CN1162433C - 一种纯化鲀毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纯化鲀毒素的方法。首先是离子交换层析，使用弱酸性阳离子交换树脂柱，转换成铵型或氢型，将经过澄清的鲀毒素粗提液上柱，以0.1-2N浓度的乙酸一步或分步洗脱，或使用乙酸梯度洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，减压蒸发至干，然后重溶于乙酸中；其次是凝胶过滤层析，将第一步所得液上柱，用乙酸洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，减压蒸发至干，得纯鲀毒素的乙酸盐固体。将上述固体溶于所需盐的相应酸中，蒸干后得所需盐。溶于苦味酸中，制成苦味酸盐，水溶后用NH4OH沉淀，即获得极纯粹的毒素。该方法简单，操作方便，所得纯鲀毒素的纯度符合药用剂型的需要，又能生产色谱试剂。
Description
本发明属于生物产品提取技术领域，更具体涉及一种纯化鲀毒素的方法。
鲀毒素(tetrodotoxin)，俗称河鲀毒素是一种毒性很强的麻痹性神经毒素，最先发现于鲀形目(tetraodontiformes)鱼类，故称鲀毒素(tetrodotoxin)。后来在爬行类，如：鲵(俗称娃娃鱼)；甲壳类，如蟹；以及微生物中的细菌与藻类中，均有发现。经检索中国专利，CN1058717C，“脱水河豚毒素的提取方法”，该发明的步骤是：(1)纯化河豚毒素母液制备：先将粗品河豚毒素加5-20％醋酸溶解，加无水乙醇1-10倍，离心除去不溶物，然后将上清液移到小烧杯、贮藏在密闭的容器中，并另放一杯乙醚，控制温度5-35℃、12-72小时，最后将醇醚溶液经离心分离出河豚毒素母液，母液经浓缩，加氨水调节PH7-10，收集其沉淀物；(2)高压液相色谱分离提取脱水河豚毒素；将上述沉淀物，用1-30％磷酸溶解，用流动相组成含有0.1-10％甲醇的0.01-0.2M磷酸盐缓冲液，调PH为5.7，流动相流速1-20ml/min，用示差检测器进行检测，分离过程按记录仪上出峰图，收集脱水豚毒馏份；(3)脱水河豚毒素馏份有脱盐、回收：选用填料为酸性阳离子交换树脂和生物凝胶，洗脱剂用1-20％的醋酸，收集PH4-7馏份，加氨水调节PH7.5-10，可沉淀出脱水豚毒素，经反复脱盐，可得到纯品脱水河豚毒素结晶，设备昂贵，产量很低。还有一种制备(纯化)鲀毒素的方法，均以日本人T.后藤等(1965)的方法为经典，(Tetrahedron，1965，Vol.21：2059-2088).然而，在实践中发现，上述方法中有些步骤很难实施，而且步骤太多，每个步骤都有损失，总得率为50％，繁杂。一般技术工人难以操作，难于工厂化。
本发明的目的是提供了一种纯化鲀毒素的方法，方法简单，操作方便，所得纯鲀毒素的纯度符合药用剂型的需要，又能生产色谱试剂。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施，一种纯化鲀毒素的方法，其步骤是：
A、离子交换层析，使用弱酸性阳离子交换树脂中适于工业规模生产用的型号装柱，转换成铵型或氢型，将pH调整为4.0-6.5，将经过澄清的鲀毒素粗提液上柱，先以纯水或缓冲液或低于0.4N浓度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N浓度的乙酸一步或分步洗脱，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脱，收集这一部分含鲀毒素的洗脱液，减压蒸发至干，然后重溶于少量0.01-0.15N乙酸中
B、凝胶过滤层析，选用排阻分子量在1500-4000Da，且适于充填大柱的凝胶装柱，将第一步骤所得鲀毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，得纯鲀毒素的乙酸盐溶液，或者再减压蒸发至干，得纯鲀毒素的乙酸盐固体。
若须获得极纯粹的鲀毒素，可将第二步骤所得纯鲀毒素等当量地溶于苦味酸中，使成为苦味酸盐。冷却后形成苦味酸盐的沉淀，分离沉淀，然后在热水中溶解，加NH4OH使pH上升至9，让纯毒素沉淀下来，过滤收集沉淀，再重新溶于少量稀乙酸溶液中。即获得极纯粹的毒素乙酸盐溶液。
第二步骤所得的纯鲀毒素的乙酸盐固体，重溶于盐酸溶液中，再减压蒸发至干，即或得鲀毒素的盐酸盐固体。重溶于柠檬酸溶液中，再减压蒸发至干，即或得鲀毒素的柠檬酸盐固体。重溶于苦味酸溶液中，再减压蒸发至干，即或得鲀毒素的苦味酸盐固体。制备过程中，可根据药用剂型的需要，依上述法转换为所需要的盐。鲀毒素在酸溶液中相当稳定，如使用液体剂型，则不必干躁。
如果鲀毒素粗提液含有相当多的大分子干扰纯化，可采用配置截留分子量500-5000Da的超滤膜的切向流超滤系统，过滤一次，作为预处理步骤。滤液即可用于第一步骤离子交换柱纯化。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：经过澄清的鲀毒素粗提液，只要经过本发明的纯化方法的第一、二两个步骤的处理，即能成为纯鲀毒素。用薄层层析法检测，本方法所得到的纯鲀毒素与西格玛化学品公司(SIGMA Chemical Co.)的色谱纯鲀毒素一样，只产生一个带，RF值完全相同，均为0.535。本发明方法简单，操作方便，步骤少，得率高，尤其是凝胶过滤层析这工序几乎没有损失，得率在70-90％，易于工业化生产。
实施例1：
以Amberlite IRC-50(SIGMA Chemical Co.)弱酸性阳离子交换树脂装柱(50×2cm)。转换为铵型。调整pH值为5。上样4mL(约含鲀毒素40mg)经澄清的鲀毒素粗提液。洗脱速度为2.6mL min-1。水洗(60mL)，此洗脱物弃去。然后以1.7N乙酸洗脱(250mL)，收集这一部分洗脱物中含鲀毒素的分部。再以水洗(250mL)以回收乙酸。
收集的鲀毒素分部经减压蒸发至干，然后重溶于少量0.1N乙酸中。如有沉淀，离心除去。然后上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝胶过滤柱(100×2cm)。凝胶以0.1N乙酸涨发并平衡。上样1.5mL(含鲀毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脱，洗脱速度为0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脱液，此分部为鲀毒素峰。减压蒸发至干，重溶于少量0.1N盐酸中。再减压蒸发至干，即得到与西格玛化学品公司(SIGMA Chemical Co.)的色谱纯鲀毒素一样的产品。
实施例2
以Bio-Rex 70(Bio-Rad Laboratories)弱酸性阳离子交换树脂装柱(50×2cm)。转换为氢型。调整pH值为4.5。上样4mL(约含鲀毒素40mg的经澄清的鲀毒素粗提液)。洗脱速度为0.79mL min-1。0.1N乙酸洗(60mL)，此洗脱物弃去。然后以0.1-3N乙酸梯度洗脱(500mL)，收集0.44-1.04N乙酸梯度区间的鲀毒素峰。
收集的鲀毒素分部经减压蒸发至干，然后重溶于少量0.1N乙酸中。如有沉淀，离心除去。然后上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝胶过滤柱(100×2cm)，以0.1N乙酸涨发并平衡。上样1.5mL(含鲀毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脱，洗脱速度为0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脱液，此分部为鲀毒素峰。减压蒸发至干，重溶于少量0.1N盐酸中。再减压蒸发至干，即得到与西格玛化学品公司(SIGMA Chemical Co.)的色谱纯鲀毒素一样的产品。
实施例3
以Amberlite IRC-50(SIGMA Chemical Co.)弱酸性阳离子交换树脂装柱(100×4cm)。转换为铵型。调整pH值为4.5。上样500mL(约含鲀毒素250mg的经澄清的鲀毒素粗提液)。洗脱速度为10mLmin-1。以400mL水洗脱，收集液弃去。再以1.7N乙酸溶液1200mL洗脱，收集此部分洗脱液中含鲀毒素的分部。再以1200mL水洗脱，收集此部分，回收乙酸。收集的鲀毒素分部经减压蒸发至干，然后重溶于少量0.1N乙酸中。如有沉淀，离心除去。然后上Bio-GelP-2(Bio-Rad Laboratories)凝胶过滤柱(100×2cm)，以0.1N乙酸涨发并平衡。上样1.5mL(含鲀毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脱，洗脱速度为0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脱液，此分部为鲀毒素峰。减压蒸发至干，重溶于少量0.1N盐酸中。再减压蒸发至干，即得到与西格玛化学品公司(SIGMA Chemical Co.)的色谱纯鲀毒素一样的产品。
Claims (2)
1、一种纯化鲀毒素的方法，其步骤是：
A、离子交换层析，使用弱酸性阳离子交换树脂柱，转换成铵型或氢型，将pH调整为4.0-6.5，将澄清的鲀毒素粗提液上柱，先以纯水或缓冲液或低于0.4N浓度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N浓度的乙酸一步或分步洗脱，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，减压蒸发至干，然后溶于0.01-0.15N乙酸中；
B、凝胶过滤层析，选用排阻分子量在1500-4000Da，充填大柱的凝胶装柱，将第一步所得鲀毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脱，收集含鲀毒素的洗脱液，得纯鲀毒素的乙酸盐溶液，减压蒸发至干，得纯鲀毒素的乙酸盐固体。
2、如权利要求1所述的一种纯化鲀毒素的方法，其特征在于将第二步骤所得纯鲀毒素溶于苦味酸中，成为苦味酸盐，冷却后形成苦味酸盐的沉淀，分离收集沉淀，然后在热水中溶解后加NH4OH使pH上升至9，让纯毒素沉淀下来，过滤收集沉淀，再溶于乙酸溶液中，获得纯粹的毒素乙酸盐溶液。
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