CN104914097A - 一种具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法 - Google Patents

Abstract

一种具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法，其步骤为：1)提取有机废弃物中粗胡敏酸组分；2)保外呼吸菌菌接种与扩繁培养；3)菌悬液离心；4)菌体重悬；5)粗胡敏酸组分的纯化；6)具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取与纯化；7)胡敏酸稳定还原能力的测定。本发明操作便捷、所提出胡敏酸纯度高，对有机废弃物资源化利用具有重要意义。

Description

一种具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法

技术领域

本发明属于固体废物处理与资源化技术领域，具体涉及一种有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的提取和还原能力的测定方法。

背景技术

有机废弃物在放置和处理过程中会形成胡敏酸类物质，相对于土壤来源的胡敏酸而言，有机废弃物来源的胡敏酸结构不稳定，其中一部分组分可以很快被微生物降解利用。除了作为微生物营养功能外，胡敏酸还可以被氧化和还原，作为电子穿梭体介导电子传递，促进环境介质中污染物的降解和转化。

胡敏酸稳定还原能力的测定具有重要意义，以生活垃圾堆肥产品为例，当将堆肥施入土壤后，其中一部分作为碳源被降解利用，剩下的部分作为电子穿梭体稳定得到或失去电子，作为氧化剂和还原剂，该部分对于土壤中污染物的降解和转化具有重要意义。

胡敏酸电子转移能力(即氧化和还原能力)的测定方法有电化学方法、Fe³⁺氧化法和H₂S还原法，在这些方法中，电化学方法可以方便快捷的测定胡敏酸的氧化和还原能力，但是它测定是总的氧化和还原能力，对于有机废弃物来源的不稳定的胡敏酸组分，无法确定其中稳定具有电子转移能力的胡敏酸的量及其电子转移能力。

一个可能的办法是，先将胡敏酸中不能稳定转移电子有机物组分降解掉，然后获得具有稳定电子转移能力的组分，再采用传统滴定化学或电化学方法测定具有稳定电子转移能力胡敏酸的还原能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的提取和还原能力的测定方法，以测定胡敏酸中能稳定进行还原能力的胡敏酸的还原能力。

为实现上述目的，本发明提供的有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法，其主要步骤为：

1)提取有机废弃物中粗胡敏酸组分：将NaOH和Na₄P₂O₇混合液加入有机废弃物中，室温下避光震荡，离心后取上清液，用HCl将上清液酸化至pH＝2，静置，离心弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀，直至洗出液无Cl^-检出，用磷酸氢二钠缓冲液将胡敏酸沉淀溶解；

2)保外呼吸菌菌接种与扩繁培养：在超净工作台下接种胞外呼吸细菌至LB液体培养基中，接种后避光摇床培养；

3)菌悬液离心：将培养好的菌悬液离心弃去上清液，保留菌体沉淀；

4)菌体重悬：往菌体沉淀中加入无机培养液，在漩涡振荡器中将菌体重悬，得菌悬液；

5)粗胡敏酸组分的纯化：将菌悬液加入步骤1提取出的粗胡敏酸溶液中，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液，随后向混合液中充氮气将瓶盖密封，避光摇床震荡培养得反应液；

6)具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取与纯化：将反应液过滤膜，收集滤液，用HCl调反应液的pH＝2，静置后离心，弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀至洗液无Cl^-检出后，用磷酸二氢钠缓冲液溶解胡敏酸沉淀，得胡敏酸溶液；

7)胡敏酸稳定还原能力的测定：往步骤6所得胡敏酸溶液加入步骤4中的菌悬液，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液。随后往混合液中充氮气将瓶盖密封，避光摇床震荡培养，得反应混合液，取部分反应混合液采用邻菲啰啉法测定混合液中Fe²⁺的含量，根据加入的Fe³⁺量与反应后生成的Fe²⁺量计算具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤7之后进行胡敏酸稳定还原能力的验证：将步骤7中所得的反应混合液剩余部分过滤膜，重复步骤6和7，再测定胡敏酸的还原能力，并重复数次，若数次测定值相差小于10％，即证明所测的为胡敏酸的稳定还原能力。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤1中的NaOH和Na₄P₂O₇混合液含有0.1M的NaOH和0.1M的Na₄P₂O₇。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤1中的NaOH和Na₄P₂O₇混合液是以固液比1g:10ml加入有机废弃物中。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤1和步骤6中的HCl为6M的HCl。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤2中的LB液体培养基经过高温灭菌处理。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤4中的无机培养液的组成为1500mg/L的NH₄Cl、600mg/L的NaH₂PO₄、100mg/L CaCl₂、100mg/L的KCl、2mg/L的MgCl₂、5mg/L的MnCl₂、1mg/L NaMoO₄，配置完后过0.22μm滤膜进行灭菌处理。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤5中菌悬液加入粗胡敏酸溶液中的混合体积比为1:1。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤5中柠檬酸铁的浓度为1mM，乳酸钠溶液的浓度为20mM。

