WO2023145872A1 - ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの安定化方法及び安定化用組成物 - Google Patents

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの安定化方法及び安定化用組成物 Download PDF

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WO2023145872A1
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nad
nicotinamide
sample
composition
measurement
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PCT/JP2023/002617
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由葵子 竹谷
寛和 松川
美子 砂原
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オリエンタル酵母工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method and composition for stabilizing nicotinamide adenine dinucleotide, and a method and kit for measuring nicotinamide adenine dinucleotide.
  • Nicotinamide adenine dinucleotide functions as an electron carrier in the cellular metabolism of aerobic respiration in many of the major redox reactions in vivo and plays an important role in maintaining the balance of redox homeostasis.
  • NAD adenine dinucleotide
  • Patent Document 1 discloses that the amount of metabolites such as NAD + in blood can be used as an index for determining the degree of human aging.
  • Non-Patent Document 3 discloses a simple quantification method using a microplate reader. In this method, it is described that the blood sample for NAD measurement is stable for 5 hours by suspending it in an extraction buffer and cooling it on ice after collecting it from a subject. That is, it has been shown that it is not preferable to keep the biological sample at room temperature or to keep it in ice for a long time in order to ensure the stability of the sample.
  • the NAD in biological samples is extremely unstable, and there is the problem that the samples cannot be stored for a long time even under refrigerated conditions. Especially in the case of whole blood specimens, it was necessary to immediately deproteinize the fresh blood after collection. In practice, however, it is often difficult to immediately measure NAD in a biological sample or perform deproteinization in a clinical setting where a biological sample is collected. Therefore, a method for simply stabilizing NAD in a biological sample is desired.
  • a method of stabilizing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) in a sample removed from a subject comprising: A method comprising a contacting step of contacting the sample with nicotinamide and/or a nicotinamide derivative.
  • a method comprising a contacting step of contacting the sample with nicotinamide and/or a nicotinamide derivative comprising: A method comprising a contacting step of contacting the sample with nicotinamide and/or a nicotinamide derivative.
  • the nicotinamide and/or nicotinamide derivative is nicotinamide, nicotinamide mononucleotide (NMN) and/or nicotinamide riboside (NR).
  • the nicotinamide and/or nicotinamide derivative comprises two or more compounds selected from the group consisting of nicotinamide, NMN and NR.
  • the final concentration of nicotinamide in the contacting step is 10 to 500 mM; ii) NMN has a final concentration of 1-100 mM; and/or iii) NR has a final concentration of 1-100 mM; The method according to (2) or (3).
  • a method for measuring NAD comprising the step of measuring NAD in a sample stabilized by the method according to any one of (1) to (6).
  • the method according to (7) further comprising the step of pretreating the sample prior to the step of measuring NAD.
  • the step of measuring NAD includes reacting the pretreated sample in a system comprising a dehydrogenase with NAD + as a coenzyme and its substrate, diaphorase, and a tetrazolium salt. the method of.
  • a composition used for stabilizing NAD in a sample comprising nicotinamide and/or nicotinamide derivatives.
  • composition according to (10), wherein the nicotinamide and/or nicotinamide derivative is nicotinamide, NMN and/or NR.
  • the composition according to (10) or (11), wherein the nicotinamide and/or nicotinamide derivative comprises two or more compounds selected from the group consisting of nicotinamide, NMN and NR.
  • the composition according to any one of (10) to (14), wherein the sample is the subject's whole blood or tissue fluid.
  • composition according to any one of (10) to (15), wherein the subject is human 17.
  • a NAD measurement kit comprising the composition according to any one of (10) to (17) and a reagent for measuring NAD in a sample.
  • the reagent for measuring NAD comprises a first test solution containing a dehydrogenase with NAD + as a coenzyme and a tetrazolium salt, and a second test solution containing a substrate for the dehydrogenase and diaphorase, ( 19) NAD measurement kit according to.
  • This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2022-011518, which is the basis of priority of this application.
  • a method and composition for stabilizing NAD in a biological sample can be provided. Moreover, according to the present invention, it is possible to provide a NAD measurement method and a NAD measurement kit for measuring the amount of NAD in a biological sample while the content is stable.
  • Fig. 4 is a line graph showing changes in content of NAD spiked into pooled human serum upon incubation at 25°C and 37°C with refrigeration. The relative value (%) of NAD concentration in serum under each incubation condition is shown, with the concentration at the time of NAD addition (0 hr) being 100%.
  • Fig. 10 is a line graph showing changes in NAD content in samples obtained by adding an NAD stabilizer or PBS to rat whole blood at refrigerated storage at 25°C. A shows the time course of the NAD concentration in the sample left still in refrigeration. B shows the change over time of the NAD concentration in the sample left still at 25°C.
  • Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) stabilization method 1-1 Configuration
  • the first embodiment of the present invention provides a method of stabilizing nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) in a biological sample removed from a subject (hereinafter also referred to as "NAD stabilization method").
  • the method for stabilizing NAD of this embodiment is characterized by including a contacting step of contacting a biological sample taken from a subject with nicotinamide and/or a nicotinamide derivative.
  • the method for stabilizing NAD of the present embodiment can suppress a decrease in the amount of NAD in a biological sample by coexistence of nicotinamide and/or a nicotinamide derivative with NAD.
  • subject refers to a mammalian animal. Mammals refer to animals belonging to the subphylum Mammalia, phylum Chordata, subphylum Mammalia, including humans and non-humans. , livestock animals such as sheep and goats, rodents such as mice and rats, and mammals kept in zoos. The subject herein is preferably human.
  • sample or “biological sample” is not particularly limited, but for example, a sample taken from a subject, such as blood (e.g., whole blood, serum, plasma), urine, feces, saliva, milk, interstitial fluid or cell extract, hair, perspiration, or a mixture thereof.
  • a preferred biological sample herein is whole blood or tissue fluid.
  • whole blood refers to whole blood that has been mixed with an anticoagulant immediately after collection so that blood clotting does not occur, unless otherwise specified.
  • anticoagulant dipotassium EDTA, disodium EDTA, heparin, trisodium citrate and the like are usually used, but any anticoagulant may be used.
  • nicotinamide adenine dinucleotide is an electron carrier that has a structure in which nicotinamide mononucleotide and adenosine are bound via a phosphate bond and functions as a coenzyme for oxidoreductase.
  • NAD has an oxidized form (NAD + ) and a reduced form (NADH) represented by the following formula (I), and the NAD described in this specification includes both the oxidized form and the reduced form.
  • the oxidized form is converted to the reduced form, and the reduced form to the oxidized form is converted by reactions occurring at the site of nicotinic acid amide, as shown in formula (II) below. This conversion reaction is reversible.
  • nicotinamide refers to a compound represented by the following formula (III).
  • nicotinamide derivative refers to a compound having a nicotinamide skeleton represented by formula (III). It is not particularly limited as long as it is a compound having a nicotinamide backbone, and examples thereof include nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide riboside (NR), including both oxidized and reduced forms thereof.
  • NNN nicotinamide mononucleotide
  • NR nicotinamide riboside
  • NNN nicotinamide mononucleotide
  • NR nicotinamide riboside
  • the NAD stabilization method of the present embodiment includes a contacting step of contacting a sample to be measured for NAD with nicotinamide and/or nicotinamide derivatives (hereinafter also referred to as “nicotinamides”).
  • the method of bringing the nicotinamides into contact with the sample is not particularly limited. It is possible to adopt a method of mixing an aqueous solution composition containing with the sample. In particular, it is preferable to employ a method of mixing an aqueous composition with a sample.
  • the nicotinamides to be used are not particularly limited as long as they are compounds having a nicotinamide skeleton, but nicotinamide, nicotinamide dimononucleotide (NMN) and/or nicotinamide riboside (NR) are particularly preferred. More preferably, two or more compounds selected from the group consisting of nicotinamide, NMN and NR. For example, a mixture of nicotinamide and NMN, a mixture of nicotinamide and NR, a mixture of NMN and NR can be used.
  • the final concentration of nicotinamide when mixed with the sample is preferably 10 to 500 mM.
  • the lower limit of the final concentration of nicotinamide is 10 mM or higher, 20 mM or higher, 30 mM or higher, 40 mM or higher, 50 mM or higher, 60 mM or higher, 70 mM or higher, 80 mM or higher, 90 mM or higher, 100 mM or higher, 150 mM or higher, 200 mM or higher, 250 mM or higher, 300 mM or higher.
  • the upper limit of the final concentration of nicotinamide is 500 mM or less, 450 mM or less, 400 mM or less, 350 mM or less, 300 mM or less, 250 mM or less, 200 mM or less, 150 mM or less, 100 mM or less, 90 mM or less, 80 mM or less, 70 mM or less, 60 mM or less, It can be 50 mM or less.
  • the final concentration of NMN when mixed with the sample is preferably 1 to 100 mM.
  • the lower limit of the final concentration of NMN is 1 mM or more, 2 mM or more, 3 mM or more, 4 mM or more, 5 mM or more, 6 mM or more, 7 mM or more, 8 mM or more, 9 mM or more, 10 mM or more, 15 mM or more, 20 mM or more, 25 mM or more, 30 mM or more, It can be 40 mM or more, 50 mM or more, 60 mM or more, 70 mM or more, 80 mM or more, or 90 mM or more.
  • the upper limit of the final concentration of NMN is 100 mM or less, 90 mM or less, 80 mM or less, 70 mM or less, 60 mM or less, 50 mM or less, 45 mM or less, 40 mM or less, 35 mM or less, 30 mM or less, 25 mM or less, 20 mM or less, 15 mM or less, and 10 mM. 9 mM or less, 8 mM or less, 7 mM or less, 6 mM or less, or 5 mM or less.
  • the final concentration of NR when mixed with the sample is preferably 1 to 100 mM.
  • the lower limit of the final concentration of NR is 1 mM or more, 2 mM or more, 3 mM or more, 4 mM or more, 5 mM or more, 6 mM or more, 7 mM or more, 8 mM or more, 9 mM or more, 10 mM or more, 15 mM or more, 20 mM or more, 25 mM or more, 30 mM or more, It can be 40 mM or more, 50 mM or more, 60 mM or more, 70 mM or more, 80 mM or more, or 90 mM or more.
  • the upper limit of the final concentration of NR is 100 mM or less, 90 mM or less, 80 mM or less, 70 mM or less, 60 mM or less, 50 mM or less, 45 mM or less, 40 mM or less, 35 mM or less, 30 mM or less, 25 mM or less, 20 mM or less, 15 mM or less, 10 mM. 9 mM or less, 8 mM or less, 7 mM or less, 6 mM or less, or 5 mM or less.
  • the NAD stabilization method of the present embodiment it was confirmed that the amount of NAD contained in a biological sample such as a whole blood specimen is stable for at least 24 hours under conditions of refrigerated storage or room temperature storage. . Since the method of the present embodiment can be achieved by a simple method such as mixing a composition containing nicotinamides with a collected sample, it can be performed at a clinical site immediately after sample collection (blood collection). Therefore, by using this method, a biological sample such as whole blood for NAD measurement can be transported from a clinical site to a laboratory under refrigerated or room temperature conditions, and NAD measurement can be performed at the laboratory. .
  • a second embodiment of the present invention provides a NAD measurement method.
  • the NAD measurement method of the present embodiment is characterized by comprising the step of measuring NAD in a sample stabilized using the method described in the section "1. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) stabilization method". and
  • the NAD measurement method of this embodiment enables more accurate quantification of the amount of NAD in vivo. Since the amount of NAD in the body can serve as an indicator of the degree of aging, it becomes possible to determine the degree of aging of a subject with higher accuracy.
  • the definitions of terms are the same as those described in the section "1. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) stabilization method”.
  • This embodiment includes a step of measuring NAD in a sample.
  • the sample Preferably, in this embodiment, before the step of measuring NAD in the sample, the sample stabilized using the method described in the section "1. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) stabilization method", It includes a step of performing pretreatment.
  • NAD Nicotinamide adenine dinucleotide
  • the sample pretreatment for example, protein removal treatment can be performed. Any known technique can be used as the technique for protein removal, and for example, protein denaturation precipitation can be used to remove protein.
  • the protein denaturation precipitation method involves adding a protein precipitant containing an organic solvent such as ethanol, acetone, or acetonitrile, or an acid such as trichloroacetic acid or perchloric acid to the sample, mixing the mixture, cooling, and then centrifuging. It refers to the method of performing and collecting the supernatant. Since NAD is easily decomposed particularly by the influence of protein derived from the sample, deproteinization is preferably performed.
  • an organic solvent such as ethanol, acetone, or acetonitrile
  • an acid such as trichloroacetic acid or perchloric acid
  • the method of measuring NAD is not particularly limited, gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS), liquid chromatography-mass spectrometry. (LC/MS), competitive immunoassay, enzymatic cycling method, and other known methods can be used.
  • GC/MS gas chromatography-mass spectrometry
  • LC/MS liquid chromatography-mass spectrometry.
  • competitive immunoassay enzymatic cycling method, and other known methods can be used.
  • a pretreated sample is combined with a dehydrogenase (eg, glucose dehydrogenase) with NAD + as a coenzyme and its substrate (eg, glucose), diaphorase and a tetrazolium salt (eg, WST- 8) can be reacted in a system.
  • a dehydrogenase eg, glucose dehydrogenase
  • NAD + as a coenzyme
  • diaphorase and a tetrazolium salt eg, WST- 8
  • the dehydrogenase that uses NAD + as a coenzyme is not particularly limited as long as it reacts with NAD + as a coenzyme.
  • glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, etc. are used. be able to.
  • the reaction concentration is preferably 50-5000 U/L, more preferably 100-3000 U/L or 250-2000 U/L.
  • Diaphorase also called NADH dehydrogenase
  • NADH dehydrogenase is known as an enzyme that uses NADH to reduce a tetrazolium salt to yield formazan, while simultaneously oxidizing NADH to yield NAD + .
  • the reaction concentration of diaphorase is preferably 100 to 5000 U/L, particularly 200 to 3000 U/L or 500 to 2000 U/L.
  • the tetrazolium salt that serves as a substrate for diaphorase is not particularly limited as long as it produces a water-soluble formazan upon reaction with diaphorase.
  • )-5-(2,4-disulfophenyl)2H-tetrazolium monosodium also referred to as WST-8
  • 2-(4-indophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium Available.
  • the above enzymatic cycling method can be easily performed using, for example, an existing automatic analyzer for clinical testing (eg Hitachi 7180 automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Tech)).
  • an existing automatic analyzer for clinical testing eg Hitachi 7180 automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Tech)
  • a method using a microplate reader described in Non-Patent Document 3 can also be used.
  • NAD Stabilizing Composition A third embodiment of the present invention is a composition used for stabilizing NAD in a biological sample (hereinafter also referred to as "NAD stabilizing composition").
  • the NAD-stabilizing composition of this embodiment is characterized by containing nicotinamide and/or a nicotinamide derivative. According to the NAD-stabilizing composition of the present embodiment, it is possible to stabilize the NAD concentration in a sample by bringing it into contact (mixing, dissolving) with the sample.
  • the NAD-stabilizing composition of the present embodiment can be used in the NAD-stabilizing method described in the section "1. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) stabilizing method". In this embodiment, unless otherwise specified, the definitions of terms are the same as those described in the section "1. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) stabilization method".
  • the NAD-stabilizing composition of the present embodiment contains nicotinamide and/or nicotinamide derivatives (nicotinamides) as an active ingredient, and if it is possible to bring the sample into contact with the active ingredient, the properties and the like are particularly Without limitation, it may be a solid composition such as solid or powder, or an aqueous composition containing nicotinamides. In particular, it is preferable to use an aqueous solution that can be easily mixed with the sample.
  • Nicotinamides contained in the NAD stabilizing composition are not particularly limited as long as they are compounds having a nicotinamide skeleton, but nicotinamide, NMN and/or NR are particularly preferred. More preferably, two or more compounds selected from the group consisting of nicotinamide, NMN and NR. For example, a mixture of nicotinamide and NMN, a mixture of nicotinamide and NR, a mixture of NMN and NR can be used.
  • the amount of nicotinamides contained in the NAD-stabilizing composition can be adjusted so that it reaches the desired final concentration when contacted (mixed, dissolved, etc.) with the sample.
  • the nicotinamide concentration in the composition may be 10 times the desired final concentration, and the sample and composition may be mixed at a volume ratio of 9:1.
  • the concentration of nicotinamides in the composition can be, for example, 100-5000 mM for nicotinamide, 10-1000 mM for NMN, and 10-1000 mM for NR.
  • the NAD stabilizing composition when the NAD stabilizing composition is an aqueous solution, the composition may optionally contain a pH buffer such as phosphoric acid, citric acid, Tris, MES, HEPES, PIPES, etc., in addition to nicotinamides as active ingredients. , a chelating agent such as EDTA, a surfactant, an antioxidant, an antiseptic, and the like.
  • the pH of the composition as an aqueous solution is preferably pH 3.0 to 8.0, more preferably pH 4.0 to 7.0, in consideration of the stability of nicotinamides.
  • the NAD stabilizing composition is a solid (solid, powder, etc.)
  • the composition may optionally contain a solubilizer, a pH buffer, a chelating agent, in addition to nicotinamides as active ingredients. , antioxidants, preservatives and the like, extenders, excipients and the like.
  • the pH of the mixture is preferably adjusted to pH 3.0 to 8.0, particularly pH 4.0 to 7.0.
  • NAD Measurement Kit A fourth embodiment of the present invention is a NAD measurement kit.
  • the NAD measurement kit of the present embodiment is characterized by comprising the composition described in the section "3.
  • NAD stabilizing composition and a reagent for measuring NAD.
  • the reagent for measuring NAD here is preferably a reagent for use in the NAD measuring method described in the section "2.
  • NAD measuring method In this embodiment, unless otherwise specified, the definitions of terms are the same as those described in the section "1. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) stabilization method".
  • the NAD measurement kit preferably further includes a pretreatment reagent for pretreating the sample.
  • a pretreatment reagent for example, a reagent for deproteinizing a sample can be used.
  • a protein denaturation precipitation method can be used as the protein removal treatment, and in this case, the pretreatment reagent is an organic solvent such as ethanol, acetone, acetonitrile, or a protein precipitant containing an acid such as trichloroacetic acid or perchloric acid. including.
  • the "reagent for measuring NAD (hereinafter also referred to as "NAD measurement reagent”)” is not particularly limited in terms of measurement principles, etc., as long as it is a reagent capable of quantifying NAD.
  • NAD measurement reagents suitable for known methods such as gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS), liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS), competitive immunoassay, and enzyme cycling can be used.
  • GC/MS gas chromatography-mass spectrometry
  • LC/MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • competitive immunoassay and enzyme cycling
  • enzyme cycling can be used.
  • NAD measurement reagents suitable for the enzymatic cycling method can be used.
  • the NAD measurement reagent preferably contains the following test solutions.
  • First test solution dehydrogenase (glucose dehydrogenase in formula (VI)) with NAD + as a coenzyme and tetrazolium salt (WST-8 in formula (VI))
  • Second reagent solution the dehydrogenase substrate (D-glucose in formula (VI)) and diaphorase
  • the first reagent solution and a sample containing NAD are mixed, and the second reagent solution is added thereto to react.
  • NAD in a sample can be quantified by measuring the absorbance at a wavelength near the maximum absorption wavelength of formazan over time and calculating the rate of increase in absorbance.
  • the NAD measurement reagent included in the kit preferably further includes a standard solution containing NAD at a known concentration (NAD standard solution).
  • a calibration curve can be prepared from the rate of increase in absorbance obtained by performing the same reaction as the sample with the NAD standard solution.
  • the NAD standard solution contains nicotinamide and/or a nicotinamide derivative for NAD stabilization, similar to the composition described in "3. NAD Stabilizing Composition" is preferred.
  • Phosphoric acid citric acid, Tris, MES, HEPES, pH buffers such as PIPES, chelating agents such as EDTA, surfactants, antioxidants, etc. Agents, preservatives and the like may be added.
  • the pH of the second reagent solution is preferably 7.5 to 9.0, particularly 7.5 to 8.5, in order to stabilize diaphorase.
  • the pH of the first test solution is preferably 5.0 to 7.4, particularly 6.0 to 7.4.
  • the NAD measurement kit includes a NAD stabilizing composition, a NAD measurement reagent, and a sample suitable for a measurement instrument (e.g., Hitachi 7180 automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Tech)). It may also include a storage container, device setup instructions, and the like.
  • a measurement instrument e.g., Hitachi 7180 automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Tech)
  • Hitachi 7180 automatic analyzer manufactured by Hitachi High-Tech
  • the NAD concentration of a sample was measured by the following procedure. (1) Deproteinization treatment Three times the volume of 0.4 M trichloroacetic acid solution was added to and mixed with the sampled sample, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After that, it was centrifuged and the supernatant was collected to obtain a NAD extract.
  • NAD measurement NAD in the extract was measured using a 7180 model Hitachi automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Tech Co., Ltd.). The measurement is performed using the first test solution (phosphate buffer (pH 7.0), 0.6 mM WST-8 and 1.7 U/mL glucose dehydrogenase (GLUCDH “Amano” 2 manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.)) and the second test solution ( A phosphate buffer (pH 7.8), 320 mM D-glucose, 15 U/mL diaphorase (Oriental Yeast No. 46445003) was set, and the following measurement parameters were used.
  • the NAD concentration of the sample was calculated from the NAD concentration-absorbance increase rate ( ⁇ Abs/min) calibration curve obtained in advance by measuring multiple NAD solutions with known concentrations.
  • Fig. 1 shows changes over time in the relative value (%) of NAD concentration in serum under each incubation condition, with the concentration at the time of NAD addition (0 hr) being 100%.
  • the NAD concentration was nearly zero percent within 2 hours. Even in the case of refrigerated storage, the concentration decreased to about half in 2 hours, and reached almost 0% within 20 hours.
  • NAD was shown to be in a highly labile state.
  • PBS pH 6.1
  • NAD extraction was performed on the sample after standing for a predetermined time in the same procedure as in Reference Example (1). For each extract, NAD measurement was performed in the same procedure as in Reference Example (2).
  • FIG. 2 shows the measurement results of each sample.
  • FIG. 2A shows the time course of NAD concentration in samples left in refrigeration.
  • FIG. 2B shows the time course of NAD concentration in the sample left at 25°C.
  • the control sample almost no NAD was detected when frozen and thawed, and the NAD concentration decreased by refrigerating and standing at 25°C.
  • the measurement sample containing the stabilizer the NAD concentration hardly decreased even after standing for 24 hours both in refrigeration and at 25 ° C. It was found that the NAD in the sample was stable. bottom.
  • Example 2 Stabilization test of NAD in blood by nicotinamide and NMN
  • Whole blood was collected from retired SD rats using a blood collection tube containing EDTA.
  • PBS (pH 6.0) containing nicotinamide and NMN at 10 ⁇ the concentrations shown in Table 1 was prepared as various 10 ⁇ stabilizers.
  • 450 ⁇ L of whole blood was placed in a 1.5 mL centrifugation tube, and 50 ⁇ L each of various 10 ⁇ stabilizers were added and mixed.
  • NAD was added to each tube so as to be 100 ⁇ M, and used as a measurement sample.
  • NAD extraction and NAD measurement were performed in the same manner as in Example 1 for each measurement sample after standing overnight at 25°C. Taking the concentration at the time of NAD addition (0 hr) as 100%, the relative value (%) of the NAD concentration of each measurement sample was calculated. Table 1 shows the results. It was confirmed that the greater the amount of nicotinamide and NMN added, the greater the amount of residual NAD.
  • Example 3 Stabilization test of NAD in blood by nicotinamide and NR Whole blood was collected from retired SD rats using a blood collection tube containing EDTA. PBS (pH 6.0) containing nicotinamide and NR at 10 times the concentration shown in Table 2 was prepared as various 10X stabilizers. 450 ⁇ L of whole blood was placed in a 1.5 mL centrifugation tube, and 50 ⁇ L each of various 10 ⁇ stabilizers were added and mixed. NAD was added to each tube so as to be 100 ⁇ M, and used as a measurement sample.
  • NAD extraction and NAD measurement were performed in the same manner as in Example 1 for each measurement sample after standing overnight at 25°C. Taking the concentration at the time of NAD addition (0 hr) as 100%, the relative value (%) of the NAD concentration of each measurement sample was calculated. Table 2 shows the results. It was confirmed that the greater the amount of nicotinamide and NR added, the greater the amount of residual NAD.
  • Example 4 NAD stabilization test in blood by NMN and NR Whole blood was collected from retired SD rats using a blood collection tube containing EDTA. PBS (pH 6.0) containing NMN and NR at 10x the concentrations shown in Table 3 were prepared as various 10x stabilizers. 450 ⁇ L of whole blood was placed in a 1.5 mL centrifugation tube, and 50 ⁇ L each of various 10 ⁇ stabilizers were added and mixed. NAD was added to each tube so as to be 100 ⁇ M, and used as a measurement sample.
  • NAD extraction and NAD measurement were performed in the same manner as in Example 1 for each measurement sample after standing overnight at 25°C. Taking the concentration at the time of NAD addition (0 hr) as 100%, the relative value (%) of the NAD concentration of each measurement sample was calculated. Table 3 shows the results. It was confirmed that the greater the amount of NMN and NR added, the greater the amount of residual NAD.
  • Example 5 Effect of pH on blood NAD stabilization
  • Whole blood was collected from retired SD rats using a blood collection tube containing EDTA.
  • PBS or citric acid solutions containing 2M nicotinamide (stabilizer 1) and 100 mM NMN (stabilizer 2) and exhibiting the respective pH values shown in Table 4 were prepared as various 10 ⁇ stabilizers.
  • 450 ⁇ L of whole blood was placed in a 1.5 mL centrifugation tube, and 50 ⁇ L each of various 10 ⁇ stabilizers were added and mixed.
  • NAD was added to each tube so as to be 100 ⁇ M, and used as a measurement sample.

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Abstract

生体試料中のＮＡＤを安定化させる方法及び組成物を提供する。　対象から取り出した試料に、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を接触させて、試料中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を安定化させる。

Description

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの安定化方法及び安定化用組成物
　本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを安定化させるための方法及び組成物、並びにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの測定方法及び測定用キットに関する。
　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、生体内でおもな酸化還元反応の多くにおいて、好気呼吸の細胞代謝の電子伝達体として機能し、酸化還元の恒常性のバランス維持に重要な役割を果たす、ピリジンヌクレオチドである。非特許文献１及び２に示されるように、ヒトの組織及び血漿中のＮＡＤは加齢とともに減少することが知られる。また、特許文献１には、ヒトの老化度を決定するための指標として、血中のＮＡＤ＋等の代謝物量を使用できることが開示されている。
　生体試料中のＮＡＤ濃度の測定方法として、非特許文献３には、マイクロプレートリーダーを用いた簡易な定量方法が開示されている。この方法において、ＮＡＤ測定用の血液試料は、対象から採取した後、抽出用緩衝液に懸濁して氷冷することで、５時間は安定であることが記載されている。すなわち、試料の安定性を確保するためには、生体試料を常温に置くこと、氷冷中で長時間置くことは好ましくないことが示されている。
特表２０１９－５０９４８９号公報
Hassina Massudi et al., PLoS One. 2012;7(7):e42357 James Clement et al., Rejuvenation Res 2019 Apr; 22(2): 121-130 柴田克己ら、ビタミン７５巻９号（９月）４５５－４６２頁（２００１）
　生体試料中のＮＡＤは非常に不安定であり、冷蔵条件下であっても試料の長時間の保管ができない、という問題がある。特に全血検体においては、採取後の新鮮血にすぐに除タンパク処理を行う必要があった。しかし、実際上、生体試料を採取する臨床現場で、直ちに生体試中のＮＡＤを測定や、除タンパク処理を行うことは困難である場合が多い。そのため、生体試料内のＮＡＤを簡便に安定化させる方法が望まれる。
　本発明は、生体試料中のＮＡＤを安定化させる方法及び組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、生体試料中のＮＡＤ量を、その含有量が安定した状態で測定するためのＮＡＤ測定方法及びＮＡＤ測定用キットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、生体試料中のＮＡＤに、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を接触させることで、生体試料中のＮＡＤ濃度が安定化することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
（１）対象から取り出した試料中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を安定化させる方法であって、
　前記試料に、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を接触させる接触工程を含む、方法。
（２）前記ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミド、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及び／又はニコチンアミドリボシド（ＮＲ）である、（１）に記載の方法。
（３）前記ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミド、ＮＭＮ及びＮＲからなる群から選択される二以上の化合物を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記接触工程における
　ｉ）ニコチンアミドの終濃度が１０～５００ｍＭである；
　ｉｉ）ＮＭＮの終濃度が１～１００ｍＭである；及び／又は
　ｉｉｉ）ＮＲの終濃度が１～１００ｍＭである；
　（２）又は（３）に記載の方法。
（５）前記試料が、対象の全血又は組織液である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記対象がヒトである、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の方法で安定化された試料中のＮＡＤを測定する工程を含む、ＮＡＤを測定する方法。
（８）ＮＡＤを測定する工程の前に、試料の前処理を行う工程をさらに含む、（７）に記載の方法。
（９）ＮＡＤを測定する工程が、前処理済みの試料を、ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素及びその基質、ジアホラーゼ及びテトラゾリウム塩を備える系で反応させることを含む、（８）に記載の方法。
（１０）ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を含む、試料中のＮＡＤの安定化に使用される、組成物。
（１１）前記ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミド、ＮＭＮ及び／又はＮＲである、（１０）に記載の組成物。
（１２）前記ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミド、ＮＭＮ及びＮＲからなる群から選択される二以上の化合物を含む、（１０）又は（１１）に記載の組成物。
（１３）水溶液である、（１０）～（１２）のいずれかに記載の組成物。
（１４）対象から取り出した試料中のＮＡＤの安定化に使用される、（１０）～（１３）のいずれかに記載の組成物。
（１５）前記試料が、対象の全血又は組織液である、（１０）～（１４）のいずれかに記載の組成物。
（１６）前記対象がヒトである、（１０）～（１５）のいずれかに記載の組成物。
（１７）（１）～（６）のいずれかに記載の方法に使用するための、（１０）～（１６）のいずれかに記載の組成物。
（１８）（１０）～（１７）のいずれかに記載の組成物と、試料中のＮＡＤを測定するための試薬とを含む、ＮＡＤ測定用キット。
（１９）試料の前処理を行うための前処理試薬を更に含む、（１８）に記載のＮＡＤ測定用キット。
（２０）前記ＮＡＤを測定するための試薬が、ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素とテトラゾリウム塩を含む第１試液と前記脱水素酵素の基質とジアホラーゼを含む第２試液とを含む、（１９）に記載のＮＡＤ測定用キット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-011518号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、生体試料中のＮＡＤを安定化させる方法及び組成物を提供することができる。また、本発明によれば、生体試料中のＮＡＤ量を、その含有量が安定した状態で測定するためのＮＡＤ測定方法及びＮＡＤ測定用キットを提供することができる。
ヒトプール血清中に添加したＮＡＤの冷蔵、２５℃及び３７℃でのインキュベーション時の含有量変化を示す折れ線グラフである。ＮＡＤ添加時（０ｈｒ）の濃度を１００％としたときの、各インキュベーション条件での血清中のＮＡＤ濃度の相対値（％）を示す。 ラット全血にＮＡＤ安定化剤又はＰＢＳを添加した検体における、冷蔵、２５℃でのＮＡＤの含有量変化を示す折れ線グラフである。Ａは、冷蔵で静置した試料中のＮＡＤ濃度の経時変化を示す。Ｂは、２５℃で静置した試料中のＮＡＤ濃度の経時変化を示す。
１．ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）安定化方法
１－１．構成
　本発明の第１の実施形態は、対象から取り出した生体試料中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を安定化させる方法（以下、「ＮＡＤ安定化方法」とも称する）を提供する。本実施形態のＮＡＤ安定化方法は、対象から取り出した生体試料にニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を接触させる接触工程を含む、ことを特徴とする。本実施形態のＮＡＤ安定化方法は、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体がＮＡＤと共存することにより、生体試料中のＮＡＤ量の低下を抑制することが可能である。
１－２．定義
　本明細書において「対象」とは、哺乳類動物を指す。哺乳類動物は、ヒト及びヒト以外を包含する、脊索動物門脊椎動物亜門哺乳網に属する動物を指し、例えば、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される哺乳類動物などが含まれる。本明細書における対象は、好ましくは、ヒトである。
　本明細書において「試料」又は「生体試料」は、特に限定されないが、例えば、対象から取り出した試料、例えば、血液（例、全血、血清、血漿）、尿、糞便、唾液、乳汁、組織液又は細胞抽出液、毛髪、汗、又はこれらの混合物とすることができる。本明細書において好ましい生体試料は、全血又は組織液である。ここでいう「全血」は、特に他の記載がない限り、血液凝固が生じないように、採血直後に抗凝固剤と混合された全血を指す。抗凝固剤としては、通常、ＥＤＴＡ２カリウム、ＥＤＴＡ２ナトリウム、ヘパリン、クエン酸３ナトリウム等が使用されるが、いずれの抗凝固剤を使用したものであってもよい。
　本明細書において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）とは、ニコチンアミドモノヌクレオチドとアデノシンとがリン酸結合を介して結合した構造を有し、酸化還元酵素の補酵素として機能する電子伝達体を示す。ＮＡＤには、下記式（Ｉ）で示される酸化型（ＮＡＤ＋）と還元型（ＮＡＤＨ）とが存在するが、本明細書に記載のＮＡＤは、酸化型及び還元型をいずれも包含する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　酸化型から還元型へ、及び還元型から酸化型へは、下記式（ＩＩ）に示す通り、ニコチン酸アミドの部位で生じる反応によって変換される。この変換反応は可逆的である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本明細書において、「ニコチンアミド」とは、下記式（ＩＩＩ）で示される化合物を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本明細書において、「ニコチンアミド誘導体」とは、式（ＩＩＩ）に示すニコチンアミド骨格を有する化合物を示す。ニコチンアミド骨格を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）が挙げられ、これらの酸化型及び還元型をいずれも包含する。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の酸化型は、下記式（ＩＶ）で示される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の酸化型は、下記式（Ｖ）で示される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
１－３．接触工程
　本実施形態のＮＡＤ安定化方法は、ＮＡＤの測定対象となる試料に、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体（以下、「ニコチンアミド類」とも称する）を接触させる、接触工程を含む。試料にニコチンアミド類を接触させる手法は、特に限定されないが、例えば、液状の試料の場合、ニコチンアミド類を含む固形状、粉末状等の固体組成物を試料に溶解する手法や、ニコチンアミド類を含む水溶液の組成物を試料と混合させる手法をとり得る。特に、水溶液の組成物を試料と混合させる手法をとることが好ましい。
　使用するニコチンアミド類は、ニコチンアミド骨格を有する化合物であれば特に限定されないが、特に、ニコチンアミド、ニコチンアミドジモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及び／又はニコチンアミドリボシド（ＮＲ）とすることが好ましい。さらに、ニコチンアミド、ＮＭＮ及びＮＲからなる群より選択される二以上の化合物とすることがより好ましい。例えば、ニコチンアミドとＮＭＮとの混合物、ニコチンアミドとＮＲとの混合物、ＮＭＮとＮＲとの混合物を使用することができる。
　ニコチンアミド類としてニコチンアミドを使用する場合、試料と混合する際のニコチンアミドの終濃度は、１０～５００ｍＭとすることが好ましい。ニコチンアミドの終濃度の下限は、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、２５０ｍＭ以上、３００ｍＭ以上とすることができる。また、ニコチンアミドの終濃度の上限は、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下とすることができる。ニコチンアミド類としてＮＭＮを使用する場合、試料と混合する際のＮＭＮの終濃度は、１～１００ｍＭとすることが好ましい。ＮＭＮの終濃度の下限は、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、２５ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上とすることができる。また、ＮＭＮの終濃度の上限は、１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下とすることができる。ニコチンアミド類としてＮＲを使用する場合、試料と混合する際のＮＲの終濃度は、１～１００ｍＭとすることが好ましい。ＮＲの終濃度の下限は、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、２５ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上とすることができる。また、ＮＲの終濃度の上限は、１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下とすることができる。
　本実施形態のＮＡＤ安定化方法を用いることで、例えば全血検体等の生体試料中に含まれるＮＡＤ量が、冷蔵保存又は室温保存の条件下で、少なくとも２４時間は安定することが確認できた。本実施形態の方法は、採取した試料にニコチンアミド類を含む組成物を混合する等の簡易な手法で達成できることから、試料採取（採血）の直後に臨床現場で行うことが可能である。そのため、この方法を用いることで、ＮＡＤ測定を行うための全血等の生体試料を、臨床現場から検査機関まで冷蔵条件又は室温条件で輸送し、検査機関でＮＡＤ測定を行うことが可能となる。
２．ＮＡＤ測定方法
　本発明の第２の実施形態は、ＮＡＤ測定方法を提供する。本実施形態のＮＡＤ測定方法は、「１．ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）安定化方法」の項に記載の方法を用いて安定化した試料中のＮＡＤを測定する工程を含む、ことを特徴とする。本実施形態のＮＡＤ測定方法は、生体内のＮＡＤ量をより正確に定量することを可能とする。生体内のＮＡＤ量は、老化度の指標となり得ることから、対象の老化度をより精度よく判定することが可能となる。本実施形態において、用語の定義は、特に記載のない限り、「１．ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）安定化方法」の項に記載の定義と共通する。
　本実施形態は、試料中のＮＡＤを測定する工程を含む。好ましくは、本実施形態は、試料中のＮＡＤを測定する工程の前に、「１．ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）安定化方法」の項に記載の方法を用いて安定化した試料について、前処理を行う工程を含む。試料の前処理としては、例えば、除タンパク処理を行うことができる。除タンパク処理の手法としては、公知の手法をいずれも使用できるが、例えば、タンパク質変性沈殿法による除タンパク処理を行うことができる。本明細書において、タンパク質変性沈殿法は、エタノール、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒、又はトリクロロ酢酸、過塩素酸等の酸を含むタンパク質沈殿剤を試料に加えて混合し、冷却した後に遠心分離を行い、上清を回収する手法を指す。ＮＡＤは、特に試料由来のタンパク質の影響により分解されやすいことから、除タンパク処理を行うことが好ましい。
　試料、好ましくは前処理済みの試料中のＮＡＤを測定する工程において、ＮＡＤを測定する手法は、特に限定されず、ガスクロマトグラフィー－質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、競合型イムノアッセイ、酵素サイクリング法等の公知の方法を使用できる。
　酵素サイクリング法を用いる場合、例えば、前処理済みの試料を、ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素（例えばグルコース脱水素酵素）及びその基質（例えば、グルコース）、ジアホラーゼ及びテトラゾリウム塩（例えばＷＳＴ－８）を備える系で反応させることができる。この系では、下記式（ＶＩ）に示す酵素サイクリング反応を生じる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（ＶＩ）に示す反応では、ＮＡＤ＋の存在下でグルコース脱水素酵素とグルコースが反応することで、ＮＡＤ＋が還元されてＮＡＤＨを生じる。一方、ＮＡＤＨの存在下でジアホラーゼとＷＳＴ－８が反応することで、ＮＡＤＨが酸化されて、ＮＡＤ＋を生じる。両酵素反応が生じることで、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨのサイクリング反応が生じる。その際、ＷＳＴ－８が還元されて生じる水溶性ホルマザンによる吸光度（極大吸収波長である４５０ｎｍに近い波長）を経時的に測定し、吸光度増加速度を算出する。予め、濃度既知のＮＡＤを含む標準液を用いて同様の反応を行い、ＮＡＤ濃度と吸光度増加速度とで検量線を作成しておくことで、試料から得られた吸光度速度を元に、試料のＮＡＤ濃度を算出することができる。
　ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素としては、ＮＡＤ＋を補酵素として反応する酵素であれば特に限定されないが、例えば、グルコース脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等を使用することができる。グルコース脱水素酵素を使用する場合、反応濃度は、５０～５０００Ｕ／Ｌ、特に１００～３０００Ｕ／Ｌ又は２５０～２０００Ｕ／Ｌとすることが好ましい。
　ジアホラーゼ（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼとも称する）は、ＮＡＤＨを用いてテトラゾリウム塩を還元してホルマザンを生じさせ、同時にＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ＋を生じる酵素として知られる。このような反応を生じさせる酵素であれば、その由来種や構造等は特に限定されないが、例えば、クロストリジウムクルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のジアホラーゼを使用することができる。ジアホラーゼの反応濃度は、１００～５０００Ｕ／Ｌ、特に２００～３０００Ｕ／Ｌ又は５００～２０００Ｕ／Ｌとすることが好ましい。
　ジアホラーゼの基質となるテトラゾリウム塩は、ジアホラーゼとの反応により水溶性ホルマザンを生じるものであれば特に限定されないが、例えば、２－（２－メトキシ－４－ニトロフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）２Ｈ－テトラゾリウム一ナトリウム（ＷＳＴ－８とも称する）、２－（４－インドフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム一ナトリウム、２－（４－インドフェニル）－３－（２，４－ジニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム一ナトリウムを使用できる。
　上記の酵素サイクリング法は、例えば、既存の臨床検査用自動分析装置（例えば、日立７１８０形自動分析装置（日立ハイテク社製））を使用して、簡易に実施することが可能である。あるいは、上記の酵素サイクリング法に代えて、非特許文献３に記載のマイクロプレートリーダーを使用する手法とすることもできる。
３．ＮＡＤ安定化組成物
　本発明の第３の実施形態は、生体試料中のＮＡＤの安定化に使用される組成物（以下、「ＮＡＤ安定化組成物」とも称する）である。本実施形態のＮＡＤ安定化組成物は、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を含むことを特徴とする。本実施形態のＮＡＤ安定化組成物によれば、試料と接触（混合、溶解）させることで、試料中のＮＡＤ濃度を安定化させることが可能である。
　本実施形態のＮＡＤ安定化組成物は、「１．ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）安定化方法」の項に記載のＮＡＤ安定化方法に使用することができる。本実施形態において、用語の定義は、特に記載のない限り、「１．ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）安定化方法」の項に記載の定義と共通する。
　本実施形態のＮＡＤ安定化組成物は、有効成分としてニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体（ニコチンアミド類）を含み、試料と有効成分とを接触させることが可能であれば、その性状等は特に限定されず、固形状、粉末状等の固体組成物であってもよく、また、ニコチンアミド類を含む水溶液の組成物であってもよい。特に、試料との混合が容易な水溶液とすることが好ましい。
　ＮＡＤ安定化組成物に含まれるニコチンアミド類は、ニコチンアミド骨格を有する化合物であれば特に限定されないが、特に、ニコチンアミド、ＮＭＮ及び／又はＮＲとすることが好ましい。さらに、ニコチンアミド、ＮＭＮ及びＮＲからなる群より選択される二以上の化合物とすることがより好ましい。例えば、ニコチンアミドとＮＭＮとの混合物、ニコチンアミドとＮＲとの混合物、ＮＭＮとＮＲとの混合物を使用することができる。
　ＮＡＤ安定化組成物に含まれるニコチンアミド類の量は、試料と接触（混合、溶解等）させたときに所望の終濃度となるように調整することができる。例えば、組成物を水溶液とした場合、組成物中のニコチンアミド濃度を所望の終濃度の１０倍の濃度として、試料と組成物を体積比９：１で混合してもよい。この場合、組成物中のニコチンアミド類の濃度は、例えば、ニコチンアミドの場合は１００～５０００ｍＭ、ＮＭＮの場合は１０～１０００ｍＭ、ＮＲの場合は１０～１０００ｍＭとすることができる。
　ＮＡＤ安定化組成物が水溶液である場合、該組成物には、有効成分となるニコチンアミド類とは別に、必要に応じてリン酸、クエン酸、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ等のｐＨ緩衝剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤等を含有させてもよい。水溶液としての前記組成物のｐＨは、ニコチンアミド類の安定性を考慮して、ｐＨ３．０～８．０とすることが好ましく、ｐＨ４．０～７．０とすることがより好ましい。
　ＮＡＤ安定化組成物が固体（固形物、粉末等）である場合、該組成物には、有効成分となるニコチンアミド類とは別に、必要に応じて、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、抗酸化剤、防腐剤等、増量剤、賦形剤等を含有させてもよい。固体としての前記組成物は、生体試料と混合した場合に、混合物のｐＨが、ｐＨ３．０～８．０、特にｐＨ４．０～７．０となるように調整されることが好ましい。
４．ＮＡＤ測定用キット
　本発明の第４の実施形態は、ＮＡＤ測定用キットである。本実施形態のＮＡＤ測定用キットは、「３．ＮＡＤ安定化組成物」の項に記載の組成物と、ＮＡＤを測定するための試薬とを含む、ことを特徴とする。ここでいうＮＡＤを測定するための試薬は、好ましくは、「２．ＮＡＤ測定方法」の項に記載のＮＡＤ測定方法に使用するための試薬である。本実施形態において、用語の定義は、特に記載のない限り、「１．ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）安定化方法」の項に記載の定義と共通する。
　本実施形態において、ＮＡＤ測定用キットは、好ましくは、試料を前処理するための前処理用試薬をさらに含む。前処理用試薬としては、例えば、試料の除タンパク処理のための試薬を使用することができる。除タンパク処理としては、タンパク質変性沈殿法を用いることができ、この場合、前処理用試薬は、エタノール、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒、又はトリクロロ酢酸、過塩素酸等の酸を含むタンパク質沈殿剤を含む。
　本実施形態において、「ＮＡＤを測定するための試薬（以下、「ＮＡＤ測定試薬」とも称する）」は、ＮＡＤの定量を実施できる試薬であれば、その測定原理等は特に限定されない。ガスクロマトグラフィー－質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、競合型イムノアッセイ、酵素サイクリング法等の公知の方法に適したＮＡＤ測定試薬を用いることができる。好ましくは、酵素サイクリング法に適したＮＡＤ測定試薬を用いることができる。
　酵素サイクリング法としては、例えば「２．ＮＡＤ測定方法」の項に記載の式（ＶＩ）に記載の原理を使用することができる。式（ＶＩ）に記載の原理を使用する場合、ＮＡＤ測定試薬は、以下の試液を含むことが好ましい。
　第１試液：ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素（式（ＶＩ）中ではグルコースデヒドロゲナーゼ）とテトラゾリウム塩（式（ＶＩ）中ではＷＳＴ－８）
　第２試液：前記脱水素酵素の基質（式（ＶＩ）中ではＤ－グルコース）とジアホラーゼ　第１試液とＮＡＤを含む試料とを混合させ、ここに第２試液を添加して反応させることで、式（ＶＩ）に示すような酵素サイクリング反応が生じる。当該反応によって、テトラゾリウム塩が還元されてホルマザンが生じる。このホルマザンの極大吸収波長近辺の波長の吸光度を経時的に測定して吸光度増加速度を算出することで、試料中のＮＡＤを定量することが可能である。
　本実施形態において、キットに含まれるＮＡＤ測定試薬には、さらに既知濃度のＮＡＤを含む標準液（ＮＡＤ標準液）が含まれることが好ましい。ＮＡＤ標準液で試料と同様の反応を行い、得られた吸光度増加速度から検量線を作成することができる。ＮＡＤ標準液を使用する場合、ＮＡＤ標準液は、ＮＡＤの安定化のために、「３．ＮＡＤ安定化組成物」に記載の組成物と同様に、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を含むことが好ましい。
　第１試液、第２試液及びＮＡＤ標準液には、必要に応じて、リン酸、クエン酸、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ等のｐＨ緩衝剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤等が添加されていてもよい。
　前記第２試液のｐＨは、ジアホラーゼを安定化させるために、ｐＨを７．５～９．０、特に７．５～８．５とすることが好ましい。一方、第１試液のｐＨは５．０～７．４、特に６．０～７．４とすることが好ましい。
　本実施形態において、ＮＡＤ測定用キットは、ＮＡＤ安定化組成物と、ＮＡＤ測定試薬に加えて、さらに、測定用機器（例えば、日立７１８０形自動分析装置（日立ハイテク社製））に適した試料収納容器、機器設定説明書等を備えていてもよい。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例］ＮＡＤの安定性試験（ヒトプール血清への添加回収試験）
　ヒトプール血清２２５０μＬにＮＡＤを５０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加して、冷蔵、２５℃及び３７℃でインキュベートした。インキュベート開始後、１、２及び１９時間の血清中のＮＡＤ濃度を測定した。
　試料（ここでは血清）のＮＡＤ濃度の測定は以下の手順で行った。
（１）除タンパク処理
　サンプリングした試料に対して、３倍容の０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液を添加混合して、室温で１０分間静置した。その後、遠心分離して上清を回収してＮＡＤ抽出液とした。
（２）ＮＡＤ測定
　抽出液中のＮＡＤは、７１８０形日立自動分析装置（日立ハイテク社製）を用いて測定した。測定は、第１試液（リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．６ｍＭ　ＷＳＴ－８及び１．７Ｕ／ｍＬ　グルコースデヒドロゲナーゼ(天野エンザイム社製ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ”２)を含む）及び第２試液（リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）、３２０ｍＭ　Ｄ－グルコース、１５Ｕ／ｍＬ　ジアホラーゼ（オリエンタル酵母社製　Ｎｏ．４６４４５００３）を含む）をセットして、以下の測定パラメーターを使用して行った。
　・分析方法　　　　　　　　・・・　レートＡ
　・測定波長（副／主）　　　・・・　６００ｎｍ／４５０ｎｍ
　・反応時間　　　　　　　　・・・　１０分間
　・測光ポイント　　　　　　・・・　２７－３４
　・試料液（ＮＡＤ抽出液）　・・・　２μＬ
　・Ｒ１試薬　　　　　　　　・・・　１２０μＬ
　・Ｒ２試薬　　　　　　　　・・・　４０μＬ
　すなわち、ＮＡＤ抽出液２μＬと第１試液１２０μＬを混合して３７℃で４．５分間インキュベートした後（測光ポイント１－１６）、第２試液４０μＬを添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。反応開始後８－１０分（測光ポイント２７－３４）の測定試料の吸光値から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。
　試料のＮＡＤ濃度は、濃度既知の複数のＮＡＤ溶液を測定して予め求めたＮＡＤ濃度－吸光度増加速度（△Ａｂｓ／ｍｉｎ）の検量線から算出した。
　ＮＡＤ添加時（０ｈｒ）の濃度を１００％としたときの、各インキュベーション条件での血清中のＮＡＤ濃度の相対値（％）の経時変化を図１に示す。２５℃及び３７℃で保管した場合、ＮＡＤ濃度は２時間以内でほぼゼロ％になった。冷蔵保存の場合も、２時間で約半分の濃度となり、２０時間以内でほぼゼロ％になった。血清中において、ＮＡＤは非常に不安定な状態であることが示された。
［実施例１］ＮＡＤ安定化剤による血中ＮＡＤ安定化試験（経時変化観察）
　ＳＤ系リタイアラットから、ＥＤＴＡ入り採血管を使用して全血を採取した。全血４５０μＬを１．５ｍＬ遠心チューブに入れ、１０×安定化剤（２Ｍ　ニコチンアミド、１００ｍＭ　ＮＭＮ、４０ｍｇ／ｍＬ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．１））５０μＬを直ちに添加混合して測定試料とした。全血検体に１０×安定化剤に代えてＰＢＳを加えたものをコントロール試料とした。測定試料及びコントロール試料は、直ちに－８０℃で凍結して保管した。凍結した各試料は、室温で約３０分間かけて融解し、よく混合した後、冷蔵と２５℃とでそれぞれ静置した。各条件の試験は、ｎ＝３で実施した。
　所定時間静置した後の試料について、参考例の（１）と同様の手順でＮＡＤ抽出を行った。各抽出液について、参考例の（２）と同様の手順でＮＡＤ測定を行った。
　各試料の測定結果を図２に示す。図２Ａは、冷蔵で静置した試料中のＮＡＤ濃度の経時変化を示す。図２Ｂは、２５℃で静置した試料中のＮＡＤ濃度の経時変化を示す。コントロール試料においては、凍結・融解した時点でＮＡＤのほとんどが検出できなくなっており、さらに冷蔵、２５℃に静置することで、ＮＡＤ濃度が減少していた。一方、安定化剤を含む測定試料においては、冷蔵、２５℃の両方で、２４時間静置した後もＮＡＤ濃度がほとんど減少しておらず、試料中のＮＡＤが安定して存在することが判明した。
［実施例２］ニコチンアミド及びＮＭＮによる血中ＮＡＤ安定化試験
　ＳＤ系リタイアラットから、ＥＤＴＡ入り採血管を使用して全血を採取した。ニコチンアミド及びＮＭＮを表１に示す濃度の１０倍濃度で含むＰＢＳ（ｐＨ６．０）を、各種１０×安定化剤として調製した。全血４５０μＬを１．５ｍＬ遠心チューブに入れ、各種１０×安定化剤をそれぞれ５０μＬ添加混合した。各チューブにＮＡＤを１００μＭとなるように添加して、測定試料とした。
　２５℃で一晩静置した後の各測定試料について、実施例１と同様にＮＡＤ抽出及びＮＡＤ測定を行った。ＮＡＤ添加時（０ｈｒ）の濃度を１００％として、各測定試料のＮＡＤ濃度の相対値（％）を算出した。結果を表１に示す。ニコチンアミド及びＮＭＮの添加量が多いほど、残存するＮＡＤ量が多くなることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例３］ニコチンアミド及びＮＲによる血中ＮＡＤ安定化試験
　ＳＤ系リタイアラットから、ＥＤＴＡ入り採血管を使用して全血を採取した。ニコチンアミド及びＮＲを表２に示す濃度の１０倍濃度で含むＰＢＳ（ｐＨ６．０）を、各種１０×安定化剤として調製した。全血４５０μＬを１．５ｍＬ遠心チューブに入れ、各種１０×安定化剤をそれぞれ５０μＬ添加混合した。各チューブにＮＡＤを１００μＭとなるように添加して、測定試料とした。
　２５℃で一晩静置した後の各測定試料について、実施例１と同様にＮＡＤ抽出及びＮＡＤ測定を行った。ＮＡＤ添加時（０ｈｒ）の濃度を１００％として、各測定試料のＮＡＤ濃度の相対値（％）を算出した。結果を表２に示す。ニコチンアミド及びＮＲの添加量が多いほど、残存するＮＡＤ量が多くなることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例４］ＮＭＮ及びＮＲによる血中ＮＡＤ安定化試験
　ＳＤ系リタイアラットから、ＥＤＴＡ入り採血管を使用して全血を採取した。ＮＭＮ及びＮＲを表３に示す濃度の１０倍濃度で含むＰＢＳ（ｐＨ６．０）を、各種１０×安定化剤として調製した。全血４５０μＬを１．５ｍＬ遠心チューブに入れ、各種１０×安定化剤をそれぞれ５０μＬ添加混合した。各チューブにＮＡＤを１００μＭとなるように添加して、測定試料とした。
　２５℃で一晩静置した後の各測定試料について、実施例１と同様にＮＡＤ抽出及びＮＡＤ測定を行った。ＮＡＤ添加時（０ｈｒ）の濃度を１００％として、各測定試料のＮＡＤ濃度の相対値（％）を算出した。結果を表３に示す。ＮＭＮ及びＮＲの添加量が多いほど、残存するＮＡＤ量が多くなることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例５］血中ＮＡＤ安定化へのｐＨの影響
　ＳＤ系リタイアラットから、ＥＤＴＡ入り採血管を使用して全血を採取した。２Ｍ　ニコチンアミド（安定化剤１）及び１００ｍＭ　ＮＭＮ（安定化剤２）を含み、かつ表４に示す各ｐＨ値を示すＰＢＳ又はクエン酸溶液を、各種１０×安定化剤として調製した。全血４５０μＬを１．５ｍＬ遠心チューブに入れ、各種１０×安定化剤をそれぞれ５０μＬ添加混合した。各チューブにＮＡＤを１００μＭとなるように添加して、測定試料とした。
　２５℃で一晩静置した後の各測定試料について、実施例１と同様にＮＡＤ抽出及びＮＡＤ測定を行った。ＮＡＤ添加時（０ｈｒ）の濃度を１００％として、各測定試料のＮＡＤ濃度の相対値（％）を算出した。結果を表４に示す。１０×安定化剤のｐＨについて、ｐＨ４．２９－ｐＨ７．１１の範囲では、血中ＮＡＤの安定化効果に大きな差異がないことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　本発明は、主に、臨床検査、体外診断用医薬品の産業分野において利用可能である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

  1. 　対象から取り出した試料中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を安定化させる方法であって、
    　前記試料に、ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を接触させる接触工程を含む、方法。
  2. 　前記ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミド、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及び／又はニコチンアミドリボシド（ＮＲ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記接触工程における
    　ｉ）ニコチンアミドの終濃度が１０～５００ｍＭである；
    　ｉｉ）ＮＭＮの終濃度が１～１００ｍＭである；及び／又は
    　ｉｉｉ）ＮＲの終濃度が１～１００ｍＭである；
    　請求項２に記載の方法。
  4. 　前記試料が、対象の全血又は組織液である、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の方法で安定化された試料中のＮＡＤを測定する工程を含む、ＮＡＤを測定する方法。
  7. 　ＮＡＤを測定する工程の前に、試料の前処理を行う工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　ＮＡＤを測定する工程が、
    　前処理済みの試料を、ＮＡＤ＋を補酵素とする脱水素酵素及びその基質、ジアホラーゼ及びテトラゾリウム塩を備える系で反応させることを含む、
    　請求項７に記載の方法。
  9. 　ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体を含む、試料中のＮＡＤの安定化に使用される、組成物。
  10. 　前記ニコチンアミド及び／又はニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミド、ＮＭＮ及び／又はＮＲである、請求項９に記載の組成物。
  11. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の方法に使用するための、請求項９又は１０に記載の組成物。
  12. 　請求項９又は１０に記載の組成物と、試料中のＮＡＤを測定するための試薬とを含む、ＮＡＤ測定用キット。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53107486A (en) * 1977-02-28 1978-09-19 Wako Pure Chem Ind Ltd Stabilized nadh aqueous solution
JPS54138596A (en) * 1978-04-01 1979-10-27 Behringwerke Ag Stabilized nicotineamideeadeninedinucleotide and its manufacture
JP2000007696A (ja) * 1998-06-25 2000-01-11 Iatron Lab Inc 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬
JP2003057235A (ja) * 2001-08-10 2003-02-26 Internatl Reagents Corp 物質の安定化方法
JP2020033288A (ja) * 2018-08-29 2020-03-05 株式会社シノテスト Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの安定化方法
JP2020048473A (ja) * 2018-09-26 2020-04-02 株式会社シノテスト Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの安定化法
WO2021192683A1 (ja) * 2020-03-27 2021-09-30 オリエンタル酵母工業株式会社 β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53107486A (en) * 1977-02-28 1978-09-19 Wako Pure Chem Ind Ltd Stabilized nadh aqueous solution
JPS54138596A (en) * 1978-04-01 1979-10-27 Behringwerke Ag Stabilized nicotineamideeadeninedinucleotide and its manufacture
JP2000007696A (ja) * 1998-06-25 2000-01-11 Iatron Lab Inc 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬
JP2003057235A (ja) * 2001-08-10 2003-02-26 Internatl Reagents Corp 物質の安定化方法
JP2020033288A (ja) * 2018-08-29 2020-03-05 株式会社シノテスト Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの安定化方法
JP2020048473A (ja) * 2018-09-26 2020-04-02 株式会社シノテスト Ｎａｄｈ及びｎａｄｐｈの安定化法
WO2021192683A1 (ja) * 2020-03-27 2021-09-30 オリエンタル酵母工業株式会社 β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUN YOSHINO; KATHRYNF. MILLS; MYEONGJIN YOON; SHIN-ICHIRO IMAI;: "Nicotinamide Mononucleotide, a Key NADIntermediate, Treats the Pathophysiology of Diet- and Age-Induced Diabetes in Mice", CELL METABOLISM, CELL PRESS, UNITED STATES, vol. 14, no. 4, 31 August 2011 (2011-08-31), United States , pages 528 - 536, XP028308487, ISSN: 1550-4131, DOI: 10.1016/j.cmet.2011.08.014 *

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