CN1177930C - 用辅酶还原系统稳定化的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶法测定病人的分析物浓度用的试剂，其中对辅酶的氧化度进行测定，特征在于：通过包括酶和底物对的辅酶还原系统来稳定所述试剂以抗氧化，所选择的酶和底物对可使所述辅酶在该试剂的贮存期间连续再生。还公开了一项酶法测定体液样本中的分析物浓度、其中对辅酶的氧化度进行测定的改进措施，此改进措施包括：通过包含酶和底物对的辅酶还原系统来稳定含所述辅酶的试剂以抗氧化，所选用的酶和底物对可使所述辅酶在该试剂的贮存期间连续再生。还公开了测定天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、氨和脲的试剂。

Description

用辅酶还原系统稳定化的试剂
本发明涉及酶法测定体液样本中的分析物浓度用的试剂。确切地说，本发明涉及同存在于样本中的分析物浓度直接相关的反应样本中氧化辅酶的定量测定方法中用的试剂。
可用本发明的试剂测定的分析物包括：转氨酶、氨、脲、乳酸脱氢酶、甘油三酯和水杨酸盐。
发现在心脏、肝、血红细胞和骨骼肌中存在高含量的天冬氨酸转氨酶。该酶催化下列反应：
在肝细胞受损伤的许多肝病中、尤其是在例如肝炎中，已发现血清中的天冬氨酸转氨酶含量升高。心肌梗死后和在肌肉疾病中该酶的含量也升高。
也发现名为丙氨酸转氨酶的酶在肝脏中的浓度较高，但它在心脏、肾和骨骼肌中含量较低。该酶催化下列反应：
通常发现在肝病、尤其是肝炎病的血清中该酶的含量升高。
酶尤其是体液样本中的转氨酶、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的间接定量测定方法可包括，将“空白”样本与其中发生与感兴趣的酶有关的分析物的酶促转化的样本进行对照。
为达到分析物的酶促转化，使底物专一性酶(转氨酶)作用于感兴趣的酶的定量测定中用的已知底物。反应组合物中相对于空白的变化可通过测定该组合物的吸光度变化的各种方法来计算。吸光度的变化与存在于样本中的转氨酶的量直接相关。
虽然已证明如比色测定的惯常方法是可行的，但在测定转氨酶含量时，业已证实酶分析法比这些其它方法远为精确、可靠和简单。
定量测定样本中的转氨酶的一种常用方法是利用偶联酶反应的动力学方法。
至于天冬氨酸转氨酶(AST)，由AST形成的草酰乙酸被包含于分析系统中的苹果酸脱氢酶(MDH)转变为苹果酸。它伴随可用分光光度法在340nm处跟踪的、辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化作用(NADH至NAD+)。所以反应顺序通常如下所示：
需要第三个反应以除去病人样本中可能存在的高含量的丙酮酸。包括高含量的酶乳酸脱氢酶(LDH)的理论上认为，如果试剂中包括高浓度，假如病人样本具有高含量的丙酮酸，则存在的NADH和LDH会通过将其转变成不干扰反应的乳酸而迅速除去样本的丙酮酸。这就要求在试剂中加入LDH以消除该副反应，这样就会因引入更多的杂质而影响试剂的稳定性。
至于丙氨酸转氨酶(ALT)，由ALT形成的丙酮酸通过反应混合物中包含的乳酸脱氢酶转变为乳酸。它伴随也可用分光光度法在340nm处跟踪的、辅酶NADH至NAD+的氧化作用。所以利用该试剂的反应依如下顺序进行：
ALT测定的原理和方法类似于AST试剂，但是对于ALT，只需一种内源性酶即LDH用于测定(对照AST测定中所需的LDH和MDH)。因此，引入ALT试剂中的杂质更少，这一般表明其重构的贮存期限会比AST试剂稍长。
至于该两种试剂，NAD+的形成速率与样本中原有的转氨酶浓度有关。
脲是蛋白质分解代谢的主要含氮代谢产物，它在肝脏中由肝脏的肝酶合成并且主要是通过肾而排泄的。血清中脲含量升高可能是由于肾机能受损伤、肝病、饮食变化、充血性心力衰竭、糖尿病和传染病的缘故。
人的血清和尿中的脲含量可用直接法和间接法测定。直接法通常包括Fearon反应的变化形式。在该反应体系中，是将双乙酰与脲反应形成铬精二嗪，可用分光光度法由它在540nm处的强吸光度来测定它。测定人的血清和尿中的脲的最常用方法包括间接偶联的酶反应系统。该反应系统中的第一种酶即脲酶，被用于将脲转变为铵离子和碳酸氢根离子。该反应系统中的第二种酶即谷氨酸脱氢酶(GLDH)，与NADH和铵离子偶联而生成NAD+和谷氨酸。随着NADH转变为NAD+，该反应可用分光光度法在340nm处跟踪。铵离子也可用电势分析法或电导分析法来定量测定。
因此，常用于测定脲浓度的反应过程如下所示：
随着NADH转变为NAD+，测得340nm处的吸光度减小，减小的量与原始样本中的脲浓度成比例。
循环氨主要来源于胃肠道。在肝脏中产生代谢变化，通过克-亨氏循环使氨变成脲。人的血清中氨含量升高往往与晚期肝病有关。高氨血对中枢神经系统有毒性作用。
人血清中氨的含量常常是直接用结合谷氨酸脱氢酶的一步酶法进行测定。在该反应中，用分光光度法在340nm处测定由氨、α-酮戊二酸和NADH(或NADPH)至谷氨酸和NAD+(或NADP+)的转化。
测定样本中氨浓度的常用反应顺序如下所示：
随着NADPH转变为NADP+，测得在340nm处的吸光度降低，该降低值与病人样本中的氨浓度成比例。
如前所述，以前的转氨酶试剂的重构的稳定性差。这类试剂尤其是在单个的小瓶中时的稳定性，常限于在冷冻条件下最多是一个月左右。不稳定的原因可能由于试剂中内源性成分变质和溶液中NADH的不稳定性。在溶液中NADH不稳定的主要原因与内源性试剂酶、即AST试剂中的LDH和MDH以及ALT试剂中的LDH的存在直接相关。得自动物或微生物的内源性酶MDH和LDH的商品化制剂含有根本上影响NADH的重构稳定性的杂质，因此影响试剂的稳定性。这些杂质通常是低含量的AST和ALT、需测定的酶和NADH氧化酶，所有这些物质会引发试剂中NADH的氧化作用。
试剂pH也对NADH的不稳定性有作用，因为NADH会在溶液中、尤其是在酸性介质中迅速分解。用于转氨酶测定的多数试剂被配成pH范围为7.3～8.0的试剂。试剂的碱性越强，则NADH在溶液中的稳定性越大。
此外，氨和脲试剂也有稳定性问题，且这些试剂在单个的小瓶中和冷冻温度下的稳定性，常局限于氨最长为一个月而脲最长为二个月。不稳定的原因可归由于试剂中内源性成分的变质、溶液中NADH或NADPH的不稳定性和用于重构试剂粉末的水中存在的氨污染。
NADH或NADPH在溶液中不稳定的主要原因与内源性试剂酶的存在直接有关。试剂的pH也对NADH或NADPH的不稳定性有作用，因为NADH和NADPH会在溶液中、尤其是在酸性介质中迅速分解。
NADPH常被用于氨试剂中(优于NADH)，以克服病人血清中内源性乳酸脱氢酶的检定干扰。病人样本中的内源性乳酸脱氢酶和丙酮酸会与NADH进行如下反应顺序的特异性反应：
保持于溶液中的NADPH也会受谷氨酸脱氢酶的商品化制剂中存在的污染物的影响，该污染物会引发氨试剂中NADPH的氧化作用。同样地，脲酶和谷氨酸脱氢酶的商品化制剂中存在的污染物会引发脲试剂中NADH的氧化作用。
克服有关NADH和NADPH在溶液中的稳定性的难点的一个方法是，就在其使用前于试剂中产生还原辅酶。
F.Hoffmann La Roche AG在澳大利亚专利申请AU-A-61906/90中描述了这样一种方法，该方法特别关于测定血清的碳酸氢盐和氨的类似酶系统。在该说明书中，同时地或先于辅酶被分析物、底物和专一性酶再氧化而就地产生还原辅酶。这可通过包括于反应混合物中、能将氧化辅酶还原的酶和酶底物来达到目的。由F.Hoffmann LaRoche AG提出并公开的特异性反应是：
这样可得到还原性烟酰胺腺苷二核苷酸。
有关生成NADH的该方式的问题在于，不可能构成稳定的单个的小瓶试剂。
F.Hoffmann La Roche AG通过将该试剂系统分成2小瓶而在一定程度上克服了该问题。在氨定量的情形中，第一种试剂包括NADP+和G-6-P，而第二种试剂包括α-酮戊二酸、G6PDH和GLDH。因此测定反应如下进行：
试剂1                                                     试剂2
其中(A)和(B)表示可选择的等效途径。
