CN1914333A - 极低密度脂蛋白残粒(vldl残粒)中的胆固醇的定量方法、试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
在含有试样的水性介质中，在能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对极低密度脂蛋白残粒中的酯化及游离胆固醇(以下统称为残粒极低密度脂蛋白胆固醇)产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合存在下，定量试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇。
Description
技术领域
本发明涉及一种试样中的极低密度脂蛋白残粒(VLDL残粒)中的胆固醇的定量方法、试剂及试剂盒。
背景技术
血液中含有各种脂蛋白。根据比重不同，这些脂蛋白分类为乳糜微粒(以下简称为CM)、极低密度脂蛋白(以下简称为VLDL)、低密度脂蛋白(以下简称为LDL)和高密度脂蛋白(以下简称为HDL)。各种脂蛋白其胆固醇、甘油三酯、磷脂、蛋白质等构成成分的比例不同，在生物体内具有不同的作用。
除了这些脂蛋白以外，血液还含有在脂蛋白利用脂肪酶代谢·分解的过程中产生的残粒脂蛋白(remnant lipoprotein)。残粒脂蛋白分类为乳糜微粒残粒(以下简称为CM残粒)及极低密度脂蛋白残粒(以下简称为VLDL残粒)。中间密度脂蛋白(以下简称为IDL)是包含在VLDL残粒中的比重为1.006～1.019的脂蛋白，被称为狭义的VLDL残粒。
残粒脂蛋白是甘油三酯(TG)丰富以及载脂蛋白(APO)E和胆固醇比较丰富的脂蛋白。CM残粒含有以载脂蛋白(APO)B-48和载脂蛋白(APO)E为主的载脂蛋白(APO)蛋白，VLDL残粒含有以载脂蛋白(APO)B-100和载脂蛋白(APO)E为主的载脂蛋白(APO)蛋白。
残粒脂蛋白在健康人中快速地代谢、快速地转入肝脏的受体中，但由于代谢异常或过食·运动不足等日常不良的生活习惯，导致滞留在血液中的残粒脂蛋白增加，以及滞留在血液中的这些残粒脂蛋白引起III型高血脂症等，造成动脉硬化症高概率地发生。一般认为：在发生动脉硬化症时，滞留在血液中的残粒脂蛋白容易转入动脉壁的巨噬细胞中，形成动脉硬化的初期病变。如上所述，认为残粒脂蛋白是动脉硬化性疾病的危险因素之一。
一般认为，CM残粒由于含有以载脂蛋白(APO)B-48为主的载脂蛋白(APO)蛋白，因此，其通过肝脏的LDL受体关联蛋白(LRP)转入；认为VLDL残粒由于含有以载脂蛋白(APO)B-100为主的载脂蛋白(APO)蛋白，因此，其通过肝脏的LDL受体转入。另外，最近报道VLDL受体路径成为巨噬细胞通过残粒脂蛋白泡沫化的新路径之一。亦即，报道提出在从单核细胞向巨噬细胞的分化过程中，VLDL受体的表达增大，残粒脂蛋白通过VLDL受体引起巨噬细胞的泡沫化。
残粒脂蛋白或残粒脂蛋白中的胆固醇的定量法，迄今为止报道的有电泳法、超离心法、高级液相色谱(HPLC)法、免疫吸附法等。电泳法报道有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法和琼脂糖凝胶电泳法等。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法用于残粒脂蛋白的定性分析中，是检测在VLDL和LDL之间看到的异常谱带即中间带的方法。琼脂糖凝胶电泳法也用于残粒脂蛋白的定性分析中，特别有效地用于III型高脂血症的诊断。在III型高脂血症中，确认向β位移动的β-VLDL。
超离心法例如有：通过超离心比重为1.006～1.019的脂蛋白的中间密度脂蛋白(以下简称为IDL)，定量得到的IDL中的胆固醇(以下简称为IDL-C)的方法。但是，该超离心法的操作非常繁杂。
HPLC法例如有：血清试样中的残粒类脂蛋白(以下简称为RLP)的分析方法，其包括用HPLC分离血清中的CM及VLDL，并分析分离过的CM中的胆固醇量及分离过的VLDL中的胆固醇量(特开平8-105876号公报)；以及血清试样中的RLP的分析方法(特开平8-105875号公报)，其包括将人血清试样中的RLP以外的脂蛋白，用脂蛋白分离用填充剂充填的脂蛋白分离用抗体柱进行分离，并分析RLP中的胆固醇的量，RLP为未被分离的脂蛋白，该柱的制备方法是将不识别载脂蛋白(APO)B-48的抗人载脂蛋白(APO)A-I单克隆抗体及不识别载脂蛋白(APO)B-48的抗人载脂蛋白(APO)B-100单克隆抗体固定在非多孔性不溶性载体上。前者的方法是基于CM胆固醇和VLDL胆固醇的总量与利用免疫吸附法测定的RLP中的胆固醇量之间存在高的相关性的方法。在这些公开专利公报中，所谓RLP用词，其意义是指CM和VLDL等利用脂蛋白脂肪酶分解而成的异常脂蛋白。
最近，开发了利用免疫吸附法测定RLP中的胆固醇的方法。在此所谓的RLP，是指富含甘油三酯的脂蛋白。在本定量法中，使用含有不识别载脂蛋白(APO)B-48的抗载脂蛋白(APO)A-I单克隆抗体及特异抗载脂蛋白(APO)B-100单克隆抗体的亲和性凝胶通过免疫亲和性色谱法，从血清中分离RLP，定量该分离过的RLP中含有的胆固醇。在本定量法中应用的RLP中的胆固醇定量用试剂，从(株)日本抗体研究所购买[制品名：RLP-胆固醇「JIMRO」II](「临床用化学(ClinicalChemistry)」，美国临床化学会，2002年，第48卷，p.217-219)。
RLP中的胆固醇的定量法，还报道有包括如下步骤的方法：在聚氧化亚烷基衍生物及聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物的共存下，使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶及水解磷脂的酶对试样作用，定量生成的过氧化氢或还原性辅酶(特开2001-231597号公报)。确认使用本专利公报的实施例1的定量用试剂可得到的试样中的胆固醇量值和使用日本抗体研究所社制的定量用试剂RLP-胆固醇「JIMRO」II可得到的试样的RLP中的胆固醇量值之间有良好的相关性。但是，报道称RLP-胆固醇「JIMRO」II对试样中未分类为残粒脂蛋白的VLDL中的胆固醇也发生反应。
近年来，报道有组合使用超离心法和凝胶过滤法对残粒脂蛋白进行分析(「动脉硬化」，日本动脉硬化学会，2001年，第29卷，p.235(讲演题目号码：98))。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种简便且快速地定量测定作为动脉硬化性疾病的危险因素之一的VLDL残粒中的胆固醇(以下称为VLDL残粒胆固醇，并简称为VLDL残粒-C)的方法、试剂及试剂盒。
本发明涉及下面的(1)～(23)。
(1)一种定量测定试样中的残粒极低密度脂蛋白酯化及游离胆固醇(下文统称为残粒极低密度脂蛋白胆固醇)的方法，其特征在于，在含有试样的水性介质中，在能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合存在下，让(c)胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶，或在氧化型辅酶的存在下，让(d)胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对试样中的极低密度脂蛋白残粒中的胆固醇发生作用，生成过氧化氢或还原型辅酶，以及定量生成的过氧化氢或还原型辅酶。
(2)如(1)所述的方法，其中极低密度脂蛋白残粒为中间密度脂蛋白。
(3)如(1)或(2)所述的方法，其中该酶反应在环糊精或其衍生物和/或白蛋白的存在下进行。
(4)如(3)所述的方法，其中环糊精或其衍生物为选自以下的化合物：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精、三甲基-α-环糊精、三甲基-β-环糊精、三甲基-γ-环糊精、羟乙基-α-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、γ-环糊精硫酸酯和β-环糊精聚合物。
(5)如(1)～(4)任一项所述的方法，其中聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚为聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚。
(6)如(1)～(5)任一项所述的方法，其中过氧化氢的定量是在过氧化物酶存在下使生成的过氧化氢与色素原反应生成色素，并定量生成的色素来进行的。
(7)如(1)～(5)任一项所述的方法，其中还原型辅酶的定量是通过测定反应液的吸光度来进行的。
(8)一种试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇的定量用试剂，其含有：使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合，胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶。
