JP2017504616A - β−ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法 - Google Patents
β−ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017504616A JP2017504616A JP2016542666A JP2016542666A JP2017504616A JP 2017504616 A JP2017504616 A JP 2017504616A JP 2016542666 A JP2016542666 A JP 2016542666A JP 2016542666 A JP2016542666 A JP 2016542666A JP 2017504616 A JP2017504616 A JP 2017504616A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nicotinamide mononucleotide
- solution
- nanofiltration
- purifying
- membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N anthracene-2-sulfonyl chloride Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC(S(=O)(=O)Cl)=CC=C3C=C21 FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 66
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 55
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 claims abstract description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 13
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 7
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-N NMN zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)([O-])=O)O2)O)=C1 DAYLJWODMCOQEW-TURQNECASA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000015532 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010064862 Nicotinamide phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/048—Pyridine radicals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、前処理されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液に膜濃縮装置で精密濾過及びナノ濾過を順次行い、濃縮された粗溶液を収集するステップaと、得られた粗溶液のpH値を3〜7に調整し、サンプルを逆相高速液体クロマトグラフ分取カラムに注入し、固定相がオクタデシルシラン結合シリカゲルであり、移動相Aが塩酸溶液で調製されたpH3〜7の溶液であり、移動相Bがエタノールである条件で、勾配溶離による精製を行い、精製されたサンプル溶液を得るステップbと、精製されたサンプル溶液を膜濃縮装置でナノ濾過した後、真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを得るステップcと、を含むβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法を開示する。
Description
本発明はヌクレオチド類補酵素に係る方法に関し、特にβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法に関する。
β-ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は補酵素Iの合成基質であり、ニコチンアミドヌクレオチドアデノシントランスフェラーゼでアデニル化された後に補酵素I（NAD）に変換される。生体内では、NMNのレベルとニコチンアミドヌクレオチドアデノシントランスフェラーゼ（NAMPT）の活性はNADの濃度に直接影響を及ぼし、また、NMNは体内のアデノシン転移に直接関与し、体内の重要な合成基質及び機能調節物質である。治療用途において、NMNは老化防止、慢性疾患の治療等に応用されることができ、また、研究により、NMNは更にインスリンの分泌を調整する役割を果たし、mRNAの発現レベルにも影響を及ぼすことが判明している。このため、NMNは医薬治療分野で幅広い応用の将来性を有し、また、反応基質としても化学工業分野で幅広い市場における将来性を持っている。
NMNは一般的にイオン交換樹脂で精製され、持っている電荷及び極性がNADのような多種の類似物と非常に似ており、分離及び精製がかなり難しく、そのうちの類似物である不純物を完全に除去することができないので、イオン交換法で得られた製品は、純度がただ約60％であり、収率がただ40％であり、生産効率が低くて、大規模な生産に適合しない。
よって、従来技術の改良及び発展が期待されている。
上記従来技術の欠点に鑑み、本発明は、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製過程において他の電荷及び極性が似ている類似物を完全に除去し難く、且つ製品の純度が低くて、収率が低いという問題を解決するためのβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術的手段を採用する。
前処理されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液に膜濃縮装置で精密濾過及びナノ濾過を順次行い、濃縮された粗溶液を収集するステップaと、
得られた粗溶液のpH値を3〜7に調整し、サンプルを逆相高速液体クロマトグラフ分取カラムに注入し、固定相がオクタデシルシラン結合シリカゲルであり、移動相Aが塩酸溶液で調製されたpH3〜7の溶液であり、移動相Bがエタノールである条件で、勾配溶離による精製を行い、精製されたサンプル溶液を得るステップbと、
精製されたサンプル溶液を膜濃縮装置でナノ濾過した後、真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを得るステップcと、
を含むβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法である。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップaにおいて精密濾過に用いる精密濾過膜の孔径が0．2〜1μmである。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップaにおいてナノ濾過に用いるナノ濾過膜は、分画分子量が200である。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップaにおいてナノ濾過に用いるナノ濾過膜は中空糸膜である。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップaにおいて濃縮された粗溶液の濃度が20〜30g／Lである。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップcにおいて膜濃縮装置でナノ濾過された後の、精製されたサンプル溶液の濃度が100〜150g／Lである。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップbにおいて、体積比で移動相A：移動相Bが2：98〜1：1にある。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップcにおいてナノ濾過に用いるナノ濾過膜は分画分子量が200である中空糸膜である。
前記のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法において、前記ステップbにおいて、勾配溶離時の溶離時間が40minである。
本発明では、オクタデシルシラン結合シリカゲルを利用して高速液体分取を行うことで、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドを精製し、それにより、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドの純度が98％に達することができ、収率が80％以上に達することができ、生産効率も他のプロセスに比べて2倍以上向上させる。β-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製過程において他の電荷及び極性が似ている類似物を完全に除去し難いという問題を効果的に解決した。
本発明のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法の好ましい実施例は、
前処理されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液に膜濃縮装置で精密濾過及びナノ濾過を順次行い、濃縮された粗溶液を収集するステップS100と、
得られた粗溶液のpH値を3〜7に調整し、サンプルを逆相高速液体クロマトグラフ分取カラムに注入し、固定相がオクタデシルシラン結合シリカゲルであり、移動相Aが塩酸溶液で調製されたpH3〜7の溶液であり、移動相Bがエタノールである条件で、勾配溶離による精製を行い、精製されたサンプル溶液を得るステップS200と、
精製されたサンプル溶液を膜濃縮装置でナノ濾過した後、真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを得るステップS300と、を含む。
本発明では、逆相高速液体クロマトグラフィーを採用して補酵素Iの合成基質であるβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを精製し、固定相がオクタデシルシラン結合シリカゲルであり、移動相が塩酸で調製された溶液及びエタノールであるクロマトグラフカラムで精製し、更に濃縮及び凍結乾燥を行うことで、精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを得る。本発明に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法は、操作が簡単で、且つ他の持っている電荷及び極性が非常に似ている類似物を効果的に除去することができ、それにより、調製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドは、純度が高く、収率が大きく、収量が大きく、大規模な工業的生産に適用できる。
好ましくは、前記ステップS100において精密濾過に用いる精密濾過膜の孔径が0．2〜1μmである。具体的には、本発明のステップS100において精密濾過に用いる精密濾過膜の孔径が0．5μmである。
精密濾過の基本原理はスクリーニング過程であり、静圧差の作用で10μmよりも大きい微粒子を濾過し除去し、操作圧力が0．7〜7barであり、原料液は圧力差の作用で、そのうちの溶剤が膜における微孔を透過して膜の低圧側に流れ、膜孔よりも大きい微粒子が分画され、それにより、原料液における微粒子と溶剤との分離を実現する。精密濾過過程の微粒子に対する分画のメカニズムはスクリーニング作用であり、膜の分離効果は膜の物理的構造、孔の形状及び大きさにより決定される。
本発明の実施例において、精密濾過時に採用される精密濾過膜は、孔径が0．5μmであり、β-ニコチンアミドモノヌクレオチド粗溶液における比較的大きい微生物及び大粒径分子を初歩的に除去することができ、精密濾過膜は大分子及び溶解固形分（無機塩）等の通過を許可するが、浮遊物、細菌及び大分子量コロイド等の物質を分画し、β-ニコチンアミドモノヌクレオチド粗溶液を初歩的に精製する。精密濾過膜の孔径が大きすぎると、比較的大きい微生物及び大粒径分子は精密濾過膜を透過することができ、初歩的な濾過の効果に影響する。孔径が小さすぎると、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドも精密濾過膜を透過することができず、製品の損失を引き起こす。
また、本発明に記載のステップS100においてナノ濾過に用いるナノ濾過膜は、分画分子量が200である。更に、本発明の好ましい実施例において採用されるナノ濾過膜は、孔径が1．5nmであり、分子量が200である物質を分画することができる。
より好ましくは、前記ステップS100においてナノ濾過に用いるナノ濾過膜は中空糸膜である。
ナノ濾過は溶剤分子又は一部の低分子量溶質又は低原子価イオンの透過を許可する濾過方法であり、かなり低い圧力で高い脱塩性能を有するとともに、分子量が数百である物質を分画できることを特徴とする。本発明では、孔径が1．5nmである濾過膜を採用し、その分画分子量が200であり、分子量が200よりも大きい物質を濾過することができ、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドにおける不純物を初歩的に濾過することができる。且つ、中空糸膜をナノ濾過膜として、中空糸膜は、外表面が繊維状であり、自己支持の役割を果たし、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドの調製プロセスで生成した残留リン酸イオン及び他の小分子不純物を効果的に除去することができ、それにより、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドを更に精製する。
精密濾過及びナノ濾過の後、濃縮された粗溶液を収集し、その濃度が20〜30g／Lである。
本発明の好ましい実施例において、前記ステップS200におけるリン酸溶液又は塩酸溶液の質量濃度が2％〜5％であり、エタノール溶液の質量濃度が5％〜30％である。
より好ましくは、前記ステップS200におけるリン酸溶液又は塩酸溶液の体積使用量は、サンプル溶液1ミリリットル当たりに5〜20ミリリットルのリン酸溶液又は塩酸溶液を加え、エタノール溶液の体積使用量は、移動相1リットル当たりに100〜400ミリリットルのエタノール溶液を添加する。
具体的には、リン酸溶液又は塩酸溶液の質量濃度が高すぎると、勾配溶離時に溶出されることがあり、質量濃度が低すぎると、物質の分離精製効果に影響することがあり、本発明において、質量濃度が2％〜5％であるリン酸溶液又は塩酸溶液を採用し、勾配溶離時に溶出されることなくβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを高度に精製する効果を達成することを確保することができる。
また、酸の使用量を変えると、ピーク形状に影響を与え、それにより、検出効果に影響を与える。本発明の実施例において、体積使用量がサンプル溶液1ミリリットル当たり5〜20ミリリットルであるリン酸溶液又は塩酸溶液、体積使用量が移動相1リットル当たり100〜400ミリリットルであるエタノール溶液を採用し、これにより、ピーク形状を対称的にし、テーリング現象を減少することができる。
本発明の好ましい実施例において、前記ステップS200において、リン酸溶液又は塩酸溶液を用いて前のステップで初歩的に精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド粗溶液のpH値を3〜7に調整し、サンプルを逆相高速液体クロマトグラフ分取カラムに注入し、その移動相Aが塩酸溶液で調製されたpH3〜7の溶液であり、移動相Bがエタノールである。
具体的には、逆相高速液体クロマトグラフィーにおいて、一般的に非極性固定相（例えばC18、C8）が採用され、その移動相は一般的に水又は緩衝液であり、常にメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン等の水に溶解可能な有機溶剤を添加することで保持時間を調整し、それは非極性及び極性の弱い化合物の分離に適用でき、且つpHはサンプルの存在状態に影響を与えるので、サンプルの保持時間に影響する。本発明の実施例において、塩酸で調製されたpH3〜7の溶液及びエタノールを移動相として採用することにより、サンプルの保持時間を効果的に調整することができ、サンプルがクロマトグラフカラムに注入されてからクロマトグラフカラムから流出するまでに要した時間を最適化し、サンプルの分離効果を良くすることができる。サンプルの保持時間が長すぎると、検出の感度を低下させ、サンプルの保持時間が短すぎると、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドと不純物との分離効果を低下させ、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製に影響する。
移動相のpH値を2〜8に制御すべきであり、pH値が8よりも大きい場合、担体であるシリカゲル、即ち固定相が溶解するようになり、pHが2よりも小さい場合、シリカゲルの化学結合相が加水分解により脱落し易い。本発明の実施例において、pH値が3〜7であり、この時、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドが安定して存在することができ、その内部構造が破壊されることがなく、この条件では、サンプルの分離効果を最適化することができる。より好ましくは、本発明における移動相のpH値が5であり、この時、サンプルの精製効果が最適になる。
本発明に記載のステップS200においてリン酸溶液又は塩酸溶液を採用して得られた粗溶液のpH値を3〜7に調整することは、β-ニコチンアミドモノヌクレオチド粗溶液にも残留リン酸イオンが含有され、且つ塩酸で調製された溶液を移動相Aとして採用するからであり、本発明では、リン酸溶液又は塩酸溶液を採用して粗溶液のpH値を調整し、新たな不純物を導入せず、且つ精製過程においてリン酸イオン等の物質を除去することができる。
好ましくは、本発明の実施例におけるステップS200において、その移動相Aと移動相Bとの体積比が2：98〜1：1にある。
移動相の割合はサンプルの検出効果及び精製効果に影響を与えることがある。塩酸溶液の使用量を向上させ、エタノールの使用量を低下させると、サンプルの保持時間が長くなり、良い分離を実現することができるが、測定されたサンプルのピークの幅が広くなり、ピーク高さが低くなり、検出の感度に影響を与える。塩酸溶液の使用量を低下させ、エタノールの使用量を向上させると、サンプルの検出感度が高いが、サンプルの分離効果が悪い。本発明のサンプル性質と精製条件に応じて、体積比で2：98〜1：1にある塩酸で調製されたpH3〜7の溶液とエタノールを選択することにより、サンプルの分離精製効果を良好にするとともにサンプルの検出感度を向上させることができる。
また、本発明の好ましい実施例において、勾配溶離時の溶離時間が40minである。具体的には、2％B〜12％Bの勾配溶離による精製を行うことができる。
勾配溶離法を採用する場合は、定組成溶離法を採用する場合と比べて、ピーク効果をより対称的にし、テーリングをなくし、且つカラム効率を向上させ、検出の感度を改良することができる。また、溶離時間を40minに制御することにより、サンプルの保持時間を適当にし、β-ニコチンアミドモノヌクレオチドの分離精製効果を最適化する。
本発明では、初めて逆相高速液体クロマトグラフィーを採用して補酵素Iの合成基質であるβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを精製し、従来のイオン交換樹脂法の、精製効率が低く、極性等の性質がβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドに似ている類似物を分離することができず、且つ収率が低いという問題を克服した。
以下、具体的な実施例により本発明を更に説明する。
本発明では、5cm*30cm、15cm*30cm、30cm*30cmの規格のクロマトグラフカラム（カラム直径*長さ）を含む。
カラム温度が室温である。
実施例一
1．粗製品の濃縮：
前処理されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液に膜濃縮装置で精密濾過及びナノ濾過を順次行い、精密濾過で微生物を除去し、ナノ濾過において、分画分子量が200である中空糸膜を採用して粗製品を20〜30g／Lに濃縮する。
2．精製：
精製条件：
クロマトグラフカラム：カラム直径と長さが5cm*30cmである。
固定相：オクタデシルシラン結合シリカゲル
移動相：A相：pH3の塩酸溶液、B相：エタノール
流速：50〜80ml／min
検出波長：260nm
勾配：B％：2％〜12％（40min）
サンプル注入量が8〜10gである。
精製過程：リン酸溶液又は塩酸溶液で濃縮後の粗溶液のpHを3〜7に調整し、クロマトグラフカラムを30％以上のエタノールできれいに洗浄した後、均一にサンプルを注入し、サンプル注入量が8〜10gであり、直線勾配溶離を40min行い、目的ピークを収集する。
3．濃縮及び凍結乾燥：
精製後のサンプル溶液を膜濃縮装置（分画分子量が200である中空糸膜）でナノ濾過して100〜150g／Lまで濃縮し、続いて、真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、純度が98％よりも大きいβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドが得られ、総収率が81．3％に達することができる。
実施例二
1．粗製品の濃縮：
前処理されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液に膜濃縮装置で精密濾過及びナノ濾過を行い、精密濾過で微生物を除去し、ナノ濾過において、分画分子量が200である中空糸膜を採用して粗製品を20〜30g／Lに濃縮する。
2．精製：
精製条件：
クロマトグラフカラム：カラム直径と長さが15cm*30cmである。
固定相：オクタデシルシラン結合シリカゲル
移動相：A相：pH5の塩酸溶液、B相：エタノール
流速：400〜500ml／min
検出波長：260nm
勾配：B％：2％〜12％（40min）
サンプル注入量が60〜80gである。
精製過程：リン酸溶液又は塩酸溶液で濃縮後の粗溶液のpHを3〜7に調整し、クロマトグラフカラムを30％以上のエタノールできれいに洗浄した後、均一にサンプルを注入し、サンプル注入量が60〜80gであり、直線勾配溶離を40min行い、目的ピークを収集する。
3．濃縮及び凍結乾燥：
精製後のサンプル溶液を膜濃縮装置（分画分子量が200である中空糸膜）でナノ濾過して100〜150g／Lまで濃縮し、続いて、真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、純度が98％よりも大きいβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドが得られ、総収率が82．3％に達することができる。
実施例三
1．粗製品の濃縮：
前処理されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液に膜濃縮装置で精密濾過及びナノ濾過を行い、精密濾過で微生物を除去し、ナノ濾過において、分画分子量が200である中空糸膜を採用して粗製品を20〜30g／Lに濃縮する。
2．精製：
精製条件：
クロマトグラフカラム：カラム直径と長さが30cm*30cmである。
固定相：オクタデシルシラン結合シリカゲル
移動相：A相：pH7の塩酸溶液、B相：エタノール
流速：2500〜3000ml／min
検出波長：260nm
勾配：B％：2％〜12％（40min）
サンプル注入量が350〜400gである。
精製過程：リン酸溶液又は塩酸溶液で濃縮後の粗溶液のpHを3〜7に調整し、クロマトグラフカラムを30％以上のエタノールできれいに洗浄した後、均一にサンプルを注入し、サンプル注入量が350〜400gである。直線勾配溶離を40min行い、目的ピークを収集する。
3．濃縮及び凍結乾燥：
精製後のサンプル溶液を膜濃縮装置（分画分子量が200である中空糸膜）でナノ濾過して100〜150g／Lまで濃縮し、続いて、真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、純度が98％よりも大きいβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドが得られ、総収率が80．9％に達することができる。
本発明において、サンプルの目的ピークを収集することにより、標準に達する場合、それを膜濃縮装置でナノ濾過し、更に真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを得る。本発明に記載の方法で調製された凍結乾燥製品であるβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドは、純度が98％に達することができ、総収率が80％以上に達することができ、また、本発明は、操作が簡単であるので、生産効率も他のプロセスよりも2倍以上向上させ、従来技術の、残留リン酸イオンが除去され難く、調製された製品の純度が低く、収率が低いという問題を効果的に解決した。本発明は良好な市場における将来性を有し、精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの工業的生産に適用できる。
本発明の応用は上記の例示に限定されず、当業者にとって、上記説明に基づいて改良又は変更することができ、これらの改良及び変更はいずれも本発明の特許請求の範囲の保護範囲に属すべきであることを理解されたい。
Claims (9)
- 前処理されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液に膜濃縮装置で精密濾過及びナノ濾過を順次行い、濃縮された粗溶液を収集するステップaと、
得られた粗溶液のpH値を3〜7に調整し、サンプルを逆相高速液体クロマトグラフ分取カラムに注入し、固定相がオクタデシルシラン結合シリカゲルであり、移動相Aが塩酸溶液で調製されたpH3〜7の溶液であり、移動相Bがエタノールである条件で、勾配溶離による精製を行い、精製されたサンプル溶液を得るステップbと、
精製されたサンプル溶液を膜濃縮装置でナノ濾過した後、真空凍結乾燥機で凍結乾燥し、精製されたβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドを得るステップcと、を含むことを特徴とするβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。 - 前記ステップaにおいて精密濾過に用いる精密濾過膜の孔径が0．2〜1μmであることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
- 前記ステップaにおいてナノ濾過に用いるナノ濾過膜は、分画分子量が200であることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
- 前記ステップaにおいてナノ濾過に用いるナノ濾過膜は中空糸膜であることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
- 前記ステップaにおいて濃縮された粗溶液の濃度が20〜30g／Lであることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
- 前記ステップcにおいて膜濃縮装置でナノ濾過された後の、精製されたサンプル溶液の濃度が100〜150g／Lであることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
- 前記ステップbにおいて、体積比で移動相A：移動相Bが2：98〜1：1にあることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
- 前記ステップcにおいて、ナノ濾過に用いるナノ濾過膜は分画分子量が200である中空糸膜であることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
- 前記ステップbにおいて、勾配溶離時の溶離時間が40minであることを特徴とする請求項1に記載のβ-ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510113667.7A CN104817604B (zh) | 2015-03-16 | 2015-03-16 | 一种β‑烟酰胺单核苷酸的纯化方法 |
| CN201510113667.7 | 2015-03-16 | ||
| PCT/CN2015/096215 WO2016086860A1 (zh) | 2015-03-16 | 2015-12-02 | 一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017504616A true JP2017504616A (ja) | 2017-02-09 |
| JP6324511B2 JP6324511B2 (ja) | 2018-05-16 |
Family
ID=53728101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016542666A Active JP6324511B2 (ja) | 2015-03-16 | 2015-12-02 | β−ニコチンアミドモノヌクレオチドの分取方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10214552B2 (ja) |
| JP (1) | JP6324511B2 (ja) |
| CN (1) | CN104817604B (ja) |
| WO (1) | WO2016086860A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021192683A1 (ja) * | 2020-03-27 | 2021-09-30 | オリエンタル酵母工業株式会社 | β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法 |
| JP2022542546A (ja) * | 2020-06-19 | 2022-10-05 | ボンタック バイオエンジニアリング（シェンゼン） カンパニー リミテッド | ニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを調製する方法 |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104817604B (zh) | 2015-03-16 | 2017-08-04 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种β‑烟酰胺单核苷酸的纯化方法 |
| JP6949002B6 (ja) | 2015-08-05 | 2021-11-17 | メトロ インターナショナル バイオテック，エルエルシー | ニコチンアミドモノヌクレオチド誘導体及びそれらの使用 |
| GB2542881B (en) | 2015-10-02 | 2020-01-01 | Carr Andrew | Crystal forms of ß-nicotinamide mononucleotide |
| WO2018023205A1 (zh) * | 2016-07-30 | 2018-02-08 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法 |
| CN108026130B (zh) * | 2016-07-30 | 2021-04-02 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 |
| CN106755209B (zh) * | 2016-12-29 | 2021-07-23 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法 |
| RU2658426C1 (ru) * | 2017-05-31 | 2018-06-21 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ЭЛЕСТ"(ООО"НПФ"ЭЛЕСТ") | Способ получения никотинамидадениндинуклеотида (над) |
| US11180521B2 (en) | 2018-01-30 | 2021-11-23 | Metro International Biotech, Llc | Nicotinamide riboside analogs, pharmaceutical compositions, and uses thereof |
| EA202190134A1 (ru) | 2018-06-27 | 2021-03-26 | Плайэнт Терапьютикс, Инк. | Соединения аминокислот с неразветвленными линкерами и способы их применения |
| US11939348B2 (en) | 2019-03-22 | 2024-03-26 | Metro International Biotech, Llc | Compositions comprising a phosphorus derivative of nicotinamide riboside and methods for modulation of nicotinamide adenine dinucleotide |
| US10618927B1 (en) | 2019-03-22 | 2020-04-14 | Metro International Biotech, Llc | Compositions and methods for modulation of nicotinamide adenine dinucleotide |
| CN111424064A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-17 | 比瑞博生物科技(北京)有限公司 | 一种基于酶法的高纯度nmn制备工艺 |
| CN112167617A (zh) * | 2020-06-29 | 2021-01-05 | 武汉林宝莱生物科技有限公司 | 一种女性抗衰老美白丸及其制备方法 |
| CN112159445B (zh) * | 2020-09-29 | 2022-04-05 | 浩宇康宁健康科技（湖北）有限公司 | β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法和制备方法 |
| CN112225759A (zh) * | 2020-10-22 | 2021-01-15 | 闵令涛 | 一种β-烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法 |
| CN114487218B (zh) * | 2020-10-23 | 2023-11-14 | 北京红惠新医药科技有限公司 | β-烟酰胺单核苷酸的分析方法 |
| CN114660187A (zh) * | 2020-12-23 | 2022-06-24 | 安徽古特生物科技有限公司 | 一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法 |
| CN112851720A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-28 | 音芙医药科技(上海)有限公司 | 一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度nmn的方法 |
| CN112870979B (zh) * | 2020-12-31 | 2022-12-23 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法 |
| CN112979730B (zh) * | 2021-02-23 | 2022-08-23 | 成都西域从容生物科技有限公司 | 一种nmn提取及纯化方法 |
| CN113121629B (zh) * | 2021-03-25 | 2023-07-21 | 沁浩膜技术(厦门)有限公司 | 一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法 |
| CN113295779B (zh) * | 2021-04-07 | 2023-02-28 | 甘肃国信润达分析测试中心 | 一种保健品中β-烟酰胺单核苷酸的快速测定方法 |
| WO2022251491A1 (en) | 2021-05-27 | 2022-12-01 | Metro International Biotech, Llc | Crystalline solids of nicotinic acid mononucleotide and esters thereof and methods of making and use |
| CN113274361B (zh) * | 2021-06-08 | 2022-05-06 | 吉林津升制药有限公司 | 一种烟酰胺冻干粉针剂及其制备方法 |
| CN114113385B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-05-12 | 成都川宇健维生物科技有限公司 | β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法 |
| CN114317643A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-04-12 | 宝莱福健康科技研究(中山)有限公司 | 一种烟酰胺单核苷酸的制备方法 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60222490A (ja) * | 1984-04-17 | 1985-11-07 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | セフアロスポリン誘導体およびその塩 |
| JPS6425056A (en) * | 1987-07-21 | 1989-01-27 | Nippon Oils & Fats Co Ltd | Manufacture of macromolecular filler for liquid chromatography |
| JPH04282396A (ja) * | 1990-09-28 | 1992-10-07 | Bristol Myers Squibb Co | 抗かび化合物 |
| JP2000007696A (ja) * | 1998-06-25 | 2000-01-11 | Iatron Lab Inc | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬 |
| JP2000106893A (ja) * | 1998-10-06 | 2000-04-18 | Kobe Tennenbutsu Kagaku Kk | タキサン型ジテルペン類の製造方法 |
| JP2009198177A (ja) * | 2006-06-02 | 2009-09-03 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | 分離方法 |
| JP2011107124A (ja) * | 2009-10-22 | 2011-06-02 | Sony Corp | 生体情報取得方法 |
| WO2011125967A1 (ja) * | 2010-04-05 | 2011-10-13 | 塩野義製薬株式会社 | カテコール基を有するセフェム化合物 |
| WO2012004917A1 (ja) * | 2010-07-06 | 2012-01-12 | Kaminishi Hidenori | 神経突起伸長剤 |
| WO2016160524A1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | Cornell University | Efficient synthesis of nicotinamide mononucleotide |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4411995A (en) | 1981-09-28 | 1983-10-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Synthesis of nicotinamide cofactors |
| US4622294A (en) * | 1985-02-08 | 1986-11-11 | Kung Viola T | Liposome immunoassay reagent and method |
| CN101503723A (zh) * | 2009-03-16 | 2009-08-12 | 南京工业大学 | 一种利用反应分离耦合技术制备核苷酸的方法 |
| CN101967182B (zh) * | 2009-07-27 | 2012-08-08 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种抗菌化合物及其制备方法和用途 |
| CN104817604B (zh) | 2015-03-16 | 2017-08-04 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | 一种β‑烟酰胺单核苷酸的纯化方法 |
-
2015
- 2015-03-16 CN CN201510113667.7A patent/CN104817604B/zh active Active
- 2015-12-02 US US15/110,005 patent/US10214552B2/en active Active
- 2015-12-02 JP JP2016542666A patent/JP6324511B2/ja active Active
- 2015-12-02 WO PCT/CN2015/096215 patent/WO2016086860A1/zh active Application Filing
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60222490A (ja) * | 1984-04-17 | 1985-11-07 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | セフアロスポリン誘導体およびその塩 |
| JPS6425056A (en) * | 1987-07-21 | 1989-01-27 | Nippon Oils & Fats Co Ltd | Manufacture of macromolecular filler for liquid chromatography |
| JPH04282396A (ja) * | 1990-09-28 | 1992-10-07 | Bristol Myers Squibb Co | 抗かび化合物 |
| JP2000007696A (ja) * | 1998-06-25 | 2000-01-11 | Iatron Lab Inc | 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する方法及び分解防止用試薬 |
| JP2000106893A (ja) * | 1998-10-06 | 2000-04-18 | Kobe Tennenbutsu Kagaku Kk | タキサン型ジテルペン類の製造方法 |
| JP2009198177A (ja) * | 2006-06-02 | 2009-09-03 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | 分離方法 |
| JP2011107124A (ja) * | 2009-10-22 | 2011-06-02 | Sony Corp | 生体情報取得方法 |
| WO2011125967A1 (ja) * | 2010-04-05 | 2011-10-13 | 塩野義製薬株式会社 | カテコール基を有するセフェム化合物 |
| WO2012004917A1 (ja) * | 2010-07-06 | 2012-01-12 | Kaminishi Hidenori | 神経突起伸長剤 |
| WO2016160524A1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | Cornell University | Efficient synthesis of nicotinamide mononucleotide |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| CHRIST, W. ET AL., METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 66, JPN6017024120, 1980, pages 71 - 81, ISSN: 0003721198 * |
| MARGOLIS, S. A. ET AL., JOURNAL OF LIQUID CHROMATOGRAPHY, vol. 2, no. 6, JPN6017024123, 1979, pages 837 - 49, ISSN: 0003589845 * |
| YAMADA, K. ET AL., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 352, JPN6017024117, 2006, pages 282 - 5, ISSN: 0003721195 * |
| 化学便覧, vol. 基礎編改訂５版Ｉ, JPN6016022340, 2004, pages 806 - 21, ISSN: 0003721197 * |
| 山岸敬道ら, 若手研究者のための有機実験ラボガイド, JPN6017024121, 2012, pages 182 - 5, ISSN: 0003721196 * |
| 科学大辞典第2版, JPN6018001121, 2005, pages 787, ISSN: 0003721194 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021192683A1 (ja) * | 2020-03-27 | 2021-09-30 | オリエンタル酵母工業株式会社 | β－ニコチンアミドモノヌクレオチド又はその薬理学的に許容される塩からなる化合物、並びにその品質評価方法および酵素反応性の判定方法 |
| JP2022542546A (ja) * | 2020-06-19 | 2022-10-05 | ボンタック バイオエンジニアリング（シェンゼン） カンパニー リミテッド | ニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを調製する方法 |
| JP7213603B2 (ja) | 2020-06-19 | 2023-01-27 | ボンタック バイオエンジニアリング（シェンゼン） カンパニー リミテッド | ニコチンアミドを原料としてニコチンアミドモノヌクレオチドを調製する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104817604A (zh) | 2015-08-05 |
| US20160333041A1 (en) | 2016-11-17 |
| CN104817604B (zh) | 2017-08-04 |
| WO2016086860A1 (zh) | 2016-06-09 |
| US10214552B2 (en) | 2019-02-26 |
| JP6324511B2 (ja) | 2018-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6324511B2 (ja) | β−ニコチンアミドモノヌクレオチドの分取方法 | |
| KR102165406B1 (ko) | 방향족 아미노산의 정제 방법 | |
| US20160340378A1 (en) | Method for purifying oxidized form of beta-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | |
| US20160264620A1 (en) | Separation And Purification Method For Vancomycin Hydrochloride Of High Purity | |
| CN103130876B (zh) | 一种高纯度多粘菌素b的制备方法 | |
| CN105001309B (zh) | 一种达巴万星的分离纯化方法 | |
| CN104418742B (zh) | 一种从金银花提取物中制备高纯度绿原酸的方法 | |
| CN104876994B (zh) | 一种纯化氧化型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法 | |
| CN101792822B (zh) | 从半纤维素酸水解液中分离提纯木糖、阿拉伯糖的方法 | |
| JP2015096076A (ja) | 発酵ブロスから有機酸およびアミノ酸を分離する方法 | |
| JP2011051909A (ja) | レバウディオサイドａの精製方法 | |
| CN100509760C (zh) | 四区模拟移动床分离纯化发酵液中的谷氨酰胺的方法 | |
| CN109721632B (zh) | 一种高纯度神经节苷脂gm1及其制备方法 | |
| CN103242402B (zh) | 一种快速制备高纯度的n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 | |
| CN104371011A (zh) | 高纯度替考拉宁精粉的纯化方法 | |
| CN102617727B (zh) | 一种胸腺法新化合物及其新制法 | |
| CN100393691C (zh) | 一种采用大孔吸附树脂制备扁桃酸的方法 | |
| CN110066306A (zh) | 一种异鼠李素-3-o-新橙皮苷制备液相色谱分离方法 | |
| RU2727130C1 (ru) | Способ хроматографического выделения и концентрирования антоцианов | |
| CN110016062A (zh) | 一种香蒲新苷制备液相色谱分离方法 | |
| CN101648984A (zh) | 5’-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法 | |
| CN116874537A (zh) | 一种高纯度烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法 | |
| CN114570065A (zh) | 一种中药中酚酸类成分的分离方法 | |
| CN117903296A (zh) | 一种非水体系分离纯化比伐芦定的方法 | |
| Kiásek | A New Method of Purification of Raw Mixtures of Alkaloids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170703 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170830 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180309 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180322 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180410 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6324511 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |