CN113030338A - 一种测定烟丝中氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，包括以下步骤：(1)标准曲线的建立：用UPLC—检测器测定衍生化的氨基酸标准工作液，绘制出标准曲线，色谱条件包括：流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，在甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；流速0.7mL/min，并对梯度洗脱程序进行限定；(2)烟丝中氨基酸的测定：用UPLC—检测器测定衍生化的烟丝提取液，外标法计算烟丝中各氨基酸的含量，且超高效液相色谱检测的色谱条件与步骤(1)中相同。本发明8.5min即可完成烟丝中21种氨基酸的测定。

Description

一种测定烟丝中氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及烟草检测技术领域，特别涉及一种测定烟丝中氨基酸的方法。

背景技术

游离氨基酸作为烟草中的重要化合物，其种类及含量对烟草品质影响很大。烟草在生长、调制、工业加工及燃烧的过程中，游离氨基酸与烟草中的还原糖发生反应，生成吡啶、吡喃、吡嗪等一系列具有香味特征的杂环化合物；某些氨基酸如苯丙氨基酸还可以自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇。因此，游离氨基酸在烟草质量控制及卷烟配方优化中具有重要的作用。

目前，氨基酸的分析方法主要有气相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(离子色谱法)、氨基酸分析仪法及液相色谱法。高效液相色谱法(HPLC)测定氨基酸首先是利用衍生剂将氨基酸衍生为极性小且具有荧光性的衍生物，然后使用荧光或伏安检测器进行检测，液相色谱法可采用柱前或柱后衍生，具有方法灵活、灵敏度高、分析时间短等优点。超高效液相色谱(UPLC)，采用细粒径的填料(一般为1.7μm)和高压分离系统，与高效液相色谱(HPLC)相比，减短了分析时间，提高了灵敏度及分离度，同时减少了溶剂用量，节约成本。

高效液相色谱法(HPLC)常用的衍生剂有：邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(Dansyl-Cl)、2,4-硝基氟苯(DNFB)、异硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)等。使用上述这些衍生剂进行衍生并使用高效液相色谱法(HPLC)进行分析还存在衍生效率低，测定时间长的问题。目前，Waters公司推出AQC衍生剂包，称其能同时与一、二级氨基酸反应，衍生物稳定，多余的衍生剂可在1min内水解，且具有水解产物不干扰测定等优点。有小组以Waters公司推出的AQC衍生剂包衍生-UPLC法分别测定烟草中17、18种游离氨基酸，但是他们均未进行天冬酰胺(Asn)、4-氨基丁酸(γ-Aba)的测定。天冬酰胺是烤烟中重要的游离氨基酸之一，在大多数烤烟中其含量仅次于脯氨酸。天冬酰胺分子中含有两个氮原子，在烟草燃吸过程中，热裂解产物比其他氨基酸更复杂，会产生氢氰酸、丙烯酰胺等有害成分；而γ-氨基丁酸是在自然界植物、动物以及微生物中广泛存在的一种非蛋白质的氨基酸，具有重要的生理功能。因此，在中华人民共和国烟草行业标准《YC/T282-2009烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪》中，对烟叶的氨基酸测定是21种。但是该方法需要氨基酸分析仪这种专门仪器设备，且需要烟末1g来进行提取和衍生，超声提取30min，衍生、分离和测定共需要122min，总时间152min。程勇等,柱前衍生UPLC法测定烟叶中20种游离氨基酸含量[J]烟草科技,2010,8-34-40中，需要烟末1g来进行提取和衍生，超声提取30min，用预处理好的732型阴离子交换柱，95mL4mol/L的氨水洗淋，收集，旋干，这一段时间不详，经评测至少30min；加80mL0.1mol/L的盐酸溶解，离心10min，取上清液定容至50mL，得样品液；取0.5mL+0.2mL衍生剂溶液(1％的2,4-二硝基氟苯溶液得乙腈溶液)，600℃衍生1h，定容，过膜，进UPLC检测，UPLC的检测时间60min；这种方法共计花费时间30+30+10+60+60＝190min。

前述的Waters公司自制了一套专门用来衍生氨基酸并进行HPLC测定的氨基酸分析方法，其售出的AQC衍生剂包(包括衍生剂和流动相试剂包，即AccQ-TagEluentA溶液，AccQ-TagEluentB溶液；AccQ-Fluor试剂盒)价格昂贵，对进行大批样品分析不利。

膨胀烟丝是卷烟配方的组成部分，使用膨胀烟丝，可为烟支提供厚实感，增加透气性、改善燃烧性能，也可达到降低焦油和烟碱的目的。膨胀工艺伴随有温度值和湿度值的变化，过程中可能会发生与氨基酸和糖有关的美拉德反应以赋予烟丝香味及色泽。因此监测膨胀前后烟叶中氨基酸的变化，有利于膨胀烟丝的工艺和质量控制。对膨胀烟丝中21种氨基酸进行测定未见报道。

因此，需对Waters公司的衍生剂和流动相试剂包进行剖析，在保证测定准确的同时，建立样品用量少、快速、低成本的同时测定烟丝中21种氨基酸的方法。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况，旨在克服现有技术缺陷，提供一种测定烟丝中氨基酸的方法，样品用量少、快速、成本低，可同时测定21种氨基酸。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的建立

制备氨基酸标准工作液，对氨基酸标准工作液进行衍生化反应，用超高效液相色谱-检测器测定衍生化的氨基酸标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后根据氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出标准曲线，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包括：

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；0.54～5.74min：流动相A90.9％，流动相B9.1％；5.74～7.74min：流动相A82％，流动相B18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B56.6％；8.04～8.64min：流动相A40.4％，流动相B59.6％；8.64～8.73min：流动相A99.8％，流动相B0.2％；8.73～9.50min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；

(2)烟丝中氨基酸的测定

制备烟丝提取液，对烟丝提取液进行衍生化反应，用超高效液相色谱-检测器测定衍生化的烟丝提取液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，根据氨基酸标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间对烟丝中各氨基酸定性，用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件与步骤(1)中相同。

采用上述技术方案，通过对于流动相组成、流速、梯度洗脱程序的限定，8.5min即可完成烟丝中21种氨基酸的测定。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，氨基酸分别为组氨酸His、天冬酰胺Asn、丝氨酸Ser、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、甘氨酸Gly、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、苏氨酸Thr、丙氨酸Ala、4-氨基丁酸GABA、脯氨酸Pro、胱氨酸Cys、赖氨酸Lys、酪氨酸Tyr、甲硫氨酸Met、缬氨酸Val、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，衍生化反应的反应条件为：取10～15μL待衍生化溶液，在步骤(1)中待衍生化溶液为氨基酸标准工作液，在步骤(2)中待衍生化溶液为烟丝提取液，在10～15μL待衍生化溶液中加70～105μL缓冲溶液，混合均匀后加入20～30μL衍生剂溶液，混合均匀后进行封口，放置后于50～60℃水浴中进行衍生化反应10～15min，完毕放置于4℃环境。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，衍生剂溶液中的衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，衍生剂溶液中衍生剂的浓度为2.5mg/L，溶剂为乙腈。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，缓冲溶液为硼酸缓冲溶液，硼酸缓冲溶液的pH为8.6～9.0。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，超高效液相色谱检测的色谱条件还包括：色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱，填料粒径为1.7μm，色谱柱的内径为2.1mm，色谱柱的长度为100mm；进样量为1μL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，检测器为荧光检测器串联光电二极管阵列检测器，荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，烟丝提取液的制备包括以下步骤：称取0.1g烟末，在0.1g烟末中加入20～25mL超纯水，超声提取10～15min，取上层液离心后，取上清液过滤得到烟丝提取液，放置于4℃环境待衍生化。

本发明的实施方式公开了一种测定烟丝中氨基酸的方法，超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器的测定时间为8.5min。

本发明仅需0.1g烟丝制成的烟末，样品用量少；本发明通过选择6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯作为衍生剂、使用自行研发的反应条件完成衍生化反应，通过自行研发的流动相组成、流速、梯度洗脱程序完成烟丝中氨基酸的测定，无需购买Waters公司的衍生剂和流动相试剂包，降低了成本；并且，本发明通过自行研发的流动相组成、流速、梯度洗脱程序仅需8.5min即可完成烟丝中21种氨基酸的测定。

附图说明

图1示出6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯与氨基酸衍生反应的机理；

图2为21种氨基酸的混合标准工作液(0.125μmol/mL)使用WatersAQC衍生试剂包的UPLC-FLD谱图；

图3为21种氨基酸的混合标准工作液(0.125μmol/mL)使用AQC试剂、自行研发的衍生反应条件、流动相组成、流速和梯度洗脱程序的UPLC-FLD谱图；

图4为21种氨基酸的混合标准工作液(0.0125μmol/mL)使用AQC试剂、自行研发的衍生反应条件、流动相组成、流速和梯度洗脱程序的UPLC-FLD谱图；

图5为21种氨基酸的混合标准工作液(0.0125μmol/mL)使用AQC试剂、自行研发的衍生反应条件、流动相组成、流速和梯度洗脱程序的UPLC-PDA谱图；

图6为本发明实施例1的膨胀烟丝的氨基酸提取液经AQC衍生后的UPLC-FLD谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。虽然本发明的描述将结合较佳实施例一起介绍，但这并不代表此发明的特征仅限于该实施方式。恰恰相反，结合实施方式作发明介绍的目的是为了覆盖基于本发明的权利要求而有可能延伸出的其它选择或改造。为了提供对本发明的深度了解，以下描述中将包含许多具体的细节。本发明也可以不使用这些细节实施。此外，为了避免混乱或模糊本发明的重点，有些具体细节将在描述中被省略。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