(9)如(8)所述的试剂，该试剂还含有过氧化氢定量用试剂。
(10)一种残粒极低密度脂蛋白胆固醇定量用试剂，其含有：使胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合，胆固醇酯酶，胆固醇脱氢酶及氧化型辅酶。
(11)如(10)所述的试剂，该试剂还含有还原型辅酶定量用试剂。
(12)如(8)～(11)任一项所述的试剂，其中残粒极低密度脂蛋白胆固醇为中间密度脂蛋白。
(13)如(8)～(12)任一项所述的试剂，还含有环糊精或其衍生物和/或白蛋白。
(14)如(13)所述的试剂，其中环糊精或其衍生物为选自下列化合物：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精、三甲基-α-环糊精、三甲基-β-环糊精、三甲基-γ-环糊精、羟乙基-α-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、γ-环糊精硫酸酯和β-环糊精聚合物。
(15)如(8)～(14)任一项所述的试剂，其中聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚为聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚。
(16)一种试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇定量用试剂盒，其包含：第1试剂，其含有与聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚组合使用时，能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用，选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶；所述试剂盒在第1试剂及第2试剂的至少一种中，还含有与该选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂组合、使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚；以及所述试剂盒在第1试剂及第2试剂的至少一种中进一步含有过氧化氢定量用试剂。
(17)一种试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇定量用试剂盒，其包含：第1试剂，其含有能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶；所述试剂盒在第1试剂和第2试剂的至少一种中还含有过氧化氢定量用试剂。
(18)一种试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇定量用试剂盒，其包含：第1试剂，其含有与聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚组合使用时，能够使胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶；所述试剂盒在第1试剂和第2试剂的至少一种中还含有氧化型辅酶，并且在第1试剂和第2试剂的至少一种中进一步含有与该选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂组合使用时、使胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对残粒胆固醇产生特异作用的聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚。
(19)一种试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇定量用试剂盒，其包含：第1试剂，其含有能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇酯脱氢酶；所述试剂盒在第1试剂和第2试剂的至少一种中还含有氧化型辅酶。
(20)如(16)～(19)任一项所述的试剂盒，其中极低密度脂蛋白残粒为中间密度脂蛋白。
(21)如(16)～(20)任一项所述的试剂盒，其在第1试剂和第2试剂的至少一种中，还含有环糊精或其衍生物和/或白蛋白。
(22)如(21)所述的试剂盒，其中环糊精或其衍生物为选自下列的化合物：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精、三甲基-α-环糊精、三甲基-β-环糊精、三甲基-γ-环糊精、羟乙基-α-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、γ-环糊精硫酸酯和β-环糊精聚合物。
(23)如(16)～(22)任一项所述的试剂盒，其中聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚为聚氧化乙烯烷基苯基醚。
下面，对本发明方法进行详细说明。
本发明的特征在于，作为促使用于胆固醇定量反应的酶对VLDL残粒-C产生特异作用的表面活性剂，(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合，具有优良的效果。亦即，这两种表面活性剂通过组合，使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对VLDL残粒-C产生特异作用。
本发明的特征还在于，在这些酶反应中，通过在水性介质中存在环糊精及其衍生物和/或白蛋白，抑制前述酶对VLDL残粒-C以外的脂蛋白中的胆固醇，特别是LDL中的胆固醇产生作用。
根据本发明方法，试样中的VLDL残粒-C可以通过如下方法来定量：在水性介质中，在能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对试样中的VLDL残粒-C产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂组合的存在下，利用胆固醇酯酶的作用，将试样中的RLP中的酯化胆固醇转换成游离胆固醇，从而(c)利用胆固醇氧化酶的作用由该游离胆固醇及VLDL残粒中的游离胆固醇生成过氧化氢，或(d)在氧化型辅酶的存在下通过胆固醇脱氢酶的作用从游离胆固醇生成还原型辅酶，以及定量生成的过氧化氢或还原型辅酶。
在该方法中，由于在环糊精及其衍生物和/或白蛋白的存在下进行酶反应，可以抑制酶对VLDL残粒以外的脂蛋白的胆固醇起作用，故优选。
利用本发明的定量方法，可以定量全血、血浆、血清等，优选血浆、血清等试样中的VLDL残粒胆固醇。
酶反应是在缓冲液等水溶液中进行的，所述缓冲液含有：能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对试样中的VLDL残粒-C产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的至少两种表面活性剂的组合，胆固醇定量必须的胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶(在使用胆固醇脱氢酶时氧化型辅酶是必需的)，以及根据需要，环糊精和/或白蛋白。通过反应生成的过氧化氢或还原型辅酶的定量利用其自身公知的方法进行。
根据需要，在不影响VLDL残粒-C定量反应的特异性的范围内，该水溶液也可含有：为了激活胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶而经常使用的酶激活剂，稳定剂，防腐剂，抗干扰剂，以及用于使生物试样中的球蛋白等蛋白质增溶的各种盐类。
胆固醇酯水解反应和游离胆固醇的氧化或脱氢反应也可以在该两种表面活性剂的存在下依次进行。另外，也可以使试样与表面活性剂在水溶液中接触，然后添加酶使其反应，但通常将所有必须的成分一次性或根据需要分成2～3组后再添加至水性介质中使其反应。更方便的是使用后述的VLDL残粒-C定量用试剂盒。
在水性介质中，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶通常使用浓度为0.001～400U/mL，优选0.01～200U/mL，更优选0.05～100U/mL。
在水性介质中，该两种表面活性剂的浓度分别优选为0.001～5(w/v)％，更优选为0.005～2.5(w/v)％，特别优选为0.05～1(w/v)％。
在水性介质中，环糊精或其衍生物的浓度优选为0.001～5(w/v)％，更优选为0.005～2.5(w/v)％，特别优选为0.01～1(w/v)％。
在水性介质中，白蛋白的浓度优选为0.001～5(w/v)％，更优选0.005～2.5(w/v)％，特别优选0.01～1(w/v)％。
