CN1306039C - 比色分析方法及其使用的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可以短时间且简单地实施可靠的分析的比色分析方法。在滤纸中浸渍含有联吡啶铜络合物及葡萄糖脱氢酶的水溶液，干燥。向其中点上血液等试样，根据葡萄糖浓度，联吡啶铜络合物显红褐色，测定之。由于该反应为一步反应，在5秒以下的短时间内便发生。而且，由于该反应不需要过氧化氢和氧，测定值的可靠性也高。

Description

比色分析方法及其使用的试剂
技术领域
本发明涉及比色分析方法及其使用的试剂。
背景技术
在临床检查及生化检查等领域中，进行葡萄糖、胆固醇等的成分分析，其中的一个方法为比色分析。例如，在葡萄糖的比色分析中，通常，首先使葡萄糖氧化酶作用于葡萄糖(底物)，产生葡萄酸内酯和过氧化氢，在过氧化酶存在下，通过Trinder试剂等显色剂检测过氧化氢。这种通过过氧化氢间接地测定底物浓度的方法，不只限于葡萄糖，也适用于胆固醇等其他的成分分析。
但是，原来的比色分析中，存在下述问题。首先，由于不是直接测定分析对象，而是通过过氧化氢间接地测定，所以测定费时间，例如，测定葡萄糖时需要30～60秒。其次，原来的比色分析法中，2种酶反应体系需要同时稳定化，条件设定困难。而且，由于需要氧，原来的比色分析法还存在这样的问题：如果氧不足，反应就不充分。
发明内容
鉴于上述问题，本发明的目的是提供反应体系为一步、分析时间短、分析值可靠的比色分析方法。
为达成上述目的，本发明的比色分析法，是使氧化还原酶作用于分析对象及通过电子授受而颜色变化的电子授受颜色变化物质，通过测定由于上述分析对象向上述电子授受颜色变化物质的电子传递而发生的上述电子授受颜色变化物质的颜色变化，对上述分析对象进行定性或定量的方法。
根据该方法，由于为一步反应，反应体系简单，稳定性好，且测定时间也短(例如，以葡萄糖为底物时，约5秒以下便可测定)，另外由于不通过过氧化氢、且在原理上也可以不受氧的量的影响，所以分析值的可靠性也高。
本发明的试剂为上述本发明的比色分析方法使用的试剂，为含有氧化还原酶及通过电子授受而颜色变化的电子授受颜色变化物质的试剂。本发明的试验片为含有上述本发明的试剂的试验片。该试验片与原来通过过氧化氢进行比色分析的试验片相比，可在极短的时间内进行分析，分析值的可靠性也高。
有将联吡啶金属络合物作为发光物质使用的分析方法(特开平10-253633号公报等)，本发明是关于比色分析方法，所以上述分析方法与本发明技术领域完全不同。同样，也有通过电极直接外加使联吡啶金属络合物发生显消色反应的技术(例如，特开昭57-192483号公报)，由于本发明是利用通过氧化还原酶的电子授受，所以上述技术也与本发明技术领域完全不同。
附图说明
图1为表示本发明一实施例中反射率的葡萄糖浓度依赖性的图。
图2为表示本发明其他实施例中反射率的葡萄糖浓度依赖性的图。
图3为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图4为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图5为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图6为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图7为表示本发明其他实施例中反射率的葡萄糖浓度依赖性的图。
图8A～图8F为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图9A～图9D为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图10A～图10C为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图11为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图12为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图13A～图13C为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图14为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图15为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图16A～图16E为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图17A和图17B为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
图18A～图18C为表示本发明其他实施例中颜色变化的图。
具体实施方式
在本发明的比色分析方法、试剂及试验片中，上述电子授受颜色变化物质优选为过渡金属络合物。过渡金属络合物优选为铜络合物、铁络合物、钌络合物或锇络合物或它们2种以上的混合物。上述过渡金属络合物的配体的配位原子优选为氮、氧及硫中的至少一种。上述配体例如优选为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物。上述配体的配位位置以外的氢原子中的至少一个可以被取代基取代。上述取代基例如有烷基、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基。上述过渡金属络合物也可以具有2种以上的配体。即上述络合物也可以是混合配体络合物。
在本发明的比色分析方法、试剂及试验片中，氧化还原酶优选为脱氢酶或氧化酶。如果酶量多，反应变快，所以优选。分析对象例如有葡萄糖、胆固醇、尿酸、乳酸、丙酮酸、肌酸、肌酸酐等，这时的氧化还原酶为对应于上述各物质的脱氢酶或氧化酶。
在本发明的比色分析方法、试剂及试验片中，除了电子授受颜色变化物质，还优选使用介质。上述电子授受颜色变化物质也是介质，它不只具有电子授受的功能，还兼具颜色变化的功能。因此，追加使用的介质是与上述电子授受颜色变化物质不同的介质。如果使用介质，电子授受速度提高，因此上述电子授受颜色变化物质的颜色变化的速度也提高。结果，可以减少氧化还原酶的用量，从成本上看有利。上述介质例如有锇络合物、钌络合物等，具体例子如后文所述。作为电子授受颜色变化物质与介质的组合，优选电子授受颜色变化物质为铜络合物、介质为锇络合物或钌络合物的组合。
在本发明的试验片中，除了上述试剂，还优选含有无机凝胶。上述颜色变化物质通过电子传递被还原，发生颜色变化，周围有氧时，可能被再氧化而发生褪色，如果含有无机凝胶，可以防止这种褪色。
下面举具体例子更详细地说明本发明。
如上所述，在本发明中，电子授受颜色变化物质优选为过渡金属络合物，在过渡金属络合物中，优选铜络合物、铁络合物、钌络合物及锇络合物。
(铜络合物)