应注意的是，在本说明书中，相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。

下述具体实施方式中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

目标氨基酸的选择：游离氨基酸作为烟草中的重要化合物，其种类及含量对烟草品质影响很大。烟草在生长、调制、工业加工及燃烧的过程中，游离氨基酸与烟草中的还原糖发生催化反应，生成吡啶、吡喃、吡嗪等一系列具有香味特征的杂环化合物；某些氨基酸如苯丙氨基酸还可以自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇。因此，游离氨基酸在烟草质量控制及卷烟配方优化中具有重要的作用。我们参考行业标准和已经进行的烟草中游离氨基酸的研究，确定了21种游离的氨基酸作为我们的目标氨基酸，它们是：组氨酸His、天冬酰胺Asn、丝氨酸Ser、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、甘氨酸Gly、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、苏氨酸Thr、丙氨酸Ala、4-氨基丁酸GABA、脯氨酸Pro、胱氨酸Cys、赖氨酸Lys、酪氨酸Tyr、甲硫氨酸Met、缬氨酸Val、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp。

仪器、试剂及样品：

超高效液相色谱仪ACQUITYUPLC(Waters，美国)，荧光检测器ACQUITYUPLCFLR(Waters，美国)(荧光检测器又简称为FLD)，光电二极管阵列检测器PDA(Waters，美国)，色谱柱ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters，美国)；MttlerAE200电子天平(感量：0.1mg，德国Sartorius公司)；MILLIPOREDirectQ5型超纯水系统(Millipore公司，U.S.A)；HY-6双层调速多用震荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；KQ-500DE超声波仪(昆山市超声仪器有限公司)；德祥高速离心机(GermanyhettichGmbh&CO.KG)；50mL三角瓶(江凌玻璃仪器)。

乙腈(HPLC，德国默克公司)；甲酸铵(Fluka，Sigma-Aldrich公司)；甲酸(HPLC，天津市科密欧化学试剂有限公司)；17种氨基酸混标溶液(北京百灵威有限公司)；6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC，重量百分比97％，北京安必奇有限公司)；pH为8.6～9.0的硼酸缓冲溶液由13.33mL0.6mol/L的硼酸、6mL0.5mol/L的氢氧化钠、30.67mL纯水配置而成。

烟丝来自贵州中烟工业有限责任公司。

本发明提供了一种测定烟丝中氨基酸的方法，包括以下步骤：

(1)标准曲线的建立

(a)氨基酸标准工作液的制备

分别称取天冬酰胺0.830g、谷氨酰胺0.660g、色氨酸0.660g、4-氨基丁酸0.660g，用0.1mol/L稀盐酸溶解，转移至25mL容量瓶，用0.1mol/L稀盐酸稀释至刻度，得到浓度为0.25mmol/mL的储备液；分别取0.25mmol/mL储备液0.25mL，转移至25mL容量瓶，用0.1mol/L稀盐酸稀释至刻度，得到浓度为2.5μmol/mL的单一标准工作液。

购买17种氨基酸的混合标准溶液，其中2.5mmol/L的氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸，1.25mmol/L的氨基酸为胱氨酸。

21种氨基酸的混合标准工作液的配制：分别移取1、4、20、40、200、400、1000μL17种氨基酸的混合标准工作液及浓度为2.5mmol/L的天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸和4-氨基丁酸四种单一标准工作液于7只10mL容量瓶中，超纯水定容，混合均匀，得到浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的7个21种氨基酸的混合标准工作液(这里21种氨基酸的混合标准工作液的浓度指21种氨基酸的混合标准工作液中大多数氨基酸的浓度，例如，浓度为0.25nmol/mL的21种氨基酸的混合标准工作液指该21种氨基酸的混合标准工作液中大多数氨基酸的浓度为0.25nmol/mL)。

(b)衍生化反应

分别对7个浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的21种氨基酸的混合标准工作液进行衍生化反应：取10～15μL混合标准工作液，在10～15μL混合标准工作液中加70～105μL的pH为8.6～9.0的硼酸缓冲溶液，涡旋3～5秒，加入20～30μL衍生剂溶液，衍生剂溶液的浓度为2.5mg/L，衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯，溶剂为乙腈，再次涡旋3～5秒进行封口，放置1min后于50～60℃水浴中进行衍生化反应10～15min，完毕放置于4℃环境。图1示出6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯与氨基酸衍生反应的机理。

(c)超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析

用超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器依次测定衍生化的混合标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包括：

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；0.54～5.74min：流动相A90.9％，流动相B9.1％；5.74～7.74min：流动相A82％，流动相B18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B56.6％；8.04～8.64min：流动相A40.4％，流动相B59.6％；8.64～8.73min：流动相A99.8％，流动相B0.2％；8.73～9.50min：流动相A99.9％，流动相B0.1％。

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

氨基酸的结构特点是含有氨基和羧基，因此在色谱柱中容易与色谱柱中残留的硅羟基相互作用，造成洗脱和分离困难。另一方面，所分析的21种氨基酸中，除了组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有发色团，可以通过紫外或荧光检测器进行检测，其余的氨基酸没有发色团，不能用紫外或荧光检测器进行检测。因此，在用液相色谱进行氨基酸的检测时，需要将氨基酸用衍生剂衍生为极性小且具有荧光性的衍生物，然后使用荧光或紫外检测器进行检测，液相色谱法可采用柱前或柱后衍生，本发明选择柱前衍生。

