CN102492768A

CN102492768A - 一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法

Info

Publication number: CN102492768A
Application number: CN2011104058027A
Authority: CN
Inventors: 孙大尼; 李焱; 王福进; 管利丰
Original assignee: SHANGHAI GAOFENG TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI GAOFENG TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2012-06-13

Abstract

本发明涉及一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，包括：(1)将尿素按质量体积比1g∶2～3ml加入过氧化氢溶液中，再加入反应稳定剂，加热至50℃～60℃，搅拌至完全溶解，反应30～40分钟，放置在冰浴中得到过氧化尿素结晶体，过滤、干燥；(2)将上述过氧化尿素制作成纸片、片剂或粉剂，在样品中加入过氧化尿素，观察气泡的产生情况，即能得到过氧化氢酶测试结果。本发明过氧化尿素比过氧化氢保存和使用更安全，含量可以预控，不需要临时现配现用，因此简易、方便，可以提高工作效率。

Description

一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法

技术领域

本发明属于过氧化氢酶测试领域，特别涉及一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法。

背景技术

过氧化氢酶是一种广泛存在于各类生物体中的酶，它是一类抗氧化剂，其作用是催化过氧化氢转化为水和氧气的反应。过氧化氢酶是具有最高转换数(与底物反应速率)的酶之一；有关文献报道，一个过氧化氢酶分子可以每秒将数百万个过氧化氢分子转化为水和氧气。过氧化氢酶在1811年由泰纳尔(Louis Jacques Thénard)首次发现。1900年，Oscar Loew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶(简写CAT)，并发现这种酶存在于许多植物和动物中。1937年，詹姆斯·B·萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶。1969年，牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。1981年，其三维结构得到解析。

过氧化氢酶完整的催化机制目前还没有完全被了解，但其催化过程被认为分为两步：

H₂O₂+Fe(III)-E→H₂O+O＝Fe(IV)-E(.+)

H₂O₂+O＝Fe(IV)-E(.+)→H₂O+Fe(III)-E+O₂

其中，“Fe()-E”表示结合在酶上的血红素基团(E)的中心铁原子(Fe)。Fe(IV)-E(.+)为Fe(V)-E的一种共振形式，即铁原子并没有完全氧化到+V价，而是从血红素上接受了一些“支持电子”。因而，反应式中的血红素也就表示为自由基阳离子(.+)。

过氧化氢酶的存在，在动植物体内可以起到清除细胞老化或者感染时产生的H₂O₂和某些有害物质的作用，细胞毒性物质，如甲醛、甲酸、_苯酚和乙醇。这些氧化过程需要利用过氧化氢通过以下反应来完成：

H₂O₂+H₂R→2H₂O+R

过氧化氢，俗称双氧水，分子式H₂O₂，是除水外的另一种氢的氧化物。过氧化氢的化学性质不稳定，一般以30％的水溶液形式低温存放。过氧化氢是非常强的氧化剂，它和其他氧化剂的标准电极电势值较高，越高代表氧化性越强。

过氧化氢可自发分解歧化生成水和氧气：

2H₂O₂→2H₂O+O₂

该反应在热力学上自发进行：ΔHo为-98.2kJ·mol^-1，ΔGo为-119.2kJ·mol^-1，ΔS为70.5J·mol^-1·K^-1。重金属离子Fe²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺等对过氧化氢的分解有催化作用。过氧化氢在酸性和中性介质中较稳定，在碱性介质中易分解。过氧化氢有很强的氧化性，同时具弱酸性。尤其是在波长为320～380nm的光照射下会使过氧化氢分解速度加快，故过氧化氢保存条件比较严格。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，该方法过氧化尿素含量可以预控，不需要临时现配现用，因此简易、方便，可以提高工作效率。

本发明的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，包括：

(1)将尿素按质量体积比1g∶2～3ml加入过氧化氢溶液中，再加入反应稳定剂，加热至50℃～60℃，搅拌至完全溶解，反应30～40分钟，放置在冰浴中得到过氧化尿素结晶体，过滤、干燥；

(2)将上述过氧化尿素制作成纸片、片剂或粉剂，在样品中加入过氧化尿素，观察气泡的产生情况，即能得到过氧化氢酶测试结果。

所述步骤(1)中过氧化氢溶液体积百分比浓度为30％。

所述步骤(1)中反应稳定剂为磷酸二氢钠或者焦磷酸钠。

所述步骤(2)中产生气泡时加入表面活性剂，增大气泡并维持气泡更长时间。

所述步骤(2)中产生气泡时加入颜料，使反应结果清晰可见。

所述步骤(2)中加入过氧化尿素后通过添加氧化还原反应指示剂，得到定量或半定量的测定结果。

所述步骤(2)中加入过氧化尿素后对产生的氧气进行气体容量测定，得到定量或半定量的测定结果。

所述步骤(2)中纸片、片剂或粉剂用于酶标记反应的方法，通过酶标仪进行酶标定量测定试验。

过氧化氢尿素又称过碳酰胺、过氧化碳酰胺，它是尿素和过氧化氢所形成的加合物。外观为白色结晶粉末，无毒无气味，H₂O₂含量可以达到35.0％，它易溶于水，水溶液具有双氧水的性质。在水中分解为尿素、H₂O₂和原子氧，原子氧可以生成氧气。其活性氧含量高，在水中的溶解度大，水溶液pH值近中性，稳定性好，效用时间长，无副作用，无毒无公害，是一种具有过氧化氢作用的稳定和容易使用和保存的化合物。

本方法和相关试剂可以应用于广泛存在于动物、植物和微生物的组织细胞中的过氧化物酶的测定，同时也在工农业产品的生产和保存中有广泛的应用，例如牛奶的保鲜、纺织品的加工过程中会应用过氧化物酶及其是否过量的测定；另外，在大自然的水质、土壤和大气污染的测定中，过氧化物酶的测定也有所应用。本发明对这些领域的研究和使用会有一定的帮助。

有益效果

(1)过氧化氢是一种液体的危险品，性质不稳定，不利于保存和使用，而过氧化尿素是一种固体物质，性质比较稳定，使用方便；

(2)本发明同等体积或者同等重量的过氧化尿素含有的过氧化氢量要超过双氧水中的过氧化氢含量；

(3)本发明根据不同需要和相应装置，过氧化尿素可以制备成定量、半定量制剂；

(4)本发明根据不同需要和用途，可以制成多种剂型：纸型和片型，含量可以预控，不需要临时现配现用，因此简易、方便，可以提高工作效率；

(5)本发明便于现场使用，可以发展为“床边试剂”。

附图说明

图1为实施例1测定装置结构图；其中，1为测定管，2为测定反应制片；

图2为实施例2测定装置结构图；其中，1为奶牛乳液现场取样器，上面附有4个测定管固定装置，可以固定4个测定管，2为测定管，管中底部放置测定反应纸片；

图3为实施例4测定装置结构图；其中，1为气泡体积的反应管，2为管壁上的刻度，3为标示加样的位置线，4为反应片剂(或纸片)；

图4为实施例6测定装置结构图；其中，1为测定反应纸片的位置；2为测定反应塑料板块；3为放置反应指示剂层析纸片的凹槽；4为测定反应纸片；5为用于测定反应纸片和反应指示剂层析纸片的连接片；6为反应指示剂层析纸片。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例测定装置见附图1。

制备方法包括：使用100克尿素(CP)，加入208毫升30％过氧化氢溶液，再加入焦磷酸钠，加热至50℃，搅拌至完全溶解，反应30分钟，放置在冰浴中得到过氧化尿素结晶体，过滤、干燥，将上述过氧化尿素制作成纸片。

测定方法是，取哺乳母亲乳汁约5ml，在实验室取100μl加入到装有反应纸片的塑料反应管中，观察气泡的产生情况。

实施例2

本实施例测定装置见附图2。

制备方法包括：使用100克尿素(CP)，加入298毫升30％过氧化氢溶液，再加入磷酸二氢钠，加热至60℃，搅拌至完全溶解，反应40分钟，放置在冰浴中得到过氧化尿素结晶体，过滤、干燥，将上述过氧化尿素制作成纸片。

用于现场测定方法是，在一块20-25cm见方的薄板上划为4个直径5-8cm区域，每个区域中设置一个塑料反应管的固定装置，上面分别固定一个塑料反应管，管中放置一片测定纸片。现场使用时，只需将奶牛的4个奶头的奶液挤入其中，多余部分任其流出，反应结果的判断同样是观察气泡的产生，气泡溢出越多说明奶液中的过氧化氢酶浓度越高。

实施例3

制备方法包括：使用100克尿素(CP)，加入208毫升30％过氧化氢溶液，再加入磷酸二氢钠，加热至50℃，搅拌至完全溶解，反应30分钟，放置在冰浴中得到过氧化尿素结晶体，过滤、干燥，将上述过氧化尿素制作成纸片。

测定方法是，取尿液约5ml，在实验室取100μl加入到装有反应纸片的塑料反应管中，观察气泡的产生情况。

实施例4

细菌和细菌种类的过氧化氢酶测定：过氧化氢酶检测是微生物鉴定细菌种类的主要检测手段之一，如果细菌中含有过氧化氢酶，则该细菌被认为是呈“过氧化氢酶阳性”菌。如staphylococcus和micrococcus。不含有过氧化物酶的细菌被认为是呈“过氧化物酶阴性”菌。如streptococcus和enterococcus。

本实施例测定装置见附图3。

制备方法包括：使用100克尿素(CP)，加入298毫升30％过氧化氢溶液，再加入焦磷酸钠，加热至60℃，搅拌至完全溶解，反应40分钟，放置在冰浴中得到过氧化尿素结晶体，过滤、干燥，将上述过氧化尿素制作成片剂。

测定方法是：将该被测细菌培养后，本实施例采用试管法，在一个5ml试管中，放入测定过氧化物酶片剂(预制压片，根据需要，含有过氧化尿素约10-50mg)1-2片，然后将培养液加入500μl。观察气泡的产生。

此方法可以根据标准过氧化氢酶加入后气泡产生的高度作标定，然后和细菌加入后气泡产生的高度比较，得到定量或者半定量的结果。(需要掌握反应温度和时间)

实施例5

试管法测定植物组织中的过氧化氢酶：植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H₂O₂发生累积。H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H₂O₂，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H₂O₂含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。

测定时，首先要提取植物组织的酶液，一般可以采用植物的叶片，以生理盐水或者磷酸缓冲溶液应用浸出的方法提取。也可以经过纯化和浓缩。

制备方法包括：使用100克尿素(CP)，加入248毫升30％过氧化氢溶液，再加入磷酸二氢钠，加热至55℃，搅拌至完全溶解，反应35分钟，放置在冰浴中得到过氧化尿素结晶体，过滤、干燥，将上述过氧化尿素制作成片剂。

实施例6

过氧化氢酶的定量测试板块：按照附图4，可以制作显色法过氧化氢酶的定量测试板，过氧化氢酶纸片部分需要加入消泡剂，显色部分可以采用氧化还原反应指示剂，也可以采用pH指示剂。

Claims

1.一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，包括：

2.根据权利要求1所述的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，其特征在于：所述步骤(1)中过氧化氢溶液体积百分比浓度为30％。

3.根据权利要求1所述的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，其特征在于：所述步骤(1)中反应稳定剂为磷酸二氢钠或者焦磷酸钠。

4.根据权利要求1所述的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，其特征在于：所述步骤(2)中产生气泡时加入表面活性剂，增大气泡并维持气泡更长时间。

5.根据权利要求1所述的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，其特征在于：所述步骤(2)中产生气泡时加入颜料，使反应结果清晰可见。

6.根据权利要求1所述的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入过氧化尿素后通过添加氧化还原反应指示剂，得到定量或半定量的测定结果。

7.根据权利要求1所述的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入过氧化尿素后对产生的氧气进行气体容量测定，得到定量或半定量的测定结果。

8.根据权利要求1所述的一种固相化底物的过氧化氢酶测试方法，其特征在于：所述步骤(2)中纸片、片剂或粉剂用于酶标记反应的方法，通过酶标仪进行酶标定量测定试验。