JPS63100376A - 分析測定における電子移動剤として置換オルト−キノン類を使用する組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学に関する。とくに、本発明は、成る
種の置換キノン電子移動剤を利用して水性液体（例えば
、生物学的流体）中の被検試料（例えば、生きている細
胞）を測定するための組成物および方法に関する。

以下全白 〔従来の技術〕 流体、例えば、水、乳および生物学的流体の化学分析は
、健康の維持および診断処置のためＫしばしば望ましく
あるいは必要である。このような分析を促進するための
種々の組成物および要素は知ら−れている。このような
組成物および要素は、一般に、分析する物質（ここでは
被検試料と呼ぶ）を測定するだめの試薬組成物を包含す
る。被検試料は、生物学的有機体または化学物質である
ことができる。この試薬組成物は、被検試料と相互作用
すると、検出可能な変化（例えば、色素の形成）を提供
する。

最近、生物学的流体、例えば、全血、血清、血漿、尿な
どの迅速かつ高度に定量的な診断または臨床的分析に有
用な組成物および要素を開発するために、多数の研究が
行なわれてきた。

伝染病の迅速かつ有効な診断および処置のために、病気
を起こすバクテリアをできるだけ迅速に検出することが
望ましい、尿道の感染は最も普通のバクテリア病気の１
つであシ、頻度の点で気道の敲染だけに次ぐものである
。事実、多くの病院において、尿道の感染は病院内の感
染が最も普通の形態であシ、しばしばカテーテルおよび
種々の外利的手順の使用に引続いて起こる。はとんどの
尿１１の感染（ＵＴＩ）は、尿道を通して導入された微
生物による上昇する感染によって生じ、過酷さの点にお
いて無自覚の感染からきびしい全身の病気まで変化する
。このような感染は、通常、尿１−につき１００，００
０（１０）以上の有機体のバクテリア計数（有意な細菌
尿と呼ばれる状態）にじ１達する。正常の状態の下で、
尿は無菌であるが、外性器からの汚染は、適切に集めか
つ輸送された標本において、１，０００（１０３）有機
体／′−までを寄与することがある。

イｒ意の細菌尿は、尿道の組織のいずれかの微生物の侵
入を含む多数の病理学的状態において存在することがあ
シ、あるいは組織の侵入なしに尿中の単純なバクテリア
の増殖から生ずることがある。

感染は単一の部位、例えば、尿道、前立腺、膀胱、また
は腎臓を含むことがあるが、しばしばそれは１よシ多い
部位を含む、尿に限定された感染は、それ自体、無症候
性細菌尿症（すなわち、感染の明白な徴候または症候を
示さない状態）として現われることがある。この状態の
早期の処置は、よシ重大な状態、例えば、腎孟腎症（腎
臓および腎孟の炎症）の発現を防止することができる。

したがって、信頼性ある方法によるバクテリアの迅速な
検出は早期の特別の診断を促進する。

さらに、処方した抗生物質が感染の処置に実際に有効で
あることを確保するために、治療の間の反復した試験が
要求される。こうして、簡単な迅速な細菌尿の試験の必
要性は明らかである。その上、子供、妊婦、糖尿病およ
び老人病の集団の間の尿道の感染の頻緊な無自覚の無症
候性発生をかんがみて、その診断はいくつかの被検物の
収集および試験を必要とすることがあシ、バクテリアの
試験は十分に簡単であシかつ経済的であって、日常の実
施を可能とすべきでちる。再び、これは迅速な経費のか
からない細菌尿の検出法の必要性を示すものである。

ある種の被検試料、とくに生きている細胞（例えに、バ
クテリア、酵母菌など）の測定は、電子移兎」剤（ＥＴ
Ａ）の存在下に検出可能な種を提供する還元性組成物を
使用して、最良に達成される。

電子移動剤は、まず、生きている細胞によって還元され
る。次いで、還元された電子移動剤は、還元性組成物を
還元して検出可能な種を発生し、次いで検出可能な種を
検出する。フェナジンメトサルフェー）　（ＰＭＳ’）
は典型的な電子移動剤である。

不都合なことＫは、ＰＭＳおよび構造的に関連する電子
移動剤は水溶液中で不安定である。特開昭６１−１８２
５７６号公報において、電子移動剤化合物の改良された
群が開示されている。これらの化合物は、置換されたベ
ンゾキノン類およびナフトキノン類である。

〔発明が解決しようとする問題点〕 前記発明の電子移動剤は、従来知られた電子移動剤よシ
も多くの利点を提供する。しかしながら、なおそれ以上
の改良が探求された。さらに詳しくは、その出願の実施
例における特定の電子移動剤は所望より劣った感度を有
する。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、既知のアッセイに比較して改良された感度を
有する被検試料例えば微生物を測定する手段を提供する
。