但该试剂系统还存在困难。除了需要2个小试剂瓶从而增高成本、库存量和损耗之外，还要求很准确的葡糖-6-磷酸含量；此外，该系统限于在特定的化学分析仪中应用。一旦将这2种试剂结合，就可通过消耗葡糖-6-磷酸从NAD+生成NADH。由于葡糖-6-磷酸如此被消耗，所以如果两试剂结合后未被立即使用，则结合后试剂的稳定性会受严重影响。如果不准确量的或过量的葡糖-6-磷酸存在的话，则有关该试剂的保温时间就变成关键问题。结果可能出现错误的低吸光度变化，并给出总体上不准确的结果。
也是涉及分析物含量的测定的一个更早的解决方法由Modrovich描述于US Patent 4,394,449中，该方法利用底物/酶对以产生如Roche方法中的还原辅酶，但该场合下按下列反应从葡萄糖生成葡糖-6-磷酸：
然后在酶即葡糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使NAD+与形成的葡糖-6-磷酸反应而生成NADH。Modrovich法的调和物中也包括NADH和NAD+，以致当NADH被氧化或被破坏时，试剂中存在的NAD+会帮助NADH再生。这也是两个小瓶的试剂。
Klose等人在US Patent 4,019,961中提供了一种早期的可选方法。该发明依赖于各种独立的反应步骤和NADH再生酶系统。该系统的缺点在于对进行各种反应步骤的依赖作用，而独立的步骤使试验耗时。此外，该试剂系统仅适合于可被磷酸化的底物。
上文的各个发明所述中采用的、有关NADH和NADPH生成机理的普遍问题，即
在于不可能用一个小瓶进行一步反应，因为一旦将病人血清加入试剂，就会同时发生两个反应：(a)吸光度的降低，由于NADH(或NADPH)被转变成NAD+(NADP+)，
(b)从NAD+(NADP+)生成NADH(NADPH)导致吸光度升高。
这两个反应以相似的速率进行，最后结果是错误的低吸光度变化和总体上不准确的结果。
因此，本发明的一个目的是提供用于测定血清分析物含量的试剂系统，它大大地改善现有技术中用于凭借辅酶的氧化而酶法分析血清分析物含量的试剂系统存在的问题，尤其是那些有关内源性或外源性试剂污染的问题。本发明的进一步的目的是提供测定病人样本中分析物浓度的一种改进方法，该方法可克服现有技术的方法中有关问题，包括辅酶决定子的过早氧化的问题和需要多个小瓶系统以将试剂的降解减至最小的问题。
为此，提供了一种用于酶法测定病人的除血清重碳酸盐之外的分析物浓度的试剂，其中对辅酶的氧化度进行测定，该试剂通过包括酶和底物对的辅酶还原系统来稳定以抗氧化，所述的酶和底物对彼此间具有不完全的专一性，因而可使所述辅酶在该试剂的贮存期间连续再生，其特征在于，该试剂中掺入了游离磷酸盐离子，而且该试剂在2-8℃下贮存至少6-8个月期间在测定分析物浓度方面没有功能上的损失。
在本发明的一个优选试剂中，所述的分析物是转氨酶。
在本发明的又一个优选试剂中，所述的分析物是天冬氨酸转氨酶。
在本发明的又一个优选试剂中，所述的分析物是丙氨酸转氨酶。
在本发明的又一个优选试剂中，所述的分析物是脲。
在本发明的又一个优选试剂中，所述的分析物是氨。
该辅酶还原系统优选包括一种酶和一种底物，所述的酶对该底物具有不完全的专一性，于是导致交叉反应性的比率降低。
该试剂优选为单个的小瓶形式。
在整个说明书中“不完全的专一性”这一术语被用于酶和底物对，其中选择的底物不是所选择的酶的天然底物，因此对于相关酶的交叉专一性小于100％。
本发明基于这种发现，即通过将彼此间具有不完全的专一性的酶和底物偶联，则辅酶的还原速率可大为降低。通过减慢还原反应，试剂的基本成分可盛于一个贮存小瓶中，低含量辅酶的连续再生可使瓶中的内含物稳定以抗污染。通过减慢该过程，可出现NADH或NADPH的再生而不会影响分析物的测定。该再生作用可发生于未用时的试剂中，且发生再生作用的速率可通过选择的酶/底物对的性质及其含量来进行细调。
在本发明的一个可选择实施方案中，提供了酶法测定病人的分析物浓度用的试剂，其中对辅酶的氧化度进行了测定，特征在于：通过包括酶和底物对的辅酶还原系统来稳定所述试剂以抗氧化，选择的酶和底物对可使所述辅酶在340nm处以0.01-0.9mAbs/min的速率再生。
在室温(18-25℃)下和于340nm处，依本发明该方面的试剂中再生的速率优选是0.05-0.4mAbs/min，且最优选是0.05-0.25mAbs/min。
在本发明的一个优选的实施方案中，辅酶还原系统的底物和酶之间的专一性程度基于等摩尔量优选小于100％，更优选小于50％，且最好是小于10％。可应用的酶/底物对的交叉反应性基于等摩尔量最好是小于5％。
虽然如烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸磷酸或硫代NADH这样的辅酶类似物也可能合适，但是本发明的试剂中应用的辅酶优选是还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。
意外地发现本发明的试剂、尤其是氨和脲试剂具有另一个优点。如果氨和脲试剂中存在用于重构粉状试剂的水引入的杂质氨，则脲和氨试剂中的NADH和/或NADPH含量将会减少。同样地，空气中的氨随时间溶于液态脲/氨试剂会减少NADH和/或NADPH的含量。在氨和脲试剂中存在杂质氨不仅可导致脲和氨的不准确测定，还可能造成在加入样本之前将发生GLDH存在时α-酮戊二酸与NADH的反应。这就致使NADH或NADPH的含量减少，于是导致在测定样本中的氨和脲浓度时的误差。但是，本发明可以除去杂质氨并使NADH或NADPH再生，从而可准确测定病人样本中的氨和脲浓度。
在测定血清样本的转氨酶含量的辅酶还原系统中运用的酶可优选是葡糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-P-DH)或葡糖脱氢酶。
在测定血清样本的脲或氨含量的辅酶还原系统中运用的酶可优选是葡糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-P-DH)或葡糖脱氢酶。
如甲酸脱氢酶、甘油脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、3α-羟基类固醇脱氢酶、L-乳酸脱氢酶(得自生孢乳杆菌(Lactobacillus sp.))或甘油-3-磷酸脱氢酶的酶也可能合适。用于转氨酶/氨和脲含量测定试剂中的优选的酶是葡糖-6-磷酸脱氢酶。它可以得自任意合适的酶源如肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilus)或酵母菌。
这些酶优选得自微生物源。业已发现，将得自微生物源的酶掺入试剂可最大程度地减少如NADH氧化酶和蛋白酶这样的内源性污染物的存在，这些污染物先前严重影响这种试剂的稳定性。这类微生物酶也有另外的优点如更耐热，因此可改善其在溶液中的长期稳定性。
葡糖-6-磷酸脱氢酶的酶源更优选得自肠膜明串珠菌。如果采用得自嗜热脂肪芽孢杆菌或运动发酵单孢菌的葡糖-6-磷酸，则反应速率会降低。类似地，如果将酵母菌用作葡糖-6-磷酸脱氢酶的酶源，则必须用辅酶NADPH代替NADH，因为酵母葡糖-6-磷酸脱氢酶只对NADP+有专一性。存在于本发明的试剂中的葡糖-6-磷酸脱氢酶的恰当的含量应随所要求的再生速率而改变。然而，对于AST试剂，特别优选的用量约为2000U/L以允许在溶液中随时间而耗尽。对于ALT，特别优选的浓度是2000U/L。对于脲试剂，优选的浓度是2000U/L；而对于氨试剂，优选的浓度是3500U/L。
应记住必须要这样选用底物和酶：即它们在辅酶还原系统中彼此间具有不完全的专一性。用于本发明的试剂中的合适的底物包括：核糖-5-磷酸、葡糖-1-磷酸、6-磷酸葡糖酸、2-脱氧葡糖-6-磷酸、2-脱氧-2-氟葡糖-6-磷酸、2-脱氧-2-氯葡糖-6-磷酸、2-脱氧-2，2-二氟葡糖-6-磷酸、2-邻-甲基葡糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸、葡糖胺-6-磷酸、3-脱氧葡糖-6-磷酸、3-脱氧-3-氟-葡糖-6-磷酸、3-邻-甲基葡糖-6-磷酸、阿洛糖-6-磷酸、ahrose-6-phosphate、4-脱氧-4-氟葡糖-6-磷酸、半乳糖-6-磷酸、5-硫代-葡糖-6-磷酸、膦酸酯类似物、glucose-6-stallate、β-D-葡萄糖、D-半乳糖、2-脱氧葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、1-山梨糖、D-甘露糖、D-果糖、D-乳糖、D-山梨醇、D-甘露糖醇、蔗糖、肌醇、麦芽糖。