酶反应通常在10～50℃，优选20～40℃的温度下进行，并通常用2～30分钟完成。
生成的过氧化氢例如通过下列方法进行定量：在过氧化酶的存在下，过氧化氢与因氧化而转换成色素的色素原反应生成色素，在生成的色素的吸收最大波长处测定反应液的吸光度的变化，由此进行定量。另外，用化学发光物质，例如鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶鎓酯等与过氧化氢反应生成光子，并定量生成的光子来定量过氧化氢。
还原型辅酶可以在300～500nm、优选330～400nm、更优选340nm左右处通过测定由酶反应生成的含还原型辅酶溶液的吸光度来定量。另外，可以通过使还原型辅酶与色素原反应生成色素，并定量生成的色素来定量。例如，使还原型辅酶和黄递酶、电子载体例如1-甲氧基-5-甲基酚嗪甲基硫酸盐及色素原反应生成色素，并在色素的吸收最大波长处，测定反应液的吸光度进行定量。作为色素原，可使用通过还原转换为色素的色素原。
使用含有预先已知浓度的VLDL残粒-C的试样，作成表示胆固醇浓度与过氧化氢或还原辅型酶的量的关系的标准曲线，试样中的VLDL残粒-C浓度可以由该标准曲线求出。
作为胆固醇酯酶，可以使用水解胆固醇酯的酶，例如胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等；来自动物、植物或微生物或利用遗传工程的方法制造的酶；化学修饰过的酶等。化学修饰过的酶，包括用如下化学修饰基团：例如以聚乙二醇或聚丙二醇为主要成分的基团、含有聚丙二醇和聚乙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合功能的基团等修饰过的酶。特别优选以聚乙二醇为主要成分的基团修饰过的酶。水溶性多糖类的例子包括糊精、支链淀粉、可溶性淀粉等。
用于化学修饰的试剂(化学修饰剂)，包括同时具有上述化学修饰基团和可以与酶的氨基、羧基、巯基等反应的官能团或结构的化合物等。可以与酶中的氨基反应的官能团或结构，包括例如羧基、活化酯基(N-羟基琥珀酰亚胺基等)、酸酐、酰基氯、醛、环氧化物基、1，3-丙烷磺内酯、1，4-丁烷磺内酯等。可以与酶中的羧基反应的官能团或结构的例子，包括氨基。与酶中的巯基存在反应性的官能团或结构的例子，包括马来酰亚胺、二硫化物、α-卤代酯(如，α-碘代酯)等。
化学修饰剂例子有：含有以聚乙二醇为主要成分的基团和N-羟基琥珀酰亚胺基的サンブライトVFM-4101、サンブライトMEAC-50HS、サンブライトMEC-50HS(全部为日本油脂社制)；含有以聚亚烷基二醇为主要成分的基团和酸酐结构的サンブライトAKM系列(例如，サンブライトAKM-1510等)、サンブライトADM系列、サンブライトACM系列(全部为日本油脂社制)；含有以聚乙二醇为主要成分的基团和环氧化物基团的EPOX-3400、M-EPOX-5000(全部为Sheawater Polmers社制)；含有具有螯合功能的基团和酸酐结构的二乙三胺-N，N’，N”，N”-五酸酐(DTPA酸酐；同仁化学社制)；聚氨酯修饰用的活化聚氨酯P4000(ベ一リンガ一マンハイム社制)；糊精修饰用的糊精T40、活化TCT(ベ一リンガ一マンハイム社制)等。
酶的化学修饰可以用例如以下方法来进行。
首先，将胆固醇酯酶溶解在pH8.0以上的缓冲液，例如HEPES缓冲液中，在0～55℃添加0.01～500倍摩尔量的化学修饰剂，然后搅拌5分钟～5小时。在实际的酶反应中，作为化学修饰过的胆固醇酯酶，不仅可使用该反应混合物本身，也可以使用根据需要利用额外的过滤膜除去未反应的化学修饰剂。
本发明方法中所用的胆固醇氧化酶可以来自动物、植物或微生物的酶，遗传工程方法制造的酶、化学修饰的酶等。
化学修饰酶可以利用前述化学修饰方法来制造。
作为胆固醇脱氢酶，只要是在氧化型辅酶的存在下具有氧化胆固醇生成还原型辅酶能力的酶，就可以使用，它们来自动物、植物或微生物的酶、利用遗传工程的方法制造的酶、进行过化学修饰的酶。化学修饰过的酶，例如可以使用前述化学修饰剂通过前述化学修饰方法来制造。
在本发明使用胆固醇脱氢酶的定量法中使用的氧化型辅酶的实例有：NAD、NADP、硫代NAD、硫代NADP。
在本发明中使用的聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚，与本发明中使用的选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂组合使用时，具有使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对VLDL残粒-C产生特异作用的功能。在单独使用时，不一定要具有使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对VLDL残粒-C产生特异作用的功能。下面，将本发明中使用的聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚称为「表面活性剂1」。
本发明中使用的选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂，与本发明中使用的聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚组合使用时，具有使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对VLDL残粒-C产生特异作用的功能。在单独使用时，不一定要具有使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对VLDL残粒-C产生特异作用的功能。下面，将本发明中使用的选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂称为「表面活性剂2」。
聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚的实例包括：聚氧化乙烯烷基苯基醚、聚氧化丙烯烷基苯基醚、聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚，优选聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚。
聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚中的烷基，包括直链或分支状的碳原子数6～15的烷基，例如己基、异己基、庚基、异庚基、辛基、异辛基、壬基、异壬基、癸基、异癸基、十一烷基、异十一烷基、十二烷基、异十二烷基、十三烷基、异十三烷基、十四烷基、异十四烷基、十五烷基、异十五烷基。聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚具体例子有：エマルゲンL-40(聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚)、エマルゲン911(聚氧化乙烯烷基苯基醚)、エマルゲン810(聚氧化乙烯烷基苯基醚)(均为花王社制)、ノニオンHS-210(聚氧化乙烯烷基苯基醚)、ノニオンHS-215(聚氧化乙烯烷基苯基醚)、ノニオンNS-208.5(聚氧化乙烯烷基苯基醚)、ノニオンHS-208(聚氧化乙烯烷基苯基醚)(均为日本油脂社制)，其中优选エマルゲンL-40。
聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物包括聚氧化乙烯和聚氧化丁烯的随机聚合物、嵌段聚合物，例如用通式(I)
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(式中，A、B及C表示相同或不同的1～200的整数，R表示氢原子、直链或分支的烷基)表示的化合物[以下称为化合物(I)]等。化合物(I)中的烷基，包括碳原子数1～30的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、庚基、异庚基、辛基、异辛基、壬基、异壬基、癸基、异癸基、十一烷基、异十一烷基、十二烷基、异十二烷基、十三烷基、异十三烷基、十四烷基、异十四烷基、十五烷基、异十五烷基、十六烷基、异十六烷基、十七烷基、异十七烷基、十八烷基、异十八烷基、十九烷基、异十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、廿三烷基、廿四烷基、廿五烷基、廿六烷基、廿七烷基、廿八烷基、廿九烷基、三十烷基等。
化合物(I)的具体例，包括プロノンB-204、プロノンB-208(皆为日本油脂社制)。聚氧化丁烯部分的分子量，优选为700以上，更优选为1,000以上，特别优选为1,500以上。
聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚例子有：BLAUNON DSP-9、BLAUNON DSP-12.5、BLAUNON DSP-20、BLAUNON DSP-10、BLAUNON TSP-5、BLAUNON TSP-7.5、BLAUNON TSP-16、BLAUNON TSP-20、BLAUNON TSP-50，均可从青木油脂社商购。
聚氧化亚烷基长链分支烷基醚例子有：ユニル一ブMT-0620B，可从日本油脂社商购。
环糊精或其衍生物例子有：环糊精、二甲基环糊精、三甲基环糊精、羟乙基环糊精、羟丙基环糊精、羧甲基环糊精、糖基环糊精、麦芽糖基环糊精、环糊精硫酸酯、环糊精聚合物，优选羟乙基环糊精及羟丙基环糊精。
环糊精例子有：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精。
二甲基环糊精例子有：二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精。
三甲基环糊精例子有：三甲基-α-环糊精、三甲基-β-环糊精、三甲基-γ-环糊精。
羟乙基环糊精例子有：羟乙基-α-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精。
羟丙基环糊精例子有：羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精。
羧甲基环糊精例子有：羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精。
糖基环糊精例子有：糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精。
麦芽糖基环糊精例子有：麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精。
环糊精硫酸酯例子有：α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、γ-环糊精硫酸酯。
环糊精聚合物例子有：β-环糊精聚合物。也可以组合使用两种以上的环糊精或其衍生物。
白蛋白例子包括来自牛、马、绵羊、人的白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA)。也可以使用通过遗传工程的方法制造的白蛋白。可以组合使用两种以上的白蛋白。
水性介质例子包括脱离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。缓冲液中使用的缓冲剂例子有：三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good氏缓冲剂等。Good氏缓冲剂例子包括2-吗啉代乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二醋酸(ADA)、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N，N’-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)。
缓冲液pH通常为4～10、优选5～9，通常以0.001～0.5mol/L、优选0.005～0.2mol/L、更优选0.01～0.1mol/L的浓度使用。
过氧化氢定量中使用的色素原，使用通过氧化转换为色素的色素原，其实例包括隐色(ロイコ)型色素原、氧化偶合型色素原。隐色型色素原是在过氧化氢及过氧化酶等过氧化物质的存在下自身转化为色素的物质。隐色型色素原例子有：10-N-羧甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲胺基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-(N-甲基氨基甲酰基)-3，7-双(二甲胺基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨羰基)-4，4’-双(二甲胺基)二苯基胺钠盐(DA-64)、4，4’-双(二甲胺基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲胺基苯基]胺(BCMA)。
氧化偶合型色素原是在过氧化氢及过氧化酶等过氧化物质的存在下，通过氧化偶合，两个化合物转换为色素的色素原。两个化合物的组合的例子包括：偶联剂和苯胺类的组合、偶联剂和酚类的组合。偶联剂例子有：4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼。苯胺类例子有：N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(T0PS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-三甲苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-三甲苯基)-N’-乙酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)。酚类例子有：苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2，4，6-三碘安息香酸(HTIB)。
过氧化酶以1～100kU/L的浓度使用。色素原以0.01～10g/L使用。
还原型辅酶定量中使用的色素原的例子包括：3-(4，5-二甲基-2噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓一钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓一钠盐(WST-3)。
酶激活剂的例子包括：胆汁酸类、烷基磺酸盐等阳离子性表面活性剂。胆汁酸类例子包括：胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸、鹅脱氧胆酸。烷基磺酸盐例子包括：1-戊磺酸盐、1-己磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-辛磺酸盐。烷基磺酸盐中的盐例子有：铵盐、锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐。
稳定剂例子有：乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙等。
防腐剂例子有：叠氮化钠、抗生素。
抗干扰剂例子有：用于抑制抗坏血酸作用的抗坏血酸氧化酶、用于控制胆红素作用的亚铁氰化钾。
盐类例子有：氯化锂、硫酸锂、氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、硫酸镁、醋酸镁、氯化铵、硫酸镁、硝酸镁、硝酸钙。
本发明的VLDL残粒-C的定量方法，可以例示以下的具体方式。
定量方法1
(1)在水性介质中，在标本、胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶、表面活性剂1及表面活性剂2的存在下，进行酶反应；
(2)测定生成的过氧化氢；和
(3)从用(2)测定的值和预先作成的标准曲线，判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法2
(1)在水性介质中，在标本、胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、表面活性剂1及表面活性剂2的存在下，进行酶反应；
(2)测定生成的还原型辅酶；和
(3)从用(2)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法3
(1)在水性介质中，在标本、胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶、表面活性剂1及表面活性剂2，以及环糊精衍生物和/或白蛋白的存在下，进行酶反应；
(2)测定生成的过氧化氢；和
(3)从用(2)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法4
(1)在水性介质中，在标本、胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、表面活性剂1及表面活性剂2以及环糊精衍生物和/或白蛋白的存在下，进行酶反应；
(2)测定生成的还原型辅酶；和
(3)从用(2)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法5
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂2，
(2)在(1)的混合物、表面活性剂1、胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的过氧化氢；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法6