流动相中，甲酸具有调节pH和抑制被分离物中羧基的电离、改善峰形的作用；甲酸铵具有缓冲pH的作用；乙腈对有机分离物具有溶解和洗脱作用；水是所使用的柱子要求条件。

图2为21种氨基酸的混合标准工作液(0.125μmol/mL)使用WatersAQC衍生试剂包的UPLC-FLD谱图；图3为21种氨基酸的混合标准工作液(0.125μmol/mL)使用AQC试剂、自行研发的衍生反应条件、流动相组成、流速和梯度洗脱程序的UPLC-FLD谱图。从图2、图3可以看出，通过使用AQC试剂、自行研发的衍生反应条件、流动相组成、流速和梯度洗脱程序可以达到使用WatersAQC衍生试剂包相同的测定效果，同时成本得到了大大的降低，衍生剂费用从26.796元/样品降为2.181元/样品。

通过对每一个氨基酸衍生物的激发和发射波长的测定，综合选出了用荧光检测器(FLD)以激发波长266nm，发射波长473nm来检测21种氨基酸AQC衍生物。通过对每一个氨基酸衍生物的最大吸收波长进行测定，综合选出用光电二极管阵列检测器(PDA)在吸收波长260nm处来检测21种氨基酸AQC衍生物。

用从北京安必奇有限公司购买的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)试剂(纯度97％)对21种氨基酸进行衍生，试验用荧光检测器(FLD)以激发波长266nm，发射波长473nm来检测21种氨基酸衍生物，如图4所示，21种氨基酸衍生物，大多数响应比紫外检测器好，但是色氨酸衍生物(标注Trp)的峰响应值很小。用光电二极管阵列检测器(PDA)在吸收波长260nm处检测，如图5所示，21种氨基酸衍生物，出现了20个对应的色谱峰，缺少了谷氨酰氨(标注Gln)对应的衍生物的峰，而且从1.5min到8.1min的出峰响应不高，但是色氨酸衍生物(标注Trp)对应8.269min的峰响应值较高。因此采用超高效液相色谱—荧光检测器串联光电二极管阵列检测器进行21种氨基酸的测定。

(d)标准曲线的绘制

以色谱峰保留时间定性，然后根据氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出标准曲线。

(2)烟丝中氨基酸的测定

(a)烟丝粉粹制烟末

根据烟草行业标准YC/T31-1996取样及处理，将烟草样品置于不高于40℃烘箱内烘约2h，直至可用手指捏碎；取出立即研磨，过40目筛，将烟末混合均匀并置于密封袋中备用。

(b)氨基酸提取和样品衍生化

称取0.1g烟末，置于50mL三角瓶中，加入20～25mL超纯水，超声提取10～15min，取2～5mL上层液置于5mL离心管中，离心10min(10000rpm)，取上清液3mL经0.22μm水相滤膜过滤，得到提取液，放置于4℃环境待衍生化。

取10～15μL烟丝提取液，在10-15μL烟丝提取液中加70～105μL的pH为8.6～9.0的硼酸缓冲溶液，涡旋3～5秒，加入20～30μL衍生剂溶液，衍生剂溶液的浓度为2.5mg/L，衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯，溶剂为乙腈，再次涡旋3～5秒进行封口，放置1min后于50～60℃水浴中进行衍生化反应10～15min，完毕放置于4℃环境。

提取条件研究：

水、乙醇和稀酸都可作为烟草中游离氨基酸的提取剂，传统的方法通常采用70％～90％乙醇水溶液或0.1mol/L的盐酸溶液为提取剂。有研究者研究认为：盐酸溶液提取氨基酸的总量比乙醇提取高4％，而以水作为提取剂报道较少。本发明对比了水与0.1mol/L的盐酸溶液对游离氨基酸的提取影响。结果表明：盐酸溶液提取样品的相对标准偏差(RSD值)高于水提取的样品的相对标准偏差(RSD值)，主要原因可能是盐酸使某些蛋白质和多肽水解，使氨基酸盐游离出氨基酸，对游离氨基酸的测定造成影响。

为研究提取时间和提取方式对氨基酸提取的影响。制备0.1g烟末各六份，用30mL超纯水在常温下，进行提取实验，分别超声5min、10min、15min、20min、30min对样品进行提取，衍生后进样分析，测定提取游离氨基酸总量，结果如表1所示。由数据可知，超声提取10min提取烟丝中的氨基酸总量为22.03mg/g，与振荡60min提取的效果一致；超声提取15min提取烟丝中的氨基酸总量为22.01mg/g，与振荡60min提取的效果一致。所以采用超声提取10-15min。

