CN1198138C - 酶电极 - Google Patents
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Abstract
一种酶电极,其特征在于该酶电极包括电极系统和反应层,所述电极系统包含绝缘基片和在绝缘基片上形成的工作电极、反电极和任选地参比电极,所述反应层包含黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS),其中至少有一部分反应层位于工作电极上,并且反应层中所含的DI、12α-HSD和NADS固定在工作电极的表面,以便在反应层中产生的化合物能够到达工作电极的表面;还公开了利用酶电极测定三磷酸腺苷(ATP)浓度的方法和进行该测定的系统。
Description
发明背景
技术领域
本发明涉及酶电极。更具体地讲,本发明涉及包括如下构成的酶电极:(a)电极系统,该电极系统包含一个在其上形成有工作电极、反电极和任选地参比电极的绝缘基片;和(b)在电极系统上形成的反应层,其中该反应层包含黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS),至少一部分反应层位于工作电极上,其中,上面提到的那部分反应层中所含的DI、12α-HSD和NADS固定在工作电极的表面,以便反应层中产生的化合物能够到达工作电极的表面。
另外,本发明涉及通过使用上面提到的酶电极来测定三磷酸腺苷(ATP)浓度的方法,还涉及用于测定ATP浓度并包含上面提到的酶电极的系统。
本发明的酶电极有利于微型化用于测定ATP浓度的装置。此外,通过使用本发明的酶电极,能够简单快速地、高灵敏度地测定样品的ATP浓度而不需要麻烦的预处理。
现有技术
三磷酸腺苷(ATP)是几乎普遍存在于多种生物有机体内的化合物。
在生物体内发生的许多化学反应都利用ATP水解产生二磷酸腺苷(ADP)或一磷酸腺苷(AMP)的过程中所释放出的能量来进行。此外,在生物体内,ATP还用作核糖核酸(RNA)的前体以及体内磷酸化作用的磷酸供体。
因此,ATP是生物体内起着非常重要作用的化合物,因此,ATP的定量分析在各种领域中都很重要。
例如,在食品卫生和环境卫生领域,ATP浓度被用作因微生物(例如细菌)或食物残渣引起的污染程度的指数,所述的食物残渣有可能是微生物污染的原因。
当微生物或食物残渣附着到食物或器具如餐具、厨房用具和食品加工机上时,从食物或器具的表面检测到的ATP的量因来自微生物或食物残渣的ATP而有所增加。因此,需要将从食物或器具表面得到的样品进行ATP的定量分析,由此确定污染程度。可以认为,样品的ATP浓度越高,被微生物或食物残渣污染的程度越高。
由于样品中ATP的量非常小,所以为了确定污染程度就需要准确地测定ATP浓度的非常灵敏的方法。作为确定污染程度的方法,公知的方法是使用荧光素-荧光素酶反应测定ATP浓度。该方法包括如下步骤:将荧光素和荧光素酶与从样品中提取的ATP反应,由此引起发光,然后从发光的强度确定样品的污染程度。
在该方法中,使用能表示发光强度与污染程度之间的相互关系的校正曲线来确定污染程度,其中,通过将几个具有预定污染程度的标准样品进行上述步骤来制备校正曲线。
基于荧光素-荧光素酶反应的方法利用昂贵的装置进行,所述的装置通常体积很大,因此难于移动。因此,上面提到的方法不能适用于需要移动装置的分析。例如,上面提到的方法不能用于需要将分析装置移到户外或者需要防止微生物污染的地方从而在那里进行所需分析的野外分析。
此外,在该方法中,使用光学技术检测ATP,因此,存在的缺点在于分析所用装置的电力消耗很大。
另外,该使用光学技术的分析方法通常难于分析浑浊的样品。因此,上面提到的方法不适用于分析非常浑浊的样品例如牛奶或血液,在分析所述的浑浊样品前,需要稀释样品,或者是将样品进行预处理以除去或溶解引起浑浊的不溶性微粒。结果,该方法也存在诸如麻烦、灵敏度低之类的问题。
在这种情况下,用于定量分析ATP的酶电极作为不仅容易移动、而且能够用很少的电力消耗进行操作的装置而受到关注,该装置紧凑并能够直接分析非常浑浊的样品。
酶电极是所谓生物传感器的一种类型,它是能够将酶反应引起的物质的量的变化通过电化学技术转换成电信号的设备。使用电信号进行具体物质的检测和测定。
通过使用酶电极来测定样品中具体物质浓度的方法在现有技术中是公知的。这些方法最近因其有利特征例如快速、简单、经济的优点而受到关注,酶电极在临床检查等领域中的应用也开始扩大。
与基于光学技术的分析不同的是,使用酶电极的分析的优点在于甚至是浑浊样品本身也能够进行分析而不需要将其稀释等,因此,进行分析只需要非常简单的操作。
现有技术中公知的酶电极的一个例子是用于测定血样的葡萄糖浓度的酶电极(参见日本专利号2517153)。该酶电极包括:电极系统,该电极系统包含在其上形成有工作电极和反电极的绝缘基片,其中通过网板印刷等制备电极;在电极系统上形成的绝缘层(该绝缘层用于将电极暴露部分的表面积保持在预定值);和酶反应层,该酶反应层包含在电极系统上形成的亲水性聚合物、氧化还原酶和电子载体。
作为定量分析ATP的酶电极,已经提出了使用葡萄糖氧化酶和己糖激酶的酶电极(参见未审查的日本专利申请公开说明书昭60-17347(对应于美国专利4,711,245和4,758,323)和Analytica Chimica Acta,1997,第340卷,109-113页)。
葡萄糖氧化酶促进葡萄糖的氧化,己糖激酶利用ATP作为磷酸供体以促进葡萄糖的磷酸化作用。由于两种酶均使用葡萄糖作为其底物,所以当将酶电极用于分析样品中的ATP时,上述的两种酶反应(前一反应和后一反应)同时进行,在酶电极上发生的后一反应的数目随着样品中ATP量的增加而增加。为了分析ATP,上述的酶电极利用了该现象。
作为定量分析ATP的酶电极的另一种类型,已知的是使用三磷酸腺苷酶(ATP酶)和氢离子敏感性场效应晶体管(pH-ISFET)的酶电极(参见未审查的日本专利中请公开说明书昭61-122560和昭61-269058)。
PH-ISFET是能够将氢离子浓度的变化转换成电信号的半导体元件。
在ATP通过ATP酶水解的过程中生成氢离子,这引起氢离子浓度的增加。上述的酶电极是能够通过pH-ISFET将所述的氢离子浓度增加转换成电信号的设备,然后将电信号用于测定ATP的量。
关于上述的酶电极,ATP的测定灵敏度仅仅约是10-4M至10-5M(参见Fuji Technosystem Co.Ltd.,日本(1976)出版的“Fukyuban SensaGijyutu(传感器技术,普通版本)”的第332页),该酶电极不适于实际应用。
作为用于定量分析ATP并具有足够灵敏度的酶电极的一个例子,可以提到使用丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶电极(Electroanalysis,1991,第3卷,659-663页)。
在该酶电极中,将丙酮酸激酶和己糖激酶用于进行ATP/ADP体系的酶催化循环,从而提高酶电极的灵敏度。酶催化循环是提高测定灵敏度的方法,其中通过使用两种或多种酶的组合来放大物质的量的变化。
在上述的酶电极中,6-磷酸葡萄糖和ADP由葡萄糖和ATP通过己糖激酶生成,将其生成的6-磷酸葡萄糖的量的变化转换成电信号。
另一方面,丙酮酸激酶催化ATP从生成的ADP的再生,然后将再生的ATP进行上述利用己糖激酶的酶催化反应。