铜络合物通过酶的电子传递，例如颜色从蓝色(Cu2+)变成红褐色(Cu+)。作为铜络合物的配体，例如有氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物等配体。上述配体也可以2种以上组合成混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数为4或6，但从稳定性的观点看，联吡啶优选配位2个。联吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶铜络合物的例子，例如有二联吡啶合铜、二(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)合铜、三联吡啶合铜、三(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铜、三(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铜、三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铜、三(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铜、三(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铜、三(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)合铜、三(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铜、三(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铜、三(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铜、三(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铜、三(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铜、三(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)合铜等。
在咪唑的情况下，配位数为4。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑铜络合物的例子，例如有四咪唑合铜、四(4-甲基-咪唑)合铜、四(4-苯基-咪唑)合铜、四(4-氨基-咪唑)合铜、四(4-羟基-咪唑)合铜、四(4-羧基-咪唑)合铜、四(4-溴-咪唑)合铜等。
氨基酸例如有精氨酸(L-Arg)。精氨酸铜络合物具有溶解性高的优点。作为混合配体，例如有联吡啶与咪唑的组合、联吡啶与氨基酸的组合。例如有[Cu(咪唑)2(联吡啶)]、[Cu(L-Arg)2(联吡啶)]。使用混合配体，可以付与铜络合物各种性质，例如，使用精氨酸时，络合物的溶解性提高。
(铁络合物)
铁络合物通过酶的电子传递，例如颜色从黄色系(Fe3+)变成红色系(Fe2+)。铁络合物的配体，例如有氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物配体。上述配体也可以2种以上组合成混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数为6。联吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶铁络合物的例子，例如有三联吡啶合铁、三(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铁、三(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铁、三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铁、三(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铁、三(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铁、三(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)合铁、三(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铁、三(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铁、三(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铁、三(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铁、三(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铁、三(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)合铁等。
在咪唑的情况下，配位数为6。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑铁络合物的例子，例如有六咪唑合铁、六(4-甲基-咪唑)合铁、六(4-苯基-咪唑)合铁、六(4-氨基-咪唑)合铁、六(4-羟基-咪唑)合铁、六(4-羧基-咪唑)合铁、六(4-溴-咪唑)合铁等。
氨基酸例如有精氨酸(L-Arg)。通常精氨酸铁络合物具有溶解性高的优点。作为混合配体，例如有联吡啶与咪唑的组合、联吡啶与氨基酸的组合。例如有[Fe(咪唑)2(联吡啶)2]、[Fe(L-Arg)2(联吡啶)2]。使用混合配体时，可以赋予络合物各种性质，例如，使用精氨酸时，络合物的溶解性提高。
(钌络合物)
钌络合物的配体，例如有氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物配体。上述配体也可以2种以上组合成混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数为6。联吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶钌络合物的例子，例如有三联吡啶合钌、三(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)合钌、三(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)合钌、三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合钌、三(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)合钌、三(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)合钌、三(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)合钌、三(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)合钌、三(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)合钌、三(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)合钌、三(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)合钌、三(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)合钌、三(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)合钌等。
在咪唑的情况下，配位数为6。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑钌络合物的例子，例如有六咪唑合钌、六(4-甲基-咪唑)合钌、六(4-苯基-咪唑)合钌、六(4-氨基-咪唑)合钌、六(4-羟基-咪唑)合钌、六(4-羧基-咪唑)合钌、六(4-溴-咪唑)合钌等。
氨基酸例如有精氨酸(L-Arg)。精氨酸钌络合物具有溶解性高的优点。作为混合配体，例如有联吡啶与咪唑的组合、联吡啶与氨基酸的组合。例如有[Ru(咪唑)2(联吡啶)2]、[Ru(L-Arg)2(联吡啶)2]。使用混合配体时，可以赋予络合物各种性质，例如，使用精氨酸时，络合物的溶解性提高。
(锇络合物)
锇络合物通过酶的电子传递，例如颜色从橙色系(Os3+)变成茶褐色系(Os2+)。作为锇络合物的配体，例如有氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物配体。上述配体也可以2种以上组合成混合配体。
在联吡啶的情况下，配位数为6。联吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
联吡啶锇络合物的例子，例如有三联吡啶合锇、三(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)合锇、三(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)合锇、三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合锇、三(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)合锇、三(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)合锇、三(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)合锇、三(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)合锇、三(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)合锇、三(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)合锇、三(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)合锇、三(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)合锇、三(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)合锇等。
在咪唑的情况下，配位数为6。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑锇络合物的例子，例如有六咪唑合锇、六(4-甲基-咪唑)合锇、六(4-苯基-咪唑)合锇、六(4-氨基-咪唑)合锇、六(4-羟基-咪唑)合锇、六(4-羧基-咪唑)合锇、六(4-溴-咪唑)合锇等。
氨基酸例如有精氨酸(L-Arg)。精氨酸锇络合物具有溶解性高的优点。作为混合配体，例如有联吡啶与咪唑的组合、联吡啶与氨基酸的组合。例如有[Os(咪唑)2(联吡啶)2]、[Os(L-Arg)2(联吡啶)2]。使用混合配体时，可以赋予络合物各种性质，例如，使用精氨酸时，络合物的溶解性提高。
上述过渡金属络合物的说明是着眼于过渡金属的种类举的例子，本发明不只限于这些。下面着眼于配体来对过渡金属络合物进行说明。
具有N、O、S配位原子的配体，是指分子内例如具有＝N-OH、-COOH、-OH、-SH、＞C＝O等基的配体。具有这种配体的金属络合物，例如有NN螯合物、NO螯合物、NS螯合物、OO螯合物、OS螯合物、SS螯合物(二齿配位)、N螯合物(单齿)、NNN螯合(三齿)等，组合达多种。如果选择有双鍵的配体，铜、铁、钌、锇金属就容易带有电子传递/授受功能。作为配体，优选具有芳环的配体。如上所述，配体上可以引入各种取代基。例如，如果引入磺基等，金属络合物的溶解度就会上升。形成金属络合物时，可以二种以上配体混合，用作混合配体络合物。例如，作为配体之一，如果混合氨基酸，有时与酶的亲和性变好。中心金属的一部分位置也可以带有各种卤素(例如氯、氟、溴、碘)等。下面所示为按配位的类型分类的过渡金属络合物的一例。
(NN配位型)
菲绕啉衍生物
Cu+1，10-菲绕啉
Fe+1，10-菲绕啉
Cu+红菲绕啉
Fe+红菲绕啉
Cu+红菲绕啉磺酸
Fe+红菲绕啉磺酸
联吡啶衍生物
Cu+2，2’-联吡啶
Fe+2，2’-联吡啶
Fe+4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶
Ru+4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶
三嗪衍生物
Cu+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)
Fe+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)
Fe+PDTS(3-(2-吡啶基)-5，6-双(4-磺苯基)-1，2，4-三嗪)
联喹啉衍生物
Cu+亚铜试剂(亚铜试剂＝2，2’-联喹啉)
吡啶基偶氮衍生物
Fe+硝基-PAPS(2-(5-硝基-2-吡啶基偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
(NO配位型)
Fe+亚硝基-PSAP(2-亚硝基-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
Fe+亚硝基-ESAP(亚硝基-ESAP＝2-亚硝基-5-[N-乙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
Fe+1-亚硝基-2-萘酚
(NS配位型)
Fe+2-氨基-4-噻唑乙酸
(OO配位型)
Fe+1，2-萘醌-4-磺酸
(混合配体型)
Os+氯，咪唑，4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶
Os+咪唑，4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶
Cu+L-精氨酸，2，2’-联吡啶
Cu+乙二胺，2，2’-联吡啶
Cu+咪唑，2，2’-联吡啶
下面，举例说明本发明的比色分析方法适用于试验片的例子，使用铜络合物作为电子授受颜色变化物质，以葡萄糖为分析对象。胆固醇等其他成分的分析，除随之改变氧化还原酶外，基本相同。
首先，准备联吡啶铜络合物。其可以使用市售品，也可以自己配制。例如，将CuCl2和2，2’-联吡啶(bpy)在约60-90℃的温浴中混合，合成[Cu(bpy)2]Cl2。CuCl2和2，2’-联吡啶(bpy)的摩尔比例如为1∶2。联吡啶铜络合物水溶液的浓度例如为1-10质量％。在该联吡啶铜络合物水溶液中溶解粘合剂，再在该粘合剂溶液中溶解葡萄糖脱氢酶(GDH)，作为试剂溶液。粘合剂例如有羟丙基纤维素(HPC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺、牛血清白蛋白(BSA)等，其中，优选HPC。粘合剂的浓度例如为0.5-5质量％的范围。GDH的浓度例如为1000～50000U/ml。使上述试剂溶液浸渍在滤纸等多孔质薄片中，然后通过干燥，可以作成葡萄糖分析用试验片。在浸渍上述试剂溶液前，优选将无机凝胶溶液浸渍在上述多孔质薄片中，干燥。无机凝胶例如有蒙脱石等。上述无机凝胶溶液的无机凝胶浓度例如为1～5质量％，优选为1～3质量％，更优选为1.5～2质量％。上述无机凝胶溶液中可以含有CHAPS等两性表面活性剂。相对于上述无机凝胶溶液总量，上述两性表面活性剂的浓度例如为0.1～2质量％，优选为0.1～1质量％，更优选为0.2～0.4质量％。相对于上述多孔质薄片，按多孔质薄片空隙体积基准，上述无机凝胶的浸渍量例如为1～50mg/cm3，优选为10～30mg/cm3，更优选为15～20mg/cm3。上述多孔质薄片，可以是孔径随着厚度方向或薄片面方向变化的非对称多孔质膜。该试验片，开始为蓝色，如果点上血液等含有葡萄糖的试样，根据其浓度，变成红褐色。通过该颜色变化，可以进行葡萄糖的定性或定量分析。分析所需要的时间为点上试样后约2～3秒。如果该试验片中浸渍有无机凝胶，可以防止颜色变化后的再氧化引起的褪色，得到更多供测定的时间。
上述无机凝胶，例如优选使用膨润性粘土矿物。膨润性粘土矿物中，更优选膨润土、蒙脱石、蛭石或合成氟云母，特别优选合成锂蒙脱石或合成皂石等合成蒙脱石，或以合成氟云母为代表的膨润性合成云母(或Na型云母)等合成云母(天然云母通常为非膨润性粘土矿物)。
下面举例说明本发明的比色分析方法适用于液系分析的例子，使用铜络合物作为电子授受颜色变化物质，以葡萄糖为分析对象。胆固醇等其他成分的分析，除随之改变氧化还原酶外，基本相同。
即，如上所述，合成铜络合物[Cu(bpy)2]Cl2。将该铜络合物和GDH在缓冲液中溶解，配制试剂溶液。也可以在水中溶解，但优选在缓冲液中溶解。缓冲液的pH例如为pH 6～8的范围，优选为pH 6.5～7的范围。铜络合物的浓度例如为0.1～60mM，优选为0.2～10mM，更优选为0.3～0.6mM。GDH的浓度例如为10～1000U/ml，优选为50～500U/ml，特别优选为100～200U/ml。该试剂溶液中如果添加血液等含葡萄糖的检体，例如，在5秒以内的短时间内，上述试剂溶液的颜色根据检体的葡萄糖浓度由蓝色变成红褐色。该变化可以用目测确认，也可以使用分光光度计等光学测定装置测定。上述检体的添加量，相对于上述试剂溶液1ml，例如为1～100μl的范围，优选为3～10μl的范围，更优选为5～10μl的范围。
如上所述，在本发明的比色分析方法中，除使用电子授受颜色变化物质，还优选使用锇络合物、钌络合物等介质。在试验片的情况下，相对于上述试剂溶液总量，该介质的用量例如为0.1～50mM，优选为0.5～10mM，更优选为1～3mM，在液系分析的情况下，相对于上述试剂溶液总量，该介质的用量例如为0.1～10mM，优选为0.1～1mM，更优选为0.1～0.3mM。它们的最适浓度根据使用的介质的种类而变化。
实施例
下面对本发明的实施例进行说明。下述中PQQ表示吡咯并喹啉醌，其他试剂的详细说明如下。
  试剂   生产厂家  备注(正式名称等)
  PQQGDH   东洋纺  PQQ-葡萄糖脱氢酶
  GOD   Sigma  葡萄糖氧化酶X-S型
  丙酮酸氧化酶   BoehringerMannheim
  葡萄糖   和光纯药  D(+)-葡萄糖
  丙酮酸   和光纯药  一水合丙酮酸锂
(实施例1)
将CuCl2和2，2’-联吡啶按摩尔比1∶2在约80℃的温浴中混合，配制[Cu(bpy)2]Cl2·6H2O水溶液(浓度80mM)。另外，将HPC-M在联吡啶铜络合物水溶液中溶解(浓度2质量％)，一次加热至50℃后，冷却至25℃。再在该水溶液中按50000U/ml的浓度溶解GDH，配制试剂溶液。然后，准备孔径随着厚度方向变化的非对称性多孔质膜(制品编号BTS-25、US Filter公司生产)，预先从上述多孔质膜的孔小的一面浸渍无机凝胶(制品编号Laponite XLG、ROOKWOOD Additives公司生产)的水溶液(2质量％)后，干燥。然后从上述多孔质膜的孔大的一面点上2μl试剂溶液，通风干燥，形成圆形的斑点(浅蓝色)。剪下该斑点部分，用带孔的PET膜夹住，制作成目的物葡萄糖分析用试验片。
在该试验片上点上4种葡萄糖浓度的血清(0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml)，点上5秒后，用反射率测定装置测定颜色变化(波长470nm)。结果如图1所示。如图所示，在该试验片中，点上5秒以内，根据葡萄糖浓度而显色。这种根据葡萄糖浓度的显色(红褐色)，通过目测也能够观察。显色所需要的时间为2～3秒。上述葡萄糖添加血清，是将糖酵解完毕的人全血血浆冻结熔化，得到的血清中，按上述各种浓度添加葡萄糖而配制的。
(实施例2)
将0.01mol氯化铜(II)在30ml热水中溶解，向其中加入0.02mol2，2’-联吡啶，搅拌。然后，冷却，析出六水合物结晶，得到[Cu(bpy)2]Cl2·6H2O。将含有该铜络合物的下述反应试剂1ml放入光程长10mm的微量吸收池中，用分光光度计(日本分光公司生产的V-550型)测定波长300nm～900nm的吸收光谱，将此作为空白(氧化型)。在该吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，搅拌，立即测定光谱。结果如图2所示。如图所示，通过酶反应，铜络合物被还原，确认在短波长侧有显色。
(反应试剂组成)
[Cu(bpy)2]Cl2     0.4mM
PIPES(pH 7.0)        50mM
PQQGDH               200U/ml
(实施例3)
将0.01mol氯化铜(II)及0.033mol 2，2’-联吡啶加到少量水中，加热至完全溶解后，冷却时，析出[Cu(bpy)3]Cl2·6H2O结晶。将含有该铜络合物的下述反应试剂1ml放入光程长10mm的微量吸收池中，用分光光度计(日本分光公司生产的V-550型)测定波长300nm～900nm的吸收光谱，将此作为空白(氧化型)。在该吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，搅拌，立即测定光谱。结果如图3所示。如图所示，通过酶反应，铜络合物被还原，确认在短波长侧有显色。
(反应试剂组成)
[Cu(bpy)3]Cl2     0.4mM
PIPES(pH 7.0)        50mM
PQQGDH               200U/ml
(实施例4)
分别将0.01mol氯化铜(II)在10ml热水中溶解，将0.01mol乙二胺(en)在10ml热水中溶解，将0.01mol 2，2’-联吡啶在10ml热乙醇中溶解，混合这3种溶液，得蓝色溶液。将该溶液冷却浓缩，得[Cu(en)(bpy)]Cl2针状结晶。将含有该铜络合物的下述反应试剂1ml放入光程长10mm的微量吸收池中，用分光光度计(日本分光公司生产的V-550型)测定波长300nm～900nm的吸收光谱，将此作为空白(氧化型)。在该吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，搅拌，立即测定光谱。结果如图4所示。如图所示，通过酶反应，铜络合物被还原，确认在短波长侧有显色。
(反应试剂)
[Cu(en)(bpy)]Cl2       0.4mM
PIPES(pH 7.0)           50mM
PQQGDH                  200U/ml
(实施例5)
将511mg(3.0mmol，1.0eq.)氯化铜(II)二水合物CuCl2·2H2O在10ml热水中溶解，配制氯化铜水溶液。另外，将408mg(6.0mmol，2.0eq.)咪唑在10ml水中溶解，将69mg(3.0mmol，1.0eq.)2，2’-联吡啶在10ml乙醇中溶解，配制这2种溶液的混合溶液。将该混合溶液加到氯化铜水溶液中，配制[Cu(Him)2(bpy)]Cl2的深蓝色溶液。将含有该铜络合物的下述反应试剂1ml放入光程长10mm的微量吸收池中，用分光光度计(日本分光公司生产的V-550型)测定波长300nm～900nm的吸收光谱，将此作为空白(氧化型)。在该吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，搅拌，立即测定光谱。结果如图5所示。如图所示，通过酶反应，铜络合物被还原，确认在短波长侧有显色。
(反应试剂)
[Cu(Him)2(bpy)]Cl2 1mM
PIPES(pH 7.0)         50mM
PQQGDH                1000U/ml
(实施例6)
