CN114487218B - β-烟酰胺单核苷酸的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种β‑烟酰胺单核苷酸的分析方法。该分析方法包括对含β‑烟酰胺单核苷酸的待测试物进行HPLC分析,其中HPLC分析的色谱柱为Waters XBridge BEH Amide色谱柱,流动相包括乙腈和缓冲溶液,缓冲溶液的pH值为3.0~10.0。本申请首次采用Waters XBridge BEH Amide色谱柱对强极性的β‑烟酰胺单核苷酸的待测试物进行梯度洗脱分析,从而使β‑烟酰胺单核苷酸的出峰时间延后,进而使β‑烟酰胺单核苷酸与各杂质进行有效分离。该方法得到的色谱图中β‑烟酰胺单核苷酸的峰形清晰、重现性好、且该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及β-烟酰胺单核苷酸的检测技术领域,具体而言,涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸的分子式为C11H15N2O8P,化学结构式如下:
β-烟酰胺单核苷酸是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物,也是NAD+的关键前体之一。NAD+是在全部生物种中的电子传递体,其广泛存在于各种生物体中,对生命活动具有极其重要的作用。而烟酰胺磷酸核糖转移酶参与细胞内β-烟酰胺单核苷酸腺苷化,从而合成NAD+,进而满足生命体的能量传递、物质代谢和信号转导等中对NAD+的需求。β-烟酰胺单核苷酸在一定程度上可以降低生物细胞的衰老和死亡,减少肿瘤的发生和发展。另外,β-烟酰胺单核苷酸还可通过参与和调节机体的内分泌,起到保护和修复胰岛功能,增加胰岛素的分泌,防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。
在产品制备和贮存过程中,对β-烟酰胺单核苷酸有关物质进行监测,对于终产品的生产过程以及产品的质量控制非常重要。
目前有一些与β-烟酰胺单核苷酸的分析相关的专利,如专利申请公开号为CN108949865 A的中国专利申请、专利申请公开号为CN 108697722A中国专利申请,其虽然公开了β-烟酰胺单核苷酸的HPLC分析方法,但是它们均采用C18柱,且β-烟酰胺单核苷酸出峰时间早,使得β-烟酰胺单核苷酸与相邻杂质峰形严重重叠,无法区分。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法,以解决现有技术中的采用HPLC分析方法难以达到β-烟酰胺单核苷酸与杂质的有效分离的问题。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法,该分析方法包括对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行HPLC分析,其中HPLC分析的色谱柱为Waters XBridge BEH Amide色谱柱,流动相包括乙腈和缓冲溶液,缓冲溶液的pH值为3.0~10.0。
进一步地,上述乙腈和缓冲溶液的体积比为50~86:14~50,优选缓冲溶液选自甲酸铵缓冲溶液、乙酸铵缓冲溶液、甲酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液中的任意一种或多种。
进一步地,上述HPLC分析的过程包括:将含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物在色谱柱中进行梯度洗脱,梯度洗脱依次包括第一梯度洗脱、第二梯度洗脱和第三梯度洗脱,其中,第一梯度洗脱采用的第一流动相包括体积比为1:4~1:6的缓冲溶液与乙腈,第二梯度洗脱采用的第二流动相包括体积比为1:1~1:2的缓冲溶液与乙腈,第三梯度洗脱采用的第三流动相包括体积比为1:4~1:6的缓冲溶液与乙腈,优选第一梯度洗脱的时间为5~10min,优选第二梯度洗脱的时间为40~55min,优选第三梯度洗脱的时间为100~150min。
进一步地,上述缓冲溶液的pH值为8.0~10.0,优选为9.0。
进一步地,上述HPLC分析的检测波长为254~270nm,优选为265nm。
进一步地,上述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的填料粒度为3~5μm,优选为5μm,优选Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱长为250mm,优选Waters XBridge BEHAmide色谱柱的柱内径为4.6mm。
进一步地,上述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的进样量为15~25μL,优选为20μL。
进一步地,上述流动相流速为0.8~1.2mL/min。
进一步地,上述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱温为20~40℃,优选为25℃。
进一步地,上述含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物包括β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖。
应用本发明的技术方案,本申请首次采用Waters XBridge BEH Amide色谱柱对强极性的β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行梯度洗脱分析:采用乙腈和缓冲溶液作为流动相,并配合不同pH值的缓冲溶液来共同调节β-烟酰胺单核苷酸与色谱柱、杂质与色谱柱之间的相互作用,从而使β-烟酰胺单核苷酸的保留时间延长,即β-烟酰胺单核苷酸的出峰时间延后,进而使β-烟酰胺单核苷酸与各杂质进行有效分离。该方法得到的色谱图中β-烟酰胺单核苷酸的峰形清晰、重现性好、且该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点,其适用于β-烟酰胺单核苷酸及其中间体杂质和起始原料的检测与分离分析,可用于烟酰胺、β-烟酰胺单核苷酸及其中间体的定性和定量分析,或进一步地用于控制β-烟酰胺单核苷酸合成反应工艺、合成产品及其制剂的质量。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1示出了根据本发明的实施例1提供的一种含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的HPLC色谱图;
图2示出了根据本发明的实施例20提供的一种高纯β-烟酰胺单核苷酸的HPLC色谱图;以及
图3示出了根据本发明的对比例1提供的一种高纯β-烟酰胺单核苷酸的HPLC色谱图。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所分析的,现有技术中存在采用HPLC分析方法难以达到β-烟酰胺单核苷酸与杂质的有效分离的问题,为解决该问题,本发明提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法。
在本申请的一种典型的实施方式中,提供了一种β-烟酰胺单苷酸的分析方法,该分析方法包括对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行HPLC分析,其中HPLC分析的色谱柱为Waters XBridge BEH Amide色谱柱,流动相包括乙腈和缓冲溶液,缓冲溶液的pH值为3.0~10.0。
本申请首次采用Waters XBridge BEH Amide色谱柱对强极性的β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行梯度洗脱分析:采用乙腈和缓冲溶液作为流动相,并配合不同pH值的缓冲溶液来共同调节β-烟酰胺单核苷酸与色谱柱、杂质与色谱柱之间的相互作用,从而使β-烟酰胺单核苷酸的保留时间延长,即β-烟酰胺单核苷酸的出峰时间延后,进而使β-烟酰胺单核苷酸与各杂质进行有效分离。该方法得到的色谱图中β-烟酰胺单核苷酸的峰形清晰、重现性好、且该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点,其适用于β-烟酰胺单核苷酸及其中间体杂质和起始原料的检测与分离分析,可用于烟酰胺、β-烟酰胺单核苷酸及其中间体的定性和定量分析,或进一步地用于控制β-烟酰胺单核苷酸合成反应工艺、合成产品及其制剂的质量。
在本申请的一种实施例中,上述乙腈和缓冲溶液的体积比为50~86:14~50,优选缓冲溶液选自甲酸铵缓冲溶液、乙酸铵缓冲溶液、甲酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液中的任意一种或多种。
采用上述体积比的乙腈和缓冲溶液为流动相对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行HPLC分析,从而有助于使β-烟酰胺单核苷酸与各杂质进行有效分离。为更好的将缓冲溶液的pH值控制在上述范围内,优选上述类型的缓冲溶液,进一步优选缓冲溶液的浓度为0.01~0.05mol/L,优选为0.05mol/L。
为了使β-烟酰胺单核苷酸与各杂质更有效地分离,以提高上述HPLC分析的效果,优选上述HPLC分析的过程包括:将含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物在色谱柱中进行梯度洗脱,该梯度洗脱依次包括第一梯度洗脱、第二梯度洗脱和第三梯度洗脱,其中,第一梯度洗脱采用的第一流动相包括体积比为1:4~1:6的缓冲溶液与乙腈,第二梯度洗脱采用的第二流动相包括体积比为1:1~1:2的缓冲溶液与乙腈,第三梯度洗脱采用的第三流动相包括体积比为1:4~1:6的缓冲溶液与乙腈,优选第一梯度洗脱的时间为5~10min,优选第二梯度洗脱的时间为40~55min,优选第三梯度洗脱的时间为100~150min。
采用第一流动相对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行一次梯度洗脱,得第一洗脱色谱柱,采用第二流动相对第一洗脱色谱柱进行二次洗脱,得第二洗脱色谱柱,采用第三流动相对第二洗脱色谱柱进行三次洗脱,被洗脱分离得到的各组分依次进入检测器进行分析,得到HPLC色谱图,其中各参数范围比例的控制,有利于进一步对HPLC分析的过程进行监控,以优化各次洗脱分离的效果。
为提高β-烟酰胺单核苷酸与各杂质的分离效果,优选上述缓冲溶液的pH值为8.0~10.0,优选为9.0。
HPLC分析的检测波长是由含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物中各组分的最大紫外吸收波长决定的,这样能够保证检测的灵敏度和响应值最高,为兼顾含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物中各组分的紫外吸收波长,尽可能的减小HPLC分析的误差,优选上述HPLC分析的检测波长为254~270nm,优选为265nm。
在本申请的一种实施例中,上述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的填料粒度为3~5μm,优选为5μm,优选Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱长为250mm,优选WatersXBridge BEH Amide色谱柱的柱内径为4.6mm。
满足上述各参数比例的Waters XBridge BEH Amide色谱柱更有利于延长β-烟酰胺单核苷酸的保留时间,并对本申请的含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物中的β-烟酰胺单核苷酸与各杂质进行有效分离。
在本申请的一种实施例中,上述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的进样量为15~25μL,优选为20μL。
色谱柱都有一定的承载量,进样量小于特定色谱仪的灵敏度会导致无法准确定量,进样量太大会导致过载,不仅损害色谱柱,还导致峰型拖尾,因此,为更精确地适应本申请的上述Waters XBridge BEH Amide色谱柱对β-烟酰胺单核苷酸的有效分析,优选上述范围内的进样量。
因为流速决定了出峰时间,而出峰时间是用来定性物质成分的,进样速度太慢导致色谱峰型较宽,从而导致色谱峰的柱效下降,也使得不同物质难以实现分离;进样速度太快易导致色谱峰型较窄,柱压增大,为平衡上述两个作用,尽可能达到充分分离的且易于表征的色谱峰,优选上述流动相与含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的流速各自独立地为0.8~1.2mL/min。且这样的流速有助于控制Amide色谱柱的柱压不超过100bar,从而确保色谱柱的正常运行。
在本申请一种实施例中,上述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱温为20~40℃,优选为25℃。
柱温影响分离效能和分析速度,提高柱温可缩短分析时间,降低柱温,使色谱柱的选择性增大,有利于组分的分离并提高色谱柱的稳定性,为平衡这两种作用,达到更好的分析效果,优选上述的柱温。
在本申请的一种实施例中,上述含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物包括β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖。
本申请的β-烟酰胺单苷酸的分析方法更适合对上述含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行分析,从而使得到的色谱图中β-烟酰胺单核苷酸的峰形清晰、重现性好、灵敏度高等,与杂质烟酰胺和烟酰胺核糖色谱峰明确分离。
以下将结合具体实施例和对比例,对本申请的有益效果进行说明。
实验材料与仪器条件:
β-烟酰胺单核苷酸,购自无锡景耀生物科技有限公司,纯度为98.6%;
β-烟酰胺单核苷酸杂质A为烟酰胺,购自北京华威锐科公司,纯度为99%;
β-烟酰胺单核苷酸杂质B为烟酰胺核糖,纯度为90%;
色谱柱:Waters XBridge BEH Amide;
实验仪器:Agilent 1260HPLC,VWD检测器;
工作站:Chromeleon 7。
实施例1
取烟酰胺约10mg,精密称定,置于10mL的容量瓶中,先加0.5mL水溶解,再加乙腈-水(体积比为4:1)稀释至刻度,摇匀,制成每1mL包含烟酰胺约1mg的烟酰胺贮备液。取烟酰胺核糖约10mg,精密称定,置于10mL的容量瓶中,先加0.5mL水溶解,再加乙腈-水(体积比为4:1)稀释至刻度,摇匀,制成每1mL包含烟酰胺核糖约1mg的烟酰胺核糖贮备液。分别精密量取烟酰胺贮备液5mL、烟酰胺核糖贮备液1mL,置于100mL的容量瓶中,加乙腈-水(体积比为4:1)稀释至刻度,摇匀,制成每1mL包含烟酰胺50μg、烟酰胺核糖10μg的混合杂质贮备液。取含β-烟酰胺单核苷酸约10mg,精密称定,置于10mL的容量瓶中,先加0.5mL水溶解,再精密量取1mL的混合杂质贮备液,置于同一容量瓶中,加乙腈-水(体积比为4:1)稀释至刻度,摇匀,制成每1mL包括含β-烟酰胺单核苷酸约1mg、烟酰胺约5μg、烟酰胺核糖约1μg的含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物溶液(包括99.40%的β-烟酰胺单核苷酸、0.50%的烟酰胺、0.10%的烟酰胺核糖)。采用Waters XBridge BEH Amide(250mm×4.6mm×5μm)对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物溶液进行HPLC分析,HPLC分析的检测波长为265nm,柱温为25℃,含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的进样量为20μL(仪器自动进样),流动相与含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的流速均为1.0mL/min,以0.03mol/L的乙酸铵水溶液(用氨水调节pH值至9.0)作为缓冲溶液,采用乙酸铵水溶液与乙腈共同作为流动相,乙酸铵水溶液与乙腈的比例如下表,依次进行一次梯度洗脱、二次梯度洗脱、三次梯度洗脱;各次梯度洗脱的流动相组成及梯度洗脱的时间如表1,其最终得到的HPLC色谱图如图1所示,从图1可以看出β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离,其中,3.810min为烟酰胺的保留时间,15.040mim为烟酰胺核糖的保留时间,38.587min为β-烟酰胺单核苷酸的保留时间。
表1
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于,
HPLC分析的检测波长为254nm,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于,
HPLC分析的检测波长为270nm,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于,
HPLC分析的检测波长为220nm,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到较好的分离。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于,
缓冲液的pH为8.0,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于,
缓冲液的pH为10.0,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例7
实施例7与实施例1的区别在于,
缓冲液的pH为3.0,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到较好的分离。
实施例8
实施例8与实施例1的区别在于,
柱温为20℃,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例9
实施例9与实施例1的区别在于,
柱温为40℃,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例10
实施例10与实施例1的区别在于,
柱温为15℃,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到较好的分离。
实施例11
实施例11与实施例1的区别在于,
灵敏度溶液配制:分别称取烟酰胺、烟酰胺核糖、β-烟酰胺单核苷酸各约10mg置于同一100mL的容量瓶,加1.5mL水溶解后,加乙腈-水(4:1)稀释至刻度,摇匀。再精密量取1mL,置于200mL的容量瓶中,加乙腈-水(4:1)稀释至刻度,摇匀即得灵敏度溶液。
灵敏度溶液的进样量为25μL,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离,信噪比均不低于定量限,灵敏度较高。
实施例12
实施例12与实施例11的区别在于,
灵敏度溶液的进样量为15μL,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离,信噪比均不低于定量限,灵敏度较高。
实施例13
实施例13与实施例11的区别在于,
灵敏度溶液的进样量为30μL,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到较好的分离,信噪比均不低于定量限,灵敏度较高。
实施例14
实施例14与实施例1的区别在于,
流动相与含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的流速均为0.8mL/min,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例15
实施例15与实施例1的区别在于,
流动相与含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的流速均为1.2mL/min,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例16
实施例16与实施例1的区别在于,
流动相与含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的流速均为1.4mL/min,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到较好的分离。
实施例17
实施例17与实施例1的区别在于,
缓冲溶液为乙酸缓冲溶液,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
实施例18
实施例18与实施例1的区别在于,
各次梯度洗脱分析的流动相组成及梯度洗脱分析的时间如表2,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
表2
实施例19
实施例19与实施例1的区别在于,
各次梯度洗脱分析的流动相组成及梯度洗脱分析的时间如表3,最终β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖各自的峰型清晰,彼此之间得到很好的分离。
表3
实施例20
实施例20与实施例1的区别在于,
取高纯β-烟酰胺单核苷酸样品(β-烟酰胺单核苷酸的纯度为98.6%,杂质为烟酰胺以及烟酰胺核糖)约10mg,精密称定,置于10mL的容量瓶中,先加0.5mL水溶解高纯β-烟酰胺单核苷酸样品,再加乙腈-水(体积比为4:1)稀释至刻度,制成每1mL含高纯β-烟酰胺单核苷酸样品约1mg的高纯β-烟酰胺单核苷酸样品溶液,对高纯β-烟酰胺单核苷酸样品溶液进行HPLC分析,其最终得到的HPLC色谱图如图2所示,从附图2可以看出,β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的出峰时间较晚,且β-烟酰胺单核苷酸与烟酰胺的峰型清晰,实现了分离,其中,3.808为烟酰胺的保留时间,15.082烟酰胺核糖的保留时间,38.585为β-烟酰胺单核苷酸的保留时间。
对比例1
对比例1与实施例20的区别在于,
采用传统的C18柱对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物(包括99.40%的β-烟酰胺单核苷酸、0.50%的烟酰胺、0.10%的烟酰胺核糖)进行HPLC分析,其最终得到的HPLC色谱图如图3所示,从附图3可以看出,β-烟酰胺单核苷酸的待测试物的出峰时间较早,且β-烟酰胺单核苷酸与烟酰胺以及烟酰胺核糖的峰重合。
将实施例1至20、对比例1中β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖的峰面积(总峰面积为单位1)列于表4。将实施例1至20、对比例1中β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖的分离度列于表5。
表4
其中,实施例11~13中烟酰胺、烟酰胺核糖以及β-烟酰胺单核苷酸的灵敏度结果均不低于定量限。
表5
从以上的描述中,可以看出,本发明上述的实施例实现了如下技术效果:
本申请首次采用Waters XBridge BEH Amide色谱柱对强极性的β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行梯度洗脱分析:采用乙腈和缓冲溶液作为流动相,并配合不同pH值的缓冲溶液来共同调节β-烟酰胺单核苷酸与色谱柱、杂质与色谱柱之间的相互作用,从而使β-烟酰胺单核苷酸的保留时间延长,即β-烟酰胺单核苷酸的出峰时间延后,进而使β-烟酰胺单核苷酸与各杂质进行有效分离。该方法得到的色谱图中β-烟酰胺单核苷酸的峰形清晰、重现性好、且该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点,其适用于β-烟酰胺单核苷酸及其中间体杂质和起始原料的检测与分离分析,可用于烟酰胺、β-烟酰胺单核苷酸及其中间体的定性和定量分析,或进一步地用于控制β-烟酰胺单核苷酸合成反应工艺、合成产品及其制剂的质量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的分析方法,其特征在于,所述分析方法包括对含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物进行HPLC分析,其中所述HPLC分析的色谱柱为Waters XBridge BEHAmide色谱柱,流动相包括乙腈和缓冲溶液,所述缓冲溶液的pH值为3.0~10.0;
所述缓冲溶液选自甲酸铵缓冲溶液、乙酸铵缓冲溶液、甲酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液中的任意一种或多种;
所述HPLC分析的过程包括:
将所述含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物在色谱柱中进行梯度洗脱,所述梯度洗脱依次包括第一梯度洗脱、第二梯度洗脱和第三梯度洗脱,
其中,所述第一梯度洗脱采用的第一流动相包括体积比为1:4~1:6的所述缓冲溶液与所述乙腈,所述第二梯度洗脱采用的第二流动相包括体积比为1:1~1:2的所述缓冲溶液与所述乙腈,所述第三梯度洗脱采用的第三流动相包括体积比为1:4~1:6的所述缓冲溶液与所述乙腈,所述第一梯度洗脱的时间为5~10min,所述第二梯度洗脱的时间为40~55min,所述第三梯度洗脱的时间为100~150min;
所述HPLC分析的检测波长为254~270nm;
所述含β-烟酰胺单核苷酸的待测试物包括β-烟酰胺单核苷酸、烟酰胺以及烟酰胺核糖。
2.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述缓冲溶液的pH值为8.0~10.0。
3.根据权利要求2所述的分析方法,其特征在于,所述缓冲溶液的pH值为9.0。
4.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述HPLC分析的检测波长为265nm。
5.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的填料粒度为3~5μm。
6.根据权利要求5所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的填料粒度为5μm。
7.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱长为250mm。
8.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱内径为4.6mm。
9.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的进样量为15~25μL。
10.根据权利要求9所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的进样量为20μL。
11.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,流动相流速为0.8~1.2mL/min。
12.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱温为20~40℃。
13.根据权利要求12所述的分析方法,其特征在于,所述Waters XBridge BEH Amide色谱柱的柱温为25℃。
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