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂2，
(2)在(1)的混合物、表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的还原型辅酶；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法7
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂2以及环糊精衍生物和/或白蛋白，
(2)在(1)的混合物、表面活性剂1、胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的过氧化氢；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法8
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂2以及环糊精衍生物和/或白蛋白，
(2)在(1)的混合物、表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的还原型辅酶；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法9
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂1及表面活性剂2，
(2)在(1)的混合物、胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的过氧化氢；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法10
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂1及表面活性剂2，
(2)在(1)的混合物、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的还原型辅酶；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法11
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂1及表面活性剂2以及环糊精衍生物和/或白蛋白，
(2)在(1)的混合物、胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的过氧化氢；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
定量方法12
(1)在水性介质中，预先混合标本和表面活性剂1及表面活性剂2以及环糊精衍生物和/或白蛋白，
(2)在(1)的混合物、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的存在下，进行酶反应；
(3)测定生成的还原型辅酶；和
(4)从用(3)测定的值和预先作成的标准曲线，可以判定标本中的VLDL残粒-C浓度。
(VLDL残粒-C的定量用试剂)
本发明的VLDL残粒-C的定量用试剂，含有胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，以及能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对VLDL残粒中的酯化及游离胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚(表面活性剂1)及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂(表面活性剂2)。
上述试剂可以含有过氧化氢定量用试剂。过氧化氢定量用试剂的实例含有过氧化酶及通过氧化转换为色素的色素原。
另外，本发明的其它VLDL残粒-C定量用试剂，含有胆固醇酶水解酶，胆固醇脱氢酶，氧化型辅酶，以及能够使胆固醇水解酶及胆固醇脱氢酶对VLDL残粒中的酯化及游离胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚(表面活性剂1)及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂(表面活性剂2)。
该试剂可以含有还原型辅酶定量用试剂。还原型辅酶定量用试剂的实例含有黄递酶、电子载体及通过还原转换为色素的色素原。
这些试剂都可以进一步含有环糊精或其衍生物和/或白蛋白。
本发明的VLDL残粒-C定量用试剂，可以例示以下的具体方式。
试剂1
含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、表面活性剂1、表面活性剂2及过氧化氢测定用试剂的试剂。
试剂2
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、表面活性剂1及表面活性剂2的试剂。
试剂3
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、表面活性剂1、表面活性剂2及还原型辅酶测定用试剂的试剂。
试剂4
含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、表面活性剂1、表面活性剂2、过氧化氢测定用试剂以及环糊精衍生物和/或白蛋白的试剂。
试剂5
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、表面活性剂1、表面活性剂2以及环糊精衍生物和/或白蛋白的试剂。
试剂6
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、表面活性剂1、表面活性剂2、还原型辅酶测定用试剂以及环糊精衍生物和/或白蛋白的试剂。
(VLDL残粒-C的定量用试剂盒)
本发明的VLDL残粒-C的定量用试剂，以试剂盒的形态保存、流通及使用。试剂盒的组成为两种试剂或三种试剂，但优选含两种试剂的试剂盒。
在第1试剂和第2试剂的两种试剂的试剂盒中，所谓的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶可以含有在分开的试剂中，但优选含有在同一试剂中，特别优选含有在第2试剂中。这些酶含有在分开的试剂中时，胆固醇酯酶含有在第1试剂中，胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶含有在第2试剂中。
选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂，含有在第1试剂、第2试剂的任一种试剂中，但优选含有在第1试剂中。
聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚含有在第1试剂、第2试剂的任一种试剂中。环糊精或其衍生物和/或白蛋白含有在第1试剂、第2试剂的至少一种中，但优选含有在第1试剂中。氧化型辅酶含有在第1试剂、第2试剂的至少一种中。过氧化氢定量用试剂含有在第1试剂、第2试剂的至少一种中，但当该试剂含有氧化偶合型色素原时，其各个化合物优选含在分开的试剂中。还原型辅酶定量用试剂含有在第1试剂、第2试剂的至少一种中。
具体例如下面形式的试剂盒。
试剂盒1
第1试剂
含有表面活性剂2及过氧化氢定量用试剂的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢定量用试剂的试剂。
试剂盒2
第1试剂
含有表面活性剂2的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂盒3
第1试剂
含有表面活性剂2的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶及还原型辅酶定量用试剂的试剂。
试剂盒4
第1试剂
含有表面活性剂2、过氧化氢定量用试剂以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢定量用试剂的试剂。
试剂盒5
第1试剂
含有表面活性剂2以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂盒6
第1试剂
含有表面活性剂2以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶及还原型辅酶定量用试剂的试剂。
试剂盒7
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2及过氧化氢定量用试剂的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢定量用试剂的试剂。