所述的还原能力测定方法，其中，步骤7中反应混合液中Fe²⁺的含量测定方法如下：将反应混合液过0.22μm滤膜后，加入5ml邻菲啰啉溶液，摇匀并用无菌水定容至25ml，静置30min后，测定其510nm的吸光度值，并与FeSO₄标准曲线对比，计算其中Fe²⁺的含量。

本发明可以有效的将胡敏酸中不能稳定进行电子转移的组分降解去除，留下能稳定进行电子转移的部分，并测定胡敏酸中能稳定进行还原能力的胡敏酸的还原能力。

本发明对于堆肥产品质量评价、堆肥技术优化以及拓展堆肥产品应用均具有指导意义。

本发明操作便捷、筛选所得胡敏酸组分纯度高、筛选效果好。

附图说明：

图1是有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取及其还原能力测定流程图。

图2是厨余垃圾堆肥胡敏酸组分电子转移能力变化图；其中a为餐厨堆肥粗提胡敏酸组分电子转移能力变化图，b为餐厨堆肥稳定电子转移能力胡敏酸组分电子转移能力变化图。

具体实施方式

本发明的有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法中包括具有稳定还原能力胡敏酸的提取，主要步骤为：

1)有机废弃物中粗胡敏酸组分的提取：将NaOH和Na₄P₂O₇混合液以固液比1g:10ml加入有机废弃物中，室温下避光震荡16～24h，11000r/min离心10min后取上清液，随即用6M的HCl将上清液酸化至pH＝2，静置12h，11000r/min离心10min，弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀，直至洗出液无Cl^-检出，用磷酸氢二钠缓冲液将胡敏酸沉淀溶解。其中的NaOH和Na₄P₂O₇混合液含有0.1M的NaOH和0.1M的Na₄P₂O₇。

2)MR-1菌接种与扩繁培养：在超净工作台下接种胞外呼吸细菌MR-1至经过高温灭菌处理的LB液体培养基中，接种后避光摇床培养12～24h。

3)菌悬液离心：将培养好的菌悬液12000r/min下离心10min，弃去上清液，保留菌体沉淀。

4)菌体重悬：往菌体沉淀中加入无机培养液，在漩涡振荡器中将菌体重悬，得菌悬液。无机培养液的组成为1500mg/L的NH₄Cl、600mg/L的NaH₂PO4、100mg/L CaCl₂、100mg/L的KCl、2mg/L的MgCl₂、5mg/L的MnCl₂、1mg/L NaMoO₄，配置完后过0.22μm滤膜进行灭菌处理。

5)粗胡敏酸组分的纯化：将菌悬液加入步骤1提取出的粗胡敏酸溶液中，两者混合的体积比为1:1，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液，柠檬酸铁的浓度为1mM，乳酸钠溶液的浓度为20mM。随后往混合液中充氮气15～30min，充氮结束后将盖上盖子并采用封口膜将瓶盖密封，避光摇床震荡培养24h，得反应液。

6)具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取与纯化：将反应液过0.45μm滤膜，收集滤液，用6M的HCl将反应液pH调至pH＝2，静置12h后，12000r/min离心10min，弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀直至洗液不再有Cl^-检出后，用磷酸二氢钠缓冲液溶解胡敏酸沉淀，得胡敏酸溶液。

7)胡敏酸稳定还原能力的测定：往步骤6所得胡敏酸溶液加入步骤4中的菌悬液，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液。随后往混合液中充氮气15～30min，充氮结束后立即封盖并用封口膜将瓶盖密封，避光摇床震荡培养12h，得反应混合液，取反应混合液中的一部分，采用邻菲啰啉法测定混合液中Fe²⁺的含量，根据加入的Fe³⁺量与反应后生成的Fe²⁺量计算具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力。

