CN114113385B - β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种β‑烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定，属于药物分析技术领域。本发明采用HPLC‑UV法；所述HPLC的色谱柱采用Sinochrom ODS‑BP，4.6×250mm 5μm或柱效相当的色谱柱；流动相A为0.1～0.3％磷酸二氢钾和0.05～0.15％四丁基氢氧化铵的混合水溶液，流动相B为甲醇；流速为1±0.3ml/min，柱温为35℃±10℃；所述β‑烟酰胺单核酸含量的测定的洗脱梯度为等度或梯度，所述有关物质的测定的洗脱为梯度。本发明溶剂和杂质均不干扰主峰的检出，各杂质之间均能达到基线分离，方法专属性强；还有效避免了现有技术中流动相高盐浓度对色谱仪的损害。

Description

β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法
技术领域
本发明涉及一种β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定，属于药物分析技术领域。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotimamide mononucletide,NMN)是人体内一种内源性物质，由烟酰胺在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生产，随后NMN又在烟酰胺单核苷酸转移酶的催化下生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)。NMN在人体内的生理作用都是通过体内转化为NAD+实现，已有的可选研究表明，NMN主要包括参与多种疾病的预防，如2型糖尿病、肥胖症和心力衰竭等。2016年，代谢领域研究最有影响的刊物《Cell metabolism》(Mills等，2016,24：795–806)报道了给实验鼠补充饲喂NMN可有效减轻小鼠与年龄相关的生理衰竭，在没有任何明显毒性或有害影响的情况下，NMN可抑制与年龄相关的体重增加，可增加能量代谢，促进体力活动，改善胰岛素敏感性和血脂水平，并改善眼功能和其他病理性疾病，证明了NMN在抗衰老方面的巨大潜力。因此，NMN是医药、功能性食品、化妆品等行业的珍贵原料。
目前，NMN的制备方法主要包括以下三种：1、酵母菌发酵法；2、化学合成法；3、酶催化合成法。其中酶催化合成法是以烟酰胺、三磷酸腺苷和D-核糖作为底物，在核糖激酶(PK)和烟酰胺核糖磷酸转移酶(NAMPT)作为催化剂的作用下催化制备NMN，是一种绿色环保无公害的NMN制备方法。
在NMN的酶催化合成过程中会产生多个重要的有关物质，这些有关物质如果过多引入药物成品中，将可能导致严重的用药安全性问题。因此，在原料药合成阶段和制剂阶段都需要对这些有关物质进行严格控制。Enrico Balducci等人报道了用液相色谱法，色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶柱，100mmol/L、pH6.0的磷酸二氢钾缓冲盐和甲醇为流动相，柱温16.5℃，流速1.3ml/min，波长254nm，梯度洗脱方式对NMN进行分析(AnalyticalBiochemistry,1995,228,64-68)。Leonardo Sorci等人报道用100mmol/L磷酸二氢钾、8mmol/L四丁基溴化铵、pH6.0的缓冲盐和甲醇为流动相流速1.0ml/min，梯度洗脱方式对NMN进行分析(PNAS,2009,106(9):3083-3088)。这两种方法流动相中缓冲盐浓度过大，易伤色谱柱，且特定杂质烟酰胺核糖(NR)与主峰NMN间不能基线分离，无法实现准确分析。因此寻求一种能够有效分离且尽可能多的检出NMN中有关物质的高效液相色谱法，对于NMN的精确质量控制具有十分重要的意义。
CN 113358776A公开了一种HPLC-UV同时检测NMN中5种有关物质的方法，色谱柱采用C18-Aq柱，流动相A为磷酸二氢钾缓冲盐溶液，流动相B为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为15～35℃，可以定量检测NMN中三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)、烟酰胺(NA)和NHO3的含量。烟酰胺核糖(NR)是合成NMN的起始物料，也是酸破坏和氧化降解NMN时易产生的降解产物，是NMN制备工艺中需要严格控制的特定杂质，但该专利未提及建立的方法是否可以用于同时检测NR。我们将该专利公开的方法用于同时检测NMN、NR、NA、ATP、ADP、AMP和烟酸(VB3)时，发现NR和ATP不能达到基线分离。因而，急需开发操作简便、专属性强、准确度高、适用性广、能同时检测NMN制备过程中多种有关物质的HPLC方法，更好的控制NMN的品质，为食品安全提供保障。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能同时检测β-烟酰胺单核酸的含量和有关物质的方法。
为解决上述技术问题，本发明的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法包括：
采用HPLC-UV法；所述HPLC的色谱柱采用Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm或柱效相当的色谱柱；流动相A为0.1～0.3％磷酸二氢钾和0.05～0.15％四丁基氢氧化铵的混合水溶液，流动相B为甲醇；流速为1±0.3ml/min，柱温为35℃±10℃；
所述β-烟酰胺单核酸含量的测定的洗脱梯度为等度或梯度，所述有关物质的测定的洗脱为梯度；
所述等度为流动相A运行7～10min；
所述梯度为：0～6分钟，流动相A为100％，流动相B为0；6～20分钟，流动相A由100％变为70％，流动相B由0变为30％；20～30分钟，流动相A为70％，流动相B为30％；30～31分钟，流动相A由70％变为100％，流动相B由30％变为0；31～40分钟，流动相A为100％，流动相B为0；
所述UV检测波长为265±10nm。
在一种具体实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为0.2％。
在一种具体实施方式中，所述流动相A中四丁基氢氧化铵的浓度为0.1％。
在一种具体实施方式中，所述流速为1ml/min。
在一种具体实施方式中，所述柱温为35℃。
在一种具体实施方式中，所述检测波长为260nm。
在一种具体实施方式中，所述HPLC的对照品和供试品溶液的制备：取NMN对照品适量和待测样品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg，作为对照品溶液和供试品溶液。
在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸含量的测定方法，其特征在于，所述HPLC的供试品溶液的制备：取待测的NMN样品，用水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg，作为供试品溶液；所述HPLC的自身对照溶液的制备：取供试品溶液适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含5μg，作为自身对照溶液。
在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸有关物质的测定方法，其特征在于，所述有关物质为烟酰胺核糖(NR)、烟酰胺(NA)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)和烟酸(VB3)中的至少一种。
有益效果：
1.本发明溶剂和杂质均不干扰主峰的检出，各杂质之间均能达到基线分离，具体表现在可以定量检测NMN中烟酰胺核糖(NR)、烟酰胺(NA)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)和烟酸(VB3)等6个已知杂质的含量，其中杂质NR即是合成NMN的起始物料，也是酸破坏、氧化易产生的降解杂质，是NMN合成工艺中需要严格控制的特定杂质，本发明能准确测定杂质NR的含量，方法操作简便，专属性强，准确度高，适用性广，可以更好的控制NMN的品质，为食品安全提供保障；
2.同时，本发明还有效避免了现有技术中流动相高盐浓度对色谱仪的损害。
附图说明
图1NMN有关物质测定——系统适用性溶液色谱图；
图2NMN有关物质测定——高温破坏样品溶液色谱图；
图3NMN有关物质测定——碱破坏样品溶液色谱图；
图4NMN有关物质测定——酸破坏样品溶液色谱图；
图5NMN有关物质测定——氧化破坏样品溶液色谱图；
图6NMN含量测定——系统适用性溶液色谱图；
图7NMN含量测定——线性关系图；
图8对比例1——系统适用性溶液色谱图
图9对比例2——系统适用性溶液色谱图
图10对比例3——系统适用性溶液色谱图
具体实施方式
为解决上述技术问题，本发明的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法包括：
采用HPLC-UV法；所述HPLC的色谱柱采用Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm或柱效相当的色谱柱；流动相A为0.1～0.3％磷酸二氢钾和0.05～0.15％四丁基氢氧化铵的混合水溶液，流动相B为甲醇；流速为1±0.3ml/min，柱温为35℃±10℃；
所述β-烟酰胺单核酸含量的测定的洗脱梯度为等度或梯度，所述有关物质的测定的洗脱为梯度；
所述等度为流动相A运行7～10min；
所述梯度为：0～6分钟，流动相A为100％，流动相B为0；6～20分钟，流动相A由100％变为70％，流动相B由0变为30％；20～30分钟，流动相A为70％，流动相B为30％；30～31分钟，流动相A由70％变为100％，流动相B由30％变为0；31～40分钟，流动相A为100％，流动相B为0；
所述UV检测波长为265±10nm。
在一种具体实施方式中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为0.2％。
在一种具体实施方式中，所述流动相A中四丁基氢氧化铵的浓度为0.1％。
在一种具体实施方式中，所述流速为1ml/min。
在一种具体实施方式中，所述柱温为35℃。
在一种具体实施方式中，所述检测波长为260nm。
在一种具体实施方式中，所述HPLC的对照品和供试品溶液的制备：取NMN对照品适量和待测样品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg，作为对照品溶液和供试品溶液。
在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸含量的测定方法，其特征在于，所述HPLC的供试品溶液的制备：取待测的NMN样品，用水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg，作为供试品溶液；所述HPLC的自身对照溶液的制备：取供试品溶液适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含5μg，作为自身对照溶液。
在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸有关物质的测定方法，其特征在于，所述有关物质为烟酰胺核糖(NR)、烟酰胺(NA)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)和烟酸(VB3)中的至少一种。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
(1)供试品溶液的制备：取NMN适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；
(2)自身对照溶液的制备：精密量取供试品溶液适量，加水定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为自身对照溶液；
(3)检测：分别取供试品溶液、自身对照溶液注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
色谱柱为Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相A为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相B为甲醇；流速为1ml/min，柱温35℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
表1：实施例1洗脱梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
6 100 0
20 70 30
30 70 30
31 100 0
40 100 0
实施例2
(1)供试品溶液的制备：取NMN适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg的溶液，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密量取NMN对照品适量，加水定量稀释制成每1ml中约含50μg的溶液，作为对照品溶液；
(3)检测：分别取供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
色谱柱为Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，等度洗脱；流速为1ml/min，柱温35℃，检测波长为265nm。
实施例3
样品制备同实施例1。
色谱柱为Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相A为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相B为甲醇；流速为1ml/min，柱温25℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
表2：实施例3洗脱梯度
Figure BDA0003369275380000051
Figure BDA0003369275380000061
实施例4
样品制备同实施例1。
色谱柱为Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相A为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相B为甲醇；流速为1ml/min，柱温45℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
表3：实施例4洗脱梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
6 100 0
20 70 30
30 70 30
31 100 0
40 100 0
实施例5
样品制备同实施例1。
色谱柱为Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相A为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相B为甲醇；流速为0.7ml/min，柱温35℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
表4：实施例5洗脱梯度
Figure BDA0003369275380000062
Figure BDA0003369275380000071
实施例6
样品制备同实施例1。
色谱柱为Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相A为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相B为甲醇；流速为1.3ml/min，柱温35℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
表5：实施例6洗脱梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
6 100 0
20 70 30
30 70 30
31 100 0
40 100 0
实施例7
色谱条件同实施例1。
实验步骤：
1.专属性试验
取NR、NA、AMP、ADP、ATP、烟酸和NMN适量，用水稀释制成含各50μg的混合溶液，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图1。
表6：实施例7的NMN与六个工艺杂质保留时间与分离度
样品 保留时间(min) 分离度
NR 3.682 /
NMN 4.960 6.2
NA 13.590 41.8
AMP 20.751 34.4
ADP 22.726 8.7
ATP 29.570 25.9
烟酸 36.057 9.0
通过计算分析可知，NMN与NR出峰最接近，分离度大于5.0，因此NMN与NR完全分离。NMN的理论塔板数为8304，大于5000，其他峰均不干扰NMN的检出，且各杂质峰均能被检出。该有关物质方法可用于检测这六个工艺杂质的检出。
2.强制降解试验
(1)高温破坏样品检测：精密称取NMN 12.5mg至25ml量瓶，加水溶解并稀释至刻度，60℃加热4小时，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图2。
(2)碱破坏样品检查：精密称取NMN 12.5mg至25ml量瓶，加0.2mol/L氢氧化钠1ml，室温放置10min，加0.2mol/L盐酸1ml，用水稀释至刻度，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图3。
(3)酸破坏样品检查：精密称取NMN12.5mg至25ml量瓶，加0.2mol/L盐酸1ml，室温放置30min，加0.2mol/L氢氧化钠1ml，用水稀释至刻度，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图4。
(4)氧化破坏样品检查：精密称取NMN 12.5mg至25ml量瓶，加5％双氧水1ml，室温放置30min，用水稀释至刻度，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图5。
由强制降解试验得到的色谱图可以发现，NMN在酸、氧化降解条件下均降解出了特定杂质NR，高温破坏、碱破坏条件下均有较大程度的降解。各个降解杂质与主峰之间均得到很好的分离，本发明有关物质分析方法可用于检测降解杂质。
实施例8
色谱条件同实施例2。
实验步骤：
(1)系统适应性溶液的制备：取NR和NMN适量，用水稀释制成含各杂质50μg的混合溶液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图6。
(2)线性溶液的制备：取NMN对照品适量，用水溶解并稀释制成0.2mg/mL，作线性储备液，将此溶液用水稀释制成浓度为66.6、50.0、40.0、23.5、18.2、9.5、6.4μg/ml的线性溶液，取各溶液20μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，线性关系图见图7。
(3)精密度试验溶液：取NMN线性溶液浓度为50μg/ml的溶液20μl，按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测。
(4)回收率试验溶液的制备：取NMN对照品适量，加水溶解并稀释制成浓度为50μg/ml的溶液，作对照品溶液。取NMN样品适量，用水稀释制成浓度分别为60μg/ml、50μg/ml、40μg/ml的溶液，每个浓度各配置三份。取各试验溶液20μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测。
由系统适用性溶液可知，NR与NMN的分离度为15.37，分离良好，NMN理论塔板数为6107.3，大于5000；由线性试验可知，NMN浓度范围在6.4～200μg/ml范围内，R2为0.9997，线性关系良好；由精密度试验可知，试验溶液连续测定6次，峰面积RSD为0.19％，精密度良好；由回收率试验可知，在80％、100％、120％三个浓度下，NMN的回收率在99.1.3％～101.9％之间，RSD％为2.73％，证实方法有良好准确度。综上所述，该方法可以准确可靠的测定NMN的含量。
对比例1
根据Enrico Balducci等人报道的HPLC方法进行操作(AnalyticalBiochemistry,1995,228:64-68)。
系统适用性溶液的制备：取NR和NMN适量，用水稀释制成含NMN 200μg和含NR 50μg的混合溶液。
取系统适用性溶液10μl注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
色谱柱为Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相为0.1mol/l磷酸二氢钾，用磷酸或氢氧化钠调pH为6.0-甲醇(95：5)；流速为1.3ml/min，柱温20℃，检测波长为260nm。洗脱梯度，色谱图见图8。
对比例2
根据专利CN 113358776 A中报道的HPLC方法进行操作。
取NR、NA、AMP、ADP、ATP、烟酸和NMN适量，用水稀释制成含各50μg的混合溶液，过滤后取续滤液作为系统适用性溶液。
取系统适用性溶液20μl注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
色谱柱为WelchUltimate AQ-C18，4.6×250mm 5μm；流动相A为0.05mol/l磷酸二氢钾，用磷酸或氢氧化钠调pH为4.5，流动相B为甲醇；流速为0.5ml/min，柱温25℃，检测波长为260nm。洗脱梯度，梯度如下，色谱图见图9。
表7：对比例2洗脱梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 100 0
10 100 0
20 50 50
25 20 80
30 20 80
30.1 100 0
35 100 0
对比例3
根据Leonardo Sorci等人报道的HPLC方法进行操作(PNAS,2009,106(9):3083-3088)。
系统适用性溶液的制备：取NR和NMN适量，用水稀释制成含NMN 200μg和含NR 50μg的混合溶液。
取系统适用性溶液10μl注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
色谱柱为Kromasil C18，4.6×250mm 5μm；流动相为0.1mol/l磷酸二氢钾和8mmol/L四丁基溴化铵的混合水溶液，用磷酸或氢氧化钠调pH为6.0-甲醇(95：5)；流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长为260nm。洗脱梯度，色谱图见图10。
试验结果：
实施例1、3、4、5、6考察不同流速、不同柱温对NMN与各杂质之间的分离度影响，结果表明，流速为0.7～1.3ml/min、柱温为25～45℃范围内变化，各杂质之间、杂质与NMN之前的分离度均大于2.0，说明方法耐用性良好。实施例7，NMN在有关物质检查方法下的强制降解试验中，NMN在酸、氧化降解条件下均降解出了特定杂质NR，高温破坏、碱破坏条件下均有较大程度的降解。各个降解杂质与主峰之间均得到很好的分离，说明方法专属性良好，能准确测定NMN中有关物质的含量。
实施例2，在NMN有关物质控制方法上，将梯度改为等度，运行时间10min，大大节约NMN含量测定时间。实施例8，NMN含量测定方法经过验证，NMN浓度范围在6.4～200μg/ml范围内，R2为0.9997，线性关系良好；试验溶液连续测定6次，峰面积RSD为0.19％，精密度良好；在80％、100％、120％三个浓度下，NMN的回收率在99.1.3％～101.9％之间，RSD％为2.73％，证实方法有良好准确度。综上所述，该方法可以准确可靠的测定NMN的含量。
对比例1中，NR与NMN不能基线分离，且出峰过快，溶剂易干扰检测；对比例2中，HPLC流速降为0.5ml/min时，杂质NR与ATP均不能基线分离，因此不能准确测定NR与ATP的残留量；对比例3中，NR与NMN仍不能基线分离。
由于NR是NMN合成工艺的起始物料，易残留在原料中，且原料NMN在氧化、酸破坏下易产生此杂质，因此NR是NMN原料中最重要的工艺和降解杂质，需要严格控制其残留量。ATP是NMN酶法合成过程中易产生的工艺杂质，也要严格控制其残留量。采用本发明检测方法，各杂质之间分离度符合要求，各杂质也不干扰NMN的检出、特别是杂质NR不干扰NMN的检测，NR与ATP之间分离度良好。
综上所述，本发明显优于Enrico Balducci等人报道的液相色谱方法(对比例1)、优于CN 113358776 A专利中一种HPLC-UV同时检测NMN中多种有关物质的方法(对比例2)、优于Leonardo Sorci等人报道的液相色谱方法(对比例3)，选择本发明的检测方法可以更准确可靠的控制NMN的质量。

Claims (8)

1. β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于，所述方法包括采用HPLC-UV法；所述HPLC的色谱柱采用Sinochrom ODS-BP，4.6×250mm 5μm；流动相A为 0.1～0.3%磷酸二氢钾和0.05～0.15%四丁基氢氧化铵的混合水溶液，流动相B为甲醇；流速为1±0.3ml/min，柱温为35℃±10℃；
所述β-烟酰胺单核酸含量的测定的洗脱梯度为等度或梯度，所述有关物质的测定的洗脱为梯度；
所述等度为流动相A运行7～10min；
所述梯度为：0～6分钟，流动相A为100%，流动相B为0；6～20分钟，流动相A 由100%变为70%，流动相B由0变为30%；20～30分钟，流动相A为70%，流动相B为30%；30～31分钟，流动相A由70%变为100%，流动相B由30%变为0；31～40分钟，流动相A为100%，流动相B为0；
所述UV检测波长为265±10nm；
所述有关物质为烟酰胺核糖、烟酰胺、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸和烟酸。
2. 根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于，所述流动相A 中磷酸二氢钾的浓度为0.2%。
3.根据权利要求1或2所述的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于，所述流动相A中四丁基氢氧化铵的浓度为0.1%。
4.根据权利要求1或2所述的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于，所述流速为1ml/min。
5.根据权利要求1或2所述的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于，所述柱温为35℃。
6.根据权利要求1或2所述的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于，所述检测波长为260nm。
7.根据权利要求1或2所述的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于，所述HPLC的对照品和供试品溶液的制备：取NMN对照品适量和待测样品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg，作为对照品溶液和供试品溶液。
8.根据权利要求1或2所述的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法，其特征在于， 所述HPLC的供试品溶液的制备：取待测的NMN样品，用水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg，作为供试品溶液；所述HPLC的自身对照溶液的制备：取供试品溶液适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含5μg，作为自身对照溶液。
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