分别将0.01mol氯化铜(II)在10ml热水中溶解，将0.01mol L-精氨酸在10ml热水中溶解，将0.01mol 2，2’-联吡啶在10ml热乙醇中溶解，混合这3种溶液，得深蓝色溶液。将该溶液冷却浓缩，得[Cu(L-Arg)(bpy)]Cl2针状结晶。将含有该铜络合物的下述反应试剂1ml放入光程长10mm的微量吸收池中，用分光光度计(日本分光公司生产的V-550型)测定波长300nm～900nm的吸收光谱，将此作为空白(氧化型)。在该吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，搅拌，立即测定光谱。结果如图6所示。如图所示，通过酶反应，铜络合物被还原，确认在短波长侧有显色。
(反应试剂)
[Cu(L-Arg)(bpy)]Cl2      1mM
PIPES(pH 7.0)              50mM
PQQGDH                     1000U/ml
(实施例7)
准备孔径随着厚度方向变化的非对称性多孔质膜(制品编号BTS-25、US Filter公司生产)，预先从上述多孔质膜的孔小的一面浸渍下述组成的无机凝胶水溶液(2质量％)后，干燥。然后从上述多孔质膜的孔大的一面点上2μl下述组成的试剂溶液，通风干燥，形成圆形的斑点(浅蓝色)。剪下该斑点部分，用带孔的PET膜夹住，制作成目的物葡萄糖分析用试验片。
(无机凝胶水溶液组成)
蒙脱石(与实施例1同一制品)        1.8质量％
CHAPS(表面活性剂)                0.4质量％
(试剂溶液)
[Cu(bpy)2]Cl2                 80mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl3        3mM
PQQ-GDH                          1000U/ml
BSA                              5％
CHAPS                            0.4％
在该试验片上点上4种葡萄糖浓度的血清(0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml)，点上5秒后，用反射率测定装置测定颜色变化(波长470nm)。结果如图7所示。如图所示，该试验片中，点上后立即根据葡萄糖浓度显色。这种根据葡萄糖浓度的显色(红褐色)，通过目测也能够观察。显色瞬时发生。上述葡萄糖添加血清，是将糖酵解完毕的人全血血浆冻结熔化，得到的血清中，按上述各种浓度添加葡萄糖而配制的。
(实施例8)
相对于下述组成的试剂溶液100μl，添加500mM葡萄糖水溶液10μl。于是，1分钟以内，上述试剂溶液由开始的颜色绿色变成红褐色，目测便可确认。上述试剂溶液开始的颜色为绿色，是因为GOD中含有的辅酶FAD为黄色、铜为蓝色，两者混合变成绿色。
(试剂溶液组成)
GOD(Sigma公司生产，比活性209U/mg)    50mg/ml
[Cu(bpy)2]Cl2                     40mM
PIPES(pH 7)                          50mM
CHAPS                                0.1质量％
(实施例9)
相对于下述组成的试剂溶液100μl，添加500mM葡萄糖水溶液10μl。于是，5秒钟以内，上述试剂溶液由开始的颜色绿色变成红褐色，目测便可确认。上述试剂溶液开始的颜色为绿色，是因为GOD中含有的辅酶FAD为黄色、铜为蓝色，两者混合变成绿色。
(试剂溶液组成)
GOD(Sigma公司生产，比活性209U/mg)    50mg/ml
[Cu(bpy)2]Cl2                     40mM
[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2            0.3mM
PIPES(pH 7)                          50mM
CHAPS                                0.1质量％
(实施例10)
制备具有各种配体的铜络合物。即，氯化铜(II)与以下配体按摩尔比1∶2混合，用精制水溶解，在约80℃的温浴中保温10分钟，使之配位，得络合物溶液。
  配体   生产厂家   络合物
  1，10-菲绕啉   和光纯药   二(1，10-菲绕啉)合铜
  红菲绕啉   和光纯药   二(红菲绕啉)合铜
  红菲绕啉磺酸二钠盐   Nacalai Tesque   二(红菲绕啉磺酸)合铜
  2，2’-联吡啶   和光纯药   二(2，2’-联吡啶)合铜
  TPTZ   同仁化学   [Cu(TPTZ)2]
  亚铜试剂   和光纯药   二(亚铜试剂)合铜
(实施例11)
使用下面所示配体和联吡啶作为配体，制备铜的混合配体络合物。即，铜∶以下配体∶联吡啶按摩尔比1∶2∶1混合，用精制水溶解，在约80℃的温浴中保温10分钟，使之配位，得以下配体。
  配体   生产厂家   络合物
  L-精氨酸   Nacalai Tesque   [Cu(L-Arg)(bpy)]
  乙二胺   Nacalai Tesque   [Cu(en)(bpy)]
  咪唑   和光纯药   [Cu(Him)(bpy)]
(实施例12)
使用各种配体制备铁络合物。将氯化铁(III)与以下配体按摩尔比1∶3混合，用精制水溶解，在约80℃的温浴中保温10分钟，使之配位，得络合物溶液。
  配体   生产厂家   络合物
  1，10-菲绕啉   和光纯药   三(1，10-菲绕啉)合铁
  红菲绕啉   和光纯药   三(红菲绕啉)合铁
  红菲绕啉磺酸二钠盐   Nacalai Tesque   三(红菲绕啉磺酸)合铁
  2，2’-联吡啶   和光纯药   三(2，2’-联吡啶)合铁
  4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶   本公司合成   三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铁
  TPTZ   同仁化学   [Fe(TPTZ)3]
  PDTS   同仁化学   [Fe(PDTS)3]
  亚硝基-PSAP   同仁化学   [Fe(亚硝基-PSAP)3]
  亚硝基-ESAP   同仁化学   [Fe(亚硝基-ESAP)3]
  1-亚硝基-2-萘酚   关东化学   三(1-亚硝基-2-萘酚)合铁
  2-氨基-4-噻唑乙酸   Lancaster   三(2-氨基-4-噻唑乙酸)合铁
  1，2-萘醌-4-磺酸   Nacalai Tesque   三(1，2-萘醌-4-磺酸)合铁
  硝基-PAPS   同仁化学   [Fe(硝基-PAPS)3]
(实施例13)
如下所述，制备2种钌络合物。
[Ru(NH3)6]
首先，将市售的钌络合物(Aldrich公司，Hexaammineruthenium(III)chloride(氯化六氨钌))在水中溶解，得[Ru(NH3)6]的络合物溶液。
三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合钌
<配体>将11.8g(63.0mmol)2，2’-联吡啶-N，N’-二氧化物g(2.60mmol)得到的[OsCl2(dmbpy)2]与0.36g(5.2mmol)咪唑(Him)在50ml水/甲醇混合溶剂中回流2小时。冷却至室温后，加入300ml饱和NaCl水溶液。将得到的沉淀减压过滤，用饱和NaCl水溶液洗涤后，减压干燥，得[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。
<精制>将[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2用尽量少量的乙腈/甲醇(1∶1v/v)溶解，用柱色谱(吸附剂：活性氧化铝，展开溶剂：乙腈/甲醇)精制。溶剂蒸发后，在少量的丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。将得到的沉淀减压过滤后，减压干燥。将其水溶，得络合物溶液。