反应混合液中Fe²⁺的含量测定方法如下：将反应混合液过0.22μm滤膜后，加入5ml邻菲啰啉溶液，摇匀并用无菌水定容至25ml，静置30min后，测定其510nm的吸光度值，并与FeSO₄标准曲线对比，计算其中Fe²⁺的含量。

8)胡敏酸稳定还原能力的验证：将步骤7中所得的反应混合液剩余部分过0.45μm滤膜，重复步骤6和7，在测定胡敏酸的还原能力，如此在重复一次，如果三次测定所得胡敏酸的还原能力值相差小于10％，即可证明所测的为胡敏酸的稳定还原能力。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

以餐厨垃圾堆肥为例，提取其中具有稳定还原能力的胡敏酸组分并对其还原能力进行测定和方法验证。

餐厨垃圾堆肥不同阶段胡敏酸样品提取：堆肥过程共47天，采集8次样品，编号1～8。按固液比1:10采用0.1M的NaOH和Na₄P₂O₇(1:1)混合液对样品胡敏酸进行浸提，摇床避光震荡24h。将混合液离心(11000r/min)10min，取上清液，随即用6M HCl对上清液进行酸化至pH＝2，静置12h，离心10min(11000r/min)，弃上清液，用超纯水冲洗离心管内的胡敏酸沉淀，直至洗出液无Cl^-检出。

试剂配制：

①配制LB液体培养基500ml并分装于2个三角瓶中，高压蒸汽灭菌，约2小时；

②配制1mM柠檬酸铁溶液500ml，将定容好的500ml柠檬酸铁溶液置于超声仪中温度控制在48-55℃以促进柠檬酸铁溶解；

③配制1g/L邻菲罗啉溶液500ml，同样将定容好的邻菲罗啉溶液置于超声仪中进行溶解；

④配制20mM乳酸钠溶液300ml，分装于2个150ml三角瓶中；

⑤配制无机培养液500ml，同样分装于2个三角瓶中；

⑥清洗、烘干厌氧瓶和比色管。

细菌接种与扩繁培养：将灭菌后的LB液体培养基和液体菌种储存管置于超净工作台内，紫外灭菌10-15min，移取200μL菌种母液至250mlLB液体培养基中，室温避光摇床培养12h。

厌氧瓶、比色管编号：对试验用厌氧瓶和比色管进行编号，使之与不同编号(包含空白对照)样品一一对应以提高试验效率。

试验药品与耗材的准备：主要包括：满压氮气瓶、50ml离心管、10ml注射器、0.22μm针头过滤器、10ml移液枪及枪头、1ml移液枪及枪头、封口膜和漩涡振荡器等。

菌悬液离心：将菌悬液分批次转移至50ml离心管中，并按顺序进行编号，12000r/min离心10min，弃去上清液。

无机培养液重悬：无机培养液过0.22μm滤膜并移至已弃去上清液的离心管中在漩涡振荡器中将菌体重悬。

稳定还原能力胡敏酸组分筛选试验：用10ml和1ml移液枪向编好号的厌氧瓶中分别移入重悬菌悬液、液体胡敏酸样品、柠檬酸铁和乳酸钠溶液。厌氧瓶充氮气30min，充氮结束后立即封盖并用封口膜将瓶盖缝隙封住，记下时间，避光摇床震荡培养24h。

反应液胡敏酸提取：将反应液过0.45μm滤膜，用6M HCl将反应液pH调至pH＝2，静置12h，离心(12000r/min)10min；用超纯水冲洗胡敏酸沉淀直至洗液不再有Cl^-检出，用磷酸盐缓冲液溶解胡敏酸沉淀，测定胡敏酸样品TOC。

稳定还原能力胡敏酸组分还原能力测定：用10ml和1ml移液枪向编好号的厌氧瓶中分别移入液体胡敏酸样品、柠檬酸铁和乳酸钠溶液。厌氧瓶充氮气30min，充氮结束后立即封盖并用封口膜将瓶盖缝隙封住，记下时间，避光摇床震荡培养12h。