试剂盒8
第1试剂
含有表面活性剂1及表面活性剂2的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂盒9
第1试剂
含有表面活性剂1及表面活性剂2的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶及还原型辅酶定量用试剂的试剂。
试剂盒10
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2、过氧化氢定量用试剂以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢定量用试剂的试剂。
试剂盒11
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂盒12
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有表面活性剂1、胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶及还原型辅酶定量用试剂的试剂。
试剂盒13
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2及过氧化氢定量用试剂的试剂。
第2试剂
含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢定量用试剂的试剂。
试剂盒14
第1试剂
含有表面活性剂1及表面活性剂2的试剂。
第2试剂
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂盒15
第1试剂
含有表面活性剂1及表面活性剂2的试剂。
第2试剂
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶及还原型辅酶定量用试剂的试剂。
试剂盒16
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2、过氧化氢定量用试剂以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶及过氧化氢定量用试剂的试剂。试剂盒17
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶及胆固醇脱氢酶的试剂。
试剂盒18
第1试剂
含有表面活性剂1、表面活性剂2以及环糊精或其衍生物和/或白蛋白的试剂。
第2试剂
含有胆固醇酯酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶及还原型辅酶定量用试剂的试剂。
本发明的VLDL残粒-C定量用试剂及试剂盒，可以用于VLDL残粒-C的定量及IDL-C的定量。
在本发明的VLDL残粒-C定量用试剂及试剂盒中的各种成分，可以使用前述VLDL残粒-C定量方法或试剂中记载的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、环糊精或其衍生物、白蛋白、聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚、选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂、过氧化氢定量用试剂及还原型辅酶定量用试剂。
本发明的VLDL残粒-C定量用试剂及试剂盒，也可以根据需要含有前述水性介质、酶激活剂、稳定剂、防腐剂、抗干扰剂、以及用于使生物试样中的球蛋白等蛋白质增溶的各种盐类。
本发明的VLDL残粒-C定量用试剂及试剂盒中的酶、两种表面活性剂、环糊精或其衍生物和/或白蛋白，在水性介质中溶解后，达到VLDL残粒-C定量方法中记载的浓度。
下面，通过实施例更详细地说明本发明。需要说明的是，在本发明实施例中，使用了下述生产厂的试剂及仪器：
MOPS(グツド缓冲剂；同仁化学社制)、TOOS(トリンダ一试剂；同仁化学社制)、硫酸钠(和光纯药社制)、エマルゲンL-40(聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚；花王社制)、プロノンB-208(聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物；日本油脂社制)、过氧化酶(POD)(东洋纺织社制)、抗坏血酸氧化酶(AOD)(旭化成社制)、4-氨基安替比林(半井化学社制)、脂蛋白脂肪酶(LPL)(东洋纺织社制)、胆固醇氧化酶(CHOD)(协和发酵工业社制)、BLAUNON TSP-50(聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚；青木油脂社制)、牛血清白蛋白(BSA)(オリエンタル酵母社制)、ユニル一ブMT-0620B(聚氧化亚烷基长链分支烷基醚；日本油脂社制)、羟丙基-β-环糊精(日本食品化工社制)。
附图说明
图1为通过超离心制成的比重为1.019以下的部分，利用凝胶过滤柱色谱法进行分析的色谱图。
图2为表示组合超离心和凝胶过滤而成的VLDL残粒-C的定量法(参考例1的定量法)和实施例9的定量法之间相关性的图。
图3为表示通过超离心的IDL-C的定量法(参考例2的定量法)和实施例9的定量法之间相关性的图。
具体实施方式
实施例1VLDL残粒-C定量用试剂盒
制成含有下面第1试剂及第2试剂的VLDL残粒-C定量用试剂盒。
·第1试剂
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸钠 1g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 5g/L
普罗隆(プロノン)B-208 6g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
抗坏血酸氧化酶(AOD) 2U/mL
·第2试剂
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4-氨基安替比林 0.5g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 2g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
脂蛋白脂肪酶(LPL) 2U/mL
胆固醇氧化酶 2U/mL
实施例2VLDL残粒-C定量用试剂盒
制成含有下面第1试剂及第2试剂的VLDL残粒-C定量用试剂盒。
·第1试剂
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸钠 1g/L
BLAUNON TSP-50 7g/L
BSA 1g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
抗坏血酸氧化酶(AOD) 2U/mL
·第2试剂
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4-氨基安替比林 0.5g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 2g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
脂蛋白脂肪酶(LPL) 2U/mL
胆固醇氧化酶 2U/mL
实施例3VLDL残粒-C定量用试剂盒
制成含有下面第1试剂及第2试剂的VLDL残粒-C定量用试剂盒。
·第1试剂
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸钠 1g/L
ユニル一ブMT-0620B 6g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
抗坏血酸氧化酶(AOD) 2U/mL
·第2试剂
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4-氨基安替比林 0.5g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 2g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
脂蛋白脂肪酶(LPL) 2U/mL
胆固醇氧化酶 2U/mL
实施例4VLDL残粒-C定量用试剂盒
制成含有下面第1试剂及第2试剂的VLDL残粒-C定量用试剂盒。
·第1试剂
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸钠 1g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 5g/L
普罗隆(プロノン)B-208 6g/L
羟丙基-β-环糊精 3g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