[Os(Him)2(dmbpy)2]
<合成>在氮气流下，将2.00g(4.56mmol)(NH4)2[OsCl6]和1.68g(9.11mmol)dmbpy在60ml乙二醇中回流1小时。冷却至室温后，用30分钟加入120ml 1M连二亚硫酸钠水溶液，在冰浴中冷却30分钟。将得到的沉淀减压过滤，用水充分洗涤(使用500～1000ml)。再用乙醚洗涤2次后，减压干燥。这样，得[OsCl2(dmbpy)2]1.5～1.7g。在氮气流下，将1.56g(2.60mmol)得到的[OsCl2(dmbpy)2]与0.36g(5.2mmol)Him在50ml 1，2-乙二醇溶剂中回流2小时。冷却至室温后，加入300ml饱和NaCl水溶液。将得到的沉淀减压过滤，用饱和NaCl水溶液洗涤后，减压干燥，得[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2。
<精制>将[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2用尽量少量的乙腈/甲醇(1∶1v/v)溶解，用柱色谱(吸附剂：活性氧化铝，展开溶剂：乙腈/甲醇)精制。溶剂蒸发后，在少量的丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。将得到的沉淀减压过滤后，减压干燥。将其水溶，得络合物溶液。
(实施例15)
按下面的试剂溶液组成1～6，混合NN配位型菲绕啉配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图8A～(Aldrich公司生产)在用冰浴冷却过的浓硫酸120ml中缓慢溶解，将反应液加热到100℃。然后缓慢滴加64.0g(630mmol)硝酸钾的100ml浓硫酸溶液，之后加热搅拌1小时。反应后，将溶液放冷至室温，倒入碎冰中，过滤得4，4’-二硝基-2，2’-联吡啶-N，N’-氧化物固体。在氩气流下，将4，4’-二硝基-2，2’-联吡啶-N，N’-氧化物7.0g(25mM)、10％钯碳6.0g混悬于23ml乙醇中。向该溶液中滴加肼一水合物6.3g(126mmol)的47ml乙醇溶液，回流8小时。将反应液放冷后，过滤，浓缩滤液。用硅胶柱进行精制，得4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶。
<合成>在50mL二颈烧瓶中放入乙二醇(10ml)，依次搅拌溶解DA-bpy(0.2g)、RuCl3(0.1g)，在N2气流下强烈搅拌的同时用加热套加热，回流约4小时。
<精制>在N2气流下搅拌·放冷后，移到100ml茄形烧瓶中，将反应液用丙酮(5ml)+乙醚(20ml)洗涤。将反应液用丙酮(5ml)+乙醚(20ml)反复洗涤，直到溶剂乙二醇完全除去。将充分洗涤过的目的物用乙醇溶解，通过加入乙醚使目的物沉淀。用乙醚洗涤的同时过滤，减压干燥，得三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合钌固体。将其水溶，得络合物溶液。
(实施例14)
如下所述，制备2种锇络合物。
[OsCl(Him)(dmbpy)2]
<合成>在氮气流下，将(NH4)2[OsCl6]2.00g(4.56mmol、Aldrich公司)和1.68g(9.11mmol)4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶(dmbpy，和光纯药公司)在60ml乙二醇中回流1小时。冷却至室温后，用30分钟加入120ml 1M连二亚硫酸钠水溶液，在冰浴中冷却30分钟。将得到的沉淀减压过滤，用水充分洗涤(使用500～1000ml)。再用乙醚洗涤2次后，减压干燥，得[OsCl2(dmbpy)2]1.5～1.7g。在氮气流下，将1.56图8F所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成1：图8A)
PQQ-GDH                            50U/ml
二(1，10-菲绕啉)合铜               1mM
PIPES pH                           750mM
Triton X-100                       0.5％
(试剂溶液组成2：图8B)
PQQ-GDH                            50U/ml
三(1，10-菲绕啉)合铁               0.1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                       0.5％
(试剂溶液组成3：图8C)
PQQ-GDH                            50U/ml
[Cu(红菲绕啉)2]                   1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                       0.5％
(红菲绕啉＝4，7-二苯基菲绕啉)
(试剂溶液组成4：图8D)
PQQ-GDH                            50U/ml
[Fe(红菲绕啉)3]                  1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                       0.5％
(红菲绕啉＝4，7-二苯基菲绕啉)
(试剂溶液组成5：图8E)
PQQ-GDH                            50U/ml
[Cu(红菲绕啉磺酸)2]              1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                        0.5％
(试剂溶液组成6：图8F)
PQQ-GDH                             50U/ml
[Fe(红菲绕啉磺酸)3]                 0.1mM
PIPES pH 7                          50mM
Triton X-100                        0.5％
(实施例16)
按下面的试剂溶液组成1～4，混合NN配位型联吡啶配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图9A～图9D所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成1：图9A)
PQQ-GDH                              50U/ml
二(2，2’-联吡啶)合铜                1mM
PIPES pH 7                           50mM
Triton X-100                         0.5％
(试剂溶液组成2：图9B)
PQQ-GDH                              50U/ml
三(2，2’-联吡啶合铁                 1mM
PIPES pH 7                           50mM
Triton X-100                         0.5％
(试剂溶液组成3：图9C)
PQQ-GDH                              50U/ml
三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶合铜   0.1mM