したがって、本発明によれば、 （色）　４位置および５位置にメトキシ基または融合１
．４−ジオキサン環をもつか、あるいは４位置に置換も
しくは非置換の低級アルコキシ基および５位置および６
位置に融合５員もしくは６員の炭素現式環または複素環
式環をもつ安定なメタノール可溶性１，２−ベンゾキノ
ンである電子移動剤、および （ｂ）　　電子移動剤により還元された場合に検出可能
な種を提供する還元性組成物、 を含んでなる被検試料を測定するだめの組成物が提供さ
れる。

さらに、本発明は、液体中の被検試料を測定する方法を
提供する。この方法は、 （Ａ）−９以下において、前記液体の試料と前記キノン
電子移動剤（ＥＴＡ）および電子移動剤による還元のと
きに検出可能な種を提供する還元性組成物とを接触させ
、そして （Ｂ）　　前記検出可能な種を検出する、工程を含む。

前述のように、本発明によって得られる利点は、本発明
の実施において特定の電子移動剤（ＥＴＡ）をイ・ｄ用
するために達成される。これらの電子移動剤類は、水性
および親油性の両者の環境と高度に相溶性である。それ
らは十分に親水性の特性をもち水性緩衝溶液中に可溶性
である。同時に、それらは十分に親油性の特性をもち、
細胞内の電子供与体との相互作用を可能とする。

本発明において有用なオルト−キノン類は、前述の関連
する電子移動剤の用途において記載するキノン類に構造
的に類似する。しかしながら、予期せざることには、本
発明のキノン類は、ここに−含１れる比較例において見
られるように、前記の出願の実施例に比較して改良され
た応答を与える。

本発明において有用な電子移動剤類は、これらの化合物
が細胞と電子移動剤として作用できるように、−１７の
水性緩衝液中で測定したとき、約−３２０〜約＋４００
　ｍＶの範囲内の還元電位（ＥＨ）をもつことが好まし
い。好ましくは、電子移動剤のＥｙ、は約−１８５〜約
＋４００　ｍＶの範囲内である。所望のＥＨは、適当な
置換基をその化合物のキノン核上に有することによって
達成される。ここに提供される教示により、合成化学の
専門家は所望のＥＨを得るためにどの置換基をキノン核
上に配置するかを知るであろう。還元電位の測定は、普
通の電気化学的技術に従い、示差パルスポーラログラフ
イーまたはサイクル的電位測定を用いて実施できる〔例
えば、ソウヤー（Ｓａｗｙｅｒ　）およびロパーツ（Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ　）　、　Ｊｒ。

ウィリー・アンド争すンズ・インコーホレーテッド（Ｊ
ｏｈｎ　Ｗｉｌａｙ　＆　５ｏｎｓ　、　Ｉｎｃ　、　
）　、二、−ヨーり、１９７４参照〕。

本発明において有用な代表的電子移動剤類は、下に例示
される： 式中、Ｒ４およびＲ５はメトキシであシ、そしてＲ３ｊ
；−よびＲ６は、水素、置換または非置換の低級アルコ
キシ、例えば、メトキシまたはエトキシ、まだは置換ま
たは非置換の低級アルキル、例えば、メチルまたはエチ
ルから成る群よシ独立に選択されるか、あるいはＲ４お
よびＲ５は、−緒になって、融合１，４−ジオキサン環
を形成し、そしてＲ３およびＲ６は前記の意味であるか
、またはＲ５およびＲ６は一緒になって、融合５員もし
くは６員の炭素現式環または複素環式環、例えば、フェ
ニル、フリル、ピリジル、チエニルまたは１，４−ジオ
キシと形成し、Ｒ４は置換または非置換の低級アルコキ
シ、例えば、メトキシまたはエトキシであシ、そしてＲ
６は上に定義した通シである。

オルト−キノン類は安定であるべきである。安定とは、
化合物を合成し、単離し、そして少なくともアッセイの
間、すなわち、少なくとも数時間、約３７℃において保
持できることを意味する。

本発明の実施において有用な代表的オルト−キノン類は
、次のものを包含する： 化合物 ０ＣＨ。

１．４−ベンゾジオキサン−６，７−ジオン５．６−ジ
オキソ−８−メトキシキノリン前述のように、本発明に
おいて有用なオルト−キノン類はメタノール可溶性であ
るべきである。メタノール可溶性とは、少なくとも約０
．００５モルである化合物の溶液をメタノール中で形成
することができることを意味する。少量のメタノール中
にオルト−キノン類を前もって溶解することは、水溶液
の形成を促進する。他の溶媒、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドは、また、オルト−キノン類を前もって
溶解するために有用である。

メタノール中に可溶性の化合物は、また、とれらの溶媒
中に可溶性であろう。

還元を位（半波電位ＥＨとして測定）は、ポーラログラ
フの分析器を使用して測定した。溶液の媒質はリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｄ（７，Ｏ、イオン強度＝０．１）で
あった、測定は標準カロメル電極に対して実施した。値
は通常の水素電極に対して報告する。

ここに記載する電子移動剤類は、この分野において知ら
れている出発材料および平頭を用いて調製できる１例え
ば、次の文献を参照二Ａ、タクワら、日本化学学会誌（
Ｂｕｌｌ　＊　Ｃｈｅｍ　＊　Ｓｏｅ　＊　Ｓｏｃ　。

ここに記載する電子移動剤類は、電子移動剤により還元
されたときに検出可能な種を提供できる還元性組成物と
組み合わせて使用する。検出可能な利・は、検出可能と
なる変化を行う還元性化合物によって得ることができる
。あるいは、検出可能なＬは還元性組成物からの放出に
よって得ることが１′きる。検出可能な種は、適当な手
段によって直上検出できる物質、ならびに他の物質例え
ば他のｔ検試料、酵素、媒染剤、金属イオンまたは他の
物質と反応して検出可能な種を提供できる物質であるこ
とができる。このような種は放射分析手段によって検出
できるものを包含し、この手段は、色測定的に検出でき
る色原体（例えば、色素またはｆ２、料）、および螢光
測定的に検出できる螢光原体（例えば、螢光色素または
グローブ）を包含する。さらに、検出可能な種はリン光
種、放射線的に標識した種、または化学ルミネセンス種
、あるいはこの分野において知られている検出可能な種
であることができる。

有用な還元性物質は、還元されて色測定的色素を生成で
きるテトラゾリウム塩類、還元されて無色の化合物を生
成できるジクロロインドフェノール色素類、および還元
可能の他の色繋提供物質を包含する。

色原体の有用な部類の例は、アゾ、アゾメチン、ニトロ
フェノール、インドフェノール、インドアニリンおよび
トリアリールメタン色素類、およびこの分野において知
られている他のものであシ、アゾ色素は好ましい、螢光
原体の有用な部類の例は、クマリン、フルオレセインお
よびローダミンの螢光性色素、およびこの分野において
既知の他のものである。

とくに有用な部分は、放出前に第１スイクトル吸収帯を
有し、そして放出後に測定したとき第２スペクトル吸収
帯を有する色原体および螢光原体である。有用なこの型
の組成物は、「還元性組成物よ・よび分析用組成物、そ
れを利用する要素および方法」と題するベリー（Ｂｅｌ
ｌｙ）らによる１９８６年１月３１日提出の米国特許出
願第８２４．７７６号；「光安定性還元性組成物および
分析用組成物、それを利用する要素および方法」と開４
．するムラ（Ｍｕｒａ　）らによる１９８６年５月３０
日提出の米国特許出願第８６８，４７９号；および「水
混和性還元性組成物および分析の組成物および方法にお
けるそれらの使用」と題するムラ（λ１ｕｒａ　）らに
よる１９８６年５月３０日提出の米Ｄ１特許出願第８６
８，８５５号（すべて上に引用した）に記載されている
。こらの化合物は、一般に、ｒＲＩＮＤＪ化合物と呼ば
れる、還元性の分子内し核変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅ
ｎｔ　）化合物である。これらの化合物は、一般構造式
ＣＡＲ−（Ｒ）　　を有し、ここでｎは１または２であ
り、ＣＡＲ−は置換または非置換の芳香族またはキノン
核であり、モしてＲはシフト可能な検出可能な種を構成
する部分である。好ましい態様において、化合物は水混
和性かつ光安定性である。

とくに好ましい試薬はコパル）　（ＩＩＩ）含有試薬で
ある。これらの組成物は水溶性コパル）　（Ｉｆｆ）錯
塩および水溶性の金属化可能な色素からなる。組成物中
に含めることができる任意の電子移動剤は、記載したよ
うなオルト−キノンの電子移動剤であることができる。

多くのレドックス試薬は知られてお）、それらの例は次
の通）である：ＮＡＤ、電子キャリヤーおよびテトラゾ
リウム塩を含有する組成物（米国特許第４，３５１，８
９９号に記載されている）；多価金属イオンのキレート
、前記金属イオンと反応できる指示薬および緩衝剤を含
有する組成物（米国特許第４，３０３，４０９号に記載
されている）；種種の還元性化合物を含有する組成物、
例えば、米国特許第３，３３１，７５２号、米国特許第
３，７１１，２５２号、米国特許第４，１０１，３８１
号、米国特許第４．１１６，７７４号、米国特許第４，
２２４，０３４号および米国特許第３，９５４，４１２
号に記載されている。

前述のように、現在のところ好ましい還元性組成ｖ１お
よびレドックス試薬はコパル）　（ＩＩＩ）錯塩含有罰
、薬である。コパル）　（ＩＩＩ）は、典型的には６の
配付数を有する三価の金属である。きわめて広い「炎の
配位子はコバルト（Ｉｌｌ）に配位することが知られて
いる。配位子はそれらが１つの負の電荷を含イ；するよ
うに選択するとき、１つの原子価は配位子によって満た
されることができる。逆に、配位仔が電気的に中性であ
るとき、原子価は非配位対イオンによって消足されなく
てはならず、そして垢が形成する。本発明において使用
するために、水に性錯塩は必要である。コパル）　（Ｉ
［Ｉ）錯塩塩類は、よシ水溶性であるので、好ましい。

Ｃｏ　（ＩＩ［）錯塩を形成するために有用な中性の配
位子は、次のものを包含する：アンモニア：脂肪族アミ
ン、例えば、エチレンジアミン、プロピレンジアミンジ
エチレントリアミン；置換または非置換の芳香族アミン
、例えば、アニリン、２−アミノエチルアニリン、　２
　、２’−ビスアニリン；置換または非置換の複素環式
アミン、例えば、ピリジン　２　、２１−ビピリジン、
２−（アミノメチル）ピリジン、４．４′−ジメチル−
２，２′−ビピリジン、２．２’、２’−ターピリジン
、モルホリン、ピリミジン、ピリダジン、２，２′−ビ
ピラジン、キノリン、イソキノリン、アクリジン、チア
ゾール、イミダゾール、トリアジン、１，１０−フェナ
ントロリン、５−ニトロフェナントロリン、　２．２’
−ビビリミジン、　２　、２’−ジイミダゾール；およ
び酸素供与体、例えば、アミド、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルモルムアミドおよび水が含まれる。任意の陰イオン
を対イオンとして使用できる。便利には、ハロゲノのイ
オン、例えば、塩素、臭素およびヨウ素のイオンは好ま
しい、他の有用な対イオンは、例えば、アジド、チオシ
アナート、テトラフルオロポレート、ニトレート、バー
クロレート、ヘキサフルオロホスフェート、サルフェー
ト、カーボネート、スルホネートおよびカルがキシレー
トのイオン類を包含する。

陰イオン性配位子は、また、コパル）　（ＩＩＩ）と配
位させることができるが、ただしコバルト（ＩＩ）につ
いての変化は配位子によって完全に中和されず、こうし
て錯塩が塩であシ、それゆえ水溶性であることを条件と
する。有用な陰イオン性配位子は、次のものを包含する
：ハロゲノ、例えば、塩素、臭舅゛、ヨウ素またはフッ
素、アジド、チオシアネート、ニトレート、カーボネー
ト、カルがキシレート、スルホネート、オキサレートお
よび２，４−ペンタンジオネートのイオン類。

秋、在のところ好ましいコバルト錯塩は、〔ｃ。

（エチレンジアミン）２（２，２’−ビピリジン）〕ｃ
ｔ３である。

本発明において有用なコパル）　（１）含有還元性組成
物またはレドックス試薬における使用に好ましい成分は
、水溶性金属化可能な色素である。コバル）　（Ｉ［［
）および（Ｉ［Ｉ）イオンと配位できる、非常に広い種
類の色素が有用である。色走は水溶性でなくてはならな
い、下の引用文献に記載する特定の色素の多くは、水溶
性でないが、普通の方法によって色素の分子中に適当な
可溶化基を組込むことによって容易に水溶性とすること
ができる。普通の可溶化基、例えば、カルボン酸、スル
ホン酸および硫酸塩の基は有用である。

好ましい色素は、また、コバルトのための王座配位子で
ある。王座配位子はよシ安定な錯塩を形成し、それゆえ
コパル）　（ＩＩＩ）錯塩からいっそう容易に配位子を
変位することができる。

これらの基準を考慮して、有用な色素および色素の部類
は、米国特許第４，３９６，５４６号、米国特許第４，
２７３，７０８号、米国特許第４，０２４，９９３号、
米国特許第４，１４７，５４４号および米国特許第４，
４１９，４３５号に記載されている。

好ましい色素は、次の通シである：２−（（３−メチル
−２−ピリジル）アゾツー１−ナフトール−４−スルホ
ン酸モノアンモニウム塩：２−〔（５−カル７？キシ−
２−ピリジル）アゾツー１−ナフトール−４−スルホン
酸ジアンモニウム塩；および２−（（３−メチル−５−
スルホ−２−ピリジル）アゾ〕−１−す７トールー４−
スルホン酸ジアンモニウム塩。

電子移動剤および還元性組成物は緩衝液と組み合わせる
ことができる。有用な緩衝液は、組成物のＰＩＩを９以
下、好ましくは約６．５〜約８に維持するものを包含す
る。代表的緩衝液は、次のものを包含するニリン酸塩、
ホウ酸塩、Ｎ−２−ヒドロキシーエチルヒヘラジンーＮ
′−２−エタンスルホンｆ−’３、およびこの分野にお
いて知られているもの、ｇ：！びれているもの。

不発明の組成物は、水性または非水性の液体、例えば、
生物学的流体、製造プロセス、廃水、食物などの分析的
測定（すなわち、定量的、半定量約１たは定性的検出）
に有用である。測定は種々のｉ検試料、例えば、生きて
いる細胞（例えば、バクテリア、酊母菌、真菌など）、
酵宋〔例えば、す／４’−ゼ、グルコースオキシダーゼ
、ラクテートオキシダーゼ、クレアチンキナーゼ、α−
グリセロホスフェートオキシダーゼ、ラクテートデヒド
ロケ゛ナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ア
スノ母ルテートアミノトランスフェラーゼおよび他のＮ
ＡＤＨ系もしくはペルオキシダーゼ系アッセイ（これは
デヒドロゲナーゼまたはりダクターゼ酵素を包含する）
〕、電子移動剤を還元する生きている細胞以外の生物学
的または化学的還元剤（例エバ、アスコルベート、シス
ティン、グルタチオンなど）、代謝可能な物質（例えば
、グルコース、乳酸、トリグリセリド、コレステロール
など）、免疫反応剤（例えば、抗原、抗体、ハプテンな
ど）ついて実施でき、そして還元性化合物の還元を生じ
かつ検出可能な柾を放出する、単一の反応または反応順
序を介して実施することができる他の測定であることが
できる。

本発明の組成物は、生物学的試料中の生きてｂる細胞の
検出または定量においてとくに有用である。生きている
細胞を有することが疑われる生物学的試料（例えば、食
物、地下水、冷却水、製薬学的生成物、下水など）は、
本発明によりバクチリア、酵母菌、菌類などについて分
析できるが、本発明は水性液体、例えば、ヒトおよび動
物の流体（例えば、尿素、脳背椎液、血液など、ならび
に什の分泌物）およびヒトおよび動物の懸濁液の中のバ
クテリアの検出に有用である。本発明の実施！、れ・、
尿（希釈または非希釈）中において尿道の窓側・を検出
するためにとに重要である。

徂きている細胞、とくにバクテリアの細胞の検出ｉ＋、
それらの細胞のだめの栄養の存在下にしはし仁実施する
が、その存在は必須ではない。有用なム素源、および必
要に応じて窒素源を含有する任尤の栄養培地を使用でき
る。適切な成分および声を有する普通の栄養培地は、こ
の分野においてよく知られている。とくに有用な栄養は
、同化が容Ｊ、な炭素源、例えば、単純糖類（グルコー
ス、スクロース、ラフィノース、マルトース、ラクトー
ス、ガラクトース、フルクトースなど）、グリロール類
（例エバ、グリセロール、ソルビトールなど）、カルが
ン酸類（例えば、酢酸、乳酸、クエン酸など、またはそ
れらの塩類）、澱粉、トリプトースなどである。とくに
有用な栄養はグルコースまたはトリプトースの単独また
は組み合わせである。

本発明は、溶液または乾式要素のアッセイのいずれにも
適合させることができる。溶液のアッセイのため、電子
移動剤および検出可能な鎚を提供するであろう還元性組
成物（例えば、コバルト■含有試薬）を含有する分析用
組成物を調製し、そして生きている細胞または測定すべ
き被検試料を含有する液状試験試料と混合することがで
きる。

電子移動剤は、また、還元性組成物と混合前に、試験試
料中に存在させることができる。一般に、分析用組成物
は試験試料と適渦な容器（例えば、試験管、ベトリ皿、
ビーカー、夕べ、トなど）中で混合する。得られる溶液
（または分散液）をおだやかに混合し、そして比較的短
い時間（すなわち、約３０分まで）約４０℃までの温度
で、一般に約り０℃〜約４０℃の温度においてインキュ
ベーションする。次いで、試験試料を、還元性組成物の
還元により放出された検出可能な種（例えば、色原体ま
たは螢光原体）を測定することによって評価する。この
ような評価は適当な検出装置を用いて実施できる。

本発明を実施する好ましい方法において、試験すべき尿
の試料を濾過する。次いで、還元性化合物各添加し、そ
して色変化の存在を測定する。存在しうる感染の型を測
定しようとするとき、２つの尿の試料を試験することが
できる。１つの未処理の試料を試験して、いずれかの型
の細胞の存在ま戸は不存在を決定する。第２試料を、１
９８５年６月２５日に発行された米国特許第４，５２５
，４３５月に記載されているように、まず、陰イオン性
界面？Ｎ＋性剤で処理する。

溶液のアッセイは、また、試験試料を含有する多孔質吸
収材料、例えば、紙のス）！Ｊ、７’を分析組成物と接
触させることＫよって実施することができる。この試験
試料中の被検試料は、多孔質利料から組成物中に移動し
、これによって測定に必要な分析反応を開始する。

試験ス）！ｊｙ７’を、測定量の分析組成物を試ｚく溶
液へ運ぶために便利な方法として用いることができる。

試験ストリップを、測定すべき細胞をすでに含有してい
るであろう溶液の中に配置する。

試薬は試験ストリップから溶液の中に溶解して、反応溶
液を形成する。本発明の試験ストリップの好ましい態様
において、試薬は水溶性結合剤中において運ばれる。

一般に、溶液のアッセイにおいて、存在する還元性組成
物中の還元性化合物の量は約０．００１〜約１０ミリモ
ル、好ましくけ約０．０５〜約１ミリモルである。電子
移動剤は、一般に、約０．００１〜約２ミリモル、好ま
しくは約０．０５〜約１ミリモルの量で存在する。他の
試薬は当業者によって容易に決定される量で存在するこ
とができる。

あるいは、本発明は、乾燥した分析要素を利用する「乾
式」アッセイにおいて実施することができる。このよう
な要素は、簡単な吸収性担体材料、すなわち、自己支持
性の吸収性または吸水性材料の薄いシートまたはストリ
ップ、例えば、性紙またはストリップであることができ
、これは還元性組成物および電子移動剤またはその乾燥
残留物を含有する。このような要素は、この分野におい
て、試ｊ々ス）　ＩＪッゾ、診断要素、浸漬棒、診断剤
などとして知られている。

本発明の１つの態様において、水性液体中の微生′：１
（例えば、酵母菌、真菌、バクテリアなど）の４・ミ出
のための要素は、電子移動剤およびコバルト（■）含有
試薬（それらの両者は前述した通シである）を含んでな
る。これらの要素は、また、生きている細胞のための栄
養および使用糸外下に（すなわち、１〜１００μｔの液
体試料と接触するとき）生理学約２を維持する緩衝液を
含有するようにすることが望ましい。このような要素は
、例えば、尿の試料（予備処理して還元性妨害物質が排
除されている）中の、バクテリアを、試料と要素とを適
当な方法で物理的に接触させ、そしてコパル）　（ＩＩ
Ｉ）試薬から生ずる色素を検出することによって、検出
することができる。

以下の実施例１において、化合物４，５−ジメトキシ−
１，２−ベンゾキンを使用した。これは上記の化合物「
Ａ」である。この化合物は、Ｙ。

Ｓｏｅ　、　Ｊａｐａｎ　）、５２．２１６９（１９７
９）の方法によって、以下のように製造した。

乾燥メタノール（５００ｍＺ）中のヨウ素酸ナトリウム
（２０，９，０，１モル）およびカテコール（５，５１
、０，０５％’Ａｚ　）　ｃＤ混合物を、６０ＣＫ２０
時間加熱した。この混合物を室温に冷却し、濾過し、モ
して濾液を約５０−に濃縮した。残留する溶液を冷却し
、そして生ずる結晶な岡過により集め、そして空気乾燥
した。この固体を塩化メチレン中に溶解し、濾過し、モ
して濾液の蒸発から得られた固体をイソプロピルアルコ
ールから再結晶化した。結晶を酢酸エチルとアセトニト
リルとの混合物中に溶解し、そしてシリカゲルのプラグ
に通過させ九。溶媒を除去すると、２．７５ｊｉ。

（３３チ）の所望生成物（融点２２７−２２８℃）が得
られた。実施例において使用した他のオルト−キノン類
を同様な方法で製造した。

以下余白 〔５Ｊ′、雄側〕 り。雄側１ この実施例は、Ｉ　Ｘ　１　ｏ５／＊の大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）の検出を、電子移動剤
である２、３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベン
ゾキン（前述の米国特許出願第６９９，３７４号中に開
示される・母う−キノンの電子移動剤）および４，５−
ジメトキシ−１，２−ベンゾキン（不発明のオルト−キ
ノン）の電子移動剤を使用して比較する。

次の溶液を１／Ｉ製した（蒸留した水道水を全体を通じ
て使用した）： 囚　リン酸塩緩衝液二連当量の下記の溶液ＸおよびＹを
混合し、そして合計体、！５００ｄＫ希釈することによ
って、要求する−の０．０５モルのリン酸塩緩衝液を調
製した： Ｘ：０．１モルの一塩基性リン酸カリウム、Ｙ：０．１
モルの二塩基性リン酸カリウム、ｒＪＩ６．８　ｏ　：
　１１２．５−のＸおよび１３７．５ゴのＹ。

ｐＨ７，５０：４０−のＸおよび２１０ｔｎｌのＹ。

ｐＨ７，８０：　２１．２５−のＸおよび２２８．７５
ゴのＹｌ Φ）細胞懸濁液：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｌ）細胞（ＡＴＣＣム２５９２２）を、胆石滲出培
地［デイフコ・うがラドリーズ（Ｄｉｆｃ。

Ｉ、ａｂｓ　）　］　　を３７℃において振盪しないで
生長させた。−夜生長させて細胞の４０−を、遠心によ
り収穫して細胞の沈殿物を形成した。

沈殿物を２５−の０．０５モルのリン酸塩緩衝液（ｐＨ
７，５）中に再懸濁し、そして生ずる懸濁液を再遠心し
た。洗浄した沈殿物を２５−の緩衝液中に懸濁し、そし
てアリコートを同一緩衝液で希釈して、緩衝液のブラン
クに対してして測定して、６２０　ｎｍにおいて０．８
３３の吸収値を得た。０．８３３の吸収値は、５Ｘ１０
８細胞／−の細胞濃度に相当することが決定された。次
いで、この溶液を１〜１００倍に希釈して、５　Ｘ　１
０’　大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ　）／−原液懸濁液を形成した。

（Ｃ）　　グルコース溶液：濾過した蒸留水中の１０　
ｊｐ、’量チのグルコース。

（９）コバルト溶液：４１．４４１ｎ９の（Ｃｏ（エチ
レンジアミン）（２，２’−ビピリジン）〕Ｃｔ３　を
、１０ｍｊの０．０５モルのリン酸塩緩衝液、−７，８
０、中に溶解した。

（６）色素溶液：３０．５１ｎ９の２−（（５−カルボ
キシ−２−ピリジル）アゾツー１−ナフトール−４−ス
ルホン酸ニアンモニウＡ塩を、１０−の０．０５モルの
リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，８０、中に溶解した。

■　電子移動剤（ＥＴＡ　）溶液：メタノール中の０．
０１モルの２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−
ベンゾキン（比較パラ−キノンの電子移動剤）。

（Ｇ）　　電子移動剤溶液：メタノール中の０．００８
モルの４，５−ジメトキシ−１，２−ベンゾキン（本発
明によるオルト−キノ７類の電子移動剤）。

アッセイのプロトコールは、２．３４−のｐＨ６，８の
リン酸緩衝液、２５μｔの原液溶液Ｃ，５０μＬの原液
溶液Ｅ、５００μｔの原液溶液り、２５μｔの電子移動
剤溶液ＦまたはＧおよび最後に６０μｔの懸濁液Ｂの混
合物を利用した。大腸菌（Ｅ。

ｅｏｌｉ）の最終濃度はＩ　Ｘ　１０５細胞／ｌｎ！で
あった。

この混合物を振とうし、そして３７℃において熱的に平
衡化した。３０分間にわたって、分光光度計を使用して
６１０　ｎｍにおける色素の出現を監視することによっ
て、反応を追跡した。パックグラウンドの対照も使用し
た。これは大腸菌（Ｅ。

ｅｏｌｉ）を除外して、同一成分のすべてを含有するも
のであった。結果は表１において、光学Ｃ度（３０分後
のΔ０Ｄ）−バックグラウドの差として記載する。

表１ ３０分におけるΔ光年濃度 オルト−キノン　　　　　　０．３５０パラ−キノン　
　　　　　　　０．０７５（比較） 結果が明瞭に示すように、オルト−キノンはパラ−キノ
ンと比較して優れる。

武雄例１を反復したが、ただし最終細胞濃度はＩ　Ｘ　
１０’細胞／Ｗｄであシ、色素溶液は、１０−の０．０
５モルのｐＨ７，８０のリン酸塩緩衝液中に溶解した３
５，７■の２−（（３−メトキシ−５−スルホ−２−ピ
リジル）アゾクー１−ナフトール−４−スルホン酸ニア
ンモニウム塩を含有し、そして２か類の異なる電子移動
剤を本発明に従い使用した。電子移動剤は次の通りであ
った： Ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ各々につ
いてΔＯＤを実施例１と同様に測定した。結果は、次の
通シである： 以１’／ＪＩ　Ｊ−ｊ 表２ ΔＯＤ オルト−キノンＢ　　　　３０分 １．７２５ オルト−キノンＣ１８分 １．０７７ 実ＩＩｉ例４ この実施例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｉｌ）細胞の検出を、電子移動剤すなわちトリメチル−
１，４−ベンゾキノン（特開昭６１−１８２５７６号公
報に開示されているパラ−キノンの電子移動剤）および
本発明の４，５−ジメトキシ−１，２−ベンゾキン、オ
ルト−キノンの電子移動剤を使用して比較する。コバル
ト試薬の代シに、ＢＩＮＤ化合物を使用した。

次の溶液を調製した（蒸留した水道水を全体を通じて使
用した）： 囚　緩衝液：　ＨＥＰＥＳ緩衝液（［Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルヒヘラジンーＮ’　−２−エタンスルホン酸〕
）、０．０５モル、ｐＨ７，８，０，２μのフィルター
を通して濾過した。

（Ｂ）　　ＲＩＮＤ化合物：２５０μｔのＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解したＢＩＮＤ化合
物を含有する溶液を調製した。ＤＭＦを０．１％の硫酸
で酸性化した。このＲＩＮＤ溶液を２５−〇ＨＥＰＥＳ
緩衝液に添加して、ＢＩＮＤ分散液を形成した。ＲＩＮ
Ｄ化合物は、次の構造を有した： Ｃ）グルコース溶液：実施例１と同一。

■）カラム懸濁液：実施例１と同一（５Ｘ１０８細胞／
−原溶液）。

（ト）電子移動剤溶液：実施例１の溶液Ｆと同一。

これは上記で参照した比較電子移動剤である。

Ｃ）電子移動剤溶液：実施例１の溶液Ｇと同一であるが
、ただし濃度は０．０１モルであった。

これは本発明において有用な電子移動剤である。

グルコース溶液Ｃ，ＲＩＮＤ分散液Ｂおよび２種類の電
子移動剤溶液ＥまたはＦのいずれか１つの各々の５００
μｔを混合することによって、試薬溶液を調製した。得
られたこの２釉類の試薬溶液に、１３８０μｔのＨＥＰ
ＥＳ緩衝液および１２０μｔの細胞懸濁液を添加し、こ
うして細胞の最終濃度を２×１０　細胞／−とした。細
胞を除外して、すべての成分を含有するバックグラウン
ドの対照を調製した。光学濃度を５４０　ｎｍにおいて
測定し、そして３０分後の光学濃度の変化を、パックグ
ラウンドについて補正し、決定した（ΔＯＤ）。

結果を下表３に記載する： 表３ オルト−キノン　　　　　　ｏ、ｓｏ。

パラ−キノン　　　　　　　　０．６４６（比較） 結果が明瞭に示すように、ＢＩＮＤ化合物を使用したと
き、オルト−キノンはノぐラーキノンに比較して優れる
。

９施側５ この実施例は、ｌＸｌ０’／−の大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ）の検出を、２，３−ジメトキシ−５−メチル
−１，４−ベンゾキン（米国特許出願第６９９．３７４
号中に開示されるパラ−キノンであシ、従って比較化合
物）：４，５−ジメトキシ−１，２−ベンゾキン（本発
明の好ましいベンゾキノン）；および４，５−ジェトキ
シ−１，２−ベンゾキン（ジメトキシ化合物の次の＠拵
同族体）を千１ご用して比較する。ジェトキシ化合物は
本発明の隼・凹円に入らない。この実乳例は実施例１に
類似する方法で実施した。

）、４に示すデータは、試験した３種類の化合物につい
ての３０分後の光学λ度−パ、クグラウンドの差である
０本発明のジメトキシ化合物の場合に才、・いて、光学
濃度の差はわずかに１８分後である。この時点において
、色素は消耗した。他の化合物について、データは３０
分についてである。

表４ ノ９ラーキノン （比較）　　　　　　　　　　１．４４４（３０分）ジ
メトキシオルト−キノン　　　　　　１．３１４（１８
分）ジェトキシオルト−キノン（比較）　　　０．４９
６（３０分）データが示すように、本発明の化合物は／
？シラーノンよりａれる。本発明の好ましい化合物の次
に隣接する同族体も劣る。

〔発明の効果〕

オルト−キノンの電子移動剤は、密接に関連するノ母う
−キノンの電子移動剤に比較して改良された感度を提供
する。

ノー゛、：４、ｉＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体中の被検試料の測定用組成物であって、（ａ）
   ４位置および５位置にメトキシ基または融合１，４−ジ
   オキサン環をもつか、あるいは４位置に置換もしくは非
   置換の低級アルコキシ基をもちしかも５位置および６位
   置に融合５員もしくは６員の炭素環式環または複素環式
   環をもつ、安定なメタノール可溶性１，２−ベンゾキノ
   ンである電子移動剤、および （ｂ）電子移動剤により還元された場合に検出可能な種
   を提供する還元性組成物、 を含んでなることを特徴とする、前記の測定用組成物。 ２、液体中の被検試料の測定方法であって、（Ａ）（ａ
   ）４位置および５位置にメトキシ基または融合１，４−
   ジオキサン環をもつか、あるいは４位置に置換もしくは
   非置換の低級アルコキシ基をもちしかも５位置および６
   位置に融合５員もしくは６員の炭素環式環または複素環
   式環をもつ、安定なメタノール可溶性１，２−ベンゾキ
   ノンである電子移動剤、および （ｂ）電子移動剤により還元された場合に 検出可能な種を提供する還元性組成物 を含む組成物と液体試料とをｐＨ９以下で接触させる工
   程、および （Ｂ）前記検出可能な種を検出する工程 を含んでなる、前記の測定方法。