将NADH作为试剂中优选的辅酶时，优选的组合酶/底物是葡糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-P-DH)/D-葡萄糖。替代D-葡萄糖的优选的底物是这种底物，即相对于葡糖-6-磷酸(G-6-P)和G-6-P-DH之间的专一性来说，酶G-6-P-DH和选择的底物之间的反应速率应小于50％，更优选小于10％，且最优选小于5％。应再次记住所要求的再生速率，最适合本发明的试剂的D-葡萄糖含量虽然可高达1000mmol/L，但优选是约100mmol/L。在更高的浓度范围，D-葡萄糖在试剂中的溶解性就成问题。
如果用到优选的组合D-葡萄糖/葡糖-6-磷酸脱氢酶，则可以磷酸氢二钾的形式往组合物中引入磷酸钾离子。合适的磷酸盐离子含量随所需的再生速率而变化。但是，例如当D-葡萄糖的浓度约为100mmol/L(但可在20～200mmol/L内变化)时，且相应的葡糖-6-磷酸脱氢酶的含量约为2000U/L(但可在500～3500U/L内变化)时，则合适的磷酸盐离子的含量可在2.0mmol/L～20mmol/L的范围内。增大磷酸盐离子的浓度将使再生速率增高。加入的磷酸盐离子含量对于AST优选约为10mmol/L，而对于ALT优选约为5mmol。对于脲试剂，优选的磷酸盐离子浓度约为5mmol，而对于氨试剂也是约为5mmol。
如果采用优选的组合D-葡萄糖和葡糖-6-磷酸脱氢酶，或者在确实未产生游离的磷酸盐的任意系统中，有必要往试剂中掺入游离磷酸盐离子。尤其需要游离磷酸盐离子与D-葡萄糖形成非特异的复合体以引发在葡糖-6-磷酸脱氢酶存在下的再生作用。
D-葡萄糖/G-6-P-DH的优选的替代物是利用按下列反应的葡糖脱氢酶(GLD)，其中D-葡萄糖是100％活性底物：
如果葡糖脱氢酶被用作酶，则还原NAD辅酶的优选的底物和它们与D-葡萄糖相比时的相对交叉反应性程度如下所示：
底物                   相对活性
木糖                    8.9％
L-山梨糖                0.3％
D-甘露糖                2.4％
D-果糖                         0.8％
D-半乳糖                       0.1％
D-乳糖                         1.2％
D-山梨醇                       0.1％
肌醇                           0.2％
麦芽糖                         3.9％
其中的数字表示相对于在天然底物1β-D-葡萄糖存在下葡糖脱氢酶的反应速率。
另外，用甘油脱氢酶(GLY.DH)作为酶时，则下列反应中合适的底物
和它们相对于甘油(100％)活性如下所示：
底物                  相对活性
甘油-α-单氯醇         48.5％
乙二醇                 7.8％
2，3-丁二醇            52.6％
其中亮氨酸脱氢酶(L.D)被用作下列反应中的酶
合
适的底物和它们相对于L-亮氨酸(100％)的活性如下所示：
底物                        相对活性
L-缬氨酸                     74％
L-异亮氨酸                   58％
L-正缬氨酸                   41％
L-正亮氨酸                   10％
L-蛋氨酸                     0.6％
L-半胱氨酸                   0.3％
如果L-丙氨酸脱氢酶(A.D)被用作类似于应用亮氨酸脱氢酶时的反应系统中的酶，则合适的底物和它们相对于L-丙氨酸(100％)的活性如下所示：
底物                        相对活性
L-丝氨酸           5％
3α-羟类固醇脱氢酶(H.DH)也可用作与下列底物组合的酶。还列出了它们相对于胆酸的活性。
底物                   相对活性
石胆酸                  96％
本胆酸(etiochlic acid)  60％
其中，得自生孢乳杆菌的L-乳酸脱氢酶(LDH)被用作下列反应中的酶，
合适的底物和它们相对于L-乳酸的活性为：
底物                   相对活性
2-氧代戊二酸            0.09％
草酰乙酸(onoloacetate)  36％
其中NADP+是得自例如酵母菌的辅酶时，则优选的底物/酶组合有：
G-6-P-DH/半乳糖-6-P         25％
G-6-P-DH/2-脱氧葡糖-6-P     18％
G-6-P-DH/葡糖胺-6-P         2％
右边的数字表示相对于G-6-P-DH/G-6-P对的反应性。
也可能用NADP+作辅酶，将甘油-3-磷酸脱氢酶与二羟基丙酮磷酸组合成酶/底物。
如本说明书的开头中所述，对于用来测定血清AST含量的、本发明的试剂的其它需要的物质有：乳酸脱氢酶、烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸、还原物(NADH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、天冬氨酸和2-氧代戊二酸。至于ALT，不需苹果酸脱氢酶，并要求以L-丙氨酸代替天冬氨酸。至于脲试剂，还需要脲酶和α-酮戊二酸，而氨试剂中也需要α-酮戊二酸。
可得到的天冬氨酸是其如钠盐和钾盐的各种盐。按本发明，优选的盐是钾盐，因为它比钠盐显得更易溶且水合度更小。它在本发明的试剂中可接受的浓度范围是180-240mmol/L。最优选的是约为200mmol/L的极限浓度，应注意，该浓度是IFCC推荐的标准。
认为优选用于本发明的试剂的2-氧代戊二酸的浓度范围为约1-15mmol/L，但是应注意，高浓度的该底物会限制可加入组合物的NADH的量，因为2-氧代戊二酸在340nm处有吸收，从而给NADH吸收提供背景吸收。通过限定加入组合物的2-氧代戊二酸的量，该试剂可被容易地用于多数光谱分析仪中。用于AST和ALT试剂的该底物的浓度优选为约12mmol/L，这也是IFCC推荐的标准。用于脲和氨试剂时优选的浓度约为7.5mmol/L。
存在于ALT试剂中的丙氨酸的量因该组分的溶解性而在一定程度上受限制。确切地说，优选的范围是200-500mmol/L，不过在该范围的上限未看到催化活性的显著增大。由于该物质的溶解性，该底物最优选的浓度约为400mmol/L。
试剂中辅酶的含量将随下述因素而变化：
·测定中所要求的线性度
·选择的波长
·样本与试剂的体积比
·所选用的分析仪的测量光度系统。
总之，增大样本的体积可改善灵敏度但降低所得读数的线性度，而减小样本的体积可提高线性度却损失灵敏度。
测定时优选的波长是320-400nm，但应调节采用的辅酶量使吸光度优选不高于2.0A。依本发明的吸光度的优选的波长是340nm。
MDH优选得自微生物源以限制内源性污染的危害，而且由于它表现出优良的热稳定性。它恰当的含量在150-1500U/L范围内，更优选是200-800U/L。按本发明，最优选的含量约为250U/L。
在AST试剂中，LDH参与除去内源性样本的丙酮酸。掺入本发明的AST试剂中的LDH的含量最好这样确定：当样本与试剂的比为1∶10时，在1分钟内清除1.0mmol/L样本的丙酮酸所需的量。该含量被确定为约2000U/L。
在ALT试剂中，LDH参与两个反应：(i)测定ALT的偶联酶反应，和(ii)除去内源性样本中的丙酮酸的反应。如同AST试剂一样，掺入的LDH的量应使得该试剂在1分钟内可除去达1.0mmol/L的样本中的丙酮酸。于是在1分钟后可测定主反应而不会受内源性样本的丙酮酸的干扰。除去内源性丙酮酸所需的LDH的最小用量确定为约1500U/L。掺入本发明的ALT试剂中的优选的量约为2000U/L。
在脲试剂中，作为动力学分析方式中的非限速酶，要求脲酶在pH8.5时的活性最小应约为5000U/L。可引入高于此值的量以提高该试剂的长期稳定性。