表1.提取时间和提取方式对游离氨基酸测定的影响

同样的0.1g烟末量，研究提取剂用量对氨基酸提取的影响。一般认为提取剂用量大提取更完全。但是提取剂用量大，提取液的浓度低，对衍生反应步骤不利。在保持其他条件不变的条件下，分别用10mL、15mL、20mL、25mL、30mL的超纯水在常温下对烟草样品超声提取10min，衍生后进样分析，测定提取游离氨基酸总量，结果如表2所示。由数据可知，20mL超声提取10min提取烟丝中的氨基酸总量为23.01mg/g，25mL超声提取10min提取烟丝中的氨基酸总量为23.00mg/g，20-25mL超声提取10min与25mL超纯水在常温振荡60min提取的效果一致。所以采用提取剂的量为20-25mL。

表2.提取剂用量对游离氨基酸测定的影响

(c)超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析

按照步骤(1)的色谱条件，用超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器测定衍生化的烟丝提取液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，根据氨基酸标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间对烟丝中各氨基酸定性，用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量：计算出超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析(UPLC-FLD/PDA)进样量1μL中21种氨基酸的浓度，再换算成0.1g烟末中21种氨基酸的含量，即得到烟丝样品中21种氨基酸的含量。

(3)方法学验证

(a)线性关系、检测限、精密度

以各氨基酸的峰面积对其浓度进行回归分析，得到各氨基酸的回归方程和相关系数。结果表明：21种游离氨基酸标准曲线的相关系数R²均大于0.9968，线性关系良好，并求得各氨基酸的检测限(S/N＝3)在0.007～2.184nmol/mL之间。日内精密度和日间精密度均小于等于10.05％。

表3.氨基酸的线性回归方程、线性范围、相关系数、检测限、定量限和精密度

(b)加标回收率

取9份同一烟样0.100g于9个50mL三角瓶中，其中6份加入低加标量的17种氨基酸混标及4种单标，3份不加标，按照(a)、(b)、(c)的方法进行前处理及UPLC分析，并根据各氨基酸加标前后的测定值及加标量计算回收率。

取9份同一烟样0.100g于9个50mL三角瓶中，其中6份加入中加标量的17种氨基酸混标及4种单标，3份不加标，按照(a)、(b)、(c)的方法进行前处理及UPLC分析，并根据各氨基酸加标前后的测定值及加标量计算回收率。

取9份同一烟样0.100g于9个50mL三角瓶中，其中6份加入高加标量的17种氨基酸混标及4种单标，3份不加标，按照(a)、(b)、(c)的方法进行前处理及UPLC分析，并根据各氨基酸加标前后的测定值及加标量计算回收率。

结果表明：21种氨基酸回收率为80.224％～119.144％。结合表3中相对标准偏差RSD为5.27％～10.05％一起，说明此方法准确性高，重复性较好，可用于烟叶中游离氨基酸的分析。

表4. 21种氨基酸加标回收率

(4)不同膨胀工艺烟丝中游离氨基酸的分析

用建立的超纯水超声萃取—AQC(6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯)分析纯试剂衍生—FLD串联PDA分析21种氨基酸的方法来测定原烟丝(膨胀前的烟丝，用YS来表示膨胀前)和经过三种膨胀工艺(用31、32、CO2分别表示经SP31、SP32、CO2膨胀工艺膨化后)膨化的膨胀烟丝中21种氨基酸的含量，如表5所示。

表5.不同膨胀工艺烟丝中氨基酸的测定(mg/g)

由表5知，对于GY等级烟丝而言，原丝经过SP31、SP32、CO2三种膨胀工艺后，检测到的氨基酸含量相对于膨胀前，大部分皆呈下降趋势，其中以SP32膨胀工艺下降最多；中性氨基酸Ala、Asn、R-ala、Gln、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Val、Trp下降率分别为19.70％、55.19％、37.50％、54.48％、25.81％、6.43％、37.98％、36.49％、25.00％、17.98％、11.94％，碱性氨基酸Lys下降率为22.17％，酸性氨基酸Asp、Glu下降率分别为36.52％、25.84％。对于X2F等级烟丝而言，原丝经过SP31、SP32、CO2三种膨胀工艺后，检测到的氨基酸含量相对于膨胀前，大部分皆呈上升趋势且以CO2膨胀工艺上升居多。

不同等级烟丝经不同膨胀工艺膨胀后，相比于膨胀前，各种氨基酸含量的变化趋势不尽一致，即有的氨基酸含量是增加的，而有的氨基酸含量呈减小趋势。氨基酸的含量上升可能是此等级烟草里面的蛋白质降解导致的；氨基酸的含量下降可能是氨基酸与单糖及醛类化合物相互反应导致的。此外，Cys在两种等级烟丝中均未检测到。总体来说，分析氨基酸的相对含量可为烟草中由发生美拉德反应产生香味物质而改善烟丝香味提供一定的参考数据。

实施例

实施例1-5的氨基酸标准工作液的制备如下：

分别称取天冬酰胺0.830g、谷氨酰胺0.660g、色氨酸0.660g、4-氨基丁酸0.660g，用0.1mol/L稀盐酸溶解，转移至25mL容量瓶，用0.1mol/L稀盐酸稀释至刻度，得到浓度为0.25mmol/mL的储备液；分别取0.25mmol/mL储备液0.25mL，转移至25mL容量瓶，用0.1mol/L稀盐酸稀释至刻度，得到浓度为2.5μmol/mL的单一标准工作液。