这两种反应的反复进行使得通过酶催化反应生成的6-磷酸葡萄糖的量增加,所述的增加与分析的样品中ATP的量成正比。结果,酶电极的灵敏度提高,从而能够定量分析通常不可检测的少量ATP。关于利用该酶电极进行的ATP测定,据报道ATP的测定灵敏度接近10-9M。
但是,该酶电极具有如下问题。
用于该酶电极的己糖激酶是变构酶,该酶的酶催化反应速率难于控制,因为酶活性易受到除其底物之外的物质的影响。因此,ATP的定量分析显得困难,特别是当样品的ATP浓度低时。
此外,在该酶电极中,通过使用明胶膜的包合法来固定酶。当将该酶电极用于分析时,为了制备均匀的样品溶液并便于样品溶液渗入含有酶的明胶膜,需要通过搅拌器产生样品溶液流。结果,使用上述酶电极的装置的微型化变得困难。
如上所述,ATP/ADP体系的酶催化循环在该酶电极中进行。由于ADP和ATP都包含在该酶催化循环内,所以利用该酶电极进行的分析受到样品中ADP浓度的影响。因此,为了选择性地测定同时含有ATP和ADP的样品中的ATP浓度,需要进行麻烦的预处理以从样品中除去ADP。
从上面的描述可以明显地看出,常规的酶电极不能用于简单快速地并且非常灵敏地对样品中的ATP浓度进行测定。
发明概述
在这种情况下,本发明人以开发能简单快速、高灵敏度地测定样品的ATP浓度而不需要麻烦的预处理的酶电极为目的进行了广泛且深入的研究。结果,出人意料地发现,当酶电极包含含有黄递酶、12α-羟基甾类脱氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶的反应层时,该酶电极能够非常灵敏、快速地测定样品中的ATP浓度。
此外,本发明人还发现,当利用上述酶电极测定样品中的ATP浓度时,酶电极不会受到样品中共存的ADP的影响,因此,不需要麻烦的预处理,并且能够用非常简单的操作进行ATP浓度的测定。
本发明在上述新发现的基础上得以完成。
因此,本发明的一个目的是提供能够简单、高灵敏地测定样品中的ATP浓度的酶电极。
本发明的另一个目的是提供通过使用上面提到的酶电极测定样品中的ATP浓度的方法。
本发明的又一个目的是提供包含上面提到的酶电极、用于测定样品中的ATP浓度的系统。
从如下的详细描述以及所附权利要求并结合附图,本发明前面描述的以及其它的目的、特征和优点对于本领域技术人员来说将更加明显。
附图简述
在附图中:
图1(a)至1(c)是表示在实施例1和2以及参考实施例2至4所用电极系统的制备过程中所涉及的步骤的示意图,其中:
图1(a)是绝缘基片的示意图,其中在绝缘基片1的表面上形成导线2,2。
图1(b)是通过分别形成与图1(a)所示的导线2和2相连的工作电极3和反电极4所得到的电极系统前体的示意图,和
图1(c)是通过在图1(b)所示的电极系统前体上,在其表面部分(除了对应于导线2和2的末端部分、工作电极3的所有部分和反电极4的所有部分之外的表面部分)形成绝缘层5所得到的电极系统的示意图;
图2是表示构成实施例1和2以及参考实施例2至4所用的电极系统的各部件之间相对位置关系的示意性分解图,其中将绝缘基片1、导线2,2、工作电极3、反电极4和绝缘层5在厚度方向上进行分解。
图3是表示参考实施例1中分析的样品的ATP浓度与关于该样品所得到的电流值之间的相互关系的图形。
图4是表示在实施例1中分析的样品的ATP浓度与关于该样品所得到的电流值之间的相互关系的图形。
图5是表示在实施例2中分析的样品的ATP浓度与关于该样品所得到的电流值之间的相互关系的图形。
编号的描述
在图1(a)至1(c)和图2中,编号的定义如下。
1:绝缘基片
2:导线
3:工作电极
4:反电极
5:绝缘层
发明详述
本发明提供了一种酶电极,所述的酶电极包括:
(a)电极系统,该电极系统包含一个在其上形成有工作电极、反电极和任选地参比电极的绝缘基片;和
(b)在电极系统上形成的反应层,其中该反应层包含黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS),
至少一部分反应层位于工作电极上,其中,这部分反应层中所含的DI、12α-HSD和NADS固定在工作电极的表面,以便反应层中产生的化合物能够到达工作电极的表面。
为了容易理解本发明,下面列举出了本发明的本质特征和各种实施方案。
1、一种酶电极,包括:
(a)电极系统,该电极系统包含一个在其上形成有工作电极、反电极和任选地参比电极的绝缘基片;和
(b)在电极系统上形成的反应层,其中该反应层包含黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS),
至少一部分反应层位于工作电极上,其中,这部分反应层中所含的DI、12α-HSD和NADS固定在工作电极的表面,以便反应层中产生的化合物能够到达工作电极的表面。
2、按照上面第1项所述的酶电极,其还包含亲水性聚合物层,所述亲水性聚合物层位于工作电极和反应层之间并与工作电极和反应层二者都接触。
3、按照上面第1或2项所述的酶电极,其中,关于位于工作电极上的反应层部分:
蛋白质的总量为每平方厘米反应层部分2.5mg或更少;
以DI的活性计,DI的量为每平方厘米反应层部分0.25U或更多;
以12α-HSD的活性计,12α-HSD的量为每平方厘米反应层部分0.63U或更多;
以NADS的活性计,NADS的量为每平方厘米反应层部分0.063U或更多。
4、按照上面第1至3项中的任何一项所述的酶电极,其中,关于位于工作电极上的反应层部分:
蛋白质的总量为每平方厘米反应层部分1.5mg或更少;
以DI的活性计,DI的量为每平方厘米反应层部分1.0U或更多;
以12α-HSD的活性计,12α-HSD的量为每平方厘米反应层部分2.5U或更多;
以NADS的活性计,NADS的量为每平方厘米反应层部分0.25U或更多。
5、按照上面第1至4项中的任何一项所述的酶电极,其中,关于位于工作电极上的反应层部分:
蛋白质的总量为每平方厘米反应层部分1.1mg或更少;
以DI的活性计,DI的量为每平方厘米反应层部分2.5U或更多;
以12α-HSD的活性计,12α-HSD的量为每平方厘米反应层部分6.25U或更多;
以NADS的活性计,NADS的量为每平方厘米反应层部分0.625U或更多。
6、一种测定样品中的三磷酸腺苷(ATP)浓度的方法,该方法包括:
将样品与含有烟酸腺嘌呤二核苷酸、胆汁盐、电子载体和至少一种选自氨和铵离子的物质的水溶液混合,由此得到样品溶液;
将样品溶液与上面第1至5项中的任何一项所述的酶电极的工作电极、反电极和任选地参比电极接触,由此形成通过样品溶液的电流;
在所述酶电极的工作电极和反电极之间、或者是其工作电极和参比电极之间向所述的酶电极施加电压,由此在工作电极的表面进行电子载体的氧化反应并同时测定所述工作电极上的电流,其中当酶电极不含参比电极时,将电压施加到工作电极和反电极之间,其中当酶电极含有参比电极时,将电压施加到工作电极和参比电极之间;然后
根据工作电极上电流的测定值计算ATP的量。
7、一种测定样品中的三磷酸腺苷(ATP)浓度的系统,其中使用烟酸腺嘌呤二核苷酸、胆汁盐、电子载体和至少一种选自氨和铵离子的物质来测定ATP的浓度,
该系统包括:
上面第1至5项中的任何一项所述的酶电极;
在所述酶电极的工作电极和反电极之间、或者是其工作电极和参比电极之间向所述的酶电极施加电压的装置,该电压足以在工作电极的表面上进行电子载体的氧化发应;和
测定工作电极上的电流的装置。
8、按照上面第7项所述的系统,其还包含用于根据工作电极上电流的测定值计算ATP的量的装置。
下面将详细描述本发明。
本发明的酶电极包括:
(a)电极系统,该电极系统包含一个在其上形成有工作电极、反电极和任选地参比电极的绝缘基片;和
(b)在电极系统上形成的反应层,其中该反应层包含黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS),
至少一部分反应层位于工作电极上,其中,这部分反应层中所含的DI、12α-HSD和NADS固定在工作电极的表面,以便反应层中产生的化合物能够到达工作电极的表面。
首先,详细解释电极系统(a)。
通过将电绝缘材料模制成板状形式来得到电极系统(a)的绝缘基片。关于绝缘基片的形状没有具体限制,可以利用所有任意选择的形状。
优选电绝缘材料具有优良的防水性、耐热性和耐化学性。另外,特别优选电绝缘材料表现出与用作下面提到的电极和导线的原料的导电材料具有优良的粘合性能。
电绝缘材料的例子包括绝缘聚合物例如聚对苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚乙烯硫化物、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚醚硫化物、聚酰亚胺和脲树脂;玻璃、石英、陶瓷和纸张。
通过在绝缘基片上形成工作电极、反电极和任选地参比电极(在下文中,通常将工作电极、反电极和参比电极统称为“电极”)可以得到上述的电极系统(a)。
一般地,参比电极不一定包括在本发明的酶电极之内,只含有工作电极和反电极的电极系统也能够起到令人满意的作用。然而,当本发明的酶电极包含参比电极时,可以更精确地测定ATP浓度。
在本发明中,通常将绝缘基片上形成的导电材料的薄膜用作电极。
导电材料的例子包括碳、金、铂、银、氯化银、铁、锌、镍和钯。这些材料可以单独使用或组合使用。
为了形成电极,可以使用喷镀法、离子镀方法、光刻法、真空沉积法、化学真空沉积(CVD)法和电解法。
此外,还可以通过将含有微粒形式的导电材料的糊状物涂布到绝缘基片的表面来形成电极。特别优选将含有微粒形式的导电材料的糊状油墨(例如碳糊油墨或银糊油墨)用于通过筛板印刷等在绝缘基片上印刷电极的方法,因为利用该方法能够快速、低成本地生成电极系统。此外,当将廉价材料例如碳用作导电材料时,可以很大程度地降低酶电极的生产成本,因此,该方法特别有利于制备一次性的酶电极。
按照下面的详细说明,当用本发明的酶电极测定样品中的ATP浓度时,在所述酶电极的工作电极和反电极之间(或其工作电极和参比电极之间)向该酶电极施加电压。因此,需要适当地选择电极的形状,以便电极能够连接到通过导体等施加电压的装置上。
如果需要,可以使用与制备电极的材料不同的导电材料在绝缘基片上形成导线,用于向酶电极施加电压的装置通过导体连接到导线上。
按照与上面描述的关于电极的方法基本上相同的方式形成导线。
此外,如果需要,为了将所有电极的暴露部分(也就是说,下面提到的与样品溶液接触的电极部分)的表面积维持在预定值并且为了防止短路的发生,可以在电极系统(a)上形成绝缘层。通常将电绝缘聚合物例如热固性聚酯用作绝缘层的材料。
绝缘层形状的例子表示在图1(c)和2中。从这些图可以明显地看出,在该实施例中,在电极系统(a)上,在其表面部分(除了对应于导线2,2的末端部分、工作电极3的所有部分和反电极4的所有部分的那些表面部分)上形成了绝缘层。导线2,2的末端部分是暴露的,没有用绝缘层覆盖,以便导线可以连接到导体等上,该导体可用于连接用于向酶电极施加电压的装置。
如果需要,可以将电极进行表面处理,例如洗涤、抛光和等离子体蚀刻。
为了洗涤电极表面,可以采用使用超声波洗涤装置的方法,或者是使用适当洗涤剂的方法。或者,这些方法可以组合使用。
优选上面提到的洗涤剂是不会损坏电极和绝缘基片的物质,通常使用有机溶剂和酸。作为有机溶剂,优选极性溶剂,特别优选酮类(例如丙酮)和醇类(例如异丙醇)。作为酸,优选稀硫酸。
另外,电解阴极的水可以用作上面提到的洗涤剂。电极阴极的水是当纯水等进行电解时在阴极侧形成的含水液体。尽管其pH在中性至弱碱性的范围内,但是电解阴极的水具有很强的引起还原的能力。电解阴极的水因该性能而优选用作洗涤剂,因为它能够对绝缘基片的表面以及附着于其上的颗粒表面给出负电荷而不会损害绝缘基片和电极,由此防止已经与基片表面分离的粒子重新附着到基片上。
作为抛光电极表面的方法,可以提到使用氧化铝悬浮液的方法以及使用经极性有机溶剂例如乙醇浸渍过的无纺布的方法。
在本发明中,优选通过等离子体蚀刻进行表面处理,因为其不仅清洗了电极表面,而且改善了电极表面的润湿性能。改善的润湿性能有利于下面提到的酶的固定。
下面详细说明反应层(b)。
如上所述,本发明所用的反应层(b)包含黄递酶(EC 1.6.99.2)(在下文中称作“DI”)、12α-羟基甾类脱氢酶(EC 1.1.1.176)(在下文中称作“12α-HSD”)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(EC 6.3.1.5)(在下文中称作“NADS”)。
DI是通过用还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为辅酶而具有催化还原各种化合物(特别是将硫辛酸衍生物还原生成相应的二氢硫辛酸衍生物)的活性的酶。
衍生自各种生物体例如哺乳动物如牛和大鼠;酵母菌;和细菌例如巨大芽孢杆菌、克氏梭菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和费氏发光杆菌的DI在本领域是公知的。在本发明中,特别优选衍生自巨大芽孢杆菌的DI。
12α-HSD是通过使用氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为辅酶而具有将胆汁酸(及其衍生物)在12α位的羟基催化氧化成酮基的活性的酶。
衍生自各种生物体例如细菌如球形芽孢杆菌、梭菌属的种和迟缓真杆菌的12α-HSD在本领域是公知的。在本发明中,特别优选衍生自球形芽孢杆菌的12α-HSD。
NADS是既能够催化ATP水解生成AMP、又能够通过使用ATP水解过程中释放的能量从烟酸腺嘌呤二核苷酸(脱酰氨基-NAD+)和氨和/或铵离子催化合成NAD+的酶。
衍生自各种生物体例如细菌如嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌的NADS在本领域是公知的。在本发明中,特别优选衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌的NADS。
在常规的酶电极中,使用许多酶并包含许多反应层的酶电极是公知的,其中酶分别包含在不同的反应层中。这种酶电极具有非常复杂的结构,该复杂结构需要复杂的制备方法。结果,这些酶电极的制作成本很高。
相反,在本发明的酶电极中,DI、12α-HSD和NADS酶包含在同一反应层中。因此,本发明的酶电极具有相对简单的结构并能够容易地、低成本地制作。
目前还没有在单一反应层中含有DI、12α-HSD和NADS酶的常规的酶电极。日本专利申请公开说明书平6-88805和平9-229895公开了在反应层中包含三种类型的酶的酶电极,其中在工作电极上形成反应层。但是,这些专利文件中公开的酶电极不是为测定样品中的ATP浓度而设计的,另外,这些酶电极中的酶不含有DI、12α-HSD和NADS中的任何一种。