在脲和氨试剂中分析物测定的优选方式基于动力学原理。由于谷氨酸脱氢酶(GLDH)是调和物中的限速酶，所以包含1于试剂中的GLDH活性水平对于分析的线性度至关重要。所需GLDH活性水平还随试剂系统的pH而变化。适宜的GLDH活性范围可在250-10000U/L之间变动。最合适的酶得自微生物源，原因是得自动物源的商品化GLDH制剂通常不太稳定，且有可能含有作为污染物的、活性值较高的NADH氧化酶。优选的GLDH活性对于脲试剂，在pH8.50时约为500U/L；而对于氨试剂，在pH8.50时约为8500U/L。
本发明的试剂除了包括测定分析物浓度所需的辅酶还原系统和其它基本底物和酶之外，还可包含防腐剂、螯合剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂、缓冲剂、辅因子、抗细菌剂和具有增强稳定性的功效而实质上不影响本发明的特性的其它成分。
选用缓冲剂的基本原则是：它在选定的pH时应具有良好的缓冲容量并最小量地结合二价阳离子。可依照the International Federation ofClinical Chemistry(IFCC)为测定转氨酶而推荐的那样来选择适于AST和ALT试剂的pH和缓冲体系。一种凭经验的总体判断方法是，如果某缓冲剂的pKa偏离选定的pH为±1.0pH单位，则可认为它是有效的。本发明的试剂优选的pH是7-9。至于天冬氨酸转氨酶，最佳催化活性产生于30℃下pH约为7.0-8.2时。对于AST试剂，在20℃时最优选的pH约为8.1±0.1，因为在该pH时NADH是稳定的。至于ALT试剂，最大催化活性产生于20℃下pH范围约为7.3-7.9时。对于ALT试剂，在20℃时最优选的pH约为7.7。在这些优选的pH时，在最佳酶活性和酶与辅酶在溶液中的稳定性之间可达到协调。更低的pH就会加重辅酶的降解。
对于脲试剂，虽然7.5-9.5的pH范围也可接受，但优选的缓冲体系是pH8.50下的Tris。为达到有效的缓冲容量，缓冲剂的优选的浓度是100mM Tris，尽管也可以用20-200mM范围内的Tris。该试剂体系中也可以用在pH7.5-9.5的范围内提供有效缓冲容量的宽范围内的任意缓冲剂。
对于氨试剂，优选的缓冲体系是在pH8.5-9.0时的Tris，不过pH7.5-9.5范围内的任意值也可以接受。为达到有效的缓冲容量，缓冲剂优选的浓度是100mM Tris，但也可以用20-200mM Tris范围内的任意值。
用于AST和ALT试剂的合适的缓冲剂包括：HEPES，4-吗啉丙磺酸(MOPS)或2-〔三(羟甲基)甲氨基〕-1-乙磺酸(TES)或二乙醇胺或其它GOOD缓冲剂，麦黄酮，N-二(羟乙基)甘氨酸，TEA和TAPS，TAPSO和POPSO。本发明的优选的缓冲剂是TRIS，其总浓度优选为30-150mmol/L，更优选约为70-100mmol/L，不过约80mmol/L也是优选的。在更高的缓冲剂浓度下，AST越发受抑制。应注意，磷酸盐缓冲剂似乎能提高NADH的分解速率并抑制吡哆醛-5-磷酸(P-5-P)与转氨酶脱辅酶的结合。如果需要的话，待测样本可用任何合适的稀释剂如去离子水或盐水稀释。除了上述适用于AST和ALT试剂的缓冲剂之外，下列GOOD缓冲剂也适用于氨和脲试剂：CAPSO、CHES和AMPSO。
合适的防腐剂如叠氮化钠(NaN3)、羟基苯甲酸、庆大霉素、麝香草酚和可得自Boehringer Mannheim的不含汞的防腐剂如甲基异噻唑酮。适宜的含量应是这样的：即在2-8℃下贮存时，防腐剂保持其防腐性能至少达6-8个月而不会抑制试剂中存在的酶。符合这些条件的合适的范围是0.1-1.0g/L。
大量的螯合剂如EDTA、EGTA、N-(2-羟乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)等等也适合作非特异性稳定剂。在本发明的AST和ALT试剂中，已被优选采用的EDTA含量约为2.0-10.0mmol/L以稳定2-氧代戊二酸。其四钠盐和钾盐可达此目的，但依本发明优选的盐是二钠盐。EDTA在脲试剂和氨试剂中的存在量处于0.2～10mM的范围内。EDTA的特别优选的浓度是1mM。
也可往本发明的试剂中掺入酶稳定剂。优选的稳定剂是不含蛋白酶级的牛血清白蛋白。其它合适的稳定剂包括牛丙种球蛋白、N-乙酰半胱氨酸和甘油。
如果需要的话，也可加入合适的消泡剂。可采用的表面活性剂包括两性离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂，其含量不能抑制试剂中存在的酶。
在本发明的另一个方面，提供了一种酶法测定除血清重碳酸盐之外的分析物浓度的方法，其中对辅酶的氧化度进行测定，该方法包括：通过包括酶和底物对的辅酶还原系统来稳定含所述辅酶的试剂以抗氧化，所述的酶和底物对彼此间具有不完全的专一性，因而可使所述辅酶在该试剂的贮存期间连续再生，其特征在于，该试剂中掺入了游离磷酸盐离子，而且该试剂在2-8℃下贮存至少6-8个月期间在测定分析物浓度方面没有功能上的损失。
在本发明的一个优选方法中，所述的分析物是转氨酶。
在本发明的又一个优选方法中，所述的分析物是天冬氨酸转氨酶。
在本发明的又一个优选方法中，所述的分析物是丙氨酸转氨酶。
在本发明的又一个优选方法中，所述的分析物是脲。
在本发明的又一个优选方法中，所述的分析物是氨。
在依本发明这一方面的一个优选方法中，酶和底物对中的酶对所述底物有不完全的专一性，因此可减小酶和底物之间的交叉反应性比率。
在本发明这一方面的一个优选实施方案中，辅酶还原系统包括的酶和底物彼此间的专一性相对于该酶对其天然底物的专一性而言小于100％，优选小于50％，最优选是小于10％。该酶/底物对彼此间的专一性相对于该酶对其天然底物的专一性而言最合适是小于5％，最理想是约为2％。
辅酶、底物和酶可选自上文所述的有关本发明的试剂的那些，这取决于待检定的分析物。
在本发明这一方面的一个实施方案中，用于测定分析物浓度的辅酶还原系统的优选的组分有：NADH、G-6-P-DH和D-葡萄糖，因此再生反应是如下进行的：
由于G-6-P-DH对D-葡萄糖的专一性小，故该再生反应缓慢，于是它不与测定分析物含量中所涉及的主反应竞争。
优选的实施方案
在本发明的一个优选的实施方案中，ALT试剂基本上包括：
L-丙氨酸                                               底物
LDH                                                    底物专一性酶
NADH                                                   辅酶
K2HPO4                                              激活剂
2-氧代戊二酸                                           底物
此外，还优选包括：TRIS缓冲剂、TRIS HCl、EDTA二钠、牛血清白蛋白和叠氮化钠。
按本发明配制的一种ALT试剂如下所示：
表1
原料 分子量 量/升
TRIS缓冲剂 121.14 1.5-3.5g
TRIS-HCl 157.60 8.0-14.0g
L-丙氨酸 89.09 34.0-45.0g
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 190.1 0.5-3.5g
EDTA二钠 372.24 1.0-3.0g
牛血清白蛋白 0.1-2.0g
NADH，Na2.3H2O 763.5 0.1-0.3g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 0.3-1.3g
叠氮化钠 65.01 0.1-1.0g
LDH，微生物的 2000-5000U
G-6-PDH 200-3000U
D-葡萄糖 180.16 15.0-21.0g
依本发明的一种特别优选的ALT试剂如下配制：
表2
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS缓冲剂 121.14 18mM 2.18g
TRIS-HCl 157.60 70mM 11.03g
L-丙氨酸 89.09 440mM 39.2g