购买17种氨基酸的混合标准工作液，其中2.5mmol/L的氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸，1.25mmol/L的氨基酸为胱氨酸。

21种氨基酸的混合标准工作液的配制：分别移取1、4、20、40、200、400、1000μL17种氨基酸的混合标准工作液及浓度为2.5mmol/L的天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸和4-氨基丁酸四种单一标准工作液于7只10mL容量瓶中，超纯水定容，混合均匀，得到浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的7个21种氨基酸的混合标准工作液。

实施例1

分别对7个浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的21种氨基酸的混合标准工作液进行衍生化反应：取10μL混合标准工作液，在10μL混合标准工作液中加70μL的pH为8.8的硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入20μL衍生剂溶液，衍生剂溶液的浓度为2.5mg/L，衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯，溶剂为乙腈，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于55℃水浴中进行衍生化反应10min，完毕放置于4℃环境。

用超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器依次测定衍生化的混合标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包括：

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；0.54～5.74min：流动相A90.9％，流动相B9.1％；5.74～7.74min：流动相A82％，流动相B18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B56.6％；8.04～8.64min：流动相A40.4％，流动相B59.6％；8.64～8.73min：流动相A99.8％，流动相B0.2％；8.73～9.50min：流动相A99.9％，流动相B0.1％。

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

以色谱峰保留时间定性，然后根据氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出标准曲线。

根据烟草行业标准YC/T31-1996取样及处理，将烟草样品置于不高于40℃烘箱内烘约2h，直至可用手指捏碎；取出立即研磨，过40目筛，将烟末混合均匀并置于密封袋中备用。

称取0.1g烟末，置于50mL三角瓶中，加入20mL超纯水，超声提取10min，取3mL上清液置于5mL离心管中，离心10min(10000rpm)，取上清液3mL经0.22μm水相滤膜过滤，放4℃冰箱待衍生化。

取10μL烟丝提取液，加70μL、pH＝8.8硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入20μLAQC溶液(浓度为2.5mg/L，溶剂为乙腈)，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于55℃水浴中衍生化反应10min。完毕放置4℃环境待进样分析。

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1μL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如表6：

表6.流动相的梯度洗脱程序

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量：计算出超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析(UPLC-FLD/PDA)进样量1μL中21种氨基酸的浓度，再换算成0.1g烟末中21种氨基酸的含量，即得到烟丝样品中21种氨基酸的含量。

实施例2

分别对7个浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的21种氨基酸的混合标准工作液进行衍生化反应：取10μL混合标准工作液，在10μL混合标准工作液中加70μL的pH为8.8的硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μL衍生剂溶液，衍生剂溶液的浓度为2.5mg/L，衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯，溶剂为乙腈，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于50℃水浴中进行衍生化反应15min，完毕放置于4℃环境。

用超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器依次测定衍生化的混合标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包括：

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1μL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；0.54～5.74min：流动相A90.9％，流动相B9.1％；5.74～7.74min：流动相A82％，流动相B18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B56.6％；8.04～8.64min：流动相A40.4％，流动相B59.6％；8.64～8.73min：流动相A99.8％，流动相B0.2％；8.73～9.50min：流动相A99.9％，流动相B0.1％。

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

以色谱峰保留时间定性，然后根据氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出标准曲线。

根据烟草行业标准YC/T31-1996取样及处理，将烟草样品置于不高于40℃烘箱内烘约2h，直至可用手指捏碎；取出立即研磨，过40目筛，将烟末混合均匀并置于密封袋中备用。

称取0.1g烟末，置于50mL三角瓶中，加入20mL超纯水，超声提取10min，取3mL上清液置于5mL离心管中，离心10min(10000rpm)，取上清液3mL经0.22μm水相滤膜过滤，放4℃冰箱待衍生化。

取10μL烟丝提取液，加70μL、pH＝8.8硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μLAQC溶液(浓度为2.5mg/L，溶剂为乙腈)，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于50℃水浴中衍生化反应15min。完毕放置4℃环境待进样分析。

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1μL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如表7：

表7.流动相的梯度洗脱程序

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量：计算出超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析(UPLC-FLD/PDA)进样量1μL中21种氨基酸的浓度，再换算成0.1g烟末中21种氨基酸的含量，即得到烟丝样品中21种氨基酸的含量。

实施例3

分别对7个浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的21种氨基酸的混合标准工作液进行衍生化反应：取15μL混合标准工作液，在15μL混合标准工作液中加105μL的pH为8.8的硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μL衍生剂溶液，衍生剂溶液的浓度为2.5mg/L，衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯，溶剂为乙腈，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于55℃水浴中进行衍生化反应10min，完毕放置于4℃环境。

用超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器依次测定衍生化的混合标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包括：

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；0.54～5.74min：流动相A90.9％，流动相B9.1％；5.74～7.74min：流动相A82％，流动相B18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B56.6％；8.04～8.64min：流动相A40.4％，流动相B59.6％；8.64～8.73min：流动相A99.8％，流动相B0.2％；8.73～9.50min：流动相A99.9％，流动相B0.1％。

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

以色谱峰保留时间定性，然后根据氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出标准曲线。

根据烟草行业标准YC/T31-1996取样及处理，将烟草样品置于不高于40℃烘箱内烘约2h，直至可用手指捏碎；取出立即研磨，过40目筛，将烟末混合均匀并置于密封袋中备用。

称取0.1g烟末，置于50mL三角瓶中，加入25mL超纯水，超声提取12min，取3mL上清液置于5mL离心管中，离心10min(10000rpm)，取上清液3mL经0.22μm水相滤膜过滤，放4℃冰箱待衍生化。

取15μL烟丝提取液，加105μL、pH＝8.8硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μLAQC溶液(浓度为2.5mg/L，溶剂为乙腈)，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于55℃水浴中衍生化反应10min。完毕放置4℃环境待进样分析。

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如表8：

表8.流动相的梯度洗脱程序

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量：计算出超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析(UPLC-FLD/PDA)进样量1uL中21种氨基酸的浓度，再换算成0.1g烟末中21种氨基酸的含量，即得到烟丝样品中21种氨基酸的含量。

实施例4

分别对7个浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的21种氨基酸的混合标准工作液进行衍生化反应：取10μL混合标准工作液，在10μL混合标准工作液中加70μL的pH为8.8的硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μL衍生剂溶液，衍生剂溶液的浓度为2.5mg/L，衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯，溶剂为乙腈，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于60℃水浴中进行衍生化反应10min，完毕放置于4℃环境。

用超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器依次测定衍生化的混合标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；0.54～5.74min：流动相A90.9％，流动相B9.1％；5.74～7.74min：流动相A82％，流动相B18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B56.6％；8.04～8.64min：流动相A40.4％，流动相B59.6％；8.64～8.73min：流动相A99.8％，流动相B0.2％；8.73～9.50min：流动相A99.9％，流动相B0.1％。

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

以色谱峰保留时间定性，然后根据氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出标准曲线。

根据烟草行业标准YC/T31-1996取样及处理，将烟草样品置于不高于40℃烘箱内烘约2h，直至可用手指捏碎；取出立即研磨，过40目筛，将烟末混合均匀并置于密封袋中备用。

称取0.1g烟末，置于50mL三角瓶中，加入25mL超纯水，超声提取15min，取3mL上清液置于5mL离心管中，离心10min(10000rpm)，取上清液3mL经0.22μm水相滤膜过滤，放4℃冰箱待衍生化。

取10μL烟丝提取液，加70μL、pH＝8.8硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μLAQC溶液(浓度为2.5mg/L，溶剂为乙腈)，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于60℃水浴中衍生化反应10min。完毕放置4℃环境待进样分析。

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如表9：

表9.流动相的梯度洗脱程序

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量：计算出超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析(UPLC-FLD/PDA)进样量1uL中21种氨基酸的浓度，再换算成0.1g烟末中21种氨基酸的含量，即得到烟丝样品中21种氨基酸的含量。

实施例5

分别对7个浓度分别为0.25、1、5、10、50、100、250nmol/mL的21种氨基酸的混合标准工作液进行衍生化反应：取15μL混合标准工作液，在15μL混合标准工作液中加105μL的pH为8.8的硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μL衍生剂溶液，衍生剂溶液的浓度为2.5mg/L，衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯，溶剂为乙腈，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于60℃水浴中进行衍生化反应10min，完毕放置于4℃环境。

用超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器依次测定衍生化的混合标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包括：

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A99.9％，流动相B0.1％；0.54～5.74min：流动相A90.9％，流动相B9.1％；5.74～7.74min：流动相A82％，流动相B18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B56.6％；8.04～8.64min：流动相A40.4％，流动相B59.6％；8.64～8.73min：流动相A99.8％，流动相B0.2％；8.73～9.50min：流动相A99.9％，流动相B0.1％。

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

以色谱峰保留时间定性，然后根据氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出标准曲线。

根据烟草行业标准YC/T31-1996取样及处理，将烟草样品置于不高于40℃烘箱内烘约2h，直至可用手指捏碎；取出立即研磨，过40目筛，将烟末混合均匀并置于密封袋中备用。

称取0.1g烟末，置于50mL三角瓶中，加入25mL超纯水，超声提取10min，取3mL上清液置于5mL离心管中，离心10min(10000rpm)，取上清液3mL经0.22μm水相滤膜过滤，放4℃冰箱待衍生化。

取15μL烟丝提取液，加105μL、pH＝8.8硼酸缓冲溶液，涡旋3秒，加入30μLAQC溶液(浓度为2.5mg/L，溶剂为乙腈)，再次涡旋5秒进行封口，放置1min后于60℃水浴中衍生化反应10min。完毕放置4℃环境待进样分析。

色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱(2.1×100mm，1.7μm)；进样量为1uL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如表10：