抗坏血酸氧化酶(AOD) 2U/mL
·第2试剂
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4-氨基安替比林 0.5g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 2g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
脂蛋白脂肪酶(LPL) 2U/mL
胆固醇氧化酶 2U/mL
实施例5VLDL残粒-C定量用试剂盒
制成含有下面第1试剂及第2试剂的VLDL残粒-C定量用试剂盒。
·第1试剂
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸钠 1g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 5g/L
普罗隆(プロノン)B-208 6g/L
BSA 3g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
抗坏血酸氧化酶(AOD) 2U/mL
·第2试剂
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4-氨基安替比林 0.5g/L
乳化剂(エマルゲン)L-40 2g/L
过氧化酶(POD) 10U/mL
脂蛋白脂肪酶(LPL) 2U/mL
胆固醇氧化酶 2U/mL
实施例6VLDL残粒-C的定量
分别对新鲜血清40个试样，使用实施例1的试剂盒，通过日立7170型自动分析装置，如下所述定量试样中的VLDL残粒-C。
(1)标准曲线的制作
标准液使用生理盐水(VLDL残粒-C浓度：0.0mg/dL)以及VLDL残粒-C浓度为45mg/dL的血清{通过山村等的方法[「动脉硬化」，日本动脉硬化学会，2001年，第29卷，p.235(题目号码：No.98)]判定浓度}及适当地稀释该血清配制而成的稀释血清。
使用实施例1的试剂盒，如下所述通过日立7170型自动分析装置定量VLDL残粒-C的浓度，制成标准曲线。
向反应池添加标准液(6μL)和第1试剂(0.18mL)，在37℃温育所得混合物5分钟。在主波长546nm、副波长700nm定量反应液的吸光度(E1)。然后，在该反应液中添加第2试剂(0.05mL)，进一步在37℃温育5分钟，在主波长546nm、副波长700nm测定反应液的吸光度(E2)。
(2)人新鲜血清(40试样)中含有的VLDL残粒-C的定量
使用人新鲜血清40试样代替标准液，利用与(1)相同的方法，分别就该40试样进行反应，以及从反应后反应液的吸光度和(1)作成的标准曲线，定量该40试样中分别含有的VLDL残粒-C。
实施例7VLDL残粒-C的定量
除使用实施例2的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例6的定量方法相同，利用日立7170型自动分析装置，测定实施例6的定量中使用的人新鲜血清试样(40试样)中分别含有的VLDL残粒-C。
实施例8VLDL残粒-C的定量
除使用实施例3的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例6的定量方法相同，利用日立7170型自动分析装置，测定实施例6的定量中使用的人新鲜血清试样(40试样)中分别含有的VLDL残粒-C。
实施例9VLDL残粒-C的定量
除使用实施例4的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例6的定量方法相同，利用日立7170型自动分析装置，测定实施例6的定量中使用的人新鲜血清试样(40试样)中分别含有的VLDL残粒-C。
实施例10VLDL残粒-C的定量
除使用实施例5的试剂盒代替实施例1的试剂盒之外，其余与实施例6的定量方法相同，利用日立7170型自动分析装置，测定实施例6的定量中使用的人新鲜血清试样(40试样)中分别含有的VLDL残粒-C。
(参考例1)利用山村等的方法定量VLDL残粒-C
分别就实施例6的定量中使用的新鲜血清(40试样)，利用山村等的方法[「动脉硬化」，日本动脉硬化学会，2001年，第29卷，p.235(题目号码：No.98)]，组合超离心和凝胶过滤，如下所述定量试样中的VLDL残粒-C。
首先，对各个试样通过超离心分离出比重小于1.019的上清液部分。亦即，在超离心管中添加2mL试样，并添加2mL比重调整液[含有KBr(37.9g/L)的生理盐水]以使其比重为1.019后，将该管固定在日立回转器50.4TI回转器中，以35,000rpm进行20小时的超离心，离心分离结束后，使用管切片机获取分离出的上清液。
该上清液含有CM、VLDL及VLDL残粒(该VLDL残粒含有IDL)。
在以下条件下，将上述得到的含有CM、VLDL及VLDL残粒的上清液，利用伴随显色反应体系的凝胶过滤柱色谱法进行分离，以定量胆固醇。
HPLC系统：东ソ一的系统
柱：Superose HR6柱(フアルマシア社制)
洗脱液：含有EDTA(1mmol/L)的0.15mol/L氯化钠水溶液(pH7.4)
显色试剂：デタミナ一LTC(R1+R2；协和メデツクス社制)
流速：0.5mL/分(洗脱液)；0.25mL/分(显色试剂)
显色反应温度：37℃
检测波长：550nm
样品量：3μL
该上清液中的胆固醇浓度，使用デタミナ一L TC(总胆固醇定量用试剂盒；协和メデツクス社制)来判定。
通过该凝胶过滤柱色谱法得到的洗脱曲线(色谱图)如图1所示。如图1所示，最初洗脱的是VLDL及CM，然后洗脱的是VLDL残粒。
实施例11
通过使先前定量过的由超离心制成的上清液中的胆固醇浓度，乘以该上清液的体积及图1色谱图中VLDL残粒部分的相对面积比，算出该上清液中的VLDL残粒-C量，最终判定试样中的VLDL残粒-C浓度。
分别对40试样进行一系列操作从通过超离心自试样制备比重低于1.019的上清液到确定试样中的VLDL残粒-C浓度。在研究了参考例1的定量方法和实施例6～10的定量法之间的相关性之后，得到了两定量法之间如表1所示的相关系数。另外，在参考例1的定量方法和实施例9的定量方法之间，得到了如图2所示的相关图(相关式：Y＝0.83X+4.7；相关系数：r＝0.91)。如上所述，由于在两定量法之间存在良好的相关性，因此判定通过本发明的定量法，可以定量试样中的VLDL残粒-C。
(参考例2)利用超离心法定量IDL-C
对实施例6的定量中使用的新鲜血清(40试样)，分别通过超离心操作，得到比重为1.006～1.019部分(IDL部分)，使用デタミナ一LTC(总胆固醇定量用试剂盒；协和メデツクス社制)定量得到的IDL部分中的胆固醇浓度。
实施例12
除使用比重为1.006～1.019的部分中的胆固醇浓度为23mg/dL的血清作为标准液制成标准曲线之外，利用与实施例6同样的方法，使用实施例1～5的试剂进行测定。在研究了参考例2的定量方法和实施例6～10的定量方法之间相关性之后，得到了两定量法之间如表1所示的相关系数。另外，在参考例2的定量方法和实施例9的定量方法之间，得到了如图3所示的相关图(相关式：Y＝1.20X+5.6；相关系数：r＝0.83)。如上所述，由于在两定量法之间存在良好的相关性，因此判定通过本发明的定量法，可以定量试样中的IDL-C。
表1
| 测定用试剂盒(测定法) | 相关系数(实施例的测定法和参考例的测定法之间相关性) | |
| 参考例1(VLDL残粒-C) | 参考例2(IDL-C) | |
| 实施例1(实施例6) | 0.87 | 0.79 |
| 实施例2(实施例7) | 0.83 | 0.74 |
| 实施例3(实施例8) | 0.69 | 0.64 |
| 实施例4(实施例9) | 0.91 | 0.83 |
| 实施例5(实施例10) | 0.92 | 0.84 |
由实施例11及实施例12的结果可知，利用本发明的定量法，可以定量试样中的VLDL残粒-C及试样中的IDL-C。
(参考例3)环糊精或其衍生物及白蛋白对LDL的反应抑制效果
使用实施例1、实施例4、实施例5的试剂盒及通过超离心配制成的LDL部分，研究各试剂盒对LDL的反应性。除使用LDL部分代替标准液以及使用构成实施例1、实施例4、实施例5的试剂盒的第1试剂及第2试剂作为第1试剂及第2试剂以外，以与实施例6中记载的相同的方法进行反应。其结果如表2所示。
表2
| 测定用试剂盒 | 添加物和有无 | LDL反应率(％) | 吸光度(Abs) | |
| 实施例1 | HP·β·CD | - | 6.3 | 0.355 |
| BSA | - | |||
| 实施例4 | HP·β·CD | + | 2.1 | 0.360 |
| BSA | - | |||
| 实施例5 | HP·β·CD | - | 2.6 | 0.443 |
| BSA | + | |||