α-酮戊二酸，Na盐，(无水的) 190.1 13.2mM 2.51g
EDTA二钠 372.24 5.5mM 2.04g
牛血清白蛋白 0.1％ 1.00g
NADH，Na2.3H2O 763.5 0.26mM 0.199g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 5mM 0.87g
叠氮化钠 65.01 7.7mM 0.50g
LDH，微生物的 4000U
G-6-PDH 2000U
D-葡萄糖 180.16 100mM 18.016g
该调和物被浓缩10％以允许样本稀释。
在本发明的一个优选的实施方案中，AST试剂基本上包括：
L-天冬氨酸                                        底物
LDH                                               底物专一性
MDH                                               酶
NADH                                              辅酶
K2HPO4                                         激活剂
2-氧代戊二酸                                      底物
此外，还优选包括：TRIS缓冲剂、TRIS HCl、EDTA二钠、牛血清白蛋白和叠氮化钠。
按本发明配制的一种AST试剂如下所示：
表3
原料 分子量 量/升
TRIS缓冲剂 121.14 2.0-6.0g
TRIS-HCl 157.60 6.0-11.0g
L-天冬氨酸，K盐 172.2 34.0-43.0g
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 190.1 0.5-4.5g
EDTA二钠 372.24 1.0-3.0g
牛血清白蛋白 0.1-2.0g
NADH，Na2·3H2O 763.5 0.1-0.3g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 0.3-2.0g
叠氮化钠 65.01 0.1-1.0g
LDH，微生物的 1000-4000U
G-6-PDH(Toyobo)，肠膜明串珠菌 1000-4500U
D-葡萄糖 180.16 15.0-21.0g
MDH，微生物的 100-600U
依本发明的一种特别优选的AST试剂配制如下：
表4
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS缓冲剂 121.14 31.2mM 3.78g
TRIS-HCl 157.60 56.8mM 8.95g
L-天冬氨酸，K盐 172.2 220mM 37.88g
α-酮戊二酸，Na盐，(无水的) 190.1 13.2mM 2.51g
EDTA二钠 372.24 5.5mM 2.04g
牛血清白蛋白 0.1％ 1.00g
 NADH，Na2.3H2O 763.5 0.26mM 0.199g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 10.0mM 1.74g
叠氮化钠 65.01 7.7mM 0.50g
LDH，微生物的 2000U
G-6-PDH，肠膜明串珠菌 2000U
D-葡萄糖 180.16 100mM 18.016g
MDH，微生物的 200U
该调和物被浓缩10％以允许样本稀释。
在本发明的一个优选的实施方案中，脲试剂基本上包括：
Figure C9619292700231
脲酶                                               分析物专一性酶
α-酮戊二酸                                        底物
NADPH                                              辅酶
K2HPO4                                          激活剂
GLDH                                               底物专一性酶
依本发明配制的一种脲试剂如下所示：
表5A
原料 分子量 量/升
TRIS缓冲剂 121.14 5.0-10.0g
TRIS-HCl 157.60 3.5-9.5g
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 190.1 0.5-3.5g
EDTA二钠 372.24 0.1-1.0g
NADH，Na2·3H2O 763.5 0.1-0.3g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 0.3-2.0g
牛血清白蛋白 0.05-2.0g
叠氮化钠 65.01 0.1-1.0g
D-葡萄糖 180.16 3.0-21.0g
脲酶(微生物的) 4000-9000U
GLDH(微生物的) 250-1000U
G-6-PDH，肠膜明串珠菌 1000-4500U
依本发明的一种特别优选的脲试剂配制如下：
表5B
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS 121.14 61.3mM 7.43g
TRIS-HCl 157.60 38.7mM 6.10g
α-酮戊二酸，Na盐，(无水的) 190.1 7.5mM 1.43g
EDTA二钠 372.24 1.0mM 0.372g
NADH，Na2.3H2O 763.5 0.28mM 0.214g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 5.0mM 0.871g
牛血清白蛋白 0.05％ 0.50g
叠氮化钠 65.01 7.7mM 0.50g
D-葡萄糖 180.16 100mM 18.016g
脲酶(微生物的) 6500U
GLDH(微生物的) 500U
G-6-PDH，肠膜明串珠菌 2000U
在本发明的一个优选的实施方案中，氨试剂基本上包括：
Figure C9619292700251
α-酮戊二酸                                   底物
NADPH                                         辅酶
K2HPO4                                     激活剂
GLDH                                          底物专一性酶
此外，还优选包括TRIS缓冲剂、TRIS HCl、EDTA二钠、ADP-K、牛血清白蛋白和叠氮化钠。
依本发明配制的一种氨试剂如下所示：
表6A
原料 分子量 量/升
TRIS 121.14 5.0-10.0g
TRIS-HCl 157.60 3.5-9.5g
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 190.1 0.5-3.5g
EDTA二钠 372.24 0.1-1.0g
NADPH，Na4·4H2O 905.4 0.1-0.35g
ADP-K 501.3 0-1.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 0.3-2.0g
牛血清白蛋白 0.05％ 0.05-2.0g
叠氮化钠 65.01 0.1-1.0g
D-葡萄糖 180.16 3-21g
GLDH(微生物的) 6000-10000U
G-6-PDH，肠膜明串珠菌 1000-4000U
依本发明的一种特别优选的脲试剂配制如下：
表6B
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS 121.14 61.3mM 7.43g
TRIS-HCl 157.60 38.7mM 6.10g
α-酮戊二酸，Na盐，(无水的) 190.1 7.5mM 1.43g
EDTA二钠 372.24 1.0mM 0372g
NADPH，Na4.4H2O 905.4 0.28mM 0.254g
ADP-K 501.3 2mM 1.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 174.18 5.0mM 0.871g
牛血清白蛋白 0.05％ 0.50g
叠氮化钠 65.01 7.7mM 0.50g
D-葡萄糖 180.16 100mM 18.016g
GLDH(微生物的) 8500U
G-6-PDH，肠膜明串珠菌 3500U
虽然本发明的试剂优选是配制于单个小瓶中，不过将其配制于两个小瓶中也行。调和物的再生组分只需掺入其中的一个小瓶中。IFCC格外推荐：对于ALT试剂和AST试剂，2-氧代戊二酸应作为单独的一个组分调和到调和物的其它组分中。试剂A(不含2-氧代戊二酸)可与病人样本一起保温达5-10分钟，在此期间使所有副反应进行完全。保温期后，可以加入2-氧代戊二酸而开始进行主反应。作为将2-氧代戊二酸用作起始组分的替代方式，也可以依同样方法应用天冬氨酸或丙氨酸，因为2-氧代戊二酸存在时可在副反应期间保护AST或ALT免遭灭活。含有非匹配的酶和底物对的再生系统应加入包含NADH的两个小瓶体系的组分中。
如果采用两个小瓶体系，建议调和物包括P-5-P，因为在保温期间，有样本存在时，加入P-5-P至血清中可激活脱辅酶而且，如果用P-5-P完全饱和的话，使之能测定血清中总的AST和ALT催化活性浓度。用于两个小瓶体系的P-5-P的含量优选约为80-120μmol/L，更优选的含量为100μmol/L。
实施例1
如下测试依本发明配制的四种特定的试剂的稳定性：
配方：
AST试剂：
表7A
TRIS缓冲剂 3.78g/L
TRIS HCl 8.95g/L
天冬氨酸 37.88g/L
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 2.51g/L
叠氮化钠 0.50g/L
牛血清白蛋白 1.0g/L
NADH.Na23H2O 0.199g/L
EDTA二钠 2.04g/L
磷酸氢二钾(K2HPO4) 0.87g/L
D-葡萄糖 18.016g/L
G-6-PDH(肠膜明串珠菌) 3500U/L
D-LDH(微生物的) 2000U/L
MDH(微生物的) 650U/L
表7B
TRIS缓冲剂 4.35g/L
TRIS HCl 8.31g/L
L-天冬氨酸，K盐 37.88g/L
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 2.51g/L
叠氮化钠 0.50g/L
牛血清白蛋白 0.50g/L
NADH，Na2·3H2O 0.234g/L
EDTA二钠 1.86g/L
磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.74g/L
D-葡萄糖 18.016g/L
G-6-PDH(Toyobo)，肠膜明串珠菌 2000U/L
LDH(微生物的) 2000U/L
MDH(微生物的) 200U/L
ALT试剂：
表8A
TRIS缓冲剂 2.18g/L
TRIS HCl 11.0g/L
L-丙氨酸 39.2g/L
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 2.51g/L
叠氮化钠 0.50g/L
牛血清白蛋白 1.0g/L
NADH.Na23H2O 0.199g/L
EDTA二钠 2.04g/L
磷酸氢二钾(K2HPO4) 0.87g/L
D-葡萄糖 18.016g/L
G-6-PDH(肠膜明串珠菌) 3500U/L
LDH(微生物的) 3000U/L
表8B
TRIS缓冲剂 3.27g/L
TRIS HCl 11.03g/L
L-丙氨酸 39.2g/L
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 2.51g/L
叠氮化钠 0.50g/L
牛血清白蛋白 0.50g/L
NADH，Na2·3H2O 0.234g/L
EDTA二钠 1.86g/L
磷酸氢二钾(K2HPO4) 0.87g/L
D-葡萄糖 18.016g/L
G-6-PDH(肠膜明串珠菌) 2000U/L
LDH(微生物的) 4000U/L
贮存条件：
密封并冷冻(2-8℃)
分光光度的参数(Shimadzu PC2101)：
·反应温度            37℃
·样本与试剂的体积比  1∶10～1∶25
·波长                340nm
·比色槽光程长度      1cm
测定的迟滞期约为1分钟或更短而测定时间为迟滞期后3分钟以上。
这些分光光度的参数被用于如下测定：
·试剂在340nm处的初始吸光度
·在20℃时的再生速率(以mAbs/min表示)
将Cobas Mira用于测定对照标准的再生率。
得如下结果：
表9A：表7A和8A中所示的AST和ALT试剂的吸光度数据
在8℃下贮存(周数)  在340nm处的吸光度
AST试剂 ALT试剂
新配制的试剂 1.88 1.99
1 1.77 1.95
3 1.72 1.88
6 1.65 1.78
10 1.54 1.64
15 1.40 1.46
20 1.25 1.29
25 1.18 1.18
29 1.13 1.10
33 1.07 1.01
表9B：
表7B和8B中所示的AST和ALT试剂的吸光度数据
在2-6℃下贮存(天数)    在340nm处的吸光度
AST试剂 ALT试剂
新配制的试剂 1.83 1.86
22 1.82 1.81
29 1.8 1.8
60 1.73 1.7
92 1.67 1.61
125 1.6 1.52
159 1.52 1.41
187 1.46 1.33
194 1.45 1.32
以下的表(表10A和10B)，证实了AST和ALT试剂在7个月期间的连续功能性。对于每一轮，利用新配制的试剂和在8℃下的不同时间间隔贮存过的试剂来试验AST和ALT血清的高和低池。
表10A：关于表7A和8A中所示的AST和ALT试剂的对照血清 再生率(control sera recoveries)
在8℃下贮存(周数) ALT试剂(U/L) AST试剂(U/L)
新配制的试剂 贮存于8℃下的试剂 新配制的试剂 在8℃下贮存的试剂
血清池→ 低 高 低 高 低 高 低 高
0 40 156 42 152 45 188 45 192
4 38 154 42 162 45 185 46 191
9 41 150 38 151 46 182 46 194
12 39 157 42 152 46 189 46 187
15 32 133 33 132 40 163 38 164
25 32 121 33 117 38 180 39 180
29 31 117 32 112 33 164 37 170
表10B：关于表7B和8B中所示的AST和ALT试剂的对照血清再 生率
贮存(天数) ALT试剂(U/L) AST试剂(U/L)
贮存于20℃下的试剂 贮存于4℃下的试剂 贮存于20℃下的试剂 贮存于4℃下的试剂
血清池→ 低 高 低 高 低 高 低 高
0 32 123 32 123 40 186 40 186
7 33 120 - - 41 191 - -
14 32 121 - - 41 184 - -
21 33 121 33 122 41 182 40 184
28 32 120 32 120 41 185 40 184
35 33 118 33 117 42 185 44 183
60 - - 33 120 - - 41 185
92 - - 36 122 - - 45 190
125 - - 35 123 - - 44 189
159 - - 36 123 - - 43 188
187 - - 35 125 - - 44 187
表11A：对于表7A和8A中所示的AST和ALT试剂的线性度研 究
AST试剂(U/L) ALT试剂(U/L)
预期值 观测值 预期值 观测值
↓ 母料 试验试剂 ↓ 母料 试验试剂
400 393 389 380 380 357
200 182 182 120 121 119
100 98 96 60 65 63
50 50 51 30 34 28
表11B：对于表7B和8B中所示的AST和ALT试剂的线性度研究
AST试剂(U/L) ALT试剂(U/L)
预期值 观测值 预期值 观测值
新配制的试剂 在4℃下200天后 新配制的试剂 在4℃下200天后
120 122 113 141 137 133
240 241 237 282 285 273
300 301 295 353 353 352
360 360 357 424 422 416
420 420 416 494 493 476
480 479 472 565 560 551
540 538 527 635 635 621
600 598 596 706 710 684
注意：试验试剂已于8℃下贮存了31周，
母料是为本研究新配制的。
给出的结果表明，再生AST和ALT试剂密封贮存于2-8℃时表现出至少6-7个月的稳定性。该试剂的有效初始吸光度定有1.0A。7个月后该试剂的吸光度至少仍有1.0A。
表10A和10B中的结果清楚地表明，用新配制的试剂与用在8℃下贮存达29周的试剂相比，所得对照血清再生率没有显著差别。示于表11A和11B中的结果指出，综合有辅酶再生技术的AST和ALT试剂在8℃下贮存31周后仍能符合线性度要求。
综合有本发明的再生系统已导致在2-8℃下密闭1个月到至少6-8个月的AST和ALT血清测定试剂重构稳定性的增强。
实施例2
用前述表5B中所示的组分配制脲试剂，但本调和物中是加入0.33mM NADH，且将其中一种试剂中D-葡萄糖的含量降低至20mM。
如此配制的调和物pH为8.5。将惯常的脲试剂调和物用作对照物。往试剂体系中加入作为污染物的氨至含量为0.15mM(最终浓度)而配成各试剂。氨污染物的含量足以消耗各份试剂中0.15mM的NADPH即相当于340nm处的0.93个吸光度单位。反应完全后(即氨从试剂调和物中消失)，在20℃的温度下，用Shimadzu分光光度计在340nm处监测各溶液(置于封闭的比色槽中)的吸光度随时间的变化。
示于图1中的结果显示出在受0.15mM氨污染后的本发明脲试剂调和物中，由NAD+再生为NADH的时间依赖性。
图1中：
A栏示出惯常的脲试剂的NADH再生情况；
B栏示出含有5mM磷酸钠、2000U/L G-6-PDH和20mM D-葡萄糖的脲试剂的NADH再生情况；
C栏示出含有5mM磷酸钾、2000U/L G-6-PDH和100mM D-葡萄糖的脲试剂的NADH再生情况。
在20℃下48小时后，惯常的试剂不能再生用氨污染试剂后消耗的任何NADH。在相同的时间内，含有20mM D-葡萄糖的本发明的脲试剂再生了0.23个吸光度单位、或0.04mM的NADH。48小时以后，含有100mM D-葡萄糖的本发明的脲试剂再生了0.70个吸光度单位、或0.11mM的NADH。这些结果说明了文中所述的试剂当试剂受氨污染后防止NADH在脲试剂中耗尽的能力。
表12在340nm处测定的有关脲试剂中NADH在20℃下再生的最大速率
脲试剂条件 再生速率(m/Abs/min)
惯常的试剂 -0.02
含5mM Na-PO4、2000U/L G-6-PDH和2mM D-葡萄糖的本发明试剂 +0.088
含5mM K-PO4、2000U/L G-6-PDH和100mM D-葡萄糖的本发明试剂 +0.386
NADH在各种脲试剂中的最大再生速率示于表12中。在惯常的试剂中，当污染物氨消失之后，吸光度随时间而缓慢降低。在本发明的调和物中，NADH的再生速率随着试剂中D-葡萄糖浓度的增大而增大。
用前述表6B中所示的组分配制氨试剂，只是要改变Tris/Tris HCl缓冲剂(100mM总的缓冲剂)使所得试剂的pH值在pH8.0-9.3的范围内。在配制的氨试剂中，也采用最终浓度为0.2mM的NADPH。也配制不含D-葡萄糖、磷酸钾或G-6-PDH的对照氨试剂。往试剂体系中加含量为0.1mM(最终浓度)的氨作为污染物  而配制试剂。各种试剂中氨污染物的含量足以消耗0.1mM NADPH-相当于340nm处的0.62个吸光度单位。反应完全后(即氨从试剂中完全消失)，在20℃的温度下，用Shimadzu分光光度计在340nm处监测各溶液(置于封闭的比色槽中)的吸光度随时间的变化。
示于图2中的结果显示：在用0.1mM氨污染后的、依本发明的氨试剂调和物中，于pH8.0-9.3之间由NADP再生NADPH的时间依赖性。在20℃下污染物氨消失后的24小时内可完成NADPH再生。各种氨试剂中NADPH的最大再生速率示于表13中。在pH8.0的惯常的氨试剂中，溶液的吸光度保持在0.6-0.65之间，且吸光度有缓慢的降低。在所有试验过的pH值下，本发明的调和物中NADPH的再生速率完全类似。NADPH的最大再生速率是在pH8.50时。这些结果清楚地表明了文中所述的试剂当试剂受氨污染后防止NADPH在氨试剂中耗尽的能力。
表13在340nm处测定的有关氨试剂中NADPH在20℃下再生的最大速率
氨试剂条件 再生速率(m/Abs/min)
pH8.0惯常的试剂 -0.03
pH8.0，本发明的调和物 +0.78
pH8.5，本发明的调和物 +0.85
pH9.0，本发明的调和物 +0.76
pH9.3，本发明的调和物 +0.71
实施例3
NAD(P)H在氨试剂和脲试剂中的损耗速率
A.脲试剂
用表5B中所示的配方组分配制脲试剂，但要求如下改动：NADH在该试剂调和物中的最终浓度是0.25mM。通过改变Tris/Tris HCl的比(100mM总的缓冲剂)而调节脲试剂的pH。配制的对照脲试剂溶液中不含D-葡萄糖、磷酸盐和G-6-PDH。
在340nm处监测贮存于20±2℃下的密封比色槽中的含试剂的样本溶液的吸光度。
在340nm处监测的、贮存于20±2℃下的脲试剂溶液的吸光度随时间的降低示于表14中。显然，存在或不存在本发明的辅酶再生系统时，在pH8.0时溶液的吸光度降低得比在pH8.5时更快。但是在本发明的调和物中，试剂溶液的吸光度降低的速率也明显地更慢。换言之，提高pH和掺入本发明的辅酶再生系统会显著减小NADPH从脲试剂溶液中消失的速率。
应注意，虽然pH升高到8.5以上也会增进NADH的稳定性，但可商购的脲酶和谷氨酸脱氢酶在本试剂调和物中就会变得越发不稳定且活性变差。因此，需要平衡试剂调和物中的pH，使得维持适当的酶活性和稳定性，同时也保证适当的NADH稳定性。基于这些，pH约为8.5的试剂调和物是优选的。
表14贮存于20℃的脲试剂溶液的吸光度(340nm)随时间的变化关系
保温期(天) pH8.0惯常的调和物 pH8.0本发明的调和物 pH8.5惯常的调和物 pH8.5本发明的调和物
0 1.73 1.72 1.77 1.74
7 1.63 1.68 1.7 1.75
14 1.52 1.61 1.64 1.7
23 1.36 1.48 1.54 1.62
29 1.25 1.4 1.47 1.53
37 1.12 1.3 1.38 1.52
B.氨试剂
用表6B中所示的配方组分配制氨试剂，但要作如下改动：通过改变Tris/Tris HCl的比(100mM总的缓冲剂)而调节氨试剂的pH。NADPH在氨试剂溶液中的最终浓度是0.2mM。配制的对照氨试剂溶液中不含D-葡萄糖、磷酸盐和G-6-PDH。
在340nm处监测贮存于20℃下的密封比色槽中的含试剂的样本溶液的吸光度。
在340nm处监测的、贮存于20℃下的氨试剂的吸光度随时间的降低示于表15中。显然，含有或不含本发明的辅酶再生系统的溶液，其吸光度随pH减小而降低得更为迅速。但是在本发明的调和物中，试剂溶液的吸光度降低速率也明显地更慢。换言之，提高pH和掺入辅酶再生系统会显著减小NADPH从氨试剂溶液中消失的速率。
应注意，虽然pH升高会增进NADPH的稳定性，但可商购的谷氨酸脱氢酶在pH大于8.5的试剂调和物中会变得越发不稳定且活性变差。因此，需要平衡试剂调和物的pH，使得维持适当的酶活性和稳定性，同时也保证适当的NADPH稳定性。基于这些，pH为8.5-9.0的试剂调和物是优选的。
表15贮存于20℃的氨试剂溶液的吸光度(340nm)随时间的变化关系
保温期(天) pH8.0惯常的调和物 pH8.0含再生技术的本发明的调和物 pH8.5惯常的调和物 pH8.5含再生技术的本发明的调和物 pH9.0惯常的调和物 pH9.0含再生技术的本发明的调和物
0 1.39 1.41 1.38 1.41 1.4 1.41
6 1 1.09 1.2 1.27 1.31 1.36
12.9 0.64 0.79 0.99 1.12 1.2 1.29