在本发明中,关于酶电极中含有的DI、12α-HSD和NADS酶的量没有具体限制。但是,从提高酶电极的灵敏度的观点来看,关于位于工作电极上的反应层部分,优选蛋白质的总量为每平方厘米反应层的重叠部分2.5mg或更少,以DI的活性计,DI的量为每平方厘米反应层的重叠部分0.25U或更多,以12α-HSD的活性计,12α-HSD的量为每平方厘米反应层的重叠部分0.63U或更多,以NADS的活性计,NADS的量为每平方厘米反应层的重叠部分0.063U或更多。
按照下面的详细解释,为了利用本发明的酶电极测定样品中的ATP浓度,样品溶液中的ATP必须扩散进入酶电极的反应层并通过反应层中的NADS水解成AMP。
当反应层含有大量蛋白质时,样品溶液中的ATP扩散进入反应层的速率降低(也就是说,每单位时间扩散进入反应层的ATP的量减少),结果,快速分析变得困难,酶电极的灵敏度也降低。
通过本发明的酶电极进行分析的样品溶液具有非常低的ATP浓度,即微摩尔浓度(μM)(10-6M)或更低,通常是纳摩尔浓度(nM)(10-9M),因此,样品溶液中的ATP扩散进入反应层的速率本身就很低。另外,在利用本发明的酶电极进行分析的过程中不进行能促进ATP扩散的操作例如对样品溶液的搅拌,因此,反应层中所含的蛋白质会明显地抑制ATP的扩散。
因此,在本发明的酶电极中,关于反应层,特别是其位于工作电极上的部分,优选蛋白质的总量不要超过本发明所定义的具体量。
在本发明的酶电极中,关于位于工作电极上的反应层部分,蛋白质的总量优选为每平方厘米反应层的重叠部分2.5mg或更少、更优选1.5mg或更少、最优选1.1mg或更少。
蛋白质的总量可以通过从酶电极中取出反应层并利用常规方法例如比色法(例如双缩脲法和BCA法)测定其中含有的蛋白质量来确定。
上面提到的日本专利申请公开说明书平6-88805和平9-229895(其公开了在工作电极上形成的反应层中包含三种酶的酶电极)记载了酶的最小用量,但是没有描述酶的最大用量。
利用上面提到的常规酶电极进行分析的样品就分析的目标物质而言具有相对高的浓度,因此,这些常规酶电极所需的灵敏度可能相对较低。所认为的其中一个原因可能是在常规的酶电极中没有考虑酶含量对酶电极灵敏度的负面影响。
另外,应该注意到,样品中用于分析的目标物质的浓度高将使得目标物质具有相对高的扩散速率。在常规酶电极的情况下,由于样品的目标物质的浓度高,所以因反应层的酶浓度高而引起的扩散速率的降低以及伴随着的灵敏度的降低并不认为是个问题,甚至在短时间内进行分析而不搅拌样品时。
另一方面,当反应层中酶的量太小时,与ATP的量成正比的电信号的值将变得非常小,因ATP引起的电信号和本底噪声之间的差值将变得太小而无法检测。结果,酶电极的灵敏度降低。
因此,在本发明的酶电极中,关于反应层,特别是其位于工作电极上的部分,以DI、12α-HSD和NADS的活性计,优选DI、12α-HSD和NADS的量不小于本发明所定义的具体量。
在本发明的酶电极中,关于位于工作电极上的反应层部分,以DI的活性计,DI的量优选为每平方厘米反应层的重叠部分0.25U或更多、更优选1.0U或更多、最优选2.5U或更多。
将DI的酶活性定义为:在37℃、pH8.0的条件下,在电子载体(如下所述)的存在下每单位时间被DI氧化的NADH的摩尔量。1U DI相当于每分钟氧化1μmol NADH的DI的酶活性。
在上面提到的反应中,NADH的氧化与电子载体的还原同时发生,因此,氧化的NADH的摩尔量等于通过电子载体的还原产生的还原态电子载体的摩尔量。因此,为了方便,通过测定因酶反应产生的还原态电子载体的摩尔量来确定DI的酶活性。
在本发明的酶电极中,关于位于工作电极上的反应层部分,以12α-HSD的活性计,12α-HSD的量优选为每平方厘米反应层的重叠部分0.63U或更多、更优选2.5U或更多、最优选6.25U或更多。
将12α-HSD的酶活性定义为:在37℃、pH8.0的条件下,每单位时间被12α-HSD氧化的脱氧胆酸(一种胆汁酸)的摩尔量。1U 12α-HSD相当于每分钟氧化1μmol脱氧胆酸的12α-HSD的酶活性。
在上面提到的反应中,脱氧胆酸的氧化与NAD+还原生成NADH同时发生,因此,产生的NADH的摩尔量等于氧化的脱氧胆酸的摩尔量。当产生的NADH以上述方式在电子载体(下面提到的)的存在下被DI氧化时,电子载体的还原同时发生,因此,氧化的NADH的摩尔量等于通过电子载体的还原产生的还原态电子载体的摩尔量。
12α-HSD的酶活性的测定如下。在200U/ml DI和电子载体存在下用12α-HSD氧化脱氧胆酸,由此产生NADH,然后用DI催化所产生的NADH的氧化和电子载体的还原。然后测定生成的还原态电子载体的摩尔量,由此测定12α-HSD的酶活性。
在本发明的酶电极中,关于位于工作电极上的反应层部分,以NADS的活性计,NADS的量优选为每平方厘米反应层的重叠部分0.063U或更多、更优选0.25U或更多、最优选0.625U或更多。
将NADS的酶活性定义为:在37℃、pH9.5的条件下,每单位时间内通过NADS合成的NAD+的摩尔量。1U NADS相当于每分钟合成1μmol NAD+的NADS的酶活性。
NADS的酶活性的测定如下。在200U/ml 3α-羟基甾类脱氢酶的存在下用NADS合成NAD+并用3α-羟基甾类脱氢酶还原合成的NAD+,由此产生NADH。然后通过测定在340nm处的吸光度来测定产生的NADH的量,由此测定NADS的酶活性。
本发明的酶电极还可以含有除上面提到的三种酶以外的蛋白质,只要这些蛋白质不会对酶电极的性能产生负面影响即可。例如,在酶电极的反应层中可以含有牛血清白蛋白、3α-羟基甾类脱氢酶、7α-羟基甾类脱氢酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。
本发明的酶电极被设计成至少有一部分反应层位于工作电极上,其中,将反应层的重叠部分所含的DI、12α-HSD和NADS酶固定在工作电极的表面,以便反应层中产生的化合物能够到达工作电极的表面。
下面详细说明形成上面提到的反应层(b)的方法。
对于形成反应层的方法没有具体限制,只要能够形成含有DI、12α-HSD和NADS酶的均匀涂层即可。反应层的形成通常也用于将DI、12α-HSD和NADS酶固定在工作电极的表面。
将酶固定在工作电极的表面不仅包括将酶直接结合到工作电极的表面上而进行的固定,而且还包括没有将酶直接结合到工作电极的表面上而达到的固定。
关于形成反应层的方法(用于固定酶的方法),可以利用常规方法,例如下面列举的方法:
(1)通过使用交联剂例如戊二醛将DI、12α-HSD和NADS直接固定到工作电极表面上的方法;
(2)在工作电极的表面上形成在其表面上具有适当官能团的涂层并将DI、12α-HSD和NADS直接键合到官能团上或者通过交联剂键合到官能团上的方法;
(3)在工作电极的表面叠加一层亲水性聚合物层并将含有DI、12α-HSD和NADS的水溶液滴加到亲水性聚合物层上然后进行干燥的方法;
(4)将具有架型结构的聚合物(例如交联的白蛋白)涂布到工作电极的表面上并将DI、12α-HSD和NADS掺入涂层中的方法。
在上面的方法(2)中所用涂层的具体例子包括通过等离子体聚合含有氮原子的单体制备的在其表面上具有氨基的涂层,还包括通过旋转涂布并干燥含有官能团的硅烷偶联剂(例如氨基硅烷、乙烯基硅烷或环氧硅烷)溶液制备的涂层。当使用硅烷偶联剂涂层时,从该涂层与工作电极的粘合性以及参与ATP分析的物质的选择性渗透性的观点来看,优选的硅烷偶联剂是γ-氨基-丙基三乙氧基硅烷(其是一种氨基硅烷)。在这种情况下,在制备涂层的溶液中,硅烷偶联剂的浓度优选约为1%(v/v)。
为了防止蛋白质和电极系统之间不必要的相互作用(例如蛋白质粘结到电极系统上),优选上面提到的方法(3)。
优选通过用0.05至2%(w/w)亲水性聚合物的水溶液涂布工作电极的表面然后干燥来形成亲水性聚合物层。
亲水性聚合物的例子包括水溶性纤维素衍生物,例如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧乙基甲基纤维素和乙基纤维素;聚乙烯吡咯烷酮;聚乙烯醇;明胶及其衍生物;聚丙烯酸及其盐;淀粉及其衍生物;马来酸酐的聚合物及其盐;聚丙烯酰胺;甲基丙烯酸树脂和聚-2-羟基乙基甲基丙烯酸酯。
关于将酶溶液涂布到工作电极表面上的方法,可以利用点滴法、旋转涂布法和浸渍法(浸涂法),优选能够精确控制涂层厚度的旋转涂布法。
优选在不会引起酶活性变性的温度下将酶溶液干燥,也就是说,温度范围为室温(25℃)至40℃。干燥酶溶液所需要的时间随着温度而变化,但是通常为0.5至24小时。干燥可以在空气中进行,但是干燥也可以在惰性气氛例如氮气中进行。例如,可以利用通过将氮气吹到基片上来干燥酶的氮气吹干法。
利用通过以上提到的方式得到的酶电极能够简单快速地、高灵敏度地测定样品中的ATP浓度而不需要麻烦的预处理。
下面将详细解释利用本发明的酶电极来测定样品中的ATP浓度的方法。
在本发明中,利用包括如下步骤的方法测定样品中的ATP浓度:
将样品与含有烟酸腺嘌呤二核苷酸(脱酰胺基-NAD+)、胆汁盐、电子载体和至少一种选自氨和铵离子的物质的水溶液混合,由此得到样品溶液;
将样品溶液与上面提到的酶电极的工作电极、反电极和任选地参比电极接触,由此形成通过样品溶液的电流;
在酶电极的工作电极和反电极之间、或者是其工作电极和参比电极之间向所述酶电极施加电压,由此在工作电极的表面进行电子载体的氧化反应并同时测定工作电极上的电流,其中当酶电极不含参比电极时,将电压施加到工作电极和反电极之间,其中当酶电极含有参比电极时,将电压施加到工作电极和参比电极之间;然后
根据工作电极上电流的测定值计算ATP的量。
至少一种选自氨和铵离子的物质是NADS的底物。一般地,通过向样品溶液中加入氨水或者有机或无机铵盐将样品溶液中的氨和/或铵离子浓度调节至2mM至200mM。
脱酰氨基-NAD+也是NADS的底物。样品溶液中脱酰氨基-NAD+的浓度通常是2μM至2mM。
胆汁盐是12α-HSD的底物,可以利用在其12α位置含有羟基的胆汁酸的盐,例如胆酸、脱氧胆酸等的钠盐和钾盐。样品溶液中胆汁盐的浓度通常是0.2mM至20mM。
电子载体是DI的底物,它可以具有两种不同的状态,也就是氧化态和还原态。处于氧化态的电子载体在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的存在下被DI还原并转化成还原态。当将足量的电压施加到酶电极上时,其中当酶电极不含参比电极时,将电压施加到工作电极和反电极之间,其中当酶电极含有参比电极时,将电压施加到工作电极和参比电极之间,处于还原态的电子载体在工作电极的表面被电化学氧化并向工作电极提供电子,同时还原态的电子载体转化成氧化态。足以氧化电子载体的电压随着电子载体的类型而变化,但通常是100mV至600mV。
电子载体的例子包括铁氰化物络合物例如铁氰化钾和铁氰化钠;醌例如1,4-苯醌、甲苯醌、1,4-萘醌、维生素K3、2,5-二氯苯醌、杜醌、2,5-二甲基苯醌和2,6-二甲基苯醌;黄素类例如核黄素、黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸;酚类例如4-氨基苯酚、4-甲基氨基苯酚、2,6-二氯苯酚和靛酚;二甲基苯基吡唑酮鎓衍生物例如吩嗪硫酸盐;吩噻嗪鎓衍生物例如亚甲蓝;二茂铁例如羟基甲基二茂铁、1-羟基乙基二茂铁、二茂铁六氟磷酸盐和二茂铁四氟硼酸盐;苯二胺例如N,N,N’,N’-四甲基苯二胺。在这些化合物中,优选铁氰化物络合物和二茂铁。
这些电子载体可以单独使用或组合使用。样品溶液中电子载体的浓度通常是0.1mM至100mM。
此外,为了确保反应层中的DI、12α-HSD和NADS酶都表现出令人满意的酶活性,优选将缓冲剂加入到上面提到的样品溶液中。
缓冲剂的例子包括甘氨酸、磷酸、乙酸、硼酸、柠檬酸、邻苯二甲酸及其盐(包括氢盐)。另外,还可以使用用于制备所谓的“Good’s缓冲液”的试剂例如CAPSO和CHES。
这些缓冲剂可以单独使用或组合使用。
主要基于DI、12α-HSD和NADS酶的最佳pH,适当地选择缓冲剂的类型和数量,以便DI、12α-HSD和NADS酶都能表现出令人满意的酶活性。但是,根据缓冲剂的类型,也应该考虑缓冲剂对反应层的影响(例如发生未注意到的副反应)。
通过使用缓冲剂得到的pH优选为6.0至10.0,更优选8.0至9.5。样品溶液中缓冲剂的浓度优选为10mM至1,000mM,更优选25mM至400mM。
如果需要,样品溶液可以含有除上面提到的物质以外的试剂,例如盐和表面活性剂。
关于本发明所用的试剂的性质和将样品与含有试剂的水溶液混合的方法没有具体限制。例如,可以利用将固体(干燥)形式的试剂固定到酶电极的适当位置从而当样品与酶电极接触时使固定化的试剂溶于样品的方法。
当上面提到的样品溶液接触酶电极时,样品溶液渗入在工作电极上形成的至少一部分反应层中,反应层中的NADS从脱酰氨基-NAD+和样品溶液中的氨和/或铵离子合成氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),其中合成的NAD+的量与样品溶液中的ATP浓度成正比。通过组合使用12α-HSD和DI的酶催化循环来检测合成的NAD+。
12α-HSD从上面合成的NAD+产生还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)并同时氧化样品溶液中的胆汁盐。
DI从生成的NADH再生NAD+并同时还原处于氧化态的电子载体,由此将电子载体转化成还原态。
此时,当将足以进行电子载体的氧化反应的电压施加到其工作电极和其反电极(当酶电极不含参比电极时)之间或者其工作电极和其参比电极(当酶电极含有参比电极时)之间时,按照上面的解释,还原态的电子载体在工作电极表面被电化学氧化并向工作电极提供电子,由此再生氧化态的电子载体。
按照上面的解释,NADH的氧化/NAD+的还原以及电子载体的氧化/还原都可以在酶电极上反复进行。在反复进行这些反应的过程中,根据还原态的电子载体在工作电极表面的电化学氧化,电子不断地供应到工作电极上。
电子供应到工作电极上的速率、也就是流过工作电极的电流值与样品溶液中的ATP浓度成正比,因此,样品溶液的ATP浓度可通过测定工作电极的电流来测定。
按照解释性的说明,样品中的ATP浓度可通过如下方法简单地测定:利用具有已知ATP浓度的标准溶液制备表示ATP浓度与工作电极上的电流值之间的相互关系的校正曲线,然后用本发明的酶电极分析具有未知ATP浓度的样品以测定工作电极上的电流,然后利用上面提到的校正曲线从测得的电流值简单地计算出ATP的量。
在组合使用DI和12α-HSD而进行的NAD+/NADH体系的酶催化循环中,每单位时间进行的反应数目很大(也就是说,酶催化循环的速率很高),因此,流过工作电极的电流值相对于单位数量的ATP显得很大。因此,本发明的酶电极具有很高的灵敏度并能够进行快速分析。
在本发明中,通常将电压在酶电极上施加0.5至2分钟。
应该注意到,本发明的酶电极主要用于定量分析ATP,但是也可以用于定量分析脱酰氨基-NAD+以及定量分析氨和/或铵离子。