表10.流动相的梯度洗脱程序

荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量：计算出超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器分析(UPLC-FLD/PDA)进样量1uL中21种氨基酸的浓度，再换算成0.1g烟末中21种氨基酸的含量，即得到烟丝样品中21种氨基酸的含量。

图6为本发明实施例1的膨胀烟丝的氨基酸提取液经AQC衍生后的UPLC-FLD谱图(谱图a是21种氨基酸的混合标准工作液经AQC衍生后的UPLC-FLD谱图，谱图b是膨胀烟丝的氨基酸提取液经AQC衍生后的UPLC-FLD谱图)，说明了本发明可实现对于烟丝中21种氨基酸的测定。

本发明仅需0.1g烟丝制成的烟末，样品用量少；本发明通过选择6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯作为衍生剂、使用自行研发的反应条件完成衍生化反应，通过自行研发的流动相组成、流速、梯度洗脱程序完成烟丝中氨基酸的测定，无需购买Waters公司的衍生剂和流动相试剂包，降低了成本；并且，本发明通过自行研发的流动相组成、流速、梯度洗脱程序仅需8.5min即可完成烟丝中21种氨基酸的测定。

虽然通过参照本发明的某些优选实施方式，已经对本发明进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)标准曲线的建立

制备氨基酸标准工作液，对所述氨基酸标准工作液进行衍生化反应，用超高效液相色谱-检测器测定衍生化的所述氨基酸标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后根据所述氨基酸标准工作液的摩尔浓度及色谱峰面积绘制出所述标准曲线，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件包括：

流动相包括流动相A和流动相B，

流动相A为甲酸、乙腈、水组成的1L混合溶液溶解20mmol甲酸铵后得到的溶液，其中，甲酸、乙腈、水组成的混合溶液中，甲酸、乙腈、水的体积百分比分别为0.5％、1％、98.5％；

流动相B为甲酸、乙腈组成的混合溶液，其中，甲酸、乙腈的体积百分比分别为1.6％、98.4％；

流速0.7mL/min；

梯度洗脱程序如下，

0～0.54min：流动相A 99.9％，流动相B 0.1％；0.54～5.74min：流动相A 90.9％，流动相B 9.1％；5.74～7.74min：流动相A 82％，流动相B 18.0％；7.74～8.04min：流动相A43.4％，流动相B 56.6％；8.04～8.64min：流动相A 40.4％，流动相B 59.6％；8.64～8.73min：流动相A 99.8％，流动相B 0.2％；8.73～9.50min：流动相A 99.9％，流动相B0.1％；

(2)烟丝中氨基酸的测定

制备烟丝提取液，对所述烟丝提取液进行衍生化反应，用超高效液相色谱-检测器测定衍生化的所述烟丝提取液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，根据所述氨基酸标准工作液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述烟丝中各氨基酸定性，用外标法计算烟丝中各氨基酸的含量，其中，超高效液相色谱检测的色谱条件与步骤(1)中相同。

2.如权利要求1所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述氨基酸分别为组氨酸His、天冬酰胺Asn、丝氨酸Ser、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、甘氨酸Gly、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、苏氨酸Thr、丙氨酸Ala、4-氨基丁酸GABA、脯氨酸Pro、胱氨酸Cys、赖氨酸Lys、酪氨酸Tyr、甲硫氨酸Met、缬氨酸Val、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp。

3.如权利要求1所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述衍生化反应的反应条件为：取10～15μL待衍生化溶液，在步骤(1)中待衍生化溶液为氨基酸标准工作液，在步骤(2)中待衍生化溶液为烟丝提取液，在10～15μL待衍生化溶液中加70～105μL缓冲溶液，混合均匀后加入20～30μL衍生剂溶液，混合均匀后进行封口，放置后于50～60℃水浴中进行衍生化反应10～15min，完毕放置于4℃环境。

4.如权利要求3所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述衍生剂溶液中的衍生剂为6-羟基喹啉基-N-羟基琥珀亚氨基甲酸酯。

5.如权利要求3所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述衍生剂溶液中衍生剂的浓度为2.5mg/L，溶剂为乙腈。

6.如权利要求3所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为硼酸缓冲溶液，所述硼酸缓冲溶液的pH为8.6～9.0。

7.如权利要求1所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的色谱条件还包括：色谱柱为ACCQ-TAGTMULTRAC18柱，填料粒径为1.7μm，色谱柱的内径为2.1mm，色谱柱的长度为100mm；进样量为1μL；样品室温度为10℃，柱温为55℃。

8.如权利要求1所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述检测器为荧光检测器串联光电二极管阵列检测器，所述荧光检测器条件：激发波长266nm，发射波长473nm；所述光电二极管阵列检测器条件：吸收波长260nm。

9.如权利要求1所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述烟丝提取液的制备包括以下步骤：称取0.1g烟末，在0.1g烟末中加入20～25mL超纯水，超声提取10～15min，取上层液离心后，取上清液过滤得到烟丝提取液，放置于4℃环境待衍生化。

10.如权利要求8所述的测定烟丝中氨基酸的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-荧光检测器串联光电二极管阵列检测器的测定时间为8.5min。

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