CN118090973A - 一种同时测定His、TMH和EGT的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化合物分析检测技术领域，公开了一种同时测定His、TMH和EGT的方法。该方法包括采用高效液相色谱仪进行检测，在检测中，采用流动相进行梯度洗脱，流动相包括流动相A和流动相B；流动相A包括0.03％～0.15％磷酸水溶液，流动相B包括0.03％～0.15％磷酸乙腈溶液。本发明提供的方法能够有效分离His、TMH、EGT与杂质，实现His、TMH和EGT的定性、定量分析。该方法在保证分离度的情况下，能够改善峰形，获得更加准确的线性图谱和标准曲线，进而能够进行更为精确的浓度标定。且该方法出峰时间短，检测效率高，对麦角硫因合成方法的优化及质量控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于化合物分析检测技术领域，具体涉及一种同时测定His、TMH和EGT的方法。
背景技术
麦角硫因(Ergothioneine，简称EGT)是一种特殊的硫代组氨酸甜菜碱的氨基酸，具有独特的氧化还原特性，且对植物和动物具有独特的生理作用，是天然的抗氧化剂和潜在的营养食品，在食品、化妆品和医药等行业具有巨大的应用前景。
麦角硫因的传统生物合成主要以平菇、猴头菇和榆黄菇等天然蘑菇发酵。目前研究出了较多酶法，以及化学-酶偶联方法用于制备麦角硫因。如先以组氨酸(His)为主底物，将其转化为组氨酸甜菜碱(TMH)，然后再利用组氨酸甜菜碱合成麦角硫因(EGT)。在该反应中，为了监测反应进行的情况，需要对该反应体系中的主要活性成分组氨酸(His)、组氨酸甜菜碱(TMH)和麦角硫因(EGT)进行检测。目前虽然有较多检测麦角硫因(EGT)的方法，但检测组氨酸和组氨酸甜菜碱的方法较少，且不成熟，更没有能够同时对三种活性成分进行检测的方法。因检测过程繁琐，部分组分检测技术不成熟等问题，也对麦角硫因合成工艺的进一步发展和完善造成了一定的影响。因此，亟需提供一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法。本发明提供的方法能够有效分离His、TMH、EGT与杂质，并实现His、TMH和EGT的定性、定量分析。
本发明提供了一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法。
具体地，一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法，包括以下步骤：
称取His、TMH、EGT中的至少两种溶解于溶剂中，制得对照品溶液；
取待测样品溶液和所述对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测，得到对照品和待测样品的色谱图；对比分析所述色谱图并判断所述待测样品中是否含有His、TMH、EGT，或根据所述色谱图的峰面积计算所述待测样品中His、TMH或EGT的含量；
在所述检测的过程中，采用流动相进行梯度洗脱，所述流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A包括0.03％～0.15％磷酸水溶液，所述流动相B包括0.03％～0.15％磷酸乙腈溶液；所述梯度洗脱的过程为：
0～1min，所述流动相A的体积百分比为3％～6％；
1～2min，所述流动相A的体积百分比由3％～6％升至58％～63％；
2～3min，所述流动相A的体积百分比由58％～63％降至41％～49％；
3～10min，所述流动相A的体积百分比由41％～49％降至32％～40％；
10～13min，所述流动相A的体积百分比保持32％～40％，或所述流动相A的体积百分比由32％～40％降至3％～10％。
优选地，所述溶剂为水或乙腈水溶液。所述乙腈水溶液中乙腈所占的体积百分比不大于75％，如50％乙腈水溶液。
优选地，在所述流动相中，所述流动相A包括0.05％～0.12％磷酸水溶液，所述流动相B包括0.05％～0.12％磷酸乙腈溶液；进一步优选地，在所述流动相中，所述流动相A包括0.05％～0.10％磷酸水溶液，所述流动相B包括0.05％～0.10％磷酸乙腈溶液。需要理解的是，所述流动相A中0.05％～0.12％磷酸水溶液为磷酸的质量百分数为0.05％～0.12％；所述流动相B中0.05％～0.12％磷酸乙腈溶液为磷酸的质量百分数为0.05％～0.12％。
优选地，所述梯度洗脱的过程为：
0～1min，所述流动相A的体积百分比为4％～6％；
1～2min，所述流动相A的体积百分比由4％～6％升至59％～62％；
2～3min，所述流动相A的体积百分比由59％～62％降至41％～45％；
3～10min，所述流动相A的体积百分比由41％～45％降至33％～40％；
10～13min，所述流动相A的体积百分比保持33％～40％，或所述流动相A的体积百分比由33％～40％降至3％～10％。
在10～13min，各物质均基本已出峰，保持所述流动相A的体积百分比不变或使所述流动相A的体积百分比逐步下降，均能使His、TMH、EGT各物质与杂质实现良好分离。
需要说明的是，洗脱13min后还可以进一步延长洗脱时间，如在13～15min，控制所述流动相A的体积百分比由39％～40％降至4％～6％，以及在15～20min，控制所述流动相A的体积百分比保持5％等。因His、TMH、EGT在13min前均能出峰，与杂质实现良好分离，洗脱时间的延长并不影响His、TMH、EGT的检测。延长洗脱时间可以对色谱柱进行洗脱，有利于保护色谱柱。
进一步优选地，所述梯度洗脱的过程为：
0～1min，所述流动相A的体积百分比为4％～6％；
1～2min，所述流动相A的体积百分比由4％～6％升至60％；
2～3min，所述流动相A的体积百分比由60％降至42％～45％；
3～10min，所述流动相A的体积百分比由42％～45％降至35％～40％；
10～13min，所述流动相A的体积百分比保持35％～40％，或所述流动相A的体积百分比由35％～40％降至3％～10％。
更优选地，所述梯度洗脱的过程为：
0～1min，所述流动相A的体积百分比为4％～6％；
1～2min，所述流动相A的体积百分比由4％～6％升至60％；
2～3min，所述流动相A的体积百分比由60％降至42％～45％；
3～10min，所述流动相A的体积百分比由42％～45％降至38％～40％；
10～13min，所述流动相A的体积百分比保持38％～40％；
13～15min，所述流动相A的体积百分比由38％～40％降至4％～6％。
优选地，在所述检测的过程中，检测波长包括200～220nm；进一步优选地，所述检测波长包括205～215nm。在检测波长200～220nm下(尤其是205～215nm)，His、TMH、EGT能够得到良好分离，实现定性分析；在此波长下His和TMH的峰形和分离度更优。
优选地，在所述检测的过程中，所述检测波长还包括250～275nm；进一步优先地，所述检测波长还包括255～265nm。在检测波长250～275nm下，EGT有较好的峰形和分离度，且His和TMH在250～275nm下没有紫外吸收。选用200～220nm作为HIS和TMH的检测波长，250～275nm作为EGT的检测波长，能够更好地避免三者的相互干扰，有利于同时对三种物质进行定量分析。
优选地，在所述检测的过程中，所述检测波长包括210nm和260nm。
优选地，在所述检测的过程中，采用两性离子键合硅胶色谱柱进行HPLC分析；进一步优选地，所述两性离子键合硅胶色谱柱为Ultimate HILIC AmphionⅡ(250x 4.6mm,5μm)。研究表明，C18和AQ-C18色谱柱无法使His、TMH和EGT实现良好分离，尤其是His和TMH在C18和AQ-C18色谱柱均较快出峰，且两峰难以分离。
优选地，在所述检测的过程中，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～45℃，进样量为5～15μL。如在所述检测的过程中，所述流速为1.0mL/min，所述柱温为30℃，所述进样量为10μL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的方法，采用液相色谱进行检测，通过对流动相进行选择，对洗脱条件进行优化，能够有效分离His、TMH、EGT与杂质，实现His、TMH和EGT的定性、定量分析。该方法在保证分离度的情况下，能够改善峰形，获得更加准确的线性图谱和标准曲线，进而能够进行更为精确的浓度标定。该方法具有良好的精密度和重复性。
(2)本发明提供的方法，出峰时间短，检测时间缩短至13min，检测效率高，对麦角硫因合成方法的优化以及质量控制具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中样品溶液在波长为210nm下的色谱图；
图2为实施例1中样品溶液在波长为260nm下的色谱图；
图3为实施例2中样品溶液在波长为210nm下的色谱图；
图4为实施例2中待测样品溶液在波长为210nm下的色谱图
图5为实施例3中样品溶液的色谱图；
图6为实施例4中样品溶液的色谱图；
图7为实施例5中样品溶液的色谱图；
图8为对比例1中样品溶液的色谱图；
图9为对比例2中样品溶液的色谱图；
图10为对比例3中样品溶液的色谱图；
图11为对比例4中样品溶液的色谱图；
图12为对比例5中样品溶液的色谱图；
图13为对比例6中样品溶液的色谱图；
图14为His的标准曲线；
图15为TMH的标准曲线；
图16为EGT的标准曲线。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例或对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法，包括以下步骤：
称取一定质量的His、TMH和EGT的对照品，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得浓度分别为0.1mg/mL的样品溶液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪进行检测。
其中检测条件：色谱柱为Ultimate HILIC AmphionⅡ(250×4.6mm,5μm)，流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为0.1％磷酸乙腈溶液，检测波长210和260nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL。
流动相洗脱梯度条件为：0～1min，流动相A的体积百分比为5％；
1～2min，流动相A的体积百分比由5％升至60％；
2～3min，流动相A的体积百分比由60％降至45％；
3～10min，流动相A的体积百分比由45％降至40％；
10～13min，流动相A的体积百分比保持40％；
13～15min，流动相A的体积百分比由40％降至5％。