在表2中，LDL反应率表示通过LDL部分和各试剂盒反应进行了定量的LDL部分中的胆固醇量与通过LDL部分和デタミナ一L TC(总胆固醇定量用试剂盒；协和メデツクス社制)反应进行了定量的LDL部分中的胆固醇量之比。在表2中，吸光度表示通过已知浓度的胆固醇标准液和各试剂盒反应得到的反应液的吸光度。由表2可知，通过添加环糊精或其衍生物或白蛋白，抑制了与LDL中的胆固醇反应。另外，由于通过添加白蛋白吸光度上升，因此判定灵敏度也提高。
工业实用性
本发明提供对动脉硬化性疾病诊断有用的VLDL残粒-C的定量方法、试剂及试剂盒。
Claims (23)
1.一种试样中的极低密度脂蛋白酯化及游离胆固醇(下文统称为残粒极低密度脂蛋白胆固醇)的定量方法，其特征在于，在含有试样的水性介质中，在能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶对极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合存在下，让(c)胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶，或在氧化型辅酶存在下，让(d)胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对试样中的极低密度脂蛋白残粒中的胆固醇发生作用，生成过氧化氢或还原型辅酶，以及定量生成的过氧化氢或还原型辅酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中极低密度脂蛋白残粒为中间密度脂蛋白。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该酶反应在环糊精或其衍生物和/或白蛋白的存在下进行。
4.如权利要求3所述的方法，其中环糊精或其衍生物为选自如下的化合物：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精、三甲基-α-环糊精、三甲基-β-环糊精、三甲基-γ-环糊精、羟乙基-α-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、γ-环糊精硫酸酯和β-环糊精聚合物。
5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其中聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚为聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其中过氧化氢的定量是在过氧化物酶存在下使生成的过氧化氢与色素原反应生成色素，并定量生成的色素来进行的。
7.如权利要求1～5任一项所述的方法，其中还原型辅酶的定量是通过测定反应液的吸光度来进行的。
8.一种试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇定量用试剂，其含有能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合，胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶。
9.如权利要求8所述的试剂，其还含有过氧化氢定量用试剂。
10.一种残粒极低密度脂蛋白胆固醇定量用试剂，其含有能够使胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合，胆固醇酯酶，胆固醇脱氢酶及氧化型辅酶。
11.如权利要求10所述的试剂，其还含有还原型辅酶定量用试剂。
12.如权利要求8～11任一项所述的试剂，其中残粒极低密度脂蛋白胆固醇为中间密度脂蛋白。
13.如权利要求8～12任一项所述的试剂，其还含有环糊精或其衍生物和/或白蛋白。
14.如权利要求13所述的试剂，其中环糊精或其衍生物为选自如下的化合物：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精、三甲基-α-环糊精、三甲基-β-环糊精、三甲基-γ-环糊精、羟乙基-α-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、γ-环糊精硫酸酯和β-环糊精聚合物。
15.如权利要求8～14任一项所述的试剂，其中聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚为聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基苯基醚。
16.一种定量试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇用试剂盒，其包含第1试剂，其含有与聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚组合使用时，能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶；所述试剂盒在第1试剂及第2试剂的至少一种中，还含有与该选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂组合使用时，使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚；并且在第1试剂及第2试剂的至少一种中进一步含有过氧化氢定量用试剂。
17.一种定量试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇用试剂盒，其包含第1试剂，其含有能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂的组合；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶；所述试剂盒在第1试剂和第2试剂的至少一种中进一步含有过氧化氢定量用试剂。
18.一种定量试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇用试剂盒，其包含第1试剂，其含有与聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚组合使用时、能够使胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶；所述试剂盒在第1试剂和第2试剂的至少一种中还含有氧化型辅酶；并且在第1试剂和第2试剂的至少一种中，进一步含有与该选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化亚烷基长链烷基醚的一种表面活性剂组合使用时，使胆固醇酯酶及胆固醇脱氢酶对残粒胆固醇产生特异作用的聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚。
19.一种定量试样中的残粒极低密度脂蛋白胆固醇用试剂盒，其包含第1试剂，其含有能够使胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶对残粒极低密度脂蛋白胆固醇产生特异作用的(a)聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚及(b)选自聚氧化乙烯聚氧化丁烯缩合物、聚氧化乙烯苯乙烯化苯基醚及聚氧化烯烃长链烷基醚的一种表面活性剂的组合；以及第2试剂，其含有胆固醇酯酶及胆固醇酯脱氢酶；所述试剂盒在第1试剂和第2试剂的至少一种中还含有氧化型辅酶。
20.如权利要求16～19任一项所述的试剂盒，其中极低密度脂蛋白残粒为中间密度脂蛋白。
21.如权利要求16～20任一项所述的试剂盒，其在第1试剂和第2试剂的至少一种中，还含有环糊精或其衍生物和/或白蛋白。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其中环糊精或其衍生物为选自如下的化合物：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-α-环糊精、二甲基-β-环糊精、二甲基-γ-环糊精、三甲基-α-环糊精、三甲基-β-环糊精、三甲基-γ-环糊精、羟乙基-α-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羧甲基-α-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、糖基-α-环糊精、糖基-β-环糊精、糖基-γ-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、γ-环糊精硫酸酯和β-环糊精聚合物。
23.如权利要求16～22任一项所述的试剂盒，其中聚氧化乙烯聚氧化亚烷基烷基芳基醚为聚氧化乙烯烷基苯基醚。
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