JPH03232498A - ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（以下、ＮＡＤＰ）（又はＮ　Ａ、　Ｄ　Ｐという）
を高い感度で測定する方法に関する。

Ｂ１発明の概要 本発明はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　１−（又はＮＡＤＰの測定方
法において、 グルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下、６６ＰＤＨ
という）に６−フオスフオゲルコン酸脱水素酵素（以下
、６　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｈという）を共存させろことにより
、 高い感度でＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ又はＮＡＤＰを測定する
ことを可能とする。

Ｃ０従来の技術 グルコースの６位のリン酸化物であるグルコース−６−
リン酸（以下、Ｇ６Ｆという）は、Ｇ６ＰＤＨにより脱
水素反応を受けることで、脱水素反応の補酵素であるＮ
ＡＤＰを還元しＮＡＤＰＨとすることが知られている。

従ってＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ又はＮＡＤＰの量を測定する
ことにより、Ｇ６Ｐの量や０６ＰＤＨの活性を知ること
かできる。更に、このことはＧ６Ｐ？Ｇ６ＰＤＨと関係
する様々な物質の量や酵素の活性を調べることに応用で
きることも意味する。そして実際に、この方法は生体内
の様々な微量成分の量や活性の測定に用いられている。

例えば赤血球中の０６ＰＤｌ＋の欠乏や異常は、溶血性
貧血を引き起こすことで有名であり、そのため赤血球中
や血液中のＧ　６　Ｐ　Ｄ　Ｊ−２活性測定が行われて
いる。

最近は早期老化症や白内障との関連性か追求されている
。また、体液中の０６ＰＤ）ｌ活性測定では心筋梗塞時
におけるＧ　６　Ｐ　Ｄ　Ｈ活性の上昇に、膣スメア中
の活性測定では該スメアにおける癌での活性上昇に、そ
れぞれ診断的価値が求められている。更に、このＧ　６
　Ｐ　Ｄ　Ｈは菌体より抽出され高度に純化された酵素
標品を用いることで、グルコースなどの化学物質の定量
やクレアチンキナーゼ（ＣＫ）などの酵素活性測定時の
共役酵素として、酵素的分析にも広く用いられている。

従ってＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰを高い感度で測定できれ
ば従来法では検出できなかった生体内、の様々な微量成
分量や活性を知ることができ、これにより種々の代謝異
常や病気の診断に貢献できる。

Ｄ１発明が解決しようとする課題 本発明はこのような背景に着目して創案されたものであ
って、 ０６　Ｐ　Ｄ　Ｉ−１に６　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｈを共存させ
ることにより、高い感度でＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ又はＮＡ
ＤＰを測定できる方法を提供するものである。

Ｅ１課題を解決するための手段及び作用即ち、本発明に
係る測定方法は、Ｇ６ＰとＧ６Ｐ　Ｄ　Ｈとの反応によ
るＮＡＤＰを測定することにより様々な物質を測定する
系において、前記Ｇ６Ｐに６　Ｇ　Ｐ　Ｄ　Ｈを共存さ
せること、をその解決手段としている。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明で使用するＧ　６　Ｐ　Ｄ　Ｈは解糖系やベント
ースリン酸回路を経て代謝されるＧ６ＰとＤ−グルコノ
−δ−ラクトン（以下、６ＰＧＬという）との反応を触
媒する酵素である（第１図参照）。

第１図に示すようにこの酵素の補酵素であるＮＡＤＰと
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈはこの反応中で可逆的に酸化・還元
され、それぞれ酸化型、還元型となる。

また、本発明で使用する６ＰＧＤＨは６−フォスフォグ
ルコン酸（以下、６ＰＧという）とりブロース５−リン
酸との反応を触媒する酵素である（第２図参照）。第２
図に示すようにＧ　６　Ｐ　Ｄ　［１と６ＰＣＤＨは共
に同一代謝経路で作用する酵素であり、かつＮＡＤＰと
ＮＡＤＰＨを補酵素とする点で共通している。従ってＮ
ＡＤＰ、ＮＡＤＰｌ（活性を測定することによりＧ６Ｐ
、６ＰＧＬ６ＰＧ、及びリブロース５−リン酸の虫、０
６ＰＤ　Ｉ−１及び６ＰＧＤＨ活性、これらの物質や酵
素に関与する様々な物質及び酵素９例えばＡＴＰ活性無
機リン酸量、ピルビン酸キナーゼ活性を知ることができ
る。

ところで、Ｇ　６　Ｐ　Ｄ　Ｈと６ＰＣＤＨは共にＮＡ
ＤＰとＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　）Ｉを補酵素とするため、これ
らの酵素を同時に又は連続的に共存させて作用さけるこ
とで２倍のＮＡＤＰＨを生成させろことができる。従っ
てＮ　Ａ、　Ｄ　Ｐ　Ｉ測定系における上記物質の量や
酵素活性の測定感度ら２倍となる。

なお、ＮＡＤＰとＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｉ−１を測定法と１
．では通常用いられろ方法９例えば発光分析法、好まし
くは生物発光法、化学発光法を挙げろことができろ。

Ｆ、実施例 以下、本発明に係るＮ　Ａ、　Ｄ　Ｐ又はＮ　Ａ　Ｄ　
Ｐ　ＩＴの測定方法の詳細な説明を実施例に基づいて説
明する。

Ａ同時測定法 表１に示した試薬Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを用いて次の方法に
よりＡＴＰａ度の測定した。

■まず、測定対象となるＡＴＰ溶液又はＡＴＰのスタン
ダード１００μｇに、試薬Ａを１ｍＬ試薬ｒ３を１００
μＱそれぞれ加え、３７℃で１０分間インキュベートし
た。

■次に、■でインキュベートしたサンプルをルミノメー
タＵＰＤ−８０００（（株）明電舎製）の測定バイアル
に！００μρ分取（１、試薬Ｃを５００ＢＱ加え、３０
秒後、装置の自動分注機能により試薬りを５００μＱ加
え、１秒〜１５秒の開発光を測定し１こ。

■更にＡＴＰのスタンダードの測定値から検量線を求め
、サンプル中のＡ　Ｔ　Ｐの濃度を計算した。

その結果を第３図に示す。第３図に示すように検量線の
直線域の測定範囲はＩ　Ｏ−’ｍｏｉ２／（！−１０ｔ
ｎｏＱ／Ｑであった。

表Ｉ　　ＡＴＰａ度の測定試薬 試薬Ａ：（１，５ｍｍｏぐ／Ｑ　　Ｍｇ（Ｊ’−０，２
ｍｍｏＱ／（！　ＮＡＤＰ ｌ　　　ｍｍｏｃ／１２　　グルコース０　、１　　ｍ
ｏＱ／Ｑ　　−ＨＣ（！　　緩衝液ｐＨ８、０試薬Ｂ；
トｉＫ／Ｇ６ＰＤＨ／６ＰＧＤＨ（各１５０ｍＵ／ｎ＋
（２）試ＸＣ：ｌ−メトキンー５−フエナノウムメチル
サルフエート（ＩＭＰＭＳ　）　５　Ｘ　Ｉ　Ｏ−”ｍ
ｏＱ＃水溶液試薬■）・イソルミノール ２　ｘ　Ｉ　Ｏ−’ｎｏ（！１０　；　０　、８　ｍｏ
（２／（ｌ炭酸緩衝液ｐ＋！９．５ｍ−ＰＯＤ　　Ｉ　
Ｘ　Ｉ　Ｏ−８ｍｏ（／（水溶液宋１１舛」ユ　無機リ
ン酸濃度の測定 表２に示した試薬Ｅ及び試薬Ｆを用いて次の方ｄ、によ
り無機リン酸濃度を測定した。

■まず、測定対象となるサンプル又はスタンダード１０
０μ（に、試薬Ｅを１ｍ１２．試薬Ｆを１００μＱそれ
ぞれ加え、３７℃でｌＯ分間インキユベートシた。

■次に実施例１と同様な方法により無機リン酸濃度を測
定した。その結果を第４図に示す。第４図に示すように
検量線の直線域の測定範囲は実施例１と同様に１．　Ｏ
”’ｍｏＱ／　１２〜Ｉ　Ｏ−’ｍｏ１２／　Ｑであっ
た。

表２　無機リン酸濃度の測定試薬 試薬Ｅ：１ｇ／ｆ！　　グリコーゲン １　　ｍｍｏｆ２／（２ＡＭＰ ０．５ｍｍｏＩ２／ｆ２　　ＭｇＣＣｔｏ、２ｍｍｏｆ
２／＆　　ＮＡＤＰ ｏ、１　　ｍｏＩ２／（ｌ　　トリス−ＨＣＱ　緩衝液
ｐｔ＋　８　、０試薬Ｆ：フォスホリラーゼａ／フオス
ホグルコムダンゼ／Ｇ６ＰＤ）（／６ＰＧＤＨ（各１５
０　ｍｕ／ｍＱ）実施例３　ピルビン酸キナーゼ活性の
測定表３に示した試薬Ｇおよび試薬Ｈを用いて次の方法
により赤血球中のピルビン酸キナーゼの活性を測定した
。

■まず、ヘパリン（１０単位／ｍ（ｌ血液）採血した静
脈血２ｍｆ２を、α−セルロースとミクロクロスタリン
セルロースを等量混和しへカラムを通し白血球と面小板
を除去した。

■次に１０倍容量の水冷生理食塩水で懸濁し遠沈した（
×２）。

■更にヘマトクリット（ｒｉ５０％の赤血球生理食塩水
浮遊液を作成した。

■加えて浮遊液に対し、ｌ：９の比率で試薬Ｇを加えた
。

■次にドライアイス−アセトンで凍結し、２０〜２５℃
水浴中で融解させ溶血さ仕た。

■更に試薬Ｇで洗ったセファデックスＧ−２５カラムを
通過させ、アロステリックエフェクターであるＦＤＰを
除き溶血液とした。

■次に、この溶血液１００μＱに試薬Ｈを９００μｇ加
え、３７°Ｃで１０分間インキュベートした。

■更に実施例１と同様な方法によりピルビン酸キナーゼ
活性を測定した。なお、盲検としてＡＤＰを含まない試
薬と反応させ比較した。

表３　ピルビン酸キナーゼ活性測定試薬試薬Ｇ　：　２
．７ｍｍｏＣ／ｆ２　　ＥＤ７１’Ａ　（ｐＨ１７，０
）０　、７　ｍｍｏｃＡ＋　　２−メルカプトエタノー
ル試薬Ｈ：０．５ｍｍｏ１２／１２　　ＥＤＴＡｏ、１
　　ｍｏ（１／（ｌ　　ＫＣ（！０　、１　　ｍｏｆ２
／１２　　Ｍｇ　Ｃｆ２゜０．２ｍｍｏｆ！／ＣＮＡＤ
Ｐ ５　　　ｍｍｏｆ！／（！　　Ａ　Ｄ　Ｐ０６ＰＤＨ／
６ＰＧＤＨ（各１５０ｍＵ／ｍ（り；０．１ ｏ４ＩＱ トリスートＩＣ（１ 緩衝液 Ｈ８ （ ）固定化に使用する緩衝液 ■緩衝液１ １Ｍリン酸緩衝液＋０ ５ＭＮａＣ（ （ｐＨ７ ０） ■緩衝液２ １Ｍトリス ＨＣＣ緩衝液＋０゜ ５　ＭＮａＣＱ（ｐＨ１８、Ｏ） ■緩衝液３ ０．１リン酸緩衝液（＋０ ０２％ＮａＮ５） （ｐＨ７ ０） （２）操作工程 ■担体の懸濁及び洗浄 カラム充てん担体としてＡＰ トレンルトヨバ 一ル６５０を緩衝液ｌに懸濁し、 グラスフィルタ ーで濾過して洗浄を行った。なお、懸濁１ａ過操作を合
計５回繰り返して行った。

■固定操作 ■で得られた洗浄を終了した担体と酵素調製液とをとき
とき撹拌しなから室温で２時間放置し、次に４°Ｃで一
昼夜放置して酵素固定終了担体を得た。

■残余活性基のブロッキング ■て得られた酵素固定終了担体をグラスフィルターで濾
過して洗浄し、次に緩衝ｔ＆２を用いてときどき撹拌し
ながら室温で２時間放置して残余活性基をブロッキング
した。

更にこのブロッキングをグラスフィルターで濾過（５て
、これを３回繰り返し洗浄した。

加えて洗浄した担体を緩衝液３に＠濁して固定化酵素を
完成した。

実施例Ａ　　ＡＴＰａ度の測定 実施例１の表１に示した試薬Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを用いて
次の方法によりＡ　Ｔ　Ｐ　ａ度を測定した。

まず、測定対象となるＡＴＰ溶液又はＡ　Ｔ　Ｐのスタ
ンダード１００μｇを、試薬Ａの流れるキャリア流路に
インジェクションし、カラム中で反応さけ、その後試薬
Ｂの流路と合流し、その後に試薬Ｃの流路と合わさせる
ことで、発光反応を起こさ仕、発光測定装置で測定した
。更にＡ　１’　ｒ）のスタンダードの測定値から検量
線を求め、サンプル中のＡ　Ｔ　Ｐの濃度を計算した。

この結果、検ｊｔ線の直線域の測定範囲は実施例１と同
様にＩ　Ｏ−’ｍｏＱ／　Ｑ〜ｌ　Ｏ−７ｍｏｃ／　Ｑ
であった。

なお、カラムの条件はＨＫｌｏ　６　Ｐ　Ｄ　１１／６
　ＰＣＤ　ＩＩをＡＦ−トレシルトヨバール６５０に固
定化した、固定化酵素を４　、　Ｏｕ＋φ×４０１のカ
ラムにしたものを用いた。比較対象としては上記カラム
の６　Ｐ　ＣＤ　Ｉ（を含まないものを調製して検討し
た。

よ叫　無機リン酸の測定 実施例１の表１に示した試薬りを用いて、次の方法によ
り無機リン酸濃度を測定した。

試薬Ａに代えて試薬り及び測定対象としてサンプルかス
タンダード１００μＱを用いる以外は実施例４と同様な
方法により無機リン酸濃度を測定した。

Ｐｌのスタンダードの測定値から検量線を求め、サンプ
ル中のＰｉの濃度を計算した。この結果、検量線の直線
域の測定範囲は１．０−’ｎｏｇ／　（！〜１０−７ｍ
ｏ（１／（！であり、実施例２と同一であった。なお、
カラム条件はＨＫに代えてフォスホリラーゼ１及びフォ
スホグルコムダーゼを用いる以外は実施例４に記載のカ
ラム条件と同一である。

〔；　発明の効果 本発明はＧ６Ｐの晴やＧ　６　Ｐ　Ｄ　ＩＩの活性を知
る／＝めにＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ｌ−（の量を測定すること
を括木とする様々な測定法において、更に６　Ｐ　ＣＤ
　Ｉ−（を共役さ０−ろことにより、２倍のＮ　Ａ　Ｄ
　Ｐ　Ｉ−１を発生さＵ。

ることかでき、これによりＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｉ＋の測定
感度を２倍にすることかできる。

従−）で本発明に係る方法によれば、次の効果が得られ
る。

（１）従来法では測定できなかった低濃度のサンプルで
も測定できる。

（２）高感度測定法であることから、大きい倍率の昂釈
が可能となりサンプル量か少なくてすむ。

（３）高感度化により、現在すでに測定可能な領域にお
し）て０測定精度が上がる。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来の測定法を示す原理図、第２図は本発明に
係る測定法を示す原理図、第３図はＡＴＰ　ａｌｘを示
すグラフ、第４図は無機リン酸濃度を示すグラフである
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルコース−６−リン酸とグルコース−６−リン
   酸脱水素酵素との反応によるニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドリン酸を測定することにより様々な物質を
   測定する系において、 前記グルコース−６−リン酸脱水素酵素に６−フォスフ
   ォグルコン酸脱水素酵素を共存させることを特徴とする
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の測定方
   法。