르베이트 산화효소 (AOD) (Asahi Kasei Corporation), 4-아미노안티피린 (Nakalai Tesque, Inc.), 지단백질 리파아제 (LPL) (Toyobo Co., Ltd.), 콜레스테롤 산화효소 (CHOD) (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), BLAUNON TSP-50 (폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르, Aoki Oil Industrial Co., Ltd.), 소혈청 알부민 (BSA) (Oriental Yeast Co., Ltd.), Unilub MT-0620B (폴리옥시알킬렌 장쇄 분지된 알킬 에테르, NOF Corporation) 및 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 (Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd.).
도 1 은 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 의해 분석된 바와 같은 초원심분리에 의해 제조된 비중이 1.019 미만인 분획의 크로마토그램이다.
도 2 는 초원심분리 및 겔 여과의 조합인 VLDL 잔유물-C 의 정량 방법 (참조예 1 의 방법) 및 실시예 9 의 방법 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
도 3 은 초원심분리에 의한 IDL-C 정량 방법 (참조예 2 의 방법) 및 실시예 9 의 방법 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
본 발명을 수행하기 위한 최선의 방식
실시예 1 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트
하기 제 1 시약 및 제 2 시약을 포함하는 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트를 제조하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.5) 20 mmol/l
TOOS 0.3 g/l
나트륨 술페이트 1 g/l
Emulgen L-40 5 g/l
Pronon B-208 6 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
아스코르베이트 산화효소 (AOD) 2 U/ml
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/l
4-아미노안티피린 0.5 g/l
Emulgen L-40 2 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
지단백질 리파아제 (LPL) 2 U/ml
콜레스테롤 산화효소 2 U/ml
실시예 2 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트
하기 제 1 시약 및 제 2 시약을 포함하는 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트를 제조하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.5) 20 mmol/l
TOOS 0.3 g/l
나트륨 술페이트 1 g/l
BLAUNON TSP-50 7 g/l
BSA 1 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
아스코르베이트 산화효소 (AOD) 2 U/ml
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/l
4-아미노안티피린 0.5 g/l
Emulgen L-40 2 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
지단백질 리파아제 (LPL) 2 U/ml
콜레스테롤 산화효소 2 U/ml
실시예 3 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트
하기 제 1 시약 및 제 2 시약을 포함하는 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트를 제조하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/l
TOOS 0.3 g/l
나트륨 술페이트 1 g/l
Unilub MT-0620B 6 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
아스코르베이트 산화효소 (AOD) 2 U/ml
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/l
4-아미노안티피린 0.5 g/l
Emulgen L-40 2 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
지단백질 리파아제 (LPL) 2 U/ml
콜레스테롤 산화효소 2 U/ml
실시예 4 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트
하기 제 1 시약 및 제 2 시약을 포함하는 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트를 제조하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.5) 20 mmol/l
TOOS 0.3 g/l
나트륨 술페이트 1 g/l
Emulgen L-40 5 g/l
Pronon B-208 6 g/l
히드록시프로필-β-시클로덱스트린 3 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
아스코르베이트 산화효소 (AOD) 2 U/ml
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/l
4-아미노안티피린 0.5 g/l
Emulgen L-40 2 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
지단백질 리파아제 (LPL) 2 U/ml
콜레스테롤 산화효소 2 U/ml
실시예 5 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트
하기 제 1 시약 및 제 2 시약을 포함하는 VLDL 잔유물-C 의 정량용 키트를 제조하였다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.5) 20 mmol/l
TOOS 0.3 g/l
나트륨 술페이트 1 g/l
Emulgen L-40 5 g/l
Pronon B-208 6 g/l
BSA 3 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
아스코르베이트 산화효소 (AOD) 2 U/ml
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/l
4-아미노안티피린 0.5 g/l
Emulgen L-40 2 g/l
페록시다아제 (POD) 10 U/ml
지단백질 리파아제 (LPL) 2 U/ml
콜레스테롤 산화효소 2 U/ml
실시예 6 VLDL 잔유물-C 의 정량
신선한 혈청 (40 개의 시료) 중의 VLDL 잔유물-C 의 정량을 하기 방식으로 실시예 1 의 키트를 사용하여 Hitachi-7170 자동분석기로 수행하였다.
