CN109596522A - 一种可稳定保存nadh的溶液及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可稳定保存NADH的溶液及试剂盒，包括以下组分：缓冲盐50～200mmol/L，氯化盐50～300mmol/L，螯合剂1.5～7.5mmol/L；本发明提供的可稳定保存NADH的溶液，在加入螯合剂和防腐剂的基础上，搭配使用氯化盐，可明显提高NADH的稳定性，将保存NADH的溶液置于37℃下7天，其相对含量保持在92％以上；放置14天，其相对含量保持在85％以上，相比于使用低浓度Tris溶液的保存方法，稳定性更高，持效性更长，可适用于多种物质的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种可稳定保存NADH的溶液及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种可稳定保存NADH的溶液及试剂盒。
背景技术
还原性辅酶Ⅰ(NADH)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，是传递电子的一种辅酶，在波长340nm处有最大吸收峰，而其氧化态NAD+在波长340nm处无吸收峰，利用其偶联的脱氢酶(如谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等工具酶)反应，根据波长340nm处吸光度的变化，可以测定人体所含代谢物和酶的浓度或活性。
NADH在液体溶液中非常不稳定，容易被氧化，特别是在偏酸性溶液中易降解，在磷酸盐溶液变得更加不稳定，现有常用技术是将NADH溶解于低浓度Tris溶液中，pH控制在8.5以上，加入螯合剂改善其液体溶液的稳定性。在Tris溶液开瓶使用过程中，会吸收空气中的二氧化碳而导致pH下降，引起NADH不稳定，并且会随着Tris浓度的增加而加速NADH的分解。
CN1311335A公开了一种可稳定还原性辅酶Ⅰ和还原性辅酶Ⅱ的试剂，用于临床生化诊断试剂的配制，其特点是：试剂溶液的pH值为8.5～11.0，且溶液中含有0.5～50mM的金属离子螯合剂。金属离子螯合剂指一个分子中含有两个或两个以上配位原子的配位体；常见的有EDTA及其各种金属盐。此方法在对生物体液样本进行定量测定以分析样本中的分析物浓度时，可在更宽的pH值环境下，阻止NADH和NADPH的氧化，低成本解决还原性辅酶不稳定的难题。但是此方法在实际使用时，仍然使用Tris缓冲液，仍然不能增加储存的稳定性。
US5278044A公开了一种稳定的水溶性NADH试剂及试剂盒，其第二试剂中，由碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、碳酸铵、碳酸氢铵及其混合物组成的缓冲液，所述缓冲液的浓度约为2-15mM，其中该水溶液的pH值为9.5～11.0。此方法采用的低浓度的缓冲体系，在开瓶使用过程中并不能有效维持溶液的pH值，限制了其应用。
87100939A公开了一种还原的二核苷酸，最好是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被稳定在含有丙二醇、硼酸和能在pH8-11范围内缓冲的缓冲液的碱性水溶液中，稳定液含有50％(体积/体积)以上的水，剩余体积的稳定液含有除去了各种氧化剂经化学处理的丙二醇。可将该试剂本身或该试剂与鉴定试剂系统一起用于临床化验室中。此方法还需要额外使用其他溶剂，也不利于实际应用。
上述技术并没有完全解决NADH在液体溶液中不稳定的问题。因此，研发一种提高NADH在液体溶液中稳定性的方法，具有良好的市场应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可稳定保存NADH的溶液及试剂盒，以达到稳定保存NADH的目的，解决其稳定性欠佳的问题。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种可稳定保存NADH的溶液，所述可稳定保存NADH的溶液，包括以下组分：缓冲盐50～200mmol/L，氯化盐50～300mmol/L，螯合剂1.5～7.5mmol/L。
本发明提供的可稳定保存NADH的溶液，在加入螯合剂和防腐剂的基础上，搭配使用氯化盐，可明显提高NADH的稳定性，将保存NADH的溶液置于37℃下7天，其相对含量保持在92％以上；放置14天，其相对含量保持在85％以上，相比于使用低浓度Tris溶液的保存方法，稳定性更高。
缓冲盐的含量为50～200mmol/L，例如可以是50mmol/L、55mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、130mmol/L、150mmol/L、170mmol/L、180mmol/L或200mmol/L等。
优选地，所述缓冲盐包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾或3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)中的任意一种或至少两种的组合；其中典型但非限制性的组合包括：碳酸氢钠和碳酸氢钾；碳酸氢钠和氢氧化钾；碳酸氢钠和氢氧化钠等等组合。
优选为碳酸氢钠和/或氢氧化钠。
氯化盐的含量为50～300mmol/L，例如可以是50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、190mmol/L、210mmol/L、250mmol/L、280mmol/L或300mmol/L等。
优选地，所述氯化盐包括氯化钠、氯化钡、氯化钙或氯化钾中的任意一种或至少两种的组合；优选为氯化钾。
在本发明中，氯化盐是提升NADH稳定性的关键物质。氯化盐常见的作用是调节电解质平衡、调节渗透压、生产肥料等，还没有任何研究表面氯化盐搭配上述缓冲盐可大大提升NADH的稳定性。如果溶液中缺少了氯化盐，NADH保存的稳定性会大幅下降。并且效果最佳的氯化盐为氯化钾。
本发明通过加入氯化盐后可在较高缓冲浓度(50～200mmol/L)维持NADH的稳定，增加了应用范围。
螯合剂的含量为1.5～7.5mmol/L，例如可以是1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L、5.5mmol/L、6mmol/L、6.5mmol/L或7mmol/L等。
优选地，所述螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸三钠或二乙基三胺五乙酸五钠中的任意一种或至少两种的组合；优选为乙二胺四乙酸二钠。
优选地，所述可稳定保存NADH的溶液还包括防腐剂2～10mmol/L，例如可以是2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L或10mmol/L等。
优选地，所述防腐剂为叠氮化钠。
优选地，所述溶液的pH值为9.2-10.0，例如可以是9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0等。
优选地，所述溶液的pH值为9.6。
在本发明中，当溶液的pH值控制在9.6时，NADH的保存效果最佳；而当溶液的pH值有所改变后，NADH的保存效果会有一定程度的下降。
优选地，所述可稳定保存NADH的溶液，NADH的保存量为0.15～10mmol/L，优选为0.3～0.5mmol/L。
在本发明中，每1L上述溶液，NADH的保存量控制在上述范围内，保存量过高会出现氧化现象，保存量过低会造成溶液的利用率不高。因此，保存时要控制NADH在合理的浓度范围内。
作为优选技术方案，所述可稳定保存NADH的溶液，包括以下组分：缓冲盐50～200mmol/L，氯化盐50～300mmol/L，螯合剂1.5～7.5mmol/L，防腐剂2～10mmol/L；溶液的pH值为8.2-10.0，NADH的保存量为9.2-10.0mmol/L。
作为优选技术方案，所述可稳定保存NADH的溶液，包括以下组分：碳酸氢钠50～200mmol/L，氯化钾50～300mmol/L，乙二胺四乙酸二钠1.5～7.5mmol/L，叠氮化钠2～10mmol/L；溶液的pH值为9.6，NADH的保存量为0.3～0.5mmol/L。
本发明还提供了一种NADH试剂盒，所述NADH试剂盒包括如上所述的可稳定保存NADH的溶液。
本发明提供的NADH试剂盒由于使用的上述保存NADH的溶液，因此试剂盒的保质期时间长，能够用于测定相关代谢物或酶的活性、浓度等等。例如对于测定尿素、总胆汁酸、丙氨酸、天冬氨酸等物质的检测诊断。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的可稳定保存NADH的溶液，在加入螯合剂和防腐剂的基础上，搭配使用氯化盐，可明显提高NADH的稳定性，将保存NADH的溶液置于37℃下7天，其相对含量保持在92％以上；放置14天，其相对含量保持在85％以上，相比于使用低浓度Tris溶液的保存方法，稳定性更高，持效性更长，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种可稳定保存NADH的溶液，包括以下组分：碳酸氢钠100mmol/L，氯化钾100mmol/L，乙二胺四乙酸二钠2mmol/L，叠氮化钠3mmol，NADH的保存量为0.4mmol/L，pH值为9.6。
实施例2
本实施例提供一种可稳定保存NADH的溶液，包括以下组分：碳酸氢钾200mmol/L，氯化钾300mmol/L，乙二胺四乙酸二钠7.5mmol/L，叠氮化钠10mmol/L，NADH的保存量为0.5mmol/L，pH值为9.6。
实施例3
本实施例提供一种可稳定保存NADH的溶液，包括以下组分：碳酸氢钠50mmol/L，氯化钾50mmol/L，乙二胺四乙酸二钠1.5mmol/L，叠氮化钠2mmol/L，NADH的保存量为0.3mmol/L，pH值为9.6。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中将碳酸氢钠替换为CAPSO，其余均与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中溶液的pH值为9.2，其余均与实施例1相同。