反应液抽取与过滤：用注射器抽取反应液5ml过0.22μm滤膜，滤至已编好号的比色管中。

邻菲啰啉显色反应：用移液枪向装有滤液的比色管中加入5ml邻菲啰啉溶液，摇匀并用无菌水定容至25ml，静置30min。

硫酸亚铁标液配制：在邻菲啰啉显色反应发生期间配制硫酸亚铁标线，同时对紫外分光光度计进行校准和参数设定。

反应液样品紫外510nm吸光度测定：对样品进行吸光度测定前先对标线进行测定并计算R值，达到要求后再对样品进行吸光度(510nm)测定。

稳定还原能力胡敏酸还原能力能力计算：采用Excel软件对试验数据进行处理分析，计算胡敏酸稳定还原能力。

结果及说明

如图2所示，图2a为餐厨堆肥粗提胡敏酸组分电子转移能力变化图，图2b为餐厨堆肥稳定电子转移能力胡敏酸组分电子转移能力变化图，8个餐厨堆肥粗提胡敏酸组分电子转移能力在与胞外呼吸菌MR-1共培养过程中其电子转移能力在第8h后下降了近2/3；而图2b所示的餐厨堆肥稳定电子转移能力胡敏酸组分电子转移能力在与MR-1细菌共培养过程中其电子转移能力均高于本底值，其电子转移能力是粗提餐厨堆肥胡敏酸的近10倍，且呈现出一定升高趋势，充分说明本发明可以较为有效的筛选出餐厨堆肥稳定电子转移能力胡敏酸组分。

Claims (10)

1.一种具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法，其主要步骤为：

1)提取有机废弃物中粗胡敏酸组分：将NaOH和Na₄P₂O₇混合液加入有机废弃物中，室温下避光震荡，离心后取上清液，用HCl将上清液酸化至pH＝2，静置，离心弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀，直至洗出液无Cl^-检出，用磷酸氢二钠缓冲液将胡敏酸沉淀溶解；

2)保外呼吸菌菌接种与扩繁培养：在超净工作台下接种胞外呼吸细菌至LB液体培养基中，接种后避光摇床培养；

3)菌悬液离心：将培养好的菌悬液离心弃去上清液，保留菌体沉淀；

4)菌体重悬：往菌体沉淀中加入无机培养液，在漩涡振荡器中将菌体重悬，得菌悬液；

5)粗胡敏酸组分的纯化：将菌悬液加入步骤1提取出的粗胡敏酸溶液中，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液，随后向混合液中充氮气将瓶盖密封，避光摇床震荡培养得反应液；

6)具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取与纯化：将反应液过滤膜，收集滤液，用HCl调反应液的pH＝2，静置后离心，弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀至洗液无Cl^-检出后，用磷酸二氢钠缓冲液溶解胡敏酸沉淀，得胡敏酸溶液；

7)胡敏酸稳定还原能力的测定：往步骤6所得胡敏酸溶液加入步骤4中的菌悬液，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液。随后往混合液中充氮气将瓶盖密封，避光摇床震荡培养，得反应混合液，取部分反应混合液采用邻菲啰啉法测定混合液中Fe²⁺的含量，根据加入的Fe³⁺量与反应后生成的Fe²⁺量计算具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力。

2.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤7之后进行胡敏酸稳定还原能力的验证：将步骤7中所得的反应混合液剩余部分过滤膜，重复步骤6和7，再测定胡敏酸的还原能力，并重复数次，若数次测定值相差小于10％，即证明所测的为胡敏酸的稳定还原能力。

3.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤1中的NaOH和Na₄P₂O₇混合液含有0.1M的NaOH和0.1M的Na₄P₂O₇。

4.根据权利要求1或3所述的还原能力测定方法，其中，步骤1中的NaOH和Na₄P₂O₇混合液是以固液比1g:10ml加入有机废弃物中。

5.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤1和步骤6中的HCl为6M的HCl。

6.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤2中的LB液体培养基经过高温灭菌处理。

7.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤4中的无机培养液的组成为1500mg/L的NH₄Cl、600mg/L的NaH₂PO₄、100mg/LCaCl₂、100mg/L的KCl、2mg/L的MgCl₂、5mg/L的MnCl₂、1mg/L NaMoO₄，配置完后过0.22μm滤膜进行灭菌处理。

8.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤5中菌悬液加入粗胡敏酸溶液中的混合体积比为1:1。

9.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤5中柠檬酸铁的浓度为1mM，乳酸钠溶液的浓度为20mM。

10.根据权利要求1所述的还原能力测定方法，其中，步骤7中反应混合液中Fe²⁺的含量测定方法如下：将反应混合液过0.22μm滤膜后，加入5ml邻菲啰啉溶液，摇匀并用无菌水定容至25ml，静置30min后，测定其510nm的吸光度值，并与FeSO₄标准曲线对比，计算其中Fe²⁺的含量。