RU2727130C1 - Способ хроматографического выделения и концентрирования антоцианов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам извлечения антоцианов из растительного сырья. Для выделения антоцианов используют водно-спиртовой экстракт ягод черники. Водный раствор, содержащий антоцианы, подают в предварительно промытую уксусной кислотой хроматографическую систему, состоящую из предколонны и колонны, заполненных стиролдивинилбензольным сорбентом, не содержащим дополнительных функциональных групп, имеющим размером пор от 10 до 60 нм. Объем сорбента, размещенный в предколонне, составляет 20-25% от объема сорбента в колонне. Раствор, содержащий антоцианы, подают в систему колонн в количестве, не превышающем 80% от суммарного объема предколонны и колонны. Элюирование проводят путем подачи раствора этилового спирта в направлении, обратном направлению подачи исходного раствора, содержащего антоцианы, и производят сбор целевой фракции. Сорбент промывают раствором уксусной кислоты. Целевую фракцию упаривают и высушивают. Изобретение обеспечивает повышение производительности процесса при сохранении высокой степени выделения и концентрирования целевого продукта. 6 з.п. ф-лы, 8 пр.

Description

Изобретение относится к области хроматографии и может быть использовано для выделения и концентрирования антоцианов из экстрактов растительного сырья.

Антоцианы содержатся во многих растениях (в плодах, ягодах, листьях), придавая им яркую окраску (обычно синюю, фиолетовую, красную), и могут, в частности, использоваться в качестве пигментов. Антоцианы также обладают биологической активностью, поэтому их можно использовать для профилактики ряда заболеваний. Для выделения, концентрирования и очистки антоцианов, как правило, используют экстракты различных частей растений. Наиболее эффективными методами их обработки являются сорбционно-хроматографические методы.

Например, известен способ выделения индивидуальных антоциановых пигментов из водно-спиртового экстракта жмыха красного винограда, получаемых сорбцией антоцианов на тальке с последующим элюированием водно-спиртовым раствором и хроматографическим разделением на индивидуальные антоцианы. Хроматографическое разделение антоцианов осуществляют пропусканием их под вакуумом через колонку или фильтр, заполненные силикагелем с размером частиц 0,040-0,063 мм с использованием в качестве элюента трехкомпонентной смеси: этилацетат:уксусная кислота:вода (RU 2302423, 2006).

Известен способ очистки экстрактов растений, содержащих антоцианы, с использованием сорбента на основе силикагеля с привитыми С18 группами. Используемый в способе сорбент хорошо удерживает гидрофобные органические соединения, что позволяет очистить экстракт от Сахаров и кислот. Промывка сорбента, осуществляемая этилацетатом, позволяет удалить фенольные соединения, отличные от антоцианов (Luis Е. Rodriguez-Saona, Ronald Е. Wrolstad Extraction, Isolation, and Purification of Anthocyanins. // Food Analytical Chemistry, 2001, F1.1.1-F1.1.11).

Однако описанный способ пригоден только для аналитических целей, так как не позволяет полностью регенерировать сорбент, как органическими растворителями, так и слабыми щелочами и кислотами.

Известен способ выделения и очистки фенольных соединений из растительного сырья, включающий: получение кислого водного экстракта с рН около 1, нанесение фильтрата на бромированный полистирольный сорбент, промывание сорбента промывочным элюентом для удаления не фенольных соединений, элюирование со сбором целевой фракции и регенерацию сорбента. (US 2009/0099373, 2009).

Недостатком способа является недостаточно высокий выход антоцианов при экстракции подкисленным водным раствором, при этом сорбция антоцианов бромированным стиролдивинилбензолом требует большого объема растворителей для их элюирования, что снижает производительность процесса. Недостатком способа является также проведение концентрирования с добавкой раствора, содержащего бисульфит-ион, и необходимость упаривания после подкисления серной кислотой.

Известен также способ выделения антоцианов из черничного экстракта, проводимый с помощью одной или двух хроматографических колонок, описанный в US 6780442,2004. Известный способ включает добавление бисульфит ионов (HSO₃ ^-) для образования антоциан-бисульфитных комплексов. Проводят фильтрацию с использованием целлита. Пропускание полученного раствора через обращенно-фазовый сорбент, который слабо удерживает антоциан-бисульфитные комплексы. Затем проводят подкисление пробы до рН 1-1,25 для разрушения антоциан-бисульфитных комплексов. Упаривают раствор для удаления SO₂. Наносят полученный раствор на сорбент SEPABEADS SP207 с последующей промывкой и снятием пробы. Полученный продукт содержит до 45 мас. % антоцианов. Выход 79-95%.

