CN103130876B - 一种高纯度多粘菌素b的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度多粘菌素B的制备方法，步骤为：(1)上柱液的准备；(2)上高效液相色谱制备柱，硫酸钠-磷酸缓冲液/有机溶剂作为流动相，收集目标组分，重点去除杂质B1-1和B3，HPLC测定收集液，目标成分B1或B2或B1和B2的混合物的色谱纯度在99.5％以上；(3)精制：将收集的目标组分真空浓缩去有机溶剂，余相进行纳滤脱盐浓缩，浓缩液，得到纯度在99.5％以上的多粘菌素B。本发明的方法提纯多粘菌素B具有纯度高、收率高、工艺简单、可连续进样等优点，产品质量远高于目前EP、USP规定的药用标准，设备一次性投资稍高，但运行成本不高，适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高纯度多粘菌素B的制备方法。
背景技术
多粘菌素B是由多粘芽胞杆菌(bacillus polymyxa)产生的、由多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肽类抗生素。多粘菌素B为多组分产品(见式I)，包括多粘菌数B1、B2、B3、B1-1，其中，B1和B2是有效成分，B3和B1-1为主要杂质。临床使用其硫酸盐，硫酸多粘菌素B对几乎所有的革兰氏阴性细菌都有抗菌作用，由于对绿脓杆菌有高效，曾经是抗绿脓杆菌的首选药物，是目前对付超级细菌有效的二种药物之一，因而备受关注，但是，杂质B3、B1-1毒副作用较大，严重影响了多粘菌素B的临床用药，目前主要是外用，只是局部用于敏感菌的眼、耳、皮肤、粘膜感染及烧伤绿脓杆菌感染。
欧洲药典EP、美国药典USP规定硫酸多粘菌素B的质量标准基本一样，要求B1、B2、B3、B1-1总和≤80.0％，杂质B3≤6.0％、B1-1≤15.0％。目前多粘菌素B的生产主要采用微生物发酵法生物合成，再经提取精制得到，市场上的硫酸多粘菌素B原料药产品，杂质B3在3.5％左右，杂质B1-1在7.5％上下。这类杂质在结构上与有效成分B1、B2极为接近(见式I)，目前常规的超滤、有机溶剂萃取、离子交换树脂、纳滤等分离纯化手段难以去除(GB9798887、GB782926、CN101974075A)。要想口服或注射用药，更多地应用于临床，必须采用新的技术手段，去除B3和B1-1这两个杂质。
式I：
| 多粘菌素 | R | R′ | X | 分子式 | Mr |
| B1 | CH3 | CH3 | L-Leu | C56H98N16O13 | 1204 |
| B2 | H | CH3 | L-Leu | C56H96N16O13 | 1190 |
| B3 | CH3 | H | L-Leu | C56H96N16O13 | 1190 |
| B1-I | CH3 | CH3 | L-Ile | C56H98N16O13 | 1204 |
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的难以去除B3和B1-1等杂质的技术问题，提供一种能有效去除各种杂质、将一般纯度(B1+B2色谱纯度在40-80.0％)多粘菌素B提纯至B1+B2≥99.5％、收率高并适合于工业化大生产的制备高纯度多粘菌素B的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种高纯度多粘菌素B的制备方法，包括如下步骤：
(1)上柱液的准备：按1g∶20-100ml的比例将经发酵并经分离提取得到的原料硫酸多粘菌素B溶于水中，经微孔过滤除杂，得澄清溶液；
(2)上柱分离：流动相为体积比为15-25∶85-75的有机溶剂和硫酸钠-磷酸缓冲液，所述硫酸钠-磷酸缓冲液为用磷酸调pH＝2.0-3.0的20-40mM的硫酸钠水溶液；将步骤(1)获得的澄清溶液进样上高效液相色谱制备柱，制备柱工作压力为3.0-10.0MPa，工作温度为15-35℃，检测波长为215nm，收集不同时段组分，所述目标组分为多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物；
(3)精制：将收集的目标组分真空蒸馏，去除有机溶剂，余相进行纳滤脱盐浓缩，浓缩液经喷干或冻干，得到色谱纯度在99.5％以上、单一杂质在0.1％以下的多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物。
原料为多粘菌素B1与多粘菌素B2之和的色谱纯度为40.0-80.0％的原料。
所述高效液相色谱制备柱中填料优选为C18、C8、C4或C6H5。
所述步骤(2)所述有机溶剂为C1-C4的醇、C3-C4的酮类、乙酸乙酯、乙腈、丙腈和氯仿至少一种。
所述C1-C4的醇优选甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇。
所述C3-C4的酮优选丙酮、2-丁酮。
本发明的优点是：
采用本发明的方法制备高纯度多粘菌素B，总收率在65-85％，产率可达150-250kg产品/100kg填料/月。采用HPLC测定，本发明制备的多粘菌素B色谱纯度可达99.5％以上，单一杂质在0.1％以下，毒副作用较大的杂质B3和B1-1被去除，产品质量远高于目前欧洲药典EP6.0、美国药典USP31规定的药用标准，属于高端产品。其制剂在口服和注射用药方面，可以更广泛地应用于临床。
本发明的方法制备的多粘菌素B具有纯度高、收率高、工艺简单、可连续进样等优点，设备一次性投资稍高，但运行成本不高，适合于工业化生产。
附图说明
图1为原料多粘菌素B样品HPLC图。
图2为实施例1的制备色谱图。(B1收集时段：35.75-42.75min，B2收集时段：15.55-17.15min)
图3为本发明的方法制备的多粘菌素B成品HPLC图。
图4为图3中保留时间7.9min峰对应的质谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
硫酸多粘菌素B原料样品，可以购自山东鲁抗医药股份有限公司，用HPLC检测，B1+B2在65.0-80.0％，杂质B3在2.5-4.5％、杂质B1-1在6.0-9.0％，还可以由本公司实验室制备。
实施例1
(1)上柱液的准备：将1g经发酵并经分离提取得到的原料硫酸多粘菌素B(多粘菌素B1+多粘菌素B2的色谱纯度为74.0％)溶于100ml水中，经微孔0.45μm滤膜过滤除杂，得澄清溶液；澄清溶液取样进行HPLC检测，色谱纯度见图1，杂质B3为3.9％、杂质B1-1为8.4％；
(2)上柱分离：流动相为体积比为15∶85的甲醇和硫酸钠-磷酸缓冲液，所述硫酸钠-磷酸缓冲液为用磷酸调pH＝2.1的20mM的硫酸钠水溶液；将步骤(1)获得的澄清溶液进样上高效液相色谱制备柱，流速1.0ml/min，高效液相色谱制备柱为Kromasil 100-3.5-C18(250×4.6mm)，填料C18的粒径5μm，制备柱工作压力为3.0MPa，工作温度为16℃，采用的UV检测波长为215nm，于15.55-17.15min收集B2，35.75-42.75min收集B1(图2)，合并目标组分，制备柱的产率为3.6g产品/kg填料/h。
(3)精制：收集液含多粘菌素B1和B2为0.65g，-0.1MPa、50℃旋转蒸发浓缩，蒸发出甲醇和部分水，再进行真空冷冻干燥，得多粘菌素B纯品0.62g，相对于B1和B2，收率为83.8％，经HPLC分析(图3)，多粘菌素B(B1+B2)色谱纯度为99.7％。采用LC/MS分析，图3中保留时间7.978min峰对应的质谱见图4，图4为m/z 1189.496及对应的LC/MS碎片离子峰，验证了图3中保留时间7.978min的峰就是多粘菌素B2。
实施例2
(1)上柱液的准备：硫酸多粘菌素B原料同实施例1，取样品1.0g，溶于25ml水，经0.45μm滤膜过滤，得澄清溶液；
(2)上柱分离：色谱柱为Kromasil 100-5-C8(250×4.6mm)，填料C8的粒径5μm，缓冲液为35mM硫酸钠水溶液(磷酸调pH＝2.8)，流动相为体积比为23∶77的乙腈和缓冲液，将步骤(1)获得的澄清溶液进样，流速1.2ml/min，工作温度33℃，压力9.2MPa，采用的UV检测波长为215nm，收集目标组分B1。
目标组分于-0.1MPa、50℃旋转蒸发浓缩，蒸发出乙腈和部分水，浓缩液进行冷干，得多粘菌素B1纯品0.51g，相对于B1，收率为80.3％，经HPLC分析，多粘菌素B1纯度为99.9％。
实施例3
用Kromasil 100-3.5-C4替代实施例1中的Kromasil 100-5-C8，其它同实施例1，得到纯度在99.5％以上的多粘菌素B2。
实施例4
用Hypersil-BDS-C6H5替代实施例1中的Kromasil 100-5-C8，其它同实施例1，得到纯度在99.5％以上的多粘菌素B1+B2。
实施例5
取硫酸多粘菌素B原料样品2.0kg，溶于100L水，经0.45μm滤膜过滤，溶液取样进行HPLC检测，色谱纯度：B1+B2为77.9％，杂质B3为3.1％、杂质B1-1为6.7％。
C18柱为填料C18的粒径10-15μm，缓冲液为30mM硫酸钠(磷酸调pH2.4)，流动相改性剂为氯仿，流动相：缓冲液/氯仿＝80/20(v/v)，多粘菌素B溶液进样，流速16L/min，工作温度25℃，压力7.0MPa，采用的UV检测波长为215nm，分别收集B2和B1馏分。隔60min上样一次，每次处理量为200g。
合并收集液，含多粘菌素B1和B2为1.39kg，-0.1MPa、50℃真空浓缩，蒸出甲醇，然后进行纳滤脱盐浓缩，浓缩液经喷雾干燥，得多粘菌素B纯品1.32kg，相对于B1和B2，收率为84.7％。制备柱的产率为180kg产品/100kg填料/月，经HPLC分析，多粘菌素B1+B2纯度为99.8％。
实施例6
(1)上柱液的准备：按1g∶20ml的比例将经发酵并经分离提取得到的原料硫酸多粘菌素B溶于水中，经微孔过滤除杂，得澄清溶液；
(2)上柱分离：流动相为体积比为15∶85的乙酸乙酯和硫酸钠-磷酸缓冲液，所述硫酸钠-磷酸缓冲液为用磷酸调pH＝2.0的30mM的硫酸钠水溶液；将步骤(1)获得的澄清溶液进样上高效液相色谱制备柱，制备柱工作压力为3.0MPa，工作温度为15℃，检测波长为215nm，收集不同时段馏分，所述目标组分为多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物；
(3)精制：将收集的目标馏分在-0.1MPa、60℃下进行真空蒸馏，去除乙酸乙酯，余相进行纳滤脱盐浓缩，浓缩液经冻干，得到色谱纯度在99.5％以上、单一杂质在0.1％以下的多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物。
实施例7
(1)上柱液的准备：按1g∶40ml的比例将经发酵并经分离提取得到的原料硫酸多粘菌素B溶于水中，经微孔过滤除杂，得澄清溶液；
(2)上柱分离：流动相为体积比为25∶75的丙腈和硫酸钠-磷酸缓冲液，所述硫酸钠-磷酸缓冲液为用磷酸调pH＝3.0的40mM的硫酸钠水溶液；将步骤(1)获得的澄清溶液进样上高效液相色谱制备柱，制备柱工作压力为10.0MPa，工作温度为35℃，检测波长为215nm，收集不同时段馏分，所述目标组分为多粘菌素B1和B2的混合物；
(3)精制：将收集的目标馏分在-0.1MPa、50℃下真空蒸馏，去除丙腈，余相进行纳滤脱盐浓缩，浓缩液经喷干，得到色谱纯度在99.5％以上、单一杂质在0.1％以下的多粘菌素B1和B2的混合物。
实施例8
(1)上柱液的准备：按1g∶60ml的比例将经发酵并经分离提取得到的原料硫酸多粘菌素B溶于水中，经微孔过滤除杂，得澄清溶液；
(2)上柱分离：流动相为体积比为20∶80的乙醇和硫酸钠-磷酸缓冲液，所述硫酸钠-磷酸缓冲液为用磷酸调pH＝2.5的20mM的硫酸钠水溶液；将步骤(1)获得的澄清溶液进样上高效液相色谱制备柱，制备柱工作压力为5.0MPa，工作温度为20℃，检测波长为215nm，收集不同时段馏分，所述目标组分为多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物；
(3)精制：将收集的目标馏分在-0.1MPa、55℃下真空蒸馏，去除乙醇，余相进行纳滤脱盐浓缩，浓缩液经喷干，得到色谱纯度在99.5％以上、单一杂质在0.1％以下的多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物。
用异丙醇、丁醇、丙酮或2-丁酮替代本实施例的乙醇也可以制备出99.5％以上高纯度的多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物。
Claims (2)
1.一种高纯度多粘菌素B的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)上柱液的准备：按1g∶20-100ml的比例将经发酵并经分离提取得到的原料硫酸多粘菌素B溶于水中，经微孔过滤除杂，得澄清溶液；
(2)上柱分离：流动相为体积比为15-25∶85-75的有机溶剂和硫酸钠-磷酸缓冲液，所述硫酸钠-磷酸缓冲液为用磷酸调pH＝2.0-3.0的20-40mM的硫酸钠水溶液；将步骤(1)获得的澄清溶液进样上高效液相色谱制备柱，制备柱工作压力为3.0-10.0MPa，工作温度为15-35℃，检测波长为215nm，收集不同时段组分，所述目标组分为多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物；
(3)精制：将收集的目标组分真空蒸馏，去除有机溶剂，余相进行纳滤脱盐浓缩，浓缩液经喷干或冻干，得到色谱纯度在99.5％以上、单一杂质在0.1％以下的多粘菌素B1单体、多粘菌素B2单体，或多粘菌素B1和B2的混合物；
所述高效液相色谱制备柱中填料为C18、C8、C4或C6H5；
所述步骤(2)所述有机溶剂为C1-C4的醇、C3-C4的酮类、乙酸乙酯、乙腈、丙腈和氯仿至少一种；所述C1-C4的醇为甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇；所述C3-C4的酮为丙酮、2-丁酮。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述原料为多粘菌素B1与多粘菌素B2之和的色谱纯度为40.0-80.0％的原料。
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