(1) 적정 곡선의 작성
표준 용액으로서, 생리학적 식염수 (VLDL 잔유물-C 농도: 0.0 mg/dl), VLDL 잔유물-C 를 농도 45 mg/dl 로 함유하는 혈청 {Yamamura, et al. 의 방법에 의해 정량된 농도 ["Arteriosclerosis", Japan Atherosclerosis Society, 제 29 권, 페이지 235 (표제 번호 98) (2001)]} 및 상기 혈청을 적절하게 희석함으로써 제조된 혈청 희석액을 사용하였다.
하기 방식으로 실시예 1 의 키트를 사용하여 Hitachi-7170 자동분석기로 VLDL 잔유물-C 농도를 정량함으로써 적정 곡선을 작성하였다.
반응 셀에 표준 용액 (6 ㎕) 및 제 1 시약 (0.18 ml) 을 첨가하고, 결과 혼합물을 37 ℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. 반응 용액의 흡광도 (E1) 를 546 nm 의 일차 파장 및 700 nm 의 이차 파장에서 측정하였다. 그 다음, 제 2 시약 (0.05 ml) 을 반응 용액에 첨가한 후, 37 ℃ 에서 5 분 동안 추가로 인큐베이 션시키고, 반응 용액의 흡광도 (E2) 를 546 nm 의 일차 파장 및 700 nm 의 이차 파장에서 측정하였다.
(2) 신선한 인간 혈청 (40 개의 시료) 중에 함유된 VLDL 잔유물-C 의 정량
표준 용액 대신에, 40 개의 신선한 인간 혈청 시료를 사용하여 상기 (1) 에서와 동일한 방식으로 반응을 수행하고, 각각의 40 개의 시료 중에 함유된 VLDL 잔유물-C 를 반응 후 반응 용액의 흡광도 및 상기 (1) 에서 작성된 적정 곡선으로부터 결정하였다.
실시예 7 VLDL 잔유물-C 의 정량
실시예 6 의 정량에 사용된 각각의 신선한 인간 혈청 시료 (40 개) 중에 함유된 VLDL 잔유물-C 를, 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 2 의 키트를 사용하였던 것을 제외하고는, 실시예 6 에서와 같은 동일한 방식으로 Hitachi-7170 자동분석기를 사용하여 정량하였다.
실시예 8 VLDL 잔유물-C 의 정량
실시예 6 의 정량에 사용된 각각의 신선한 인간 혈청 시료 (40 개) 중에 함유된 VLDL 잔유물-C 를, 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 3 의 키트를 사용하였던 것을 제외하고는, 실시예 6 에서와 같은 동일한 방식으로 Hitachi-7170 자동분석기를 사용하여 정량하였다.
실시예 9 VLDL 잔유물-C 의 정량
실시예 6 의 정량에 사용된 각각의 신선한 인간 혈청 시료 (40 개) 중에 함유된 VLDL 잔유물-C 를, 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 4 의 키트를 사용하였던 것을 제외하고는, 실시예 6 에서와 같은 동일한 방식으로 Hitachi-7170 자동분석기를 사용하여 정량하였다.
실시예 10 VLDL 잔유물-C 의 정량
실시예 6 의 정량에 사용된 각각의 신선한 인간 혈청 시료 (40 개) 중에 함유된 VLDL 잔유물-C 를, 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 5 의 키트를 사용하였던 것을 제외하고는, 실시예 6 에서와 같은 동일한 방식으로 Hitachi-7170 자동분석기를 사용하여 정량하였다.
참조예 1 Yamamura, et al. 의 방법에 의한 VLDL 잔유물-C 의 정량
실시예 6 의 정량에서 사용된 각각의 신선한 혈청 시료 (40 개) 중의 VLDL 잔유물-C 를, Yamamura, et al. 의 방법 ["Arteriosclerosis", Japan Atherosclerosis Society, 제 29 권, p. 235 (표제 번호 98) (2001)] 에 따른 초원심분리 및 겔 여과의 조합에 의해 하기 방식으로 정량하였다.
비중이 1.019 미만인 상청액 분획을 분리하기 위해 각 시료를 초원심분리하였다. 즉, 2 ml 의 시료를 초원심분리 튜브에 첨가하고, 2 ml 의 비중-맞춤 용액 [KBr (37.9 g/l) 을 함유하는 생리학적 식염수] 을 첨가하여 비중을 1.019 로 맞추었다. 그 다음, 본 튜브를 로터 (Hitachi 50.4 TI 로터) 에 넣고, 35,000 rpm 에서 20 시간 동안 초원심분리하였다. 초원심분리의 완료 후에, 분리된 상청액을 튜브 슬라이서 (slicer) 를 사용하여 수득하였다.
수득된 상청액은 CM, VLDL 및 VLDL 잔유물 (VLDL 잔유물은 IDL 을 함유함) 을 함유한다.
상기에서 수득된 CM, VLDL 및 VLDL 잔유물을 함유하는 상청액을, 콜레스테롤을 정량하기 위해 다음 조건하에서 반응 시스템을 발색시킴으로써 수반되는 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하였다.
HPLC 시스템: Tosoh Corporation's system
컬럼: Superose HR6 컬럼 (Pharmacia)
용출액: EDTA 0.15 mol/l 를 함유하는 염화나트륨 수용액 (1 mmol/l) (pH 7.4)
착색 시약: Determiner L TC (R1 + R2; Kyowa Medex Co., Ltd.)
유속: 0.5 ml/분 (용출액); 0.25 ml/분 (발색 시약)
착색 반응 온도: 37 ℃
검출 파장: 550 nm
시료의 양: 3 ㎕
상청액 중의 콜레스테롤의 농도를 Determiner L TC (총 콜레스테롤의 정량용 키트; Kyowa Medex Co., Ltd.) 를 사용하여 정량하였다.
상기 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 의해 수득된 용출액 패턴 (크로마토그램) 을 도 1 에 제시한다. 도 1 에서 보는 바와 같이, VLDL 및 CM 이 첫번째로, 그 다음 VLDL 잔유물이 용출되었다.
실시예 11
상청액 중의 미리 정량된 콜레스테롤 농도에 상청액의 부피 및 도 1 에서의 크로마토그램의 VLDL 잔유물 부분의 상대 면적 비를 곱함으로써 초원심분리에 의해 제조된 상청액 중의 VLDL 잔유물-C 의 양을 계산하고, 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도를 결정하였다.
각각의 40 개의 시료에, 시료 중의 VLDL 잔유물-C 의 농도 결정을 통한 초원심분리에 의한 시료로부터의 비중이 1.019 미만인 상청액의 제조액으로부터 상기 일련의 조작을 수행하였다. 참조예 1 의 방법과 실시예 6 내지 10 의 방법 사이의 상관관계를 시험하는 결과로서, 상기 방법들 사이에서 표 1 에 제시된 상관관계 계수를 수득하였다. 도 2 는 참조예 1 의 방법과 실시예 9 의 방법 사이의 상관관계를 나타낸다 (상관관계 화학식: Y=0.83X + 4.7; 상관관계 계수: r=0.91). 그러므로, 상기 방법들 사이의 양호한 상관관계는 시료 중의 VLDL 잔유물-C 가 본 발명의 방법에 의해 정량될 수 있다는 것을 밝혔다.
참조예 2 초원심분리에 의한 IDL-C 의 정량
실시예 6 의 정량에 사용된 각각의 신선한 혈청 시료 (40 개의 시료) 를 비중이 1.006 내지 1.019 인 분획 (IDL 분획) 을 수득하기 위해 초원심분리하였다. 수득된 IDL 분획 중의 콜레스테롤의 농도를 Determiner L TC (총 콜레스테롤의 정량용 키트; Kyowa Medex Co., Ltd.) 를 사용하여 정량하였다.
실시예 12
적정 곡선을, 표준 용액으로서 비중이 1.006 내지 1.019 인 분획 중의 콜레스테롤 농도가 23 mg/dl 인 혈청을 사용하여 작성했던 것을 제외하고는, 실시예 6 에서와 동일한 방식으로 실시예 1 내지 5 의 시약을 사용하여 정량을 수행하였다. 참조예 2 의 방법과 실시예 6 내지 10 의 방법 사이의 상관관계를 시험하는 결과로 서, 상기 방법들 사이에서 표 1 에 제시된 상관관계 계수를 수득하였다. 도 3 은 참조예 2 의 방법과 실시예 9 의 방법 사이의 상관관계를 나타낸다 (상관관계 화학식: Y=1.20X + 5.6; 상관관계 계수: r=0.83). 그러므로, 상기 방법들 사이의 양호한 상관관계는 시료 중의 IDL-C 가 본 발명의 방법에 의해 정량될 수 있다는 것을 밝혔다.
표 1
정량용 키트 (정량 방법) 상관관계 계수 (실시예의 방법 및 참조예의 방법 사이의 상관관계)
참조예 1 (VLDL 잔유물-C) 참조예 2 (IDL-C)
실시예 1 (실시예 6) 0.87 0.79
실시예 2 (실시예 7) 0.83 0.74
실시예 3 (실시예 8) 0.69 0.64
실시예 4 (실시예 9) 0.91 0.83
실시예 5 (실시예 10) 0.92 0.84
실시예 11 및 12 의 결과로서, 시료 중의 VLDL 잔유물-C 및 시료 중의 IDL-C 가 본 발명의 방법에 의해서 정량될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
참조예 3 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및 알부민의 LDL 에 대한 반응-억제 효과
LDL 에 대한 실시예 1, 4 및 5 의 키트의 반응성을 각각의 키트 및 초원심분리에 의해 제조된 LDL 분획을 사용하여 시험하였다. 반응을 표준 용액 대신에 LDL 분획을 사용하고, 제 1 시약 및 제 2 시약으로서 실시예 1, 4 및 5 의 키트를 구성하는 제 1 시약 및 제 2 시약을 사용했던 것을 제외하고는, 실시예 6 에서와 동일한 방식으로 수행하였다. 결과를 표 2 에 제시한다.
표 2
정량용 키트 첨가제 LDL 반응율 (%) 흡광도 (Abs)
실시예 1 HP-β-CD - 6.3 0.355
BSA -
실시예 4 HP-β-CD + 2.1 0.360
BSA -
실시예 5 HP-β-CD - 2.6 0.443
BSA +
표 2 에서, LDL 반응율은, 각 키트로 LDL 분획의 반응에 의해 정량된 바와 같은 LDL 분획 중의 콜레스테롤의 양 대 Determiner L TC (총 콜레스테롤의 정량용 키트; Kyowa Medex Co., Ltd.) 로 LDL 분획의 반응에 의해 정량된 바와 같은 콜레스테롤의 양의 비율을 나타낸다. 표 2 에서, 흡광도는 각 키트로 공지된 농도의 콜레스테롤을 갖는 표준 용액의 반응에 의해 수득된 반응 용액의 흡광도를 언급한다. 표 2 로부터 볼 수 있는 바와 같이, LDL 중의 콜레스테롤과의 반응을 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 또는 알부민을 첨가함으로써 억제시켰다. 또한, 감도는 알부민의 첨가에 의해 흡광도의 상승에 의해 밝혀지는 바와 같이 향상되었다.
본 발명은 동맥경화증 질병의 진단에 유용한 VLDL 잔유물-C 의 정량 방법, 시약 및 키트를 제공한다.

Claims (23)

  1. 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 중의 에스테르화된 및 유리 콜레스테롤 (이하 집합적으로 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤로 언급함) 의 정량 방법으로, (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소 또는 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함) 의 존재하에서, 시료를 함유하는 수성 매질에서, (c) 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 또는 (d) 산화된 조효소의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 중의 콜레스테롤에 작용하여 과산화수소 또는 환원된 조효소를 생성할 수 있게 하는 것; 및 생성된 과산화수소 또는 환원 조효소를 정량하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 초저밀도 지단백질 잔유물이 중간밀도 지단백질인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소 반응이 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민의 존재하에서 수행되는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체가 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 디메틸-γ-시클로덱스트린, 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린, 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린, 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린, 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린, 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린, 글리코실-γ-시클로덱스트린, 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 말토실-γ-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술페이트, γ-시클로덱스트린 술페이트 및 β-시클로덱스트린 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 과산화수소의 정량이 페록시다아제의 존재하에서, 생성된 과산화수소를 크로모겐과 반응시켜 색소를 생성하고, 생성된 색소를 정량함으로써 수행되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 환원된 조효소의 정량이 반응 용액의 흡광도를 측정함으로써 수행되는 방법.
  8. (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함), 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소를 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 시약.
  9. 제 8 항에 있어서, 추가로 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 시약.
  10. (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함), 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 탈수소효소 및 산화된 조효소를 포함하는, 초저밀도 지단백질 잔유 물 콜레스테롤의 정량용 시약.
  11. 제 10 항에 있어서, 추가로 환원된 조효소의 정량용 시약을 포함하는 시약.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤이 중간밀도 지단백질인 시약.
  13. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 시약.
  14. 제 13 항에 있어서, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체가 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 디메틸-γ-시클로덱스트린, 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린, 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린, 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린, 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린, 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린, 글리코실-γ-시클로덱스트린, 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 말토실-γ-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린 술페이트, β- 시클로덱스트린 술페이트, γ-시클로덱스트린 술페이트 및 β-시클로덱스트린 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 시약.
  15. 제 8 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르가 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르인 시약.
  16. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제를 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 한 종류의 계면활성제와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르를 포함하고, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에, 과산 화수소의 정량용 시약을 포함하는 키트.
  17. (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함) 을 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 산화효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 과산화수소의 정량용 시약을 포함하는 키트.
  18. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제를 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에, 산화된 조효소를 포함하고, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 한 종류의 계면활성제와 조합으로 사용되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르를 포함하는 키트.
  19. (a) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르 및 (b) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 스티렌화된 페닐 에테르 및 폴리옥시알킬렌 장쇄 알킬 에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 한 종류의 계면활성제의 조합 (조합은 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소가 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤에 특이적으로 작용할 수 있게 함) 을 포함하는 제 1 시약, 및 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 탈수소효소를 포함하는 제 2 시약을 포함하는, 시료 중의 초저밀도 지단백질 잔유물 콜레스테롤의 정량용 키트로, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 산화된 조효소를 포함하는 키트.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 초저밀도 지단백질 잔유물이 중간밀도 지단백질인 키트.
  21. 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 제 1 시약 및 제 2 시약 중 하나 이상 중에 시클로덱스트린 또는 그의 유도체 및/또는 알부민을 포함하는 키트.
  22. 제 21 항에 있어서, 시클로덱스트린 또는 그의 유도체가 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 디메틸-γ-시클로덱스트린, 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린, 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린, 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린, 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린, 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린, 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린, 글리코실-γ-시클로덱스트린, 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 말토실-γ-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술페이트, γ-시클로덱스트린 술페이트 및 β-시클로덱스트린 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 키트.
  23. 제 16 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌 알킬아릴 에테르가 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르인 키트.
KR1020067015426A 2004-01-29 2005-01-28 초저밀도 지단백질 잔유물 (ｖｌｄｌ 잔유물) 중의콜레스테롤 정량 방법, 시약 및 키트 KR20060127111A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2004-00021478 2004-01-29
JP2004021478 2004-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060127111A true KR20060127111A (ko) 2006-12-11

Family

ID=34823794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067015426A KR20060127111A (ko) 2004-01-29 2005-01-28 초저밀도 지단백질 잔유물 (ｖｌｄｌ 잔유물) 중의콜레스테롤 정량 방법, 시약 및 키트

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20070161068A1 (ko)
EP (1) EP1715060A4 (ko)
JP (1) JP4690200B2 (ko)
KR (1) KR20060127111A (ko)
CN (1) CN1914333A (ko)
TW (1) TW200528717A (ko)
WO (1) WO2005073401A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2589459C (en) * 2004-11-29 2014-01-07 Jimro Co., Ltd. Method of measuring cholesterol in remnant-like lipoproteins
KR101326476B1 (ko) * 2005-02-14 2013-11-07 교와 메덱스 가부시키가이샤 렘난트형 리포단백질 (ｒｌｐ) 중의 콜레스테롤의 정량방법, 시약 및 키트
US20090170139A1 (en) * 2005-12-09 2009-07-02 Kyowa Medex Co., Ltd. Method, reagent and kit for measurement of cholesterol in remnant-like particles
EP2751575B1 (en) * 2011-11-11 2018-09-12 Axis-Shield AS Blood sample assay method
CN106950095B (zh) * 2017-04-01 2020-01-10 合肥迪安医学检验所有限公司 一种减少脂血样本检测干扰的方法
WO2019181911A1 (ja) * 2018-03-23 2019-09-26 東洋紡株式会社 アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法
CN109187997A (zh) * 2018-09-20 2019-01-11 苏州普瑞斯生物科技有限公司 一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法
CN109580504B (zh) * 2018-10-19 2021-10-26 东软威特曼生物科技(南京)有限公司 一种脂蛋白胆固醇测定试剂及试剂盒
CN109706218A (zh) * 2019-03-08 2019-05-03 浙江达美生物技术有限公司 一种测定脂蛋白残粒胆固醇的试剂盒
CN112695071B (zh) * 2020-12-16 2022-12-30 浙江伊利康生物技术有限公司 一种高密度脂蛋白3的测定试剂、方法和试剂盒
CN115932284B (zh) * 2023-03-10 2023-07-21 江苏奥雅生物科技有限公司 一种吖啶酯偶联免疫蛋白的方法及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01130617A (ja) * 1987-11-17 1989-05-23 Sharp Corp 電圧制御発振回路
WO1996029599A1 (fr) * 1995-03-20 1996-09-26 Kyowa Medex Co., Ltd. Methode de quantification du cholesterol dans une lipoproteine a faible densite ou a tres faible densite
JPH09285298A (ja) * 1996-04-22 1997-11-04 Iatron Lab Inc Ｈｄｌ−コレステロールの測定方法及び測定用試薬
US5814472A (en) * 1997-05-13 1998-09-29 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Measurement of LDL-cholesterol
JPH1130617A (ja) * 1997-05-13 1999-02-02 Wako Pure Chem Ind Ltd Ｌｄｌ−コレステロール測定法
JP3822340B2 (ja) * 1997-11-26 2006-09-20 シスメックス株式会社 リポ蛋白質コレステロールの定量方法および試薬キット
ATE278805T1 (de) * 1998-09-18 2004-10-15 Kyowa Medex Co Ltd Verfahren zur quantifizierung von cholesterol in lipoproteinen und quantifizierungsreagenzien
JP4456715B2 (ja) * 2000-02-28 2010-04-28 協和メデックス株式会社 レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005073401A1 (ja) 2005-08-11
JP4690200B2 (ja) 2011-06-01
CN1914333A (zh) 2007-02-14
EP1715060A4 (en) 2009-07-22
TW200528717A (en) 2005-09-01
EP1715060A1 (en) 2006-10-25
JPWO2005073401A1 (ja) 2007-09-13
US20070161068A1 (en) 2007-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1849876B1 (en) Method, reagent and kit for determination of cholesterol in remnant-like particles (rlp)
JP4498143B2 (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬
KR20060127111A (ko) 초저밀도 지단백질 잔유물 (ｖｌｄｌ 잔유물) 중의콜레스테롤 정량 방법, 시약 및 키트
JP5534644B2 (ja) レムナント様リポ蛋白中のコレステロール測定方法、試薬及びキット
JP5191236B2 (ja) 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット
JPWO2008050636A1 (ja) 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
KR102524702B1 (ko) 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트
JP4796489B2 (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法
JP5864858B2 (ja) 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
JP6372921B2 (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid