JP2000007696A - 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド類（ＮＡＤＨ等）含有液状試薬が関与する測定系にお
いて、夾雑物質によるＮＡＤＨ等からニコチンアミドモ
ノヌクレオチド（ＮＭＮＨ）への分解を有効に防止する
方法及び試薬を提供する。 【解決手段】 分解防止方法は、ＮＡＤＨ等含有液状試
薬と検体とをｐＨ値が７．５〜１１の条件下で接触させ
る測定系にキレート剤を共存させるか；又はＮＡＤＨ等
と、ＮＡＤＨ等を分解する夾雑物質とを含み、ｐＨ値が
７．５〜１１の液状試薬にキレート剤を共存させる。液
状試薬は、ＮＡＤＨ等とキレート剤とを含み、ｐＨ値が
７．５〜１１である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及
び分解防止用試薬に関する。本発明の防止方法によれ
ば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含
有液状試薬が関与する測定系において、その液状試薬の
他の成分又は検体中に存在する夾雑物質による前記還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類からニコチ
ンアミドモノヌクレオチドへの分解を有効に防止するこ
とができる。

【０００２】

【従来の技術】医療分野において、適切な治療を行うた
めには正確に疾病を診断することが必要である。生体試
料中の多数の生理活性物質、例えば、アスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アラニンアミノト
ランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤ
Ｈ）、α−オキシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤ）、遊離脂肪
酸（ＮＥＦＡ）、尿素窒素（ＵＮ）、又はクレアチニン
（ＣＲＥ）などを精度良く、迅速簡便に測定することが
望まれ、種々の試験法、試薬及び分析機器が開発されて
きた。近年では多数の検体を短時間で処理し、自動的に
測定結果を得ることが主流となり検査装置、試薬の両面
で高度な性能が求められている。実際に病院や検査セン
ター等での測定では自動分析機による測定が主流となっ
ている。

【０００３】前記の生体試料中の生理活性物質の測定
は、すべて酵素反応を利用して測定することができる。
酵素反応を利用する測定法としては、（１）一定の測定
条件下で生成された生成物量を測定する方法、（２）補
酵素の変化量を測定する方法、及び（３）基質の減少量
を測定する方法の３つに大別することができる。特に
（２）の補酵素の変化量を測定する方法が汎用されてお
り、その補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類、すなわち、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと称することがある）又
は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（以下、ＮＡＤＰＨと称することがある）と、酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ
⁺ と称することがある）又は、酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ⁺ と称す
ることがある）とを適用した各種脱水素酵素による反応
系が多く利用されている。基本的な反応式を示すと次の
ようになる。

【０００４】

【化１】

【０００５】従来、これらの試薬は、酵素等を含むもの
についてはその保存性を考慮して凍結乾燥の状態で供給
され、使用時に緩衝液等で溶解して用いるようになって
いた。しかしながら、近年はその調製の手間を省くため
に、当初から溶液状態のいわゆる液状試薬が広く普及し
てきた。特に、液状試薬の場合には、そこに含まれる酵
素等の各組成成分の安定化が重要である。当然、補酵素
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類もその対象で
あり、安定化方法に関する報告も多い。例えば、ホウ酸
を添加する方法（特開昭６２−１９８６９７号公報）や
アルカリ金属を添加する方法（特開平７−２２９１９２
号公報）等が開示されている。

【０００６】補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド類の溶液での安定性は、一般に還元型がアルカリ性
溶液中で安定であり、酸化型は酸性溶液中で安定である
ことが知られている。実際に、還元型のニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド類を利用した測定試薬で、還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）
や還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）を含有する溶液が液状試薬であればその
ｐＨはアルカリ性のものが多く、その他の組成成分の組
み合わせが工夫されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、本発明
者が見いだしたところによれば、例えば、ＮＡＤＨ（又
はＮＡＤＰＨ）が安定なアルカリ性の条件下において、
共存する酵素活性が低下しないにもかかわらず、ＮＡＤ
Ｈ（又はＮＡＤＰＨ）の含量のみが極端に低下するとい
う問題が発生することがある。生理活性物質測定系にお
いて、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量が低下すると
目的とする生理活性物質の正確な測定値が得られなくな
ってしまう。その一般的な原因を本発明者が探求したと
ころ、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）を分解する夾雑物質
が、種々のルートから測定系に混入してくることが分か
った。

【０００８】生体試料中の生理活性物質測定方法におい
て、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を
用いる測定系では酵素反応を利用するので、多くの場
合、補酵素と酵素とを共存させる。補酵素と共存させる
酵素は、動物組織や細菌等から精製された標品である場
合がほとんどである。補酵素と共存させる酵素中にＮＡ
ＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量を低下させ、本来の反応
を阻害する物質が夾雑酵素として存在していると、生理
活性物質を測定する場合に、正確な値が得られないこと
になる。例えば、試薬の性能評価において、その試薬の
測定上限の性能を評価する目的で、測定対象の生理活性
物質が極端に高値の検体を測定する場合がある。通常の
生体試料（血清等）それ自体では測定上限を評価するた
めの検体としては十分ではないので、目的の生理活性物
質を添加して人為的に高値となるように検体を調製する
か、あるいは目的に合う市販の管理血清を検体として使
用することになる。特に市販の管理血清は、目的物質の
みならず同時に数種類の生理活性物質を有しているもの
が一般的である。また、その調製は、ベースとなる血清
に動物組織や細菌等から精製された標品を測定目的物質
として添加する。ここで、添加された標品中にＮＡＤＨ
（又はＮＡＤＰＨ）の含量を低下させ、反応の場で酵素
反応を阻害する物質が夾雑していた場合には、目的の生
理活性物質の正確な測定値が得られないこととなる。

【０００９】本発明者は、後述する参考例１に示すよう
に、自動分析機によるＧＰＴ測定において、反応を阻害
する夾雑物質を含む検体及び夾雑物質を含まない検体
（添加されたＧＰＴは同程度の活性のもの）を同一の液
状試薬で測定した。その結果、夾雑物質含有検体では、
直線性が１０００ｕ／ｌ程度までしか認められないが、
夾雑物質不含検体では直線性が２０００ｕ／ｌ程度まで
認められた。このことは、本来なら、高値検体として測
定されなければならない検体において、反応を阻害する
夾雑物質が存在する場合には、所望の値が得られないこ
とを示している。測定物質の正確な値が得られないと、
生理活性物質を各種疾病の診断の指標としている医療分
野に与える影響は甚大である。

【００１０】補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド類を利用した酵素法による生理活性物質測定は、補
酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の変化量
を波長３４０ｎｍの吸光度変化量として検出して測定す
る。更に詳述すれば、自動分析機においては、酵素反応
によるＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の吸光度の減少を利
用して、あらかじめ設定した測光時間時間内で、一定の
間隔で測定された吸光度から反応の速度（傾き）を求
め、更に単位時間当たりの吸光度の減少速度を求め、Ｎ
ＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の分子吸光係数から生理活性
物質の値を算出する。又は、標準液を用いる場合は、標
準液と検体との吸光度の差により目的の生理活性物質の
値を算出する。ここでＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の存
在量が保存中の含量の低下によって不足していたり、反
応の場に共存する夾雑物質により酵素反応が阻害を受け
ると、正確な反応速度や、吸光度が得られないため、算
出された値も不正確となる。

【００１１】本発明者は上記のようなニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド類を含んだ測定系において、従来
使用されてきた凍結乾燥品の試薬ではなく、近年使用さ
れるようになった液状試薬を用いた場合に、反応阻害が
生じる点に着目し、その原因を追求した。その主要因
は、吸光度変化の指標となるＮＡＤＨが夾雑物質として
存在するヌクレオチドピロフォスファターゼにより、Ｎ
ＭＮＨ（還元型ニコチンアミドモノヌクレオチド）へ分
解されることにあると考えられる。ＮＭＮＨもＮＡＤＨ
と同様に３４０ｎｍに最大吸収をもつため、吸収特性の
面からは区別することができない。更に、ＮＭＮＨは、
各種脱水素酵素とは反応しないために、本来所望の酵素
反応が阻害を受けてしまうことも判明した。

【００１２】この点に関して、後述する参考例２に示す
ように、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
類と動物由来の酵素とを含む液状試薬を保存した場合
に、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）が経時的に分解されＮ
ＭＮＨが生成することを確認した。また、前記参考例１
のＧＰＴ測定例においても、夾雑物質含有検体と、安定
な液状試薬として供給されている弱アルカリ性のＮＡＤ
Ｈ含有液状試薬（ｐＨ９．２）とを共存させておくと、
経時的にＮＡＤＨが分解されてＮＭＮＨが生成すること
が確認された。

【００１３】更に、参考例１において、自動分析機の測
定で得られる一定間隔で測定された吸光度変化（いわゆ
るタイムコース）をグラフ化すると、ＧＰＴの反応阻害
が生じる夾雑物質含有検体と、反応阻害が生じない夾雑
物質不含検体では明らかに差があった。すなわち、ＧＰ
Ｔの反応阻害が生じない夾雑物質不含検体では、酵素反
応が終了した時点での吸光度が一定であったのに対し
て、反応阻害が生じる夾雑物質含有検体では、希釈列が
高濃度になるほど反応終了時の吸光度が上昇していっ
た。反応終了時の吸光度の上昇は、希釈列が高濃度にな
るに従って、ＮＡＤＨが分解して生じるＮＭＮＨの生成
量が多くなることを示している。

【００１４】夾雑物質として存在すると思われるヌクレ
オチドピロフォスファターゼの反応の至適ｐＨは、弱ア
ルカリ性にあると考えられる。すなわち、従来の凍結乾
燥品から液状試薬に移行し、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類の安定化のために、ＮＡＤＨ（又
はＮＡＤＰＨ）を含む溶液のｐＨがアルカリ性になった
ことにより、従来には全く予期することができなかった
前記のような新たな問題が発生しているのである。

【００１５】従って、本発明の目的は、還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与す
る測定系において、その液状試薬の他の成分や検体中に
存在する夾雑物質による前記還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類からニコチンアミドモノヌクレオ
チドへの分解を有効に防止する手段を提供することにあ
る。例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド類を安定に供給することができる条件下、例えばア
ルカリ性の環境で、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが、精製さ
れた各種酵素と共存した場合の含量低下や、目的の生理
活性物質である酵素標品が高濃度で添加された検体（例
えば、市販管理血清）を測定する場合に、補酵素ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止し、且
つ、その酵素測定系での主要酵素反応の反応阻害を起こ
さずに、目的とする生理活性物質を正確に測定する手段
を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬と、
検体とを、ｐＨ値が７．５〜１１の条件下で接触させる
測定系に、キレート剤を共存させることを特徴とする、
夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノ
ヌクレオチドへの分解を防止する方法に関する。また、
本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド類と、その還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド類を還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分解
する夾雑物質とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１の液状試
薬に、キレート剤を共存させることを特徴とする、前記
夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノ
ヌクレオチドへの分解を防止する方法にも関する。更
に、本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類とキレート剤とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１
である液状試薬にも関する。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳述する。本発明
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む任
意の液状試薬に適用することができる。すなわち、任意
の「生理活性物質」の測定に用いる液状試薬、特に生体
試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、細胞もし
くは組織抽出液、唾液、汗）に存在する臨床検査の対象
となる任意の物質、例えば、各種の酵素の測定に用いる
液状試薬に適用することができる。測定対象物質として
は、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
（ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰ
Ｔ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、α−オキシ酪酸脱水
素酵素（ＨＢＤ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、尿素窒素
（ＵＮ）、又はクレアチニン（ＣＲＥ）などを挙げるこ
とができる。いずれの項目もニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド類を利用した測定系で測定することが可能
なため、本発明を好適に適用することができる。

【００１８】ここで「ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類を含む液状試薬」とは、測定に使用するまで、
夾雑物質を含む酵素や他の添加成分と共に比較的長期間
にわたって保存される保存用液体試薬を意味するだけで
なく、保存時には、夾雑物質を含む酵素や他の添加成分
と共存しないが、測定時に、夾雑物質を含む検体とアル
カリ性条件下で（例えば、２試薬系測定試薬など多試薬
系測定試薬の第１試薬と）接触する液状試薬も含まれ
る。

【００１９】本発明は、ｐＨがアルカリ性に維持された
液状試薬に適用する。具体的にはｐＨ７．５〜１１（好
ましくは８．５〜１０）の範囲である。ｐＨ値が７．５
より低いと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド類の保存安定性が不十分であったり、またｐＨ値が１
１より高いと反応の雰囲気調整が難しくなったり、分析
装置への影響等が懸念され好ましくない。

【００２０】本発明で用いることのできるキレート剤
は、金属イオンに配位し、水溶性キレート化合物を与え
る多座配位子であり、具体的には、エチレンジアミン四
酢酸塩（ＥＤＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシ
クロヘキサン四酢酸塩（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリ
アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、グリコールエーテルジアミ
ン四酢酸塩（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六
酢酸（ＴＴＨＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤ
Ａ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン
酸）（ＥＤＴＰＯ）、エチレンジアミン二プロピオン酸
塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸塩
（ＨＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰ
Ａ）、エチレンジアミン−ビス（メチレンホスホン酸）
（ＥＤＤＰＯ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ
トリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、ニトリロ
三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシ
ン（ＤＨＥＧ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）等及びこれら
の塩を挙げることができる。

【００２１】本発明方法においては、前記のキレート剤
を液状試薬に添加するか、あるいは酵素反応測定時にそ
の測定系に単独で添加することもできる。例えば、保存
用液状試薬中に夾雑物質が存在する場合には、保存用液
状試薬中に前記キレート剤を添加する必要がある。ま
た、保存用液状試薬中には夾雑物質が存在せず、酵素反
応の実施時に、例えば、検体に含まれている夾雑物質が
測定系に混入してくる場合には、前記キレート剤を、保
存用液状試薬に予め含有させておくこともできるし、保
存用試薬とは別に、前記キレート剤を、その測定系に添
加することもできる。特に、２試薬系測定試薬などの場
合には、第１試薬と検体とをアルカリ性条件下で一定時
間接触させてから、その混合液を第２試薬と中性条件下
で接触させ、酵素反応を実施する場合が多い。従って、
夾雑物質が検体に含まれている場合には、少なくともア
ルカリ性条件下での第１試薬との接触時にキレート剤を
存在させる必要があり、キレート剤を予め保存用液状試
薬（例えば、保存用液状第１試薬）に含有させておく
か、あるいはキレート剤を別途、検体と共に反応系に添
加することもできる。

【００２２】本発明において使用するキレート剤の濃度
は、夾雑物質（おそらくヌクレオチドピロフォスファタ
ーゼ）によって還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類が還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分
解されることを実質的に防止することのできる濃度であ
る。個々の測定系や液状試薬におけるキレート剤の濃度
は、本発明が適用される測定系や液状試薬において夾雑
物質として共存するヌクレオチドピロフォスファターゼ
の由来や共存量に依存するため、適用される測定系や液
状試薬に使用されるキレート剤の種類に基づいて、当業
者が適宜決定することができる。

【００２３】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類
と前記に示したキレート剤の組合せとしては、特に限定
されないが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類
を含む溶液の環境において、夾雑物質（おそらく、ヌク
レオチドピロフォスファターゼ）によるニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド類の分解を防止する効果のある
キレート剤を適宜選択して使用することができる。ま
た、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を
防止するために上記のキレート剤を数種混合して添加す
ることもできる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド類を分解する夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロ
フォスファターゼ）の由来によって分解反応の至適ｐＨ
は異なり、また防止効果のあるキレート剤の種類も異な
る。従って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類
の種類とその環境及び夾雑物質（おそらく、ヌクレオチ
ドピロフォスファターゼ）の由来により、効果のあるキ
レート剤の一種類又は数種類を選択し、具体的な添加量
も、使用する個々の測定系に応じて適宜決定することが
できる。

【００２４】例えば、安定化された液状試薬を用いるＧ
ＰＴ測定系において、使用するＮＡＤＨを含む溶液のｐ
Ｈは、一般にアルカリ性である。更に、ＮＡＤＨを利用
するＧＰＴの測定は、ほとんどの場合ＬＤＨを共役酵素
としている。従って、液状試薬の場合、ＮＡＤＨはアル
カリ性の条件下でＬＤＨと長期間（例えば半年以上）共
存することとなる。この場合、ＮＡＤＨと共存させるＬ
ＤＨは、その由来が動物組織や細菌である。動物組織や
細菌から精製されたＬＤＨ中にヌクレオチドピロフォス
ファターゼが夾雑酵素として存在していた場合には、Ｎ
ＡＤＨ溶液の長期間の保存中にＮＡＤＨが分解されＮＭ
ＮＨが生成される。ＮＭＮＨはＮＡＤＨと同様に３４０
ｎｍに吸収があるために吸光度上では区別することがで
きないので見かけ上ＮＡＤＨの量が維持されているよう
に見えてしまう。この試薬でＧＰＴ活性の測定を行う
と、実際のＮＡＤＨ量が少ないために、所望の測定値が
得られない。そこで、夾雑物質（おそらく、ヌクレオチ
ドピロフォスファターゼ）が共存しているＮＡＤＨ溶液
中にキレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを添加するとＮ
ＡＤＨの分解反応を防止することができる。この時のＥ
ＤＴＡ・２Ｎａ添加濃度は０．１ｍｍｏｌ／ｌ以上で夾
雑物質による反応阻害を防止する効果があり、特に１〜
５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましい。５０ｍｍｏｌ／ｌを超え
ると、ＮＡＤＨの分解反応の防止には効果があるもの
の、主要酵素反応であるＧＰＴの反応が影響を受け、Ｇ
ＰＴ活性値が低くなる傾向があるため好ましくない。

【００２５】また例えば、ＬＤＨ測定系において検体と
してＬＤＨ測定系に阻害を与える市販の直線性管理用血
清を使用する場合、液状試薬でありそのｐＨがアルカリ
であるＮＡＤＨを含む測定用試薬にキレート剤としてＥ
ＤＴＡ・２Ｎａを添加すると阻害を防止することができ
る。この時のＥＤＴＡ・２Ｎａ添加濃度は０．１ｍｍｏ
ｌ／ｌ以上で夾雑物質による反応阻害を防止する効果が
あり、特に１〜５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましい。５０ｍｍ
ｏｌ／ｌを超えるとＮＡＤＨの分解反応の防止には効果
があるものの、ＬＤＨの反応が影響を受け、ＬＤＨ活性
値が低くなる傾向があるため好ましくない。

【００２６】また、本発明においては、前記ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド類の溶液中に、前記のキレ
ート剤の他に、必要により、生理活性物質測定用試薬に
一般に添加される成分、例えばアジ化物等の防腐剤、及
び界面活性剤等を適宜添加することができる。すでに、
本発明は安定化されたニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類を含む液状試薬で用いる方法であるため、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類を含有している溶
液中には安定化のためにさまざまな添加物が添加されて
いる。

【００２７】生理活性物質測定用試薬として凍結乾燥品
の試薬が用いられていた頃とは異なり、最近では当初か
ら溶液状態で供給される液状試薬の必要性が増し、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類が、安定化された
液状試薬で供給されるようになった。ところが、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類を安定化し、液状試
薬の形で供給しなければならなくなったため、溶液の環
境が凍結乾燥品が主流だった頃とは異なっている。その
ために、以前にはなかった不都合が生じることになっ
た。

【００２８】本発明は、液状試薬が主流になったことを
契機として明らかになった問題点に着目し、その解決方
法として見いだしたものである。液状試薬になったこと
がきっかけとなり夾雑酵素によってニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類の分解が生じてしまう場合がある
事実にはこれまで着目されていなかった。そこで、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類が分解する原因を
解明し、原因となる夾雑物質の影響を回避する方法を見
いだしたことで、生理活性物質を正確に測定することが
可能になった。液状試薬で提供される生体試料液中の生
理活性物質測定用試薬に、安定化の目的ではなく、夾雑
物質の影響の回避の目的でキレート剤を添加することは
従来にはなかった手法である。

【００２９】

【作用】本発明によるキレート剤の添加でニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する機構は、
キレート剤の添加によるヌクレオチドピロフォスファタ
ーゼの反応阻害によるものと考えられる。ヌクレオチド
ピロフォスファターゼは、２分子のリボヌクレオチドが
結合したピロリン酸の部分のエステル結合に作用する加
水分解酵素であり、ＮＡＤＨを基質とした場合、ＮＡＤ
ＨをＮＭＮＨに分解しＡＭＰ（アデノシン一リン酸）が
生成する。ヌクレオチドピロフォスファターゼは、その
由来により反応の至適ｐＨが異なり、また夾雑酵素とし
て精製された酵素標品に混在している場合、その混在量
も様々である。本発明による作用機構の詳細は、現在の
ところ完全には明らかではないが、本発明によるキレー
ト剤の添加によって還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド類の分解を防止することができたことから、
夾雑酵素（おそらくヌクレオチドピロフォスファター
ゼ）が金属要求酵素であるものと考えられる。実際に、
植物、腎・肝の細胞顆粒・膜、蛇毒又は細菌等のヌクレ
オチドピロフォスファターゼが報告されており、それぞ
れ性質が異なり、基質特異性、至適ｐＨ、及び金属要求
性等は様々である。

【００３０】また、ヌクレオチドピロフォスファターゼ
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類だけでは
なく、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ウ
リジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）等が共存した場
合でも、一定の条件が整えば反応が進行し、反応阻害を
起こす可能性が充分考えられる。従って、補酵素等にニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用する酵素
反応以外の場合でも、前記のようなリボヌクレオチドが
結合した構造をもつ基質（補酵素）が関与する測定系又
はその測定系に用いる液状試薬においても、ヌクレオチ
ドピロフォスファターゼの反応阻害としてキレート剤を
添加する方法は有効である。

【００３１】

【実施例】以下、実施例及び参考例によって本発明を具
体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するも
のではない。

【実施例１】《ＧＰＴ測定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添
加効果》 （１）対照試験 以下に示したＧＰＴ測定用液状試薬を用い、ＧＰＴの反
応阻害が生じる市販の管理血清（商品名：ハイレベルチ
ェック・Ｅ；国際試薬社製）を検体として用いた。具体
的には、前記管理血清を生理食塩水で希釈して１０段階
希釈列（１／１０〜１０／１０）検体を調製した（１０
／１０は非希釈検体）。日立７１５０型自動分析機によ
り、検体（１５μｌ）と以下に示す試薬１（３００μ
ｌ）を混合し、３７℃で５分間加温した後、試薬２（１
００μｌ）を添加した。下記のパラメータにより、試薬
２の添加時から１分間経過後から５分間経過後までの４
分間にわたり、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍ
での吸光度変化を測定し、１分間当たりの吸光度の減少
速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸光係数（ε）からＧＰＴ
活性値を下記式より算出した。また、検体の代わりに生
理食塩水を使用してコントロール試験を行った。なお、
試薬１及び試薬２に含まれるＧＴＡ緩衝液は、β，β’
−ジメチルグルタル酸、トリス（ヒドロキシメチルアミ
ノ）メタン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオールの等モル濃度溶液をＨＣｌあるいはＮａＯＨ
で所望のｐＨに調製した緩衝液である。

【００３２】使用した液状試薬の組成、測定パラメータ
及びＧＰＴ活性値の計算式は以下のとおりである。 （ａ）試薬１（ｐＨ９．０） ＧＴＡ緩衝液 ２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−アラニン ２００ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ ０．２５ｍｍｏｌ／ｌ ＬＤＨ ５０００ｕ／ｌ （ｂ）試薬２（ｐＨ ６．０） ＧＴＡ緩衝液 １００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−アラニン １０００ｍｍｏｌ／ｌ α−ケトグルタル酸 ６０ｍｍｏｌ／ｌ

【００３３】 （ｃ）測定パラメータ（日立７１５０型） ＡＳＳＡＹ ＣＯＤＥ ［ＲＡＴＥ Ａ］：［３０−５０］ ＳＡＭＰＬＥ ＶＯＬＵＭＥ ［１５］ Ｒ１ ＶＯＬＵＭＥ ［３００］ Ｒ２ ＶＯＬＵＭＥ ［１００］ ＷＡＶＥ ＬＥＮＧＴＨ ［４０５］［３４０］ ＡＢＳ．ＬＩＭＩＴ（INC／DEC） ［４０００］［ＤＥＣＲＥＡＳＥ］ （ｄ）ＧＰＴ活性値の計算式： ＧＰＴ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×
１０³ 上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であ
り、εは分子吸光係数（６．３）であり、Ｖは全反応液
量であり、そしてｖは試料液量である。

【００３４】（２）本発明試薬による試験 本発明試薬として、上記の試薬１にＥＤＴＡ・２Ｎａを
１ｍｍｏｌ／ｌの量で添加した試薬を調製し、同一の検
体（１０段階希釈列及びコントロール試験としての生理
食塩水）について対照試薬での測定と同様の操作で測定
し、ＧＰＴ活性値を求めた。

【００３５】（３）結果 それらの結果を、表１、並びに図１（対照試験）及び図
２（本発明）に示す。

【表１】

【００３６】

【実施例２】《ＬＤＨ測定におけるＮＴＡ添加効果》 （１）対照試薬 以下に示した組成のＬＤＨ測定用液状試薬を用い、ＬＤ
Ｈの反応阻害が生じる市販の管理血清（商品名：ハイレ
ベルチェック・Ｅ；国際試薬社製）を検体として用い
た。具体的には、前記管理血清を生理食塩水で希釈して
１０段階希釈列を調製した（１０／１０は非希釈検
体）。日立７１７０型自動分析機により、検体（１０μ
ｌ）と以下に示す試薬１（１８０μｌ）とを混合し、３
７℃で５分間加温した後、試薬２（９０μｌ）を添加し
た。下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分
間経過後から５分間後まで４分間にわたり、主波長３４
０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、
１分間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分
子吸光係数（ε）からＬＤＨ活性値を下記式より算出し
た。また、前記検体の代わりに生理食塩水を使用してコ
ントロール試験を行った。

【００３７】使用した液状試薬の組成、測定パラメータ
及びＬＤＨ活性値の計算式は以下のとおりである。 （ａ）試薬１（ｐＨ９．０） ＧＴＡ緩衝液 ２０ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ ０．３ｍｍｏｌ／ｌ （ｂ）試薬２（ｐＨ６．０） ＧＴＡ緩衝液 １００ｍｍｏｌ／ｌ ピルビン酸リチウム塩 ６ｍｍｏｌ／ｌ

【００３８】 （ｃ）測定パラメータ（日立７１７０型） 分析法／測光ポイント ［レートＡ］［１０］［２０］［３４］ 波長（副／主） ［４０５］［３４０］ 検体量（標準） ［１０］ 試薬分注量（Ｒ１） ［１８０］ 試薬分注量（Ｒ３） ［９０］ 反応限界吸光度 ［４０００］ （試薬２は、パラメータ上では自動分析機の特性上「Ｒ３」で表されている） （ｄ）ＬＤＨ活性値の計算式 ＬＤＨ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×
１０³ 上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であ
り、εは分子吸光係数（６．３）であり、Ｖは全反応液
量であり、そしてｖは試料液量である。

【００３９】（２）本発明試薬による試験 本発明試薬として、上記の試薬１にＮＴＡを１０ｍｍｏ
ｌ／ｌの量で添加した試薬を調製し、同一の検体（１０
段階希釈列及びコントロール試験としての生理食塩水）
について対照試薬での測定と同様の操作で測定し、ＬＤ
Ｈ活性値を求めた。

【００４０】（３）結果 それらの結果を、表２（試薬２の添加から１分間経過後
から４分後までの３分間の測定に基づく）、並びに図３
（対照試験）及び図４（本発明）に示す。

【表２】

【００４１】

【参考例１】（１）ＧＰＴの測定 自動分析機によるＧＰＴの測定において、同一の液状試
薬を用いて、反応を阻害する夾雑物質を含む検体及び反
応を阻害する夾雑物質を含まない検体を以下に示すＧＰ
Ｔ測定用試薬で測定し、以下に示す計算式でＧＰＴの活
性値を求めた。豚心臓由来ＧＰＴ（ベーリンガーマンハ
イム社）を生理食塩水に溶かし、３０００ｕ／ｌとした
ものを標準（夾雑物質不含検体）とした。これに夾雑物
質を含む豚腎臓由来γ−ＧＴＰ（シグマ社）を４０００
ｕ／ｌとなるよう添加したものを夾雑物質含有検体とし
た。なお、夾雑物質含有検体及び夾雑物質不含検体のい
ずれにおいても、添加されたＧＰＴの活性は、同程度の
活性であった。各検体を、実施例１（１）に記載の方法
と同様に、生理食塩水で希釈して１０段階希釈列（１／
１０〜１０／１０）検体を調製した（１０／１０は非希
釈検体）。日立７０７０型自動分析機により、検体（１
５μｌ）と試薬１（３００μｌ）とを混合し、３７℃で
５分間加温した後、試薬２（１００μｌ）を添加した。
下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分間経
過後から５分間後まで４分間にわたり、主波長３４０ｎ
ｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、１分
間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸
光係数（ε）からＧＰＴ活性値を下記式より算出した。
また、前記検体の代わりに生理食塩水を使用してコント
ロール試験を行った。

【００４２】使用した液状試薬の組成、測定パラメータ
及びＧＰＴ活性値の計算式は以下のとおりである。 （ａ）試薬１（ｐＨ９．０） ＧＴＡ緩衝液 ２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−アラニン ２００ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＨ ０．３５ｍｍｏｌ／ｌ ＬＤＨ ５０００ｕ／ｌ （ｂ）試薬２（ｐＨ６．０） ＧＴＡ緩衝液 １００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−アラニン １０００ｍｍｏｌ／ｌ α−ケトグルタル酸 ６０ｍｍｏｌ／ｌ

【００４３】 （ｃ）測定パラメータ（日立７０７０型） 分析法 ［レートＡ］［１０］［２０］［３４］ 測光ポイント ［１９］−［３１］ 波長（副／主） ［４０５］［３４０］ 反応限界吸光度 ［４０００］［減少］ 検体量（標準） ［１０］ 試薬分注量 第１試薬 ［３００］ 試薬分注量 第３試薬 ［１００］ （試薬２は、パラメータ上では自動分析機の特性上第３試薬で表されている）

【００４４】（ａ）ＧＰＴ活性値の計算式 ＧＰＴ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×
１０³ 上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であ
り、εは分子吸光係数（８．３）であり、Ｖは全反応液
量であり、そしてｖは試料液量である。

【００４５】結果を表３に示す。

【表３】

【００４６】夾雑物質含有検体では、直線性の１０段階
希釈列で直線性が１０００ｕ／ｌ程度までしか認められ
ないが、夾雑物質不含検体では直線性が２０００ｕ／ｌ
程度まで認められる。

【００４７】（２）ＮＡＤＨからＮＭＮＨへの分解 前記参考例１（１）において使用した夾雑物質含有検体
を、ＮＡＤＨ含有液状試薬（０．３ｍｍｏｌ／ｌのＮＡ
ＤＨを含む３０ｍｍｏｌ／ｌのＧＴＡ緩衝液：ｐＨ＝
９．２）と共存させておいた場合の経時変化を、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認した。Ｈ
ＰＬＣ測定条件は以下のとおりである。 分析装置： 島津１０Ａシステム カラム： ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００（関東化学） ＲＰ−１８（ｅ） （５μｍ） カラムオーブン： ４０℃ 検出器： ＳＰＤ−１０ＡＶ ３４０ｎｍ 流 速： ０．５ｍｌ／ｍｉｎ １０μｌ インジェクション 溶離液： ５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５） 結果を図５に示す。図５において、曲線１は、ＮＡＤＨ
含有液状試薬と夾雑物質含有検体とを共存させない場合
であり、曲線２は、ＮＡＤＨ含有液状試薬と夾雑物質含
有検体を混合した直後の場合であり、曲線３は、混合か
ら２時間後の場合であり、曲線４は、混合から６時間後
の場合であり、そして曲線５は、混合から１０時間後の
場合である。また、図５の横軸の時間（分）は、ＨＰＬ
Ｃにおける溶出の時間である。

【００４８】（３）吸光度変化（タイムコース） 前記参考例１（１）において使用した夾雑物質含有検体
及び夾雑物質不含検体のそれぞれの１０段階希釈列（１
／１０〜１０／１０）検体について実施例１（１）に記
載の操作と同様の操作を行った。結果を示す図６（夾雑
物質含有検体）及び図７（夾雑物質不含検体）から明ら
かなように、夾雑物質不含検体では、酵素反応が終了し
た時点での吸光度が一定であったが、夾雑物質含有検体
では、希釈列が高濃度になるほど反応終了時の吸光度が
上昇していった。反応終了時の吸光度の上昇は、希釈列
が高濃度になるほど、ＮＡＤＨが分解して生じるＮＭＮ
Ｈの生成量が多いことを示している。

【００４９】

【参考例２】《保存液状試薬におけるＮＡＤＨからＮＭ
ＮＨへの分解》３０ｍｍｏｌ／ｌのＧＴＡ緩衝液（ｐＨ
９．２）に０．３ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＨを溶解し、豚
心臓由来ＬＤＨの３ロット（ロットＡ，ロットＢ，ロッ
トＣ）をそれぞれ２．５ｍｇ／ｍｌ（ＬＤＨ活性として
約１０００ｕ／ｍｌ相当）の量で添加した溶液を２５℃
で一週間放置した後、ＮＭＮＨの生成量を高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）により前記参考例１と同じ
条件下で測定した。結果を表４に示す。ＮＭＮＨの生成
量は、ＨＰＬＣで得られたＮＡＤＨのピーク面積に対す
るＮＭＮＨのピーク面積の割合で示した。

【００５０】

【表４】

【００５１】

【発明の効果】本発明により、還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系
において、その液状試薬の他の成分又は検体中に存在す
る夾雑物質による前記還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド類からニコチンアミドモノヌクレオチドへ
の分解を有効に防止することができる。例えば、補酵素
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と共に夾雑物
質を含む保存用液状試薬において、その液状試薬の保存
中に前記補酵素が夾雑物により分解されることを防止す
ることができる。また、還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系におい
て、検体由来の夾雑物により補酵素ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類が分解され、測定系の反応から不
正確な測定値が誘導されることを防止することもでき
る。更に、本発明により、生理活性物質を測定する液状
試薬で、測定系での主要酵素反応が阻害されることなく
目的の生理活性物質を正確に測定することができ、長期
間安定で且つ正確な測定値が得られる液状試薬を提供す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本明細書の実施例１において実施したＧＰＴ測
定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加の効果を示す実験にお
ける対照試験の結果（タイムコース）を示すグラフであ
る。

【図２】本明細書の実施例１において実施したＧＰＴ測
定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加の効果を示す実験にお
ける本発明の結果（タイムコース）を示すグラフであ
る。

【図３】本明細書の実施例２において実施したＬＤＨ測
定におけるＮＴＡ添加の効果を示す実験における対照試
験の結果（タイムコース）を示すグラフである。

【図４】本明細書の実施例２において実施したＬＤＨ測
定におけるＮＴＡ添加の効果を示す実験における本発明
の結果（タイムコース）を示すグラフである。

【図５】本明細書の参考例１において得られたＧＰＴ測
定の反応の場においてＮＭＮＨが生成していることがＨ
ＰＬＣにより確認された結果を示すグラフである。

【図６】本明細書の参考例１のＧＰＴ測定において、夾
雑物質含有検体を測定した場合のタイムコースを示すグ
ラフである。

【図７】本明細書の参考例１のＧＰＴ測定において、夾
雑物質不含検体を測定した場合のタイムコースを示すグ
ラフである。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年８月３１日（１９９８．８．３
１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００４】

【化１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ24 QQ26 QR42 QR54 QS20 QX01 4C057 BB02 CC03 DD01 LL05 LL29 LL46 MM02

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチド類を含む液状試薬と、検体とを、ｐＨ値が７．５
   〜１１の条件下で接触させる測定系に、キレート剤を共
   存させることを特徴とする、夾雑物質の干渉作用による
   前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類か
   ら還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を防
   止する方法。
2. 【請求項２】 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチド類と、その還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチド類を還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ
   分解する夾雑物質とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１の液
   状試薬に、キレート剤を共存させることを特徴とする、
   前記夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミド
   モノヌクレオチドへの分解を防止する方法。
3. 【請求項３】 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチド類とキレート剤とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１
   である液状試薬。