实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中溶液的pH值为10.0，其余均与实施例1相同。
实施例7
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中将氯化钾替换为氯化钠，其余均与实施例1相同。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中不包括氯化钾，其余均与实施例1相同。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中不包括氯化钾且将碳酸氢钠替换为CAPSO，其余均与实施例1相同。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中将碳酸氢钠替换为Tris，其余均与实施例1相同。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中将碳酸氢钠替换为Tris且不包括氯化钾，其余均与实施例1相同。
性能测试：
NADH的测定：使用摩尔吸光系数630m2/mol，采用生化分析仪或紫外分光光度计在波长340nm处测定溶液中的NADH含量。
将上述溶液放置于37℃进行加速试验，测定结果是相对于同时配制放置于2-8℃溶液的NADH量的百分比。具体结果如表1所示：
表1
通过实施例1-3与实施例4的对比可知，缓冲盐选用碳酸盐的效果更好；通过实施例5和实施例6的对比可知，pH控制为9.6时，保存NADH的效果最佳；通过实施例7的对比可知，氯化盐中选用氯化钾的效果更优异。
通过对比例可知，本发明相比使用Tris缓冲液保存NADH的效果更好；而当溶液中不包括氯化盐时，NADH的保存效果下降。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的可稳定保存NADH的溶液及试剂盒，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种可稳定保存NADH的溶液，其特征在于，所述可稳定保存NADH的溶液包括以下组分：缓冲盐50～200mmol/L，氯化盐50～300mmol/L，螯合剂1.5～7.5mmol/L。
2.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述缓冲盐包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾或3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸中的任意一种或至少两种的组合；
优选为碳酸氢钠和/或氢氧化钠。
3.根据权利要求1或2所述的溶液，其特征在于，所述氯化盐包括氯化钠、氯化钡、氯化钙或氯化钾中的任意一种或至少两种的组合；优选为氯化钾。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的溶液，其特征在于，所述螯合剂包括乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸三钠或二乙基三胺五乙酸五钠中的任意一种或至少两种的组合；优选为乙二胺四乙酸二钠。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的溶液，其特征在于，所述可稳定保存NADH的溶液还包括防腐剂2～10mmol/L；
优选地，所述防腐剂为叠氮化钠。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液的pH值为9.2-10.0；
优选地，所述溶液的pH值为9.6。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的溶液，其特征在于，所述可稳定保存NADH的溶液，NADH的保存量为0.15～10mmol/L，优选为0.3～0.5mmol/L。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的溶液，其特征在于，包括以下组分：缓冲盐50～200mmol/L，氯化盐50～300mmol/L，螯合剂1.5～7.5mmol/L，防腐剂2～10mmol/L；溶液的pH值为8.2-10.0，NADH的保存量为9.2-10.0mmol/L。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的溶液，其特征在于，包括以下组分：碳酸氢钠50～200mmol/L，氯化钾50～300mmol/L，乙二胺四乙酸二钠1.5～7.5mmol/L，叠氮化钠2～10mmol/L；溶液的pH值为9.6，NADH的保存量为0.3～0.5mmol/L。
10.一种NADH试剂盒，其特征在于，所述NADH试剂盒包括如权利要求1-9中任一项所述的可稳定保存NADH的溶液。
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