按照与上面提到的测定ATP浓度基本上相同的方式,进行脱酰氨基-NAD+的定量分析,所不同的是用脱酰氨基-NAD+代替ATP。按照与上面提到的测定ATP浓度基本上相同的方式,进行氨和/或铵离子的定量分析,所不同的是用氨和/或铵离子代替ATP。
现有技术中公开了包括如下步骤的方法(参见日本专利申请公开说明书平8-336397):以与样品中ATP的量成正比的量产生NAD+并利用NAD+/NADH体系的酶催化循环来测定ATP的浓度。但是,在该方法中,通过利用四氮唑盐着色、也就是通过光学技术测定ATP浓度,因此,该现有技术没有关于酶电极的教导。此外,在该方法中,进行酶催化循环时没有组合使用DI和12α-HSD,该专利文献对于组合使用DI和12α-HSD没有任何建议。
另外,在电极上形成的反应层中通过DI和12α-HSD的组合而进行的NAD+/NADH体系的酶催化循环是公知的,利用该酶催化循环的酶电极已在现有技术中公开了(参见日本专利申请公开说明书2000-189188)。然而,该酶电极被设计成只用于分析NAD+/NADH,并且关于在电极附近进行的产生NAD+/NADH的其它反应没有教导。
利用包括如下部件的系统通过本发明的酶电极对ATP浓度进行测定:
上面提到的酶电极;
在上述酶电极的工作电极和反电极之间、或者是其工作电极和参比电极之间向所述酶电极施加电压的装置,所述电压足以在工作电极的表面进行电子载体的氧化发应;和
测定工作电极上的电流的装置。
关于施加电压的装置和测定电流的装置,各种装置在本领域内是公知的,并且可以利用适当的常规装置。施加电压的装置和测定电流的装置可以包括两个独立的装置,也可以包括既能够施加电压又能够测定电流的单一装置。
本发明的酶电极被设计成可以用作一次性使用的酶电极,因此,就包含酶电极的系统而言,优选酶电极的更换可以容易地进行。因此,优选本发明的上述系统的结构能够使酶电极既可以容易地与系统连接又可以容易地与系统分开。该结构的例子包括:
仅有酶电极能够被连接和取下的结构;和
包括酶电极和其它部件(例如用于将酶电极连接到系统的其它部件上的导线)的一部分系统能够被连接和取下的结构。
另外,优选上述系统还包括根据工作电极上电流的测定值计算ATP量的装置。
作为计算装置,各种数据处理装置在本领域是公知的,这些装置将电流的测定值转换成模拟的或数字式的电信号,然后通过计算器等处理电信号以计算ATP的量(浓度)。使用这些装置可以非常容易地测定ATP的量(浓度)。
实施本发明的最佳方式
下面参照如下实施例和参考实施例对本发明进行更加详细的描述,但是,不应该将它们解释为对本发明范围的限制。
参考实施例1
进行实验以证实含有黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)的反应层可以用作酶电极的反应层来测定三磷酸腺苷(ATP)的浓度。
制备含有3,200U/ml DI(商品目录号T-06,由Asahi Kasei Corporation,日本生产和销售)、9,600U/ml 12α-HSD(商品目录号T-29,由Asahi KaseiCorporation,日本生产和销售)和880U/ml NADS(商品目录号T-67,由Asahi Kasei Corporation,日本生产和销售)的25%(w/v)海藻糖水溶液,然后将含有DI、12α-HSD和NADS酶的0.5μL所制备的海藻糖水溶液与0.25μL1%(v/v)戊二醛水溶液混合,由此得到混合物。将直径为3mm的镜面抛光的玻璃碳电极(商品目录号11-2012,由BAS Inc.,日本生产和销售)用形成的混合物涂布,然后将生成的碳电极在室温(25℃)静置2小时,由此将酶固定到碳电极的表面。结果,在上面提到的碳电极的表面形成含有DI、12α-HSD和NADS酶的反应层。蛋白质的总量为每平方厘米反应层1.16mg,以DI、12α-HSD和NADS的活性计,DI、12α-HSD和NADS的量分别为每平方厘米反应层22.6U、67.9U和6.2U。
将所制备的碳电极(作为工作电极)与饱和的甘汞电极(商品目录号11-2055,由BAS Inc.,日本生产和销售)(作为参比电极)和铂电极(商品目录号11-2230,由BAS Inc.,日本生产和销售)(作为反电极)一起连接到MCAMicrocell Kit(商品目录号11-1065,由BAS Inc.,日本生产和销售)上。将已连接有这三种电极的MCA Microcell Kit连接到BAS-100B型恒电位仪(由BAS Inc.,日本生产和销售)(恒电位仪能够用作测定工作电极上的电流的安培计)上,由此得到用于测定ATP浓度的系统。
另一方面,制备下述标准溶液1至5。
标准溶液1:含有2mM脱氧胆酸钠、5mM氯化镁、20mM氯化铵和0.1mM羟甲基二茂铁的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.5);
标准溶液2:对标准溶液1进行改动,使其还含有2mM烟酸腺嘌呤二核苷酸(脱酰氨基-NAD+);和
标准溶液3至5:对标准溶液2进行改动,使其还含有ATP,其中标准溶液3、4和5分别含有0.2μM、0.5μM和1μM ATP。
将样品罐(商品目录号11-2228,由BAS Inc.,日本生产和销售)连接到上面提到的MCA Microcell Kit上并将200μL标准溶液1注入样品罐。将上面提到的工作电极浸入标准溶液1,在30℃将0.2V电压施加到工作电极和参比电极之间并维持30分钟。
重复与上面的描述相同的操作,所不同的是用标准溶液2代替标准溶液1。在30℃将0.2V电压施加到工作电极和参比电极之间并维持10分钟,然后利用上面提到的恒电位仪测定工作电极上的电流。
随后,重复与前面测定标准溶液2的电流所进行的相同操作,所不同的是分别用标准溶液3至5代替标准溶液2。
另外,重复与前面测定标准溶液2的电流所进行的相同操作,所不同的是用水代替标准溶液2(该测定称作“空白试验”)。
将标准溶液2至5得到的电流值减去空白试验得到的电流值,从而得到校正电流值。标准溶液2至5的校正电流值分别为150nA、391nA、503nA和735nA。
校正电流值与标准溶液2至5的ATP浓度之间的相互关系如图3所示。
如图3所示,在上面得到的系统中,流过工作电极的电流值与样品的ATP浓度成正比,因此,从电流的测定值可以计算样品的ATP浓度。从该结果可以证实,包含DI、12α-HSD和NADS酶的反应层可以用作用于测定ATP浓度的酶电极的反应层。
实施例1
通过网板印刷制备图1(c)所示的包含绝缘层5的电极系统。
将厚度为188μm的PET膜(商品名:Melinex S,由Du Pont Co.Ltd.,日本生产和销售)用作绝缘基片1。通过网板印刷使用银糊(商品目录号FA-353,由Fujikura Kasei Co.,Ltd.,日本生产和销售)和抗蚀剂(商品目录号XC-101G,由Fujikura Kasei Co.,Ltd.,日本生产和销售)在绝缘基片1上形成导线2,2(参见图1(a))。
然后,通过网板印刷使用碳糊(商品目录号FC-415,由Fujikura KaseiCo.,Ltd.,日本生产和销售)和上面提到的抗蚀剂分别形成与导线2,2相连的工作电极3和反电极4,由此得到电极系统前体(参见图1(b))。工作电极3的形状是4mm×4mm的正方形。
在所得到的电极系统前体上,在其表面部分(除了对应于导线2,2的末端部分、工作电极3的所有部分和反电极4的所有部分之外的表面部分)形成作为绝缘层5的热固性聚酯涂层,由此得到电极系统(参见图1(c))。
随后,将所得到的工作电极3的表面用氧化铝水悬浮液抛光。
将含有DI、12α-HSD和NADS酶的5μL 25%(w/v)海藻糖水溶液(该溶液与参考实施例1使用的相同)与2.5μL 1%(v/v)戊二醛水溶液混合,由此得到混合物。将所得到的混合物涂布到前面得到的电极系统上,将生成的整个电极系统在室温(25℃)静置2小时,由此将酶固定到工作电极的表面。结果得到在电极系统的工作电极上所形成的反应层中含有DI、12α-HSD和NADS酶的酶电极。反应层的形状是6mm×6mm的正方形,并且反应层覆盖着工作电极的所有部分。蛋白质的总量为每平方厘米反应层2.15mg,以DI、12α-HSD和NADS的活性计,DI、12α-HSD和NADS的量分别为每平方厘米反应层44.4U、133.3U和12.2U。
将该酶电极的工作电极和反电极连接到与参考实施例1使用的相同的恒电位仪上。
另一方面,制备下述标准溶液6至11:
标准溶液6:含有2mM脱氧胆酸钠、5mM氯化镁、20mM氯化铵和10mM铁氰化钾的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.5);
标准溶液7:对标准溶液6进行改动,使其还含有2mM脱酰氨基-NAD+;和
标准溶液8至11:对标准溶液7进行改动,使其还含有ATP,其中标准溶液8、9、10和11分别含有0.1μM、0.2μM、0.4μM和1μM ATP。
将标准溶液6滴到前面得到的酶电极的工作电极上,直到工作电极的整个表面被标准溶液6所润湿。然后,在22℃将0.2V电压施加到工作电极和反电极之间并维持30分钟。
重复与前面提到的相同的操作,所不同的是用标准溶液7代替标准溶液6。在22℃将0.2V电压施加到工作电极和反电极之间并维持10分钟,然后利用恒电位仪测定工作电极上的电流。
随后,重复与前面测定标准溶液7的电流所进行的相同操作,所不同的是分别用标准溶液8至11代替标准溶液7。
另外,重复与前面测定标准溶液7的电流所进行的相同操作,所不同的是用水代替标准溶液7(该测定称作“空白试验”)。
将标准溶液7至11得到的电流值减去空白试验得到的电流值,从而得到校正电流值。标准溶液7至11的校正电流值分别为173nA、290nA、413nA、594nA和791nA。
校正电流值与标准溶液7至11的ATP浓度之间的相互关系如图4所示。
如图4所示,在前面制备的系统中,工作电极上的电流值与样品的ATP浓度成正比,因此,从电流的测定值可以计算样品的ATP浓度。
实施例2
按照与实施例1基本上相同的方式制备电极系统,所不同的是反应层的形状改变成4mm×4mm的正方形(因此,反应层的表面积与工作电极的相同,也就是0.16cm2)。
将3μL 0.5%(w/v)羧甲基纤维素(CMC)水溶液滴到上面提到的电极系统的工作电极上,然后干燥,由此在电极系统的工作电极上形成CMC层。
将含有2.1mg/ml(100U/ml)DI(其与参考实施例1使用的相同)、4.6mg/ml(1,000U/ml)12α-HSD(其与参考实施例1使用的相同)、1.5mg/ml(50U/ml)NADS(其与参考实施例1使用的相同)和2.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的6μL水溶液滴到CMC层上,然后干燥,由此将溶液中含有的酶固定在工作电极的表面。结果得到在工作电极上所形成的反应层中含有DI、12α-HSD和NADS酶的酶电极。蛋白质的总量为每平方厘米反应层0.40mg,以DI、12α-HSD和NADS的活性计,DI、12α-HSD和NADS的量分别为每平方厘米反应层3.75U、37.5U和1.875U。
将该酶电极的工作电极和反电极连接到与参考实施例1使用的相同的恒电位仪上。
另一方面,制备下述标准溶液12至17:
标准溶液12:含有2mM脱氧胆酸钠、5mM氯化镁、20mM氯化铵、20μM脱酰氨基-NAD+和10mM铁氰化钾的0.1M甘氨酸缓冲液(pH9.5);和
标准溶液13至17:对标准溶液12进行改动,使其还含有ATP,其中标准溶液13、14、15、16和17分别含有5nM、10nM、20nM、40nM和80nM ATP。
将100μL标准溶液12滴到前面得到的酶电极的工作电极上,直到电极的整个表面被标准溶液12所润湿。然后,在25℃将400mV电压施加到工作电极和反电极之间并维持30秒钟,然后利用恒电位仪测定工作电极上的电流(该测定称作“空白试验”)。
随后,重复与前面测定标准溶液12的电流所进行的相同操作,所不同的是分别用标准溶液13至17代替标准溶液12。
将用标准溶液13至17得到的电流值减去空白试验得到的电流值,从而得到校正电流值。标准溶液13至17的校正电流值分别为39nA、73nA、154nA、301nA和753nA。
校正电流值与标准溶液12至17的ATP浓度之间的相互关系如图5所示。
如图5所示,在前面制备的系统中,工作电极上的电流值与样品的ATP浓度成正比,因此,从电流的测定值可以计算样品的ATP浓度。
参考实施例2
对于位于工作电极上的反应层部分,检验蛋白质的总量对酶电极灵敏度的影响。
试验(A):
按照与实施例2基本上相同的方式制备酶电极,所不同的是将含有12.4mg/ml(530U/ml)DI(其与参考实施例1使用的相同)、5.9mg/ml(1,300U/ml)12α-HSD(其与参考实施例1使用的相同)和5.9mg/ml(130U/ml)NADS(其与参考实施例1使用的相同)的水溶液涂覆到CMC层上,由此形成反应层。蛋白质的总量为每平方厘米反应层0.91mg,以DI、12α-HSD和NADS的活性计,DI、12α-HSD和NADS的量分别为每平方厘米反应层20U、50U和5U。
使用所制备的酶电极,重复与实施例2中测定电流所进行的相同操作,所不同的是用标准溶液18代替标准溶液13至17。标准溶液18是对标准溶液12进行改动,使其还含有500nM ATP的溶液。
试验(B):
按照与前面的试验(A)基本上相同的方式制备酶电极,所不同的是将含有15.5mg/ml(670U/ml)DI(其与参考实施例1使用的相同)、7.4mg/ml(1,700U/ml)12α-HSD(其与参考实施例1使用的相同)和7.4mg/ml(170U/ml)NADS(其与参考实施例1使用的相同)的水溶液涂覆到CMC层上,由此形成反应层。蛋白质的总量为每平方厘米反应层1.14mg,以DI、12α-HSD和NADS的活性计,DI、12α-HSD和NADS的量分别为每平方厘米反应层25U、62.5U和6.25U。
使用所制备的酶电极,重复与前面试验(A)中测定电流所进行的相同操作。
试验(A)中得到的校正电流值与试验(B)中得到的校正电流值之间的比较说明试验(B)的校正电流值仅仅是试验(A)的73%。
尽管前面的试验(B)中使用的酶电极含有大量的酶(以其各自的活性计),但是,当位于工作电极上的反应层部分所含的蛋白质总量超过最佳量时,酶电极的灵敏度降低。
参考实施例3
对于位于工作电极上的反应层部分,检验蛋白质的总量对酶电极灵敏度的影响。
试验(C):
按照与参考实施例2的试验(A)基本上相同的方式制备酶电极,所不同的是将含有15.5mg/ml(670U/ml)DI(其与参考实施例1使用的相同)、7.4mg/ml(1,700U/ml)12α-HSD(其与参考实施例1使用的相同)、7.4mg/ml(170U/ml)NADS(其与参考实施例1使用的相同)和9.35mg/ml BSA的水溶液涂覆到CMC层上,由此形成反应层。蛋白质的总量为每平方厘米反应层1.49mg(以其活性计的酶的量与前面的试验(B)相同)。