PIPES pH 7                           50mM
Triton X-100                         0.5％
(试剂溶液组成4：图9D)
PQQ-GDH                                50U/ml
三(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶合钌     10mM
PIPES pH 7                             50mM
Triton X-100                           0.5％
(实施例17)
按下面的试剂溶液组成1～3，混合NN配位型三嗪配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图10A～图10C所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成1：图10A)
PQQ-GDH                                50U/ml
[Cu(TPTZ)2]                          1mM
PIPES pH 7                             50mM
Triton X-100                           0.5％
(TPTZ＝2，4，6-三吡啶基-s-三嗪)
(试剂溶液组成2：图10B)
PQQ-GDH                                50U/ml
[Fe(TPTZ)3]                          0.1mM
PIPES pH 7                             50mM
Triton X-100                           0.5％
(TPTZ＝2，4，6-三吡啶基-s-三嗪)
(试剂溶液组成3：图10C)
PQQ-GDH                                50U/ml
[Fe(PDTS)3]                          1mM
PIPES pH 7                             50mM
Triton X-100                           0.5％
(PDTS＝3-(2-吡啶基)-5，6-二(4-磺苯基)-1，2，4-三嗪)
(实施例18)
按下面的试剂溶液组成，混合NN配位型联喹啉配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图11所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成)
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Cu(亚铜试剂)2]                           1mM
PIPES pH 7                                 50mM
Triton X-100                               0.5％
(亚铜试剂＝2，2’-联喹啉)
(实施例19)
按下面的试剂溶液组成，混合NN配位型吡啶基偶氮配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图12所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成)
PQQ-GDH                                    50U/ml
[Fe(硝基-PAPS)3]                          0.02mM
PIPES pH 7                                 50mM
Triton X-100                               0.5％
(硝基-PAPS＝2-(5-硝基-2-吡啶基偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
(实施例20)
按下面的试剂溶液组成1～3，混合NO配位型配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图13A～图13C所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成1：图13A)
PQQ-GDH                                50U/ml
[Fe(亚硝基-PSAP)3]                   0.05mM
PIPES pH 7                             50mM
Triton X-100                           0.5％
(亚硝基-PSAP＝2-亚硝基-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
(试剂溶液组成2：图13B)
PQQ-GDH                                50U/ml
[Fe(亚硝基-ESAP)3]                   0.1mM
PIPES pH 7                             50mM
Triton X-100                           0.5％
(亚硝基-ESAP＝2-亚硝基-5-[N-乙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
(试剂溶液组成3：图13C)
PQQ-GDH                                50U/ml
[Fe(1-亚硝基-2-萘酚)3]               0.1mM
PIPES pH 7                             50mM
Triton X-100                           0.5％
(实施例21)
按下面的试剂溶液组成，混合NS配位型配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图14所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成)
PQQ-GDH                            50U/ml
三(2-氨基-4-噻唑乙酸)合铁          1mM
PIPES pH 7                         50mm
Triton X-100                       0.5％
(实施例22)
按下面的试剂溶液组成，混合OO配位型配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图15所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成)
PQQ-GDH                            50U/ml
三(1，2-萘醌-4-磺酸)合铁           1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                       0.5％
(实施例23)
按下面的试剂溶液组成1～5，混合混合配体的络合物、酶、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖，测定颜色变化后的光谱。结果如图16A～图16E所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成1：图16A)
PQQ-GDH                            50U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2]              0.1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                       0.5％
(Him＝咪唑)
(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)
(试剂溶液组成2：图16B)
PQQ-GDH                           50U/ml
[Os(Him)2(dmbpy)2]              0.1mM
PIPES pH 7                        50mM
Triton X-100                      0.5％
(试剂溶液组成3：图16C)
PQQ-GDH                           50U/ml
[Cu(L-Arg)2(bpy)]                1mM
PIPES pH 7                        50mM
Triton X-100                      0.5％
(L-Arg＝L-精氨酸)
(bpy＝2，2’-联吡啶)
(试剂溶液组成4：图16D)
PQQ-GDH                           50U/ml
[Cu(en)2(bpy)]                   1mM
PIPES pH 7                        50mM
Triton X-100                      0.5％
(en＝乙二胺)
(bpy＝2，2’-联吡啶)
(试剂溶液组成5：图16E)
PQQ-GDH                           50U/m1
[Cu(Him)2(bpy)]                  1mM
PIPES pH 7                        50mM
Triton X-100                      0.5％
(实施例24)
按下面的试剂溶液组成1、2，混合络合物、酶(葡萄糖氧化酶(GOD)、丙酮酸氧化酶)、缓冲液，配制试剂溶液。测定其光谱，作为空白，再相对于络合物添加当量的葡萄糖或丙酮酸，测定颜色变化后的光谱。结果如图17A、图17B所示。络合物使用根据上述实施例配制的。
(试剂溶液组成1：图17A)
GOD                                100U/ml
二(2，2’-联吡啶)合铜              1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                       0.5％
(试剂溶液组成2：图17B)
丙酮酸氧化酶                       100U/ml
[OsCl(Him)(dmbpy)2]                0.1mM
PIPES pH 7                         50mM
Triton X-100                       0.5％
(Him＝咪唑)
(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)
(实施例25)
按下面的试剂溶液组成，混合缓冲液，配制试剂溶液。另外，配制下述酶溶液1、2、3。在10mm长的处理池中添加0、10、20、30mM葡萄糖水溶液10μl(终浓度0、0.1、0.2、0.3mM)，然后添加上述试剂溶液500μl，最后，添加酶溶液500μl，开始反应，用分光光度计(波长600nm)观察50秒间的吸光度变化。结果如图18A、图18B、图18C所示。如图所示，酶量越增加，反应速度越快，酶活性1000U/ml时，5秒左右就达反应终点。对反应达到终点的5秒钟附近的信号取样，可以进行葡萄糖的定量。另外，根据反应到达终点的时间进程的趋势也可以进行葡萄糖的定量。
(试剂组成)
Cu(PDTS)2                        1mM
PIPES pH 7                        50mM
Triton X-100                      0.5％
(酶溶液1：图18A)
PQQ-GDH                           111U/ml
(酶溶液2：图18B)
PQQ-GDH                           333U/ml
(酶溶液3：图18C)
PQQ-GDH                           1000U/ml
产业利用性
如上所述，根据本发明的比色分析方法，可以短时间且简单地进行可靠的分析。

Claims (20)

1、使氧化还原酶作用于分析对象及通过电子授受而颜色变化的过渡金属络合物，通过测定由于上述分析对象向上述过渡金属络合物的电子传递而发生的上述过渡金属络合物的颜色变化，对上述分析对象进行定性或定量的比色分析方法。
2、根据权利要求1所述的比色分析方法，其中过渡金属络合物为选自铜络合物、铁络合物、钌络合物和锇络合物的至少一种络合物。
3、根据权利要求2所述的比色分析方法，其中过渡金属络合物的配体中的配位原子为选自氮、氧及硫的至少一种。
4、根据权利要求3所述的比色分析方法，其中过渡金属络合物的配体为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物。
5、根据权利要求4所述的比色分析方法，其中配体的配位位置以外的氢原子的至少一个被取代基取代。
6、根据权利要求5所述的比色分析方法，其中取代基为选自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基的至少一种。
7、根据权利要求1所述的比色分析方法，其中过渡金属络合物具有2种以上的配体。
8、根据权利要求1所述的比色分析方法，其中氧化还原酶为脱氢酶或氧化酶。
9、根据权利要求1所述的比色分析方法，其中分析对象为葡萄糖、胆固醇、尿酸、丙酮酸或乳酸，氧化还原酶为对应于上述各物质的脱氢酶或氧化酶。
10、在权利要求1所述的比色分析方法中使用的试剂，其为含有氧化还原酶及通过电子授受而颜色变化的过渡金属络合物的试剂。
11、根据权利要求10所述的试剂，其中过渡金属络合物为选自铜络合物、铁络合物、钌络合物和锇络合物的至少一种络合物。
12、根据权利要求10所述的试剂，其中过渡金属络合物的配体中的配位原子为选自氮、氧及硫的至少一种。
13、根据权利要求12所述的试剂，其中过渡金属络合物的配体为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物。
14、根据权利要求13所述的试剂，其中配体的配位位置以外的氢原子的至少一个被取代基取代。
15、根据权利要求14所述的试剂，其中取代基为选自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基的至少一种。
16、根据权利要求10所述的试剂，其中过渡金属络合物具有2种以上的配体。
17、根据权利要求10所述的试剂，其中氧化还原酶为脱氢酶或氧化酶。
18、根据权利要求10所述的试剂，其中分析对象为葡萄糖、胆固醇、尿酸、丙酮酸或乳酸，氧化还原酶为对应于上述各物质的脱氢酶或氧化酶。
19、含有权利要求10所述的试剂的试验片。
20、根据权利要求19所述的试验片，其还含有无机凝胶。
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