Недостатком способа является то, что добавление бисульфит ионов приводит к выделению большого количества SO₂, что приводит к значительным сложностям при работе в больших масштабах. Целит принципиально не может быть использован повторно. Также, с учетом количества необходимых операций данный метод занимает крайне продолжительное время. О возможности и способах регенерации сорбентов не сказано.

Известен способ, описанный в US 8575334 В2 2013. Данный способ включает нанесение экстракта на сорбенты из числа Oasis МСХ, Oasis HLB, Sephadex LH-20 или Sep-Pak С18, промывку и элюирование продукта. Элюирование производится раствором с рН 9,5 -10. Данный способ позволяет получить антоцианы высокой чистоты (более 85 мас. %) с выходом более 93%, однако для реальной технологии не предназначен.

Способ включает использование картриджей для твердофазной экстракции и предназначен для получения высокоочищенных антоцианов для последующего анализа. Масштабирование описанного подхода, способы регенерации и нагрузочные характеристики не обсуждаются.

Известен способ, описанный в US 9969707, 2018, в соответствии с которым предложено на первой стадии фильтровать спиртовой экстракт через фильтр с размером пор 100 мкм, затем при необходимости через 10 мкм фильтр. Далее из экстракта отгоняют спирт. Повторно фильтруют. Затем наносят на силикагель, модифицированный группами С-8 либо С-18, с последующей промывкой и элюированием. Данный способ позволяет получить продукт с содержанием антоцианов более 40 мас. %.

Недостатком описанного способа является невозможность полной регенерации сорбента на основе силикагеля, так как для этого необходимо использовать щелочь. Таким образом, после нескольких циклов дорогой сорбент необходимо заменять.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ хроматографического выделения и концентрирования антоцианов из водно-спиртового экстракта черники, включающий следующие стадии. Экстракцию черники 70%-ным этиловым спиртом, содержащим 3% серной кислоты с последующим удалением спирта упариванием и одновременным разбавлением водой для предотвращения выпадения осадка. Добавление к полученному водному раствору порошка целлита (Celite 512) и нанесение полученной суспензии на фильтр со слоем целита. Фильтрацию суспензии с последующей промывкой фильтра 1%-ным раствором серной кислоты и разбавлением деионизованной водой. Нанесение полученного раствора на бромированный стиролдивинилбензол (сорбент SP 207). Промывку колонны 1 объемом 0,1 об. % уксусной кислоты и 2,5 объема колонки 10%-ным этиловым спиртом, содержащим 0,1 об. % уксусной кислоты. Элюирование 10-ю колоночными объемами 70%-ного спирта. Высушивание целевого продукта под вакуумом при 60°С. В результате получают обогащенный антоцианами продукт с 32%-ным содержанием антоцианов (US 6960360б 2005).

Недостатком, способа, принятого за прототип, является его низкая производительность, обусловленная большой продолжительностью хроматографического процесса. Известный способ характеризуется пропусканием не менее 13,5 колоночных объемов, длительностью процедуры подготовки экстракта за счет фильтрации с предварительным получением суспензии с целитом и наслаиванием суспензии на фильтр. Кроме того, использованный сорбент-целит не подлежит регенерации. Производительность известного способа не превышает 0,75 граммов на литр сорбента в час.

Анализ уровня техники показал, что содержание антоциановых пигментов в водно-спиртовых экстрактах черники химическими методами не удается поднять выше 20-25%. Требования промышленности к продукту по этому показателю должны превышать 30%.

Поэтому существует необходимость в повышении производительности сорбционно-хроматографических методов выделения и концентрирования антоцианов.

Задачей настоящего изобретения является разработка эффективного способа выделения и концентрирования антоцианов из водно-спиртового экстракта черники с содержанием антоцианов 0,8-1,4 мас. %.

Целью изобретения является увеличение производительности выделения антоцианов при достижении их содержания в продукте не менее 30%.

Поставленная задача решается описываемым способом хроматографического выделения и концентрирования антоцианов из водно-спиртового экстракта черники, который включает удаление из экстракта спирта с получением водного раствора, подачу раствора на колонну с полимерным сорбентом, промывку колонны раствором уксусной кислоты, фракционное элюирование с использованием раствора этилового спирта, высушивание целевой фракции продукта, причем водный раствор, содержащий антоцианы, наносят на сорбент путем его подачи в хроматографическую систему, состоящую из предколонны и колонны, заполненных стиролдивинилбензольным сорбентом, не содержащем дополнительных функциональных групп, имеющем размером пор от 10 до 60 нм, при этом объем сорбента, размещенный в предколонне, составляет 20-25% от объема сорбента в колонне. Согласно способу, перед подачей водного раствора, содержащего антоцианы, производят предварительную промывку системы раствором уксусной кислоты, водный раствор, содержащий антоцианы, подают в количестве, не превышающем 80% от суммарного объема системы, состоящей из предколонны и колонны, элюирование осуществляют путем подачи раствора этилового спирта в направлении, обратном направлению подачи исходного раствора, содержащего антоцианы, со сбором целевой фракции.

В предпочтительном варианте в качестве сорбента используют Диасфер-150-CT или DIAION HP20SS, загруженные в систему, где предколонна и колонна имеют равные диаметры.

Способ осуществляют, преимущественно, при следующих параметрах процесса.

После нанесения раствора, содержащего антоцианы, для промывки колонны используют 0,08-0,12 об. % раствор уксусной кислоты в количестве, равном 2 объемам системы, состоящей из предколонны и колонны, подаваемый с линейной скоростью, равной 0,9-1,1 см/мин.

На стадии элюирования раствор этилового спирта с концентрацией 70-75 об. % пропускают в обратном направлении с линейной скоростью 0,9-1,1 см/мин, в количестве равном 2 двум объемам системы, состоящей из предколонны и колонны.

Направление потока опять изменяют и проводят промывку 0,08-0,12 об. % раствором уксусной кислоты, пропуская 5 объемов системы со скоростью 2,4 см/мин.

Дополнительно осуществляют регенерацию сорбента в предколонне путем пропускания через нее вначале ОДМ раствора NaOH в количестве, равном 3 объемам, со скоростью 1 мл/мин (линейная скорость 0,22 см/мин) и затем воды в количестве, равном 4 объемам.

В объеме совокупности признаков независимого пункта формулы достигается увеличение производительности процесса относительно прототипа в 4-5 раз, поскольку способ реализуется с использованием не более 11 объемов хроматографической системы, что снижает общую продолжительность процесса выделения антоцианов из водно-спиртового экстракта черники с содержанием антоцианов 0,8-1,4 мас. %, обеспечивая их содержание в целевом продукте не менее 30 мас. %. Содержание антоцианов на всех стадиях контролировалось рН дифференциальным спектрофотометрическим методом. Предложенный способ обеспечивает производительность 1,23-3,91 г/л час, что значительно выше производительности способа-прототипа.

Признаки, включенные в зависимые пункты формулы, являются предпочтительными в частных случаях осуществления изобретения, а их выбор обусловлен следующим. Линейная скорость потока в процессе 0,9-1,1 см/мин обусловлена тем, что при ее превышении увеличиваются потери и снижается чистота продукта, а при уменьшении - увеличивается чистота, но несколько увеличивается продолжительность процесса. На этапе регенерации колонны скорость может достигать 2,4 см/мин.

Возможность осуществления изобретения с получением целевого продукта, содержащего антоцианы в количестве не менее 30 мас. % с выходом более 85 мас. % от их содержания в сырье, проиллюстрирована конкретными примерами, приведенными ниже, включая сравнительные примеры.

Примеры.

Во всех примерах в качестве сырья использован водно-спиртовой экстракт ягод черники, из которого предварительно удален этиловый спирт выпариванием при одновременном разбавлении экстракта водой для предотвращения выпадения осадка. Далее полученный водный раствор, содержащий антоцианы в количестве 0,8-1,4 мас. %, подвергнут хроматографическому выделению и концентрированию антоцианов. Пример 1.

Предколонну объемом 15 мл и колонну объемом 60 мл обе диаметром 24 мм, заполненные сорбентом Диасфер-150-CT (размер частиц 100-250 мкм, диаметр пор 10-15 нм) промывают 375 мл 0,1 об. % раствора уксусной кислоты при скорости потока 11 мл/мин (2,4 см/мин) в течение 34 минут. Далее 65 мл водного концентрата экстракта черники с содержанием антоцианов 10,5 мг/мл наносят на подготовленную колонну со скоростью 4 мл/мин (0,9 см/мин) в течение 16 минут. Промывают 150 мл 0,1 об. % раствора уксусной кислоты со скоростью 4 мл/мин (0,9 см/мин) в течение 38 мин.

Направление потока изменяют и проводят элюирование 225 мл 70%-ного этилового спирта со скоростью 4 мл/мин (0,9 см/мин) в течение 57 мин. Первую фракцию объемом 75 мл отбрасывают (19 мин). Целевую фракцию собирают в объеме 150 мл в течение 38 мин. Направление потока опять изменяют и проводят промывку, пропуская 375 мл 0,1 об. % раствора уксусной кислоты со скоростью 11 мл/мин (2,4 см/мин) в течение 34 мин.

Целевую фракцию упаривают до объема 45 мл и подвергают распылительной сушке. Получают 1,84 г продукта с содержанием антоцианов 33,7%. Выход составляет 90,7%. Время полного цикла концентрирования с выделением чистого продукта составляет 145 мин (2,42 ч), что соответствует производительности 3,41 г антоцианов на 1 л сорбента в час.

Пример 2.

Процесс осуществляют в условиях примера 1, но в качестве сорбента используют DIAION HP20SS (размер частиц 75-150 мкм, диаметр пор 58-60 нм), скорость потока составила 1,5 мл/мин (0,33 см/мин), вместо 1 мл/мин (0,22 см/мин). Объем пробы 65 мл. Объем пропускаемого 70%-ного этилового спирта 225 мл. Экстракт черники с содержанием антоцианов 12,9 мг/мл.

Получают 1,94 грамм продукта с содержанием антоцианов 40,2%. Выход составляет 93%. Время полного цикла выделения и концентрирования составило 505 мин (8,42 ч), что соответствует производительности 1,23 г антоцианов на 1 л сорбента в час.

Пример 3.

Процесс осуществляют в условиях примера 1, но скорость нанесения, промывки и элюирования 5 мл/мин (1,1 см/мин), скорость регенерации 11 мл/мин (2,4 см/мин). Используют 0,08 об. % раствор уксусной кислоты.

Получают 1,97 грамм продукта с содержанием антоцианов 30,2%. Выход составляет 87,2%. Время полного цикла 122 мин (2,03 ч), что соответствует производительности 3,91 грамм антоцианов на 1 л сорбента в час.

Пример 4.

Процесс осуществляют в условиях примера 1, но колонна с диаметром 15 см и высотой 20 см, объем сорбента в колоне - 3096 мл, в предколонне- 774 мл, скорости 160 мл/мин (0,9 см/мин) и 425 мл/мин (2,4 см/мин). Экстракт черники, содержащий антоцианов 13,69 мг/мл. Объем пробы 2460 мл. Используется 0,12 об. % раствор уксусной кислоты.

Получают 94,5 грамма продукта с содержанием антоцианов 32,1%. Выход составляет 90,1%. Время полного цикла 182 мин (3,03 ч), что соответствует производительности 2,59 грамма антоцианов на 1 л сорбента в час.

Пример 5.

Процесс осуществляют в условиях примера 1, но колонна с диаметром 15 см и высотой 20 см, объем сорбента в колоне - 3096 мл, в предколонне - 774 мл, скорости 160 мл/мин (0,9 см/мин) и 425 мл/мин (2,4 см/мин). Экстракт черники, содержащий 13,69 мг/мл антоцианов. Объем пробы 2475 мл. Первую фракцию при смене потока собирают как целевую. Используется 0,12 об. % раствор уксусной кислоты.

Получают 111,1 грамм продукта с содержанием антоцианов 30,5%. Выход составляет 98,7%. Время полного цикла очистки 182 мин (3,03 ч), что соответствует производительности 2,89 граммов антоцианов на 1 л сорбента в час.

Пример 6 (сравнительный).

Процесс осуществляют в условиях примера 1, но без предколонны, объем сорбента в колонне 75 мл. Экстракт черники, содержащий 8,75 мг/мл антоцианов.

В данных условиях не удается нанести 65 мл пробы (80 об. % от объема сорбента). Максимальная нагрузка составляет 40 мл пробы (61,5 об. % от объема сорбента) из-за возникновения «языков», т.е.фронт нанесения пробы идет крайне неравномерно, что не дает сильнее нагрузить сорбент без значительных потерь.

Получают 0,96 граммов продукта с содержанием антоцианов 33,3%. Выход составляет 91,1%. Время полного цикла очистки 139 мин (2,32 ч), что соответствует производительности 1,84 г антоцианов на 1 л сорбента в час.

Пример 7 (сравнительный).

Процесс осуществляют в условиях примера 1, но в качестве сорбента используют Диасфер-75-CT (размер частиц 100-250 мкм, диаметр пор 7,5 нм).

После нанесения 20 об. % пробы от объема сорбента начинается проскок. Пример 8 (сравнительный).

Предколонну объемом 15 мл и колонну объемом 60 мл обе диаметром 24 мм, заполненные сорбентом SEPABEADS SP207 (бромированный стиролдивинилбензол, размер частиц 250-850 мкм, диаметр пор 22 нм) промывают 375 мл 0,1 об. % раствора уксусной кислоты при скорости потока 11 мл/мин (2,4 см/мин) в течение 34 минут. Далее 300 мл водного концентрата экстракта черники с содержанием антоцианов 7,95 мг/мл наносят на подготовленную колонну со скоростью 1 мл/мин (0,2 см/мин) в течение 300 минут. Промывают 150 мл 0,1 об. % раствора уксусной кислоты со скоростью 1 мл/мин(0,2 см/мин) в течение 150 мин.

Направление потока изменяют и проводят элюирование 825 мл 70%-ного этилового спирта со скоростью 1 мл/мин (0,2 см/мин) в течение 825 мин. Первую фракцию объемом 75 мл отбрасывают (75 мин). Целевую фракцию собирают в объеме 750 мл в течение 750 мин. Направление потока опять изменяют и проводят регенерацию, пропуская 225 мл 0,1 М раствора NaOH со скоростью 1 мл/мин (0,2 см/мин) в течение 225 мин, затем 300 мл воды со скоростью 11 мл/мин (2,4 см/мин) в течение 27 мин, и затем 375 мл 0,1 об. % раствора уксусной кислоты со скоростью 11 мл/мин (2,4 см/мин) в течение 34 мин.

Целевую фракцию упаривают до объема 100 мл и подвергают распылительной сушке. Получают 7,05 г продукта с содержанием антоцианов 28,3%. Выход составляет 83,6%. Время полного цикла очистки 1561 мин (26 ч), что соответствует производительности 1,02 г антоцианов на 1 л сорбента в час.

Представленные в примере 8 результаты осуществления способа при использовании бромированного сорбента SEPABEADS SP207 (сорбент, используемый в способе-прототипе), но при варьировании параметров процесса показали следующее. Увеличение скорости нанесения, промывки, снятия до 1,5-2 мл/мин (0,33-0,44 см/мин) приводит к снижению выхода до 65-75%. Увеличение объема промывки до 225 мл приводит к снижению выхода до 70% и увеличению содержания антоцианов до 30%. Уменьшение объема промывки до 75 мл приводит к увеличению выхода до 89% и уменьшению содержания антоцианов до 20%.

Таким образом, примерами подтверждено, что для осуществления способа и получения заявленного результата существенным является использование мезо- и макропористых стиролдивинилбензольных сорбентов с диаметром пор 10-60 нм (DIAION HP20SS и Диасфер-150-CT), не содержащих дополнительных функциональных групп.

Использование стиролдивинилбензольных сорбентов с порами менее 10 нм, например, Диасфер-75-CT, не позволяет реализовать предложенный способ из-за низкой сорбционной емкости, что, по-видимому, связано с блокированием большинства пор полимерами, содержащимися в сырье.

Использование, как в прототипе, бромированного стиролдивинилбензола (SEPABEADS SP207) снижает производительность процесса.

Наличие предколонны (20-25 об. % от общего объема сорбента), обусловлено присутствием в исходном сырье пектинов. Высокомолекулярные соединения сорбируются в начале слоя сорбента и искажают ровную линию сорбционного фронта. Это приводит к необходимости снижения нагрузки на 30-40%, что снижает производительность, кроме того, это увеличивает общее время регенерации сорбента. Поэтому нами предложено весь объем сорбента разделить на колонку и предколонку, что обеспечивает ровный фронт нанесения сырья и увеличение нагрузки и, соответственно, производительности. Для снижения затрат и времени на регенерацию целесообразно регенерировать только часть сорбента. Для этого весь сорбент распределяют между колонкой и предколонкой. Увеличение доли сорбента в предколонке выше 25% приводит к увеличению времени регенерации, снижение доли сорбента в предколонке ниже 20% от общего объема сорбента приводит к необходимости более частой регенерации предколонки.

Объем пропускаемого водного раствора, содержащего 0,8-1,4 мас. % антоцианов, оптимально составляет 80% от суммарного объема системы колонны с предколонной, что соответствует нагрузке 11 мг/мл сорбента. В случае превышения нагрузки, которая может быть достигнута, как из-за повышенной концентрации антоцианов, так и из-за увеличения объема наносимого сырья, снижается чистота целевого продукта или его выход.

Как проиллюстрировано в примерах, объем промывки раствором уксусной кислоты на втором этапе составляет 200% от объема системы колонны с предколонной (2 объема). Объем элюирования спиртовым раствором составляет 200% от объема системы колонны с предколонной (2 объема). Объем раствора уксусной кислоты необходимый для предварительного уравновешивания составляет 500% от объема колонны с предколонной (5 объемов).

Таким образом, описанием подтверждена возможность осуществления изобретения с реализацией его назначения и достижение заявленного результата в объеме формулы изобретения.

Claims (7)

1. Способ хроматографического выделения и концентрирования антоцианов из водно-спиртового экстракта черники, включающий удаление из экстракта спирта с получением водного раствора, содержащего антоцианы, нанесение раствора на сорбент путем подачи раствора в колонну с полимерным сорбентом, промывку колонны раствором уксусной кислоты, фракционное элюирование раствором этилового спирта, высушивание целевой фракции продукта, отличающийся тем, что водный раствор, содержащий антоцианы, подают в хроматографическую систему, состоящую из предколонны и колонны, заполненных стиролдивинилбензольным сорбентом, не содержащим дополнительных функциональных групп, имеющим размер пор от 10 до 60 нм, при этом объем сорбента, размещенный в предколонне, составляет 20-25% от объема сорбента в колонне, перед подачей водного раствора, содержащего антоцианы, в хроматографическую систему производят ее предварительную промывку раствором уксусной кислоты, водный раствор, содержащий антоцианы, подают в систему в количестве, не превышающем 80% от суммарного объема предколонны и колонны, элюирование осуществляют раствором этилового спирта, подаваемым в направлении, обратном направлению подачи водного раствора, содержащего антоцианы со сбором целевой фракции.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют Диасфер-150-CT или DIAION HP20SS.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что система состоит из предколонны и колонны, имеющих равные диаметры.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для предварительной промывки используют раствор уксусной кислоты с концентраций 0,08-0,12 об.% в количестве, равном 5-ти объемам системы, состоящей из предколонны и колонны, подаваемый с линейной скоростью, равной 2,4 см/мин.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после нанесения раствора, содержащего антоцианы, для промывки колонны используют 0,08-0,12 об.% раствор уксусной кислоты в количестве, равном 2-м объемам системы, состоящей из предколонны и колонны, подаваемый с линейной скоростью, равной 0,9-1,1 см/мин.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии элюирования раствор этилового спирта с концентрацией 70-75% пропускают с линейной скоростью 0,9-1,1 см/мин, в количестве, равном 2-м объемам системы, состоящей из предколонны и колонны.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют регенерацию сорбента в предколонне путем пропускания через нее вначале 0,1М раствора NaOH в количестве, равном 3-м объемам предколонны, с линейной скоростью 0,22 см/мин и затем воды в количестве, равном 4-м объемам предколонны.