色谱图如图1和图2所示，其中图1为检测波长为210nm下的色谱图，图2为检测波长为260nm下的色谱图。图1中峰1为EGT，峰2为TMH，峰3为His。在图2中，峰1为EGT。由图1可知，在检测波长为210nm下，His、TMH、EGT能够得到良好分离，实现定性分析。且EGT、His和TMH峰分离度和峰形好，不对称度也均超过1.36。由图2可知，在检测波长为260nm下，仅EGT有紫外吸收，且吸收更强，可实现EGT的定性、定量分析。
实施例2
一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法，包括以下步骤：
称取一定质量的His、TMH和EGT的对照品，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得浓度分别为0.1mg/mL的样品溶液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪进行检测。
其中检测条件：色谱柱为Ultimate HILIC AmphionⅡ(250×4.6mm,5μm)，流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为0.1％磷酸乙腈溶液，检测波长210nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL。
流动相洗脱梯度条件为：
0～1min，流动相A的体积百分比为5％；
1～2min，流动相A的体积百分比由5％升至60％；
2～3min，流动相A的体积百分比由60％降至42％；
3～10min，流动相A的体积百分比由42％降至40％；
10～13min，流动相A的体积百分比保持40％；
13～15min，流动相A的体积百分比由40％降至5％。
色谱图如图3所示。由图3可知，在检测波长为210nm下，His、TMH、EGT能够得到良好分离，实现定性分析。
取以组氨酸(His)为主底物，以组氨酸甜菜碱(TMH)为中间产物，制备的麦角硫因(EGT)反应液，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得待测样品溶液。采用以上方法进行液相检测，色谱图如图4所示。由图4可知，在检测波长为210nm下，待测样中His、TMH、EGT与杂质能够得到良好分离，实现定性分析。
实施例3
一种能够同时测定His、TMH的方法，包括以下步骤：
称取一定质量的His、TMH的对照品，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得浓度分别为0.1mg/mL的样品溶液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪进行检测。
其中检测条件：色谱柱为Ultimate HILIC AmphionⅡ(250×4.6mm,5μm)，流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为0.05％磷酸乙腈溶液，检测波长210nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL。
流动相洗脱梯度条件为：0～1min，流动相A的体积百分比为5％；
1～2min，流动相A的体积百分比由5％升至60％；
2～3min，流动相A的体积百分比由60％降至45％；
3～10min，流动相A的体积百分比由45％降至35％；
10～13min，流动相A的体积百分比保持35％；
13～15min，流动相A的体积百分比由35％降至5％；
15～20min，流动相A的体积百分比保持5％。
色谱图如图5所示，图5中峰1为TMH，峰2为His。由图5可知，His和TMH峰分离度和峰形都较好。因为EGT易与His、TMH分离，该条件也能实现EGT、His、TMH三者的分离。
实施例4
一种能够同时测定His、TMH的方法，包括以下步骤：
称取一定质量的His、TMH的对照品，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得浓度分别为0.1mg/mL的样品溶液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪进行检测。
其中检测条件：色谱柱为Ultimate HILIC AmphionⅡ(250×4.6mm,5μm)，流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为0.05％磷酸乙腈溶液，检测波长210nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL。
流动相洗脱梯度条件为：0～1min，流动相A的体积百分比为5％；
1～2min，流动相A的体积百分比由5％升至60％；
2～3min，流动相A的体积百分比由60％降至45％；
3～10min，流动相A的体积百分比由45％降至40％；
10～13min，流动相A的体积百分比保持40％。
色谱图如图6所示，图6中峰1为TMH，峰2为His。由图6可知，His和TMH峰分离度和峰形都较好。因为EGT易与His、TMH分离，该条件也能实现EGT、His、TMH三者的分离。
实施例5
一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法，包括以下步骤：
取以组氨酸(His)为主底物，制备的组氨酸甜菜碱(TMH)反应液，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得待测样品溶液，再用0.22μm的微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪进行检测。
其中检测条件：色谱柱为Ultimate HILIC AmphionⅡ(250×4.6mm,5μm)，流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为0.1％磷酸乙腈溶液，检测波长210nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL。
流动相洗脱梯度条件为：0～1min，流动相A的体积百分比为5％；
1～2min，流动相A的体积百分比由5％升至60％；
2～3min，流动相A的体积百分比由60％降至43％；
3～10min，流动相A的体积百分比由43％降至40％；
10～13min，流动相A的体积百分比保持40％；
13～15min，流动相A的体积百分比由40％降至5％。
检测后色谱图如图7所示，由图7可知，His、TMH得到了有效分离，且与杂质峰分离良好。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，样品溶液为浓度分别为1.0mg/mL的His、TMH、EGT混合溶液；流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液。其余同实施例1。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，样品溶液为浓度分别为1.0mg/mL的His、TMH、EGT混合溶液；流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液。其余同实施例1。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，样品溶液为浓度分别为1.0mg/mL的His、TMH、EGT混合溶液；流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液。其余同实施例1。
对比例1～3的色谱图如图8～10所示。由图8～10可知，在210nm下，因受甲酸、乙酸、三氟乙酸的截止波长干扰，这三种缓冲体系均出现基线不稳，与杂质分离度较差的现象。
对比例4
对比例4与实施例2的区别在于，样品溶液为浓度为1.0mg/mL的His和0.5mg/mLTMH的混合溶液；流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液；检测时间延长至20min，15～20min，流动相A的体积百分比保持5％。其余同实施例1。
检测后色谱图如图11所示，由图11可知，以水和乙腈作为流动相溶液，His与TMH无法得到分离。
对比例5
对比例5与实施例4的区别在于，流动相A为0.05％磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液。其余同实施例3。
检测后色谱图如图12所示，由图12可知，以0.05％磷酸水溶液和乙腈作为流动相溶液，His与TMH无法得到分离。
对比例6
对比例6与对比例5的区别在于：流动相A为0.1％磷酸水溶液，流动相B为乙腈溶液。
检测后色谱图如图13所示，由图13可知，以0.1％磷酸水溶液和乙腈作为流动相溶液时，His峰前沿严重，TMH与杂质没有得到完全分离，且峰不对称度较高。
进一步评价本发明提供的检测方法，包括检测限和定量限、精密度、重复性、加样回收率等。
1.检测限和定量限实验：
使用50％的乙腈水逐步稀释HIS、TMH和EGT对照品溶液，进行色谱分析，色谱条件同实施例1的液相条件，在信噪比S/N为3和10时，分别计算HIS、TMH和EGT的检测限和定量限。
结果可知，HIS的检测限和定量限是3.0mg/L，10.0mg/L；TMH的检测限和定量限是1.0mg/L，3.0mg/L；EGT的检测限和定量限是1.0mg/L，3.0mg/L。
2.标准曲线的绘制
使用50％的乙腈水逐步稀释His、TMH和EGT对照品溶液，进行色谱检测，检测条件同实施例1的液相条件，记录色谱图，根据对照品的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，结果见附图14至图16。标准曲线用于定量测定样品中His、TMH和EGT的含量。
3.精密度实验
取以组氨酸(His)为主底物，以组氨酸甜菜碱(TMH)为中间产物，制备的麦角硫因(EGT)反应液，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得待测样品溶液；然后对待测样品溶液进行5次平行的液相色谱测定，色谱条件同实施例1的液相条件。
结果可知，His、TMH和EGT的含量检测结果的相对标准偏差RSD分别为0.82％、1.39％、0.18％，表明该方法的精密良好。
4.重复性实验：
取以组氨酸(His)为主底物，以组氨酸甜菜碱(TMH)为中间产物，制备的麦角硫因(EGT)反应液，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得待测样品溶液。平行制备5份待测样品溶液，分别测定His、TMH和EGT的含量，并计算三者含量的RSD值。
结果可知，His、TMH和EGT含量的RSD值分别为1.27％、1.81％、1.57％，表明该方法重复性良好。
5.加样回收率试验：
取以组氨酸(His)为主底物，以组氨酸甜菜碱(TMH)为中间产物，制备的麦角硫因(EGT)反应液，用50％的乙腈水溶液进行稀释，制得待测样品溶液。取2份待测样品溶液，分别添加已知浓度的His、TMH和EGT对照品溶液，测定His、TMH和EGT在样品中的含量，色谱检测条件同实施例1的液相条件，每份样品平行进样5次，根据检测值计算出His、TMH和EGT的回收率，检测结果见表1、2、3。由His、TMH和EGT检测回收率的实验结果看出，本发明提供的方法能够满足定量分析的要求。
表1His回收率的测定结果
*回收率＝(检测值-样品溶液中His浓度)/His标准溶液浓度×100％。
表2TMH回收率的测定结果
*回收率＝(检测值-样品溶液中TMH浓度)/TMH标准溶液浓度×100％。
表3EGT回收率的测定结果
*回收率＝(检测值-样品溶液中EGT浓度)/EGT标准溶液浓度×100％。
由以上实施例和评价实验可知，本发明提供的检测方法，能够对His、TMH和EGT进行定性分析；且能够同时分析样品中三种化合物的浓度变化，并依据标准曲线对这三种成分进行准确定量。而且本发明提供的方法，在保证分离度的情况下，能够改善峰形，当色谱柱长度相同时，理论塔板数大幅提高，从而获得更加准确的线性图谱和标准曲线，更加精确地进行浓度标定。此外，本发明提供的方法，出峰时间短，能够缩短检测时间至13min，检测效率高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种能够同时测定His、TMH和EGT的方法，其特征在于，包括以下步骤：
称取His、TMH、EGT中的至少两种溶解于溶剂中，制得对照品溶液；
取待测样品溶液和所述对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测，得到对照品和待测样品的色谱图；对比分析所述色谱图并判断所述待测样品中是否含有His、TMH或EGT，或根据所述色谱图的峰面积计算所述待测样品中His、TMH或EGT的含量；
在所述检测的过程中，采用流动相进行梯度洗脱，所述流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A包括0.03％～0.15％磷酸水溶液，所述流动相B包括0.03％～0.15％磷酸乙腈溶液；所述梯度洗脱的过程为：
0～1min，所述流动相A的体积百分比为3％～6％；
1～2min，所述流动相A的体积百分比由3％～6％升至58％～63％；
2～3min，所述流动相A的体积百分比由58％～63％降至41％～49％；
3～10min，所述流动相A的体积百分比由41％～49％降至32％～40％；
10～13min，所述流动相A的体积百分比保持32％～40％，或所述流动相A的体积百分比由32％～40％降至3％～10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂为水或乙腈水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述流动相中，所述流动相A包括0.05％～0.12％磷酸水溶液，所述流动相B包括0.05％～0.12％磷酸乙腈溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述流动相中，所述流动相A包括0.05％～0.10％磷酸水溶液，所述流动相B包括0.05％～0.10％磷酸乙腈溶液。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程为：
0～1min，所述流动相A的体积百分比为4％～6％；
1～2min，所述流动相A的体积百分比由4％～6％升至59％～62％；
2～3min，所述流动相A的体积百分比由59％～62％降至41％～45％；
3～10min，所述流动相A的体积百分比由41％～45％降至33％～40％；
10～13min，所述流动相A的体积百分比保持33％～40％或所述流动相A的体积百分比由33％～40％降至3％～10％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程为：
0～1min，所述流动相A的体积百分比为4％～6％；
1～2min，所述流动相A的体积百分比由4％～6％升至60％；
2～3min，所述流动相A的体积百分比由60％降至42％～45％；
3～10min，所述流动相A的体积百分比由42％～45％降至35％～40％；
10～13min，所述流动相A的体积百分比保持35％～40％，或所述流动相A的体积百分比由35％～40％降至3％～10％。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，检测波长包括200～220nm；优选地，所述检测波长包括205～215nm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，所述检测波长还包括250～275nm；优先地，所述检测波长还包括255～265nm。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，采用两性离子键合硅胶色谱柱进行HPLC分析。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～45℃，进样量为5～15μL。
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