使用所制备的酶电极,重复与参考实施例2的试验(A)中测定电流所进行的相同操作。
试验(D)至(F):
按照与前面的试验(C)基本上相同的方式制备酶电极,所不同的是改变水溶液中BSA的浓度,从而形成具有不同蛋白质含量的反应层。试验(D)至(F)所用的水溶液的BSA浓度分别为18.8mg/ml、25.0mg/ml和50.5mg/ml。因此,蛋白质的总量分别为每平方厘米反应层1.84mg、2.07mg和3.01mg(以其活性计的酶的量与前面的试验(B)相同)。
使用所制备的各个酶电极,重复与前面试验(C)中测定电流所进行的相同操作。
参考实施例2的试验(A)中得到的校正电流值与试验(C)至(F)中得到的各校正电流值之间的比较表明试验(C)至(F)的校正电流值分别是试验(A)的57%、38%、22%和5%。
从该事实可以明显地看出,当位于工作电极上的反应层部分所含的蛋白质总量超过特定范围时,反应层的蛋白质总含量越高,酶电极的灵敏度越低。
参考实施例4
对于位于工作电极上的反应层部分,以其活性计,检验酶的量对酶电极灵敏度的影响。
试验(G)至(J):
按照与参考实施例2的试验(A)基本上相同的方式制备酶电极,所不同的是先将用于制备反应层的水溶液稀释,然后再将其涂覆到CMC层上。具体地讲,将试验(A)所用的水溶液稀释2倍、4倍、16倍和80倍,然后分别用于试验(G)至(J)(因此,以其活性计,酶的量是参考实施例2的试验(A)中形成的反应层的1/2、1/4、1/16和1/80)。
使用所制备的各个酶电极,重复与前面试验(A)中测定电流所进行的相同操作。
参考实施例2的试验(A)中得到的校正电流值与试验(G)至(J)中得到的各校正电流值之间的比较表明试验(G)至(J)的校正电流值分别是试验(A)的63%、47%、33%和4%。
从该事实可以明显地看出,关于位于工作电极上的反应层部分,以其活性计,酶的量越低,酶电极的灵敏度越低。
工业实用性
本发明的酶电极有利于微型化测定ATP浓度的装置。此外,通过使用本发明的酶电极,可以简单快速、高灵敏度地测定样品的ATP浓度而不需要进行麻烦的预处理。
Claims (8)
1、一种酶电极,包括:
(a)电极系统,该电极系统包含一个在其上形成有工作电极、反电极和任选地参比电极的绝缘基片;和
(b)在所述的电极系统上形成的反应层,其中所述的反应层包含黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS),
至少一部分所述的反应层位于所述的工作电极上,其中,所述的这部分反应层中所含的黄递酶(DI)、12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)固定在所述工作电极的表面,以便在所述反应层中产生的化合物能够到达所述工作电极的表面。
2、按照权利要求1所述的酶电极,其还包含亲水性聚合物层,所述的亲水性聚合物层位于所述工作电极和所述反应层之间并与所述工作电极和所述反应层二者都接触。
3、按照权利要求1或2所述的酶电极,其中,关于位于所述工作电极上的所述反应层部分:
蛋白质的总量为每平方厘米所述反应层部分中2.5mg或更少;
以黄递酶(DI)的活性计,黄递酶(DI)的量为每平方厘米所述反应层部分中0.25U或更多;
以12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)的活性计,12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)的量为每平方厘米所述反应层部分中0.63U或更多;
以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)的活性计,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)的量为每平方厘米所述反应层部分中0.063U或更多。
4、按照权利要求1至3中的任何一项所述的酶电极,其中,关于位于所述工作电极上的所述反应层部分:
蛋白质的总量为每平方厘米所述反应层部分中1.5mg或更少;
以黄递酶(DI)的活性计,黄递酶(DI)的量为每平方厘米所述反应层部分中1.0U或更多;
以12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)的活性计,12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)的量为每平方厘米所述反应层部分中2.5U或更多;
以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)的活性计,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)的量为每平方厘米所述反应层部分中0.25U或更多。
5、按照权利要求1至4中的任何一项所述的酶电极,其中,关于位于所述工作电极上的所述反应层部分:
蛋白质的总量为每平方厘米所述反应层部分中1.1mg或更少;
以黄递酶(DI)的活性计,黄递酶(DI)的量为每平方厘米所述反应层部分中2.5U或更多;
以12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)的活性计,12α-羟基甾类脱氢酶(12α-HSD)的量为每平方厘米所述反应层部分中6.25U或更多;
以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)的活性计,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(NADS)的量为每平方厘米所述反应层部分中0.625U或更多。
6、一种测定样品中的三磷酸腺苷(ATP)浓度的方法,该方法包括:
将样品与含有烟酸腺嘌呤二核苷酸、胆汁盐、电子载体和至少一种选自氨和铵离子的物质的水溶液混合,由此得到样品溶液;
将所述的样品溶液与权利要求1至5中的任何一项所述的酶电极的所述工作电极、反电极和任选地参比电极接触,由此形成通过所述样品溶液的电流;
在所述酶电极的工作电极和反电极之间、或者是其工作电极和参比电极之间向所述的酶电极施加电压,由此在所述工作电极的表面进行电子载体的氧化反应并同时测定所述工作电极上的电流,其中当所述酶电极不含参比电极时,将所述电压施加到所述工作电极和所述反电极之间,其中当所述酶电极含有参比电极时,将所述电压施加到所述工作电极和所述参比电极之间;然后
根据所述工作电极上所述电流的测定值计算三磷酸腺苷(ATP)的量。
7、一种测定样品中的三磷酸腺苷(ATP)浓度的系统,其中使用烟酸腺嘌呤二核苷酸、胆汁盐、电子载体和至少一种选自氨和铵离子的物质来测定所述的三磷酸腺苷(ATP)浓度,
所述的系统包括:
权利要求1至5中的任何一项所述的酶电极;
在所述酶电极的工作电极和反电极之间、或者是其工作电极和参比电极之间向所述的酶电极施加电压的装置,所述的电压足以在所述工作电极的表面上进行所述电子载体的氧化发应;和
测定所述工作电极上的电流的装置。
8、按照权利要求7所述的系统,其还包含用于根据所述工作电极上所述电流的测定值计算三磷酸腺苷(ATP)的量的装置。
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