20.1 0.39 0.57 0.79 0.97 1.09 1.22
32.9 0.15 0.33 0.49 0.74 0.87 1.07
38.1 0.13 0.28 0.39 0.67 0.8 1.03
实施例4
氨试剂和脲试剂的函数性
A.脲试剂
按列于表5B中的成分配制包含和不含D-葡萄糖、磷酸盐和G-6-PDH的脲试剂。但是，NADH在各试剂调和物中的最终浓度均为0.25mM。利用如下特定参数，在ROCHE_COBAS MIRATM仪上比较各试剂相对于Verichem/标准的/非标准的对照样的线性度。
反应温度：37℃
样本与试剂的体积比：1∶100
波长：340nm
示于表16中的结果表明：在pH8.50时的本发明脲试剂，直到试验的脲对照样本的最高含量(Verichem Level E，含37.4mM脲)都呈线性关系，其测定值偏差在特定浓度的5％的范围内。在有关标准的和非标准的脲对照样本的值的偏差内，本发明的脲试剂也可准确地读数。
表16在pH8.50时对脲试剂的线性度研究
对照样本 对照样本的特定的脲浓度(mM) 有关对照样本的估测的脲浓度(mM)
本发明的脲试剂 脲试剂(惯常的)
Verichem level A 1.8 2 2
Verichem level B 10.7 10.8 11.3
Verichem level C 19.6 19.9 19.6
Verichem level D 28.5 27.7 26.7
Verichem level E 37.4 35.9 35.8
标准对照物 5.2±1.4 5.2 5.2
非标准对照物 18.3±2.1 19.1 18.6
B.氨试剂
按列于表6B中的成分配制含有和不含D-葡萄糖、磷酸盐和G-6-PDH的氨试剂。利用下列特定参数，在ROCHE_COBAS MIRATM仪上比较各试剂相对于含水的氨对照样的线性度。
反应温度：37℃
样本与试剂的体积比：1∶10
波长：340nm
示于表17中的结果表明：本发明的氨试剂在pH8.50时，直到试验的氨对照样的最高含量(1200μM氨)都呈线性关系，其测定值偏差在特定浓度的5％的范围内。
表17在pH8.50时对氨试剂的线性度研究
有关含水的对照样的特定的氨浓度(μM) 有关对照样的氨浓度的两次测定平均估测值(μM)
10 11.6±6
20 24.2±2.3
50 52.5±3.1
100 101.9±2.7
200 203.5±1.3
400 409.7±3.1
800 789.3±3.5
1200 1164±2.2
实施例5
依如下规定的调和物组成可将脲试剂配成两个小瓶的形式。要求装入小瓶A和小瓶B的试剂的相对体积使合并后的试剂小瓶A：小瓶B为5∶1。
脲小瓶A
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS 121.14 61.3mM 7.43g
TRIS-HCl 157.6 38.7mM 6.10g
NADH，Na2.3H2O 763.5 0.34mM 0.26g
NaN3 65.01 7.7mM 0.5g
K2HPO4 174.18 5mM 0.871g
D-葡萄糖 180.16 100mM 18.02g
BSA - 0.05％ 0.5g
G-6-PDH，肠膜明串珠菌 2000U/L 2000U
脲小瓶B
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS 121.14 61.3mM 7.43g
TRIS-HCl 157.6 38.7mM 6.10g
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 190.1 45mM 8.55g
EDTA，Na2.3H2O 372.24 1mM 0.372g
BSA - 0.05％ 0.5g
CLDH(微生物的) - 50000U/L 50000U
脲酶(微生物的) - 40000U/L 40000U
氨试剂.2小瓶形式
依如下规定的调和物组成可将氨试剂配成以两个小瓶的形式。要求装入小瓶A和小瓶B的试剂的相对体积使合并后的试剂小瓶A∶小瓶B为5∶1。在提供的实施例调和物中，用NADH代替NADPH。因此，在开始进行主要的分析反应之前，在小瓶A中包括LDH以除去病人样本中的丙酮酸干扰物。
氨小瓶A
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS 121.14 61.3mM 7.43g
TRIS-HCl 157.6 38.7mM 6.10g
NADH，Na2.3H2O 763.5 0.34mM 0.26g
NaN3 65.01 7.7mM 0.5g
K2HPO4 174.18 5mM 0.871g
D-葡萄糖 180.16 100mM 18.02g
BSA - 0.05％ 0.5g
G-6-PDH，肠膜明串珠菌 2000U/L 2000U
LDH(微生物的) - 2000U/L 2000U
氨小瓶B
原料 分子量 浓度 量/升
TRIS 121.14 61.3mM 7.43g
TRIS-HCl 157.6 38.7mM 6.10g
α-酮戊二酸，Na盐(无水的) 190.1 45mM 8.55g
EDTA，Na2.3H2O 372.24 1mM 0.372g
BSA - 0.05％ 0.5g
GLDH(微生物的) - 50000U/L 50000U
脲酶(微生物的) - 40000U/L 40000U
本发明的试剂和方法的其它主要优点有：该试剂为其最优选的形式，于是单个的小瓶试剂减小了有关现有技术的试剂的空间和存贮问题，因此它适合于各种检测仪器系统。
应当懂得，有多种“非专一性”底物/酶对可被用于减慢在本发明的试剂和方法中应用的辅酶的再生。除了文中提及的那些之外，还有不能商购的或相当昂贵的其它底物/酶对。
也应懂得，本发明也适用于除了AST、ALT、氨和脲试剂之外的其它试剂如LDH(丙酮酸至乳酸)、甘油三酯和水杨酸盐的稳定化。不能认为本发明局限于该说明书中的有关AST、ALT、氨和脲的具体范例。

Claims (15)

1.一种用于酶法测定病人的除血清重碳酸盐之外的分析物浓度的试剂，其中对辅酶的氧化度进行测定，该试剂通过包括酶和底物对葡糖-6-磷酸脱氢酶/D-葡萄糖的NAD+或NADP+辅酶还原系统来稳定以抗氧化，所述的酶和底物对葡糖-6-磷酸脱氢酶/D-葡萄糖彼此间具有不完全的专一性，因而可使所述辅酶在该试剂的贮存期间连续再生，其特征在于，该试剂中掺入了游离磷酸盐离子，而且该试剂在2-8℃下贮存至少6-8个月期间在测定分析物浓度方面没有功能上的损失。
2.权利要求1所要求的试剂，其中所述的连续再生作用是在18～25℃下以0.01～0.9mAbs/min的速率发生的。
3.权利要求1或2所要求的试剂，其中所述的分析物是转氨酶。
4.权利要求3所要求的试剂，其中所述的转氨酶是天冬氨酸转氨酶。
5.权利要求3所要求的试剂，其中所述的转氨酶是丙氨酸转氨酶。
6.权利要求1或2所要求的试剂，其中所述的分析物是脲。
7.权利要求1或2所要求的试剂，其中所述的分析物是氨。
8.权利要求1或2所要求的试剂，其中所述试剂以单个小瓶构成。
9.一种酶法测定除血清重碳酸盐之外的分析物浓度的方法，其中对辅酶的氧化度进行测定，该方法包括：通过包括酶和底物对葡糖-6-磷酸脱氢酶/D-葡萄糖的NAD+或NADP+辅酶还原系统来稳定含所述辅酶的试剂以抗氧化，所述的酶和底物对葡糖-6-磷酸脱氢酶/D-葡萄糖彼此间具有不完全的专一性，因而可使所述辅酶在该试剂的贮存期间连续再生，其特征在于，该试剂中掺入了游离磷酸盐离子，而且该试剂在2-8℃下贮存至少6-8个月期间在测定分析物浓度方面没有功能上的损失。
10.权利要求9所要求的方法，其中所述的连续再生作用是在18～25℃下以0.01～0.9mAbs/min的速率发生的。
11.权利要求9或10所要求的方法，其中所述的分析物是转氨酶。
12.权利要求11所要求的方法，其中所述的分析物是天冬氨酸转氨酶。
13.权利要求11所要求的方法，其中所述的分析物是丙氨酸转氨酶。
14.权利要求9或10所要求的方法，其中所述的分析物是脲。
15.权利要求9或10所要求的方法，其中所述